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[硕士论文] 董美
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:伴随着测序技术的高速发展,下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)是目前核酸序列分析领域的主流测序技术,被广泛用于各类组学的研究。NGS是一种通量高、覆盖度广、快速有效的全基因组重测序手段,为生物技术作物分子特征解析提供了新的选择。分子特征是对生物技术作物在基因组上的改变及其产生的影响进行全面准确的描述。本研究以生物技术水稻作为实验材料,构建生物技术作物分子特征解析的数据分析体系。主要研究内容与结果如下:
  1、建立了生物技术作物分子特征解析的NGS分析方法。以抗虫水稻科丰2号为研究材料,利用NGS技术初步建立生物技术作物分子特征解析的数据分析体系。分析结果与hiTAIL-PCR方法获得的科丰2号水稻分子特征结果一致,证明了该分析体系的可行性及可靠性。同时,该分析体系提供了一种较为简单的分子特征解析策略,即只需利用NGS解析插入位点,采用PCR扩增获得插入位点处的外源DNA全长序列。对于外源DNA片段相对较短的情况,这种方法简单易行、适用性强。
  2、获得了T1C-19和T2A-1两种水稻的分子特征信息,并进一步完善了基于NGS的分子特征解析体系。针对两种材料外源片段结构的复杂性,采用了个性化分析的方式,通过测序数据的挖掘分析、外源片段拷贝数预测,获得了两种材料的分子特征:T1C-19水稻的外源插入片段为2个拷贝的T-DNA同向串联重复,采用PCR验证了此结构;T2A-1水稻ubiquitin基因部分序列反向互补,采用PacBio三代测序验证了此结构。因此,该分析体系提供了另一种分子特征解析策略,即利用NGS获得分子特征信息,利用PCR扩增、三代测序等进行验证,该解析策略对解决外源DNA串联重复问题提供了参考方法。此外,对于单株作物获得的测序数据,直接可以对其纯合及杂合状态进行判定,为生物技术作物的遗传选育、品种鉴定提供服务。
  综上,本论文的研究结果显示,基于NGS技术的生物技术作物分子特征解析体系,克服了传统分析方法的不足,对于生物技术作物的审批、监管、追溯和标识等方面具有重要意义,此外,也为生物技术作物成分检测技术的发展提供技术支持。
[硕士论文] 刘欢
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:植物的正常生长离不开茎尖分生组织和花分生组织的正常发育。拟南芥中研究结果表明,WUSCHEL(WUS)基因主要参与茎尖干细胞的维持,在胚珠和花粉发育过程中也起着重要的作用。WUS可以通过诱导细胞分裂素响应调节因子来调控分生组织的发育,还可以和CLAVATA(CLV)形成负反馈调节环来决定干细胞分裂与分化之间的动态平衡,同时WUS可以与AGAMOUS(AG)基因协同调控花分生组织向花器官的转化。但是在豆科作物中该基因如何调控并影响干细胞的维持和发育目前还没有明确的研究结果。
  蒺藜苜蓿是研究豆科功能基因组学的模式生物,其基因组较小,且遗传转化体系较为成熟。以本实验室前期得到的三个茎尖分生组织发育异常的突变体headless(hdl)为基础,成功克隆到了HDL基因,通过对hdl-1突变体的表型分析和对HDL基因功能进行解析,初步明确了HDL基因在蒺藜苜蓿茎尖分生组织发育和叶型发育中的调控作用。主要研究结果如下:
  通过正向遗传学的方法,我们在豆科模式植物蒺藜苜蓿中克隆了一个拟南芥WUS的同源基因HDL,该基因主要参与蒺藜苜蓿茎尖分生组织维持和叶片发育。当HDL突变后,茎尖分生组织发育异常,主要表现在茎尖分生组织形态和功能不完整以及腋芽分生组织的不规则发育,导致hdl突变体丧失顶端优势,只进行营养生长,没有明显的茎秆出现。hdl-1突变体叶片由于尖端伸长减少而导致其叶片长度变短,这导致突变体叶片呈现心形的表型,这是拟南芥wus突变体中没有描述的新表型。对HDL蛋白进行转录活性分析得出,HDL可以与TOPLESS(TPL)相互作用形成共抑制子,且二者的互作需要HDL蛋白保守的WUS-box和EAR-like结构域。进一步遗传学分析发现,尽管HDL和蒺藜苜蓿叶片生长的关键调节因子STENOFOLIA(STF)都可以招募TPL蛋白,但是在调控蒺藜苜蓿叶片发育中,二者功能是相对独立的。我们的研究结果表明,和拟南芥相比,WUS/HDL在调控蒺藜苜蓿分生组织和叶片发育中的功能既有保守又存在分化,为理解豆科植物分生组织发育和叶型发育提供了新的思路。
[博士论文] 雷娜
园艺学(蔬菜学) 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:干旱胁迫与高盐胁迫是全球范围内严重影响农作物产量的两种主要非生物胁迫。对于生长调节而言,盐和干旱胁迫包括离子信号通路和渗透平衡信号通路。传统的育种方法耗时耗力,并且对于提高作物对高盐和干旱的耐力效率极低。为了探究非生物胁迫的抗性机理,前人从形态学、生理学、生物化学以及之后的分子水平等方面进行了大量的研究。目前,番茄已成为茄科的一种经济蔬菜作物,并作为双子叶植物基因研究的模式植物。属于一个多基因家族的膜联蛋白在植物胁迫反应和多种细胞过程中发挥着不可或缺的作用。在本研究中,我们从具有抗旱性的野生番茄潘那利(Solanum pennelli)克隆了AnnSp2,并在栽培种中对其进行了功能研究。主要研究成果如下:
  1、对AnnSp2进行克隆和测序,结果表明AnnSp2编码一个有316个氨基酸组成的膜联蛋白。
  2、通过实时定量PCR对AnnSp2表达谱分析,结果表明AnnSp2在叶片和花中大量表达,AnnSp2蛋白主要定位于细胞核。AnnSp2能够被植物激素以及非生物胁迫强烈诱导,如失水,高盐以及脱落酸。
  3、通过农杆菌介导的遗传转化,获得了16个AnnSp2过表达的转基因株系。
  4、对3个AnnSp2过表达株系进行了非生物胁迫的抗性鉴定。通过对发芽率、根系发育状况、存活率、叶片失水率和叶绿素含量等生理学指标的测定,结果表明过表达AnnSp2能增强番茄对干旱及盐胁迫的抗性。
  5、AnnSp2转基因植株在种子萌发期和幼苗期对脱落酸不敏感,这一现象揭示了转基因植株对胁迫抗性有所增强。
  6、此外,ROS的清除,叶绿素总含量的提高,脂质过氧化水平的降低,过氧化酶活性的增强(包括APX,CAT和SOD)以及脯氨酸含量的升高—这些现象均在AnnSp2超表达植株中被观察到,这和那些与胁迫相关的基因的在转录水平的变化联系紧密。
  7、通过与胁迫相关的基因表达量的变化而得到的关于发芽和幼苗实验的结果显示,超量表达AnnSp2基因的转基因番茄株系通过ABA信号调节与ROS的清除提高了对于盐与干旱的抗性。
[硕士论文] 徐进
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界公认的主要粮食作物之一,它的块茎不仅可以当作粮食作物,而且还可以用于工业生产淀粉等。在植物光合作用产生的碳水化合物,通过韧皮部筛管向储存库器官运输并积累的过程中,起到主要作用的就是蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter)。双子叶植物中的蔗糖转运蛋白包括SUT1、SUT2和SUT4三类,主要功能就是对植物光合产物蔗糖的装载、运输和卸载过程的调节作用。在马铃薯中,StSUT1蛋白主要对蔗糖的装载进行调控,StSUT4蛋白主要对蔗糖的卸载过程进行调控,并且还与光周期相互作用来调节马铃薯植株的开花、茎长短和块茎形成,但是StSUT2蛋白的功能仍是未知的。根据国内外多年来对高等植物SUT2的研究分析来看,它的结构与葡萄糖信号感受器类似,因此推测SUT2有可能是蔗糖信号感受器而不是蔗糖转运体。
  本研究主要通过构建马铃薯StSUT2基因的干扰载体,并对其转化至马铃薯中,为对StSUT2蛋白进行功能分析奠定了基础。实验主要分为两部分:一是干扰载体的构建,用Gateway克隆技术可将StSUT2基因干扰片段快速重组到表达载体中,通过对重组子进行测序,确定为干扰表达载体;二是马铃薯遗传转化,将构建好的干扰载体通过农杆菌介导法转化至马铃薯块茎中,使其再分化产生含有干扰基因的转基因植株。取得的主要成果如下:
  (1)利用TOPO克隆,将扩增出的干扰片段整合到pENTR中,构建出入门载体命名为pENTR-SUT2。
  (2)根据Gateway克隆技术进行LR重组,根据入门载体与表达载体的attL和attR位点重组,构建出干扰表达载体pSUT2-RNAi。
  (3)用冻融法将干扰载体pSUT2-RNAi转至农杆菌GV3101中。
  (4)将干扰载体转化至夏波蒂(SHB)和陇薯3号(L3)等马铃薯品种的块茎中,通过卡那霉素筛选和PCR扩增检测,初步确定干扰基因已经成功转入马铃薯植株中。用实时荧光定量 PCR对转化株进行相对表达量检测表明,干扰基因已经转入马铃薯植株,并对StSUT2基因表达产生抑制作用。
[硕士论文] 吴婷婷
自然地理学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:湿地土壤种子库是湿地植被自然更新与演替的种质资源,是湿地植被生态恢复的物质基础。土壤种子库的规模及其物种组成、多样性与丰富度特征等可用来评估湿地植被的恢复潜力,其储量与受损后相应生态系统的恢复速度成正比。本文以图们江下游不同类型湿地土壤种子库为研究对象,通过选取图们江下游四个类型湿地的七块标准样地,采用标准样地调查与取样,野外植被调查与室内种子库不同水分条件萌发控制试验相结合的手段,探究图们江下游不同类型湿地土壤种子库特征及其在湿地植被生态恢复过程中的应用潜力。
  主要研究结果如下:
  (1)图们江下游湿地各样地土壤种子库中优势物种地位突出,储量丰富,具有进行湿地植被生态恢复的种质资源潜力,土壤种子库的储量在垂直方向上基本呈现随深度增加而下降的趋势。本试验共出现物种60种,计植物幼苗数14723株,其中湿润处理条件下出现物种数46种显著高于沉水/淹水处理33种,但从萌发植物幼苗数量上看,沉水/淹水处理条件下种子库萌发数量占土壤种子库总数的60%,表明水文恢复在图们江下游湿地植被恢复过程中具有重要意义。
  (2)图们江下游湿地各样地地上植被群落物种组成较丰富,地上植被群落调查过程中共计出现植物79种,隶属28科58属,优势物种以禾本科、莎草科、菊科、蓼科类植物为主。各湿地样地地上植被群落单位面积内植被数量差异明显,湖泊型湿地地上植被密度最大,约1458株/m2。从植被群落的物种重要值来看,除沼泽型湿地与自然湖泊型湿地仍以以湿生植被:蔗草、密穗莎草、通泉草、雨久花为优势种外,其余湿地样地地上植被群落优势种都已趋向旱化,问荆、稗草等杂草类植物优势突出。
  (3)图们江下游湿地各样地土壤种子库中出现的植物科与地上植被群落调查时出现的植物科相似性系数达到80.77%。但各样地间物种相似性系数均较低,在7.14%-42.86%之间,表明地表植被与种子迁移过程受外界生境因子影响较明显,不同湿地类型植被恢复潜力存在差异,从数据分析结果来看,同等情况下图们江下游地区湖泊型湿地植被的恢复潜力较其它样地大。
  (4)图们江下游湿地各样地土壤种子库特征与地上植被群落物种组成结构特征在时间尺度上均存在差异,主要表现为:植被的物种数量增加,多年生物种比例与湿生植被物种比例均降低。从物种生物多样性指数来看,受人为干扰较小的沼泽型湿地生态系统土壤种子库与地上植被群落稳定性较好。
  (5)针对不同湿地类型的植被群落结构特征,在湿地植被生态恢复过程中应选取适合的修复技术,如:自然恢复法更适用于干扰程度在一定阈值内的区域;表层沉积物去除法,适用于受到强烈人为干扰的区域,但可能需要重播种;种子库移植法对主要依靠无性繁殖的物种恢复效果较好,但大面积施用存在困难。
[硕士论文] 尹艳
微生物与生化药学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:丹参酮是常用药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza)中一类二萜醌类化合物,为丹参主要药效成份,在治疗心脑血管疾病方面具有极其重要的药用价值。在植物中,二萜类化合物的代谢受到多种酶的调控,其中异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)是其下游代谢途径的总开关,编码该酶的基因目前已经成为大肠杆菌中异戊二烯类化合物代谢工程的一个有效靶点。本研究利用Gateway技术构建SmIPI基因的干扰表达载体,并利用根癌农杆菌介导转化紫花丹参外植体,经激素诱导及抗性筛选、Egfp荧光标记检测、目标基因表达分析筛选,获得 SmIPI基因表达抑制的丹参植株。并利用GC-MS检测以及LC-MS检测方法,初步分析了SmIPI基因表达对丹参体内MEP和MVA途径上初生代谢和次生代谢产物积累的影响,为完全解析SmIPI在MEP和MVA途径中的作用方式提供基础研究。
  主要研究结果如下:
  1.通过Gateway技术克隆及亚克隆方法,将从SmIPI1和SmIPI2中分别扩增到特异性基因片段分别重组进入专用于RNA干扰研究的Gateway双元表达载体pK7WIWG2D(II)。重组质粒经过特异性引物的菌液PCR反应及测序验证,表明干扰表达载体构建成功,获得SmIPI1基因干扰表达载体RSi1A、RSi1B,以及SmIPI2基因干扰表达载体RSi2A、RSi2B。
  2.利用农杆菌介导遗传转化,建立了以丹参叶盘为外植体,含400mg/L Cef、1.0mg/L6-BA、0.1mg/L NAA的MS为诱导培养基,30mg/L Kan为抗性筛选标记,含0.5mg/L IBA、0.5mg/L NAA的1/2MS为生根培养基的SmIPI基因干扰的丹参植株再生体系。转化植株根尖在荧光显微镜下呈强烈绿色荧光,且干扰型植株SmIPI1和SmIPI2基因的相对表达量分别下调64%-82%和23%-78%。
  3.使用GC-EI-MS/MRM和UPLC-ESI-MS/MRM检测并分析了SmIPI1-RNAi、SmIPI2-RNAi及V0对照株系丹参植株地上部分中植物甾醇和地下部分中以丹参酮为主的二萜类化合物积累差异,结果表明,与对照组V0株系相比,SmIPI1-RNAi株系菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇总含量降低10.73%,丹参酮IIA等10种二萜类化合物总含量水平降低49.76%,差异极显著。而SmIPI2-RNAi株系中,菜油甾醇和豆甾醇含量与对照组V0株系间无统计学差异,三种植物甾醇总含量下降幅度为6.59%,二脱氢丹参酮IIA、丹参酮IIB、15,16-二羟基丹参酮I、丹参酮I、1,2-二羟基丹参酮Ⅰ、丹参酮IIA含量与对照组V0株系相比无统计学差异,所测10种二萜类化合物总积累水平下降32.35%。
  综合研究结果认为,SmIPI1与SmIPI2协同调节MEP质体途径上二萜等的代谢,而SmIPI1在其中起到主要作用,SmIPI1还兼顾胞质中MVA途径上IPP和DMAPP的异构化。
[硕士论文] 张亚玲
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计,从1996年到2015年的20年间,全球转基因作物累计种植面积达到20亿公顷,其中,转基因棉花累计种植面积达3亿公顷。转基因作物为农户及消费者带来的利益不言而喻。转Bt基因抗虫棉的应用及推广有效地解决了棉铃虫害对棉花生产的影响。随着研究的不断深入,发现其存在几个问题:一方面,Bt基因在棉花体内的表达存在时空差异;另一方面,目前抗虫棉花品种选育普遍采用的方法是利用获得转基因应用安全证书的品种作供体,与非转基因棉花杂交,转Bt基因抗虫棉品种间Bt蛋白表达量差异较大,尤其是其杂交后代Bt蛋白的表达量差异很大,对棉花的抗虫育种造成很大困难;第三,抗虫基因单一,现有的抗虫基因主要用于防治鳞翅目的棉铃虫(Helicoverpaarmigera)和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella),使得棉田其他害虫如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(Prodenia litura)、玉米螟(Pyrausta nubilalis)等对棉花的危害逐渐加重,其中,甜菜夜蛾于2001年被列入重要害虫的潜在爆发名单。
  本研究测定了不同抗虫棉花品种、不同遗传背景棉花品种杂交F1代及不同熟性棉花品种杂交F1代棉花Bt蛋白表达量的差异,探究Bt基因在棉花中的表达及遗传规律,为抗虫棉的育种工作提供理论依据;在保证Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)基因继续发挥作用的同时,尝试将Cry1C*基因转入棉花,研究其对棉花害虫的控制效果,保证抗虫棉花的健康发展。主要结论如下:
  1)连续两年对6个不同抗虫棉花品种不同组织器官中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量进行测定及室内生物测定,结果表明:不同棉花品种间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量及棉铃虫幼虫校正死亡率均存在显著差异,其中冈383和鲁6269两个棉花品种Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量和棉铃虫幼虫校正死亡率均较其他几个品种高,Cry1Ab/Cry1Ac蛋白在不同品种组织中的表达规律大体相同:苗期叶片>蕾期叶片>铃期叶片>蕾期小蕾>铃期小铃;
  2)不同遗传背景棉花杂交F1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但与抗虫亲本相比,F1代显著低于抗虫亲本;二代、三代棉铃虫幼虫校正死亡率在不同杂交组合间存在显著差异,说明遗传背景对棉花的抗虫性有影响。
  3)不同熟性棉花品种杂交F1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但F1代Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量显著低于抗虫亲本鲁6269;棉花熟性与各组织中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量、棉铃虫幼虫校正死亡率均不存在显著的相关性,说明棉花的熟性对其抗虫性没有显著的影响。
  4)得到转Cry1C*基因棉花T0代2株(能收到种子的),后续的转化工作仍在继续,T1代阳性植株22株,初步筛选到Cry1C*-5-7、Cry1C*-5-8、Cry1C*-5-14三个Cry1C*蛋白表达量较高,抗虫性好的植株。
[博士论文] 杜红园
植物营养学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜是我国主要的油料作物,需磷多,对缺磷敏感,最大栽培区(长江中下游)又位于我国土壤磷缺乏或严重缺乏的地区。因此,研究甘蓝型油菜磷营养高效的遗传机理,对于甘蓝型油菜磷营养的遗传改良具有重要的理论和实践意义。含SPX保守结构域的基因对体内磷稳态的调节及磷信号调控的重要性在拟南芥和水稻中均有报道,但在其它作物中鲜有研究。本研究在全基因组水平上鉴定了甘蓝型油菜中所有含SPX保守结构域的基因(BnaSPXs),分析了SPX家族各成员的序列特征和响应磷胁迫的表达谱,并将BnaA2.SPX1和BnaC3.SPX1作为候选基因,对其潜在的调控磷信号的功能进行了研究。同时,以缺磷特异诱导表达基因BnaC3.SPX3为对象,对植物响应低磷的转录调控机制进行研究。获得的主要结果如下:
  1、甘蓝型油菜SPX超家族基因成员的鉴定
  甘蓝型油菜基因组中共有69个含SPX保守结构域的基因(BnaSPXs),其中67个基因不均匀地分布在甘蓝型油菜的18条染色体上,且大部分基因位于染色体的臂末端,预示着它们有很高的基因重组概率。A9染色体上分布最多(11个),A4染色体上分布最少(1个)。利用甘蓝型油菜和拟南芥SPX蛋白序列构建的系统进化树显示,SPX基因分成了4个亚家族,即SPX(11个成员)、SPX-EXS(43个成员)、SPX-MFS(8个成员)、SPX-RING亚家族(7个成员)。基因结构及蛋白保守结构域分析进一步证实了系统进化树结果的可靠性。对BnaSPXs基因启动子序列中的顺式作用元件进行分析,发现SPX亚家族基因成员(除去BnaSPX4s)的上游启动子中均含有2-4个P1BS(GNATATNC)元件。
  2、甘蓝型油菜SPX基因响应低磷胁迫的表达模式
  甘蓝型油菜苗期地上部和/或根部响应磷饥饿的转录组数据中,共检测到50个BnaSPXs基因的表达。其中,SPX亚家族基因(除去BnaSPX4s外),均受到磷饥饿的诱导。进一步的qRT-PCR表明,这种诱导具有持续性和可逆性。低磷下甘蓝型油菜不同组织部位的定量表达结果显示,甘蓝型油菜多倍化产生的重复基因间有不同的表达模式,说明在长期的进化过程中重复基因间产生了功能分化。
  3、甘蓝型油菜BnaAZSPX1和BnaC3.SPX1基因响应低磷的功能
  BnaA2.SPX1和BnaC3.SPX1在低磷胁迫下均受到诱导表达,且均为细胞核定位蛋白,但是在低磷胁迫下有不同的表达模式。pBnaA2.SPX1∷BnaA2.SPX1和pBnaC3.SPX1∷BnaC3.SPX1拟南芥转基因材料在正常磷(1000μM)和低磷(50μMPi)条件下的表型分析显示:低磷胁迫下pBnaA2.SPX1∷ BnaA2.SPX1转基因株系地上部干重和磷含量均低于野生型,许多磷饥饿诱导表达基因均受到显著抑制,表明BnaA2.SPX1是磷信号网络中的负调控因子。然而,BnaC3.SPX1的转基因材料与野生型相比,表型无明显变化。
  4、甘蓝型油菜BnaC3.SPX3的调控模式
  本课题组前期研究结果表明,BnaC3.SPX3为缺磷特异诱导表达基因,并且启动子上游-746至-326区域存在新的响应低磷胁迫的顺式作用元件。通过对该区域序列的分析,发现其中含有4个P1BS-like序列,即P1BS-like1(CTATATAC,-337/-330)、P1BS-like2(GTTTATAC,-387/-380)、P1BS-like3(ACATATGC,-672/-665)和P1BS-like4(GGGTATGC,-708/-701),所以命名该段序列为LZ(Like Zone)序列。LZ的缺失分析表明近端的两个P1BS-like元件及其边框序列(LZ5△)具有独立响应低磷胁迫的能力。此外,该DNA序列保留了BnaC3.SPX3响应Pi饥饿诱导的快速性、持续性和可逆性特点。进一步通过GUS组织化学法研究LZ5△序列响应低磷胁迫的表达模式,发现LZ5△∷GUS转基因拟南芥的地上部、根、花器官及荚果中均有报告基因的表达。LZ5△内含的两个P1BS-like元件和边框序列对其增强子的功能是必需的和充分的。双荧光素酶检测结果表明,该DNA序列能与PHR1、PHL1、PHL2和PHL2等MYB-CC家族转录因子成员结合并受到它们的转录激活调控。
  综上所述,本研究首次从全基因水平上分析了甘蓝型油菜中SPX家族基因的进化和响应低磷胁迫的表达谱,为后期BnaSPXs基因功能的深入研究奠定了基础。两个BnaSPX1s旁系同源基因在拟南芥中的功能差异可能由启动子差异所导致,显示异源四倍体物种在进化过程中同源基因功能的分化。BnaC3.SPX3启动子的缺失分析揭示近端的P1BS-like/P1BS-like及其边框序列组成的结构具有独立响应低磷胁迫的能力,并且这种结构是P1BS元件的“助推剂”,能够协助P1BS元件高效启动缺磷响应基因的表达。
[硕士论文] 胡美玲
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:非生物逆境胁迫严重影响棉花的生长发育、产量及纤维品质,培育抗逆的棉花新品种对棉花生产具有重要的意义。NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物对非生物逆境的响应。本研究基于前期棉花干旱胁迫表达谱分离到一个显著诱导表达的NAC基因GhNAC3,对其在棉花中参与响应干旱和盐胁迫的功能进行初步鉴定和机制探索,主要结果如下:
  我们在棉花中鉴定到232个NAC家族转录因子,并基于公共数据库表达谱数据对其组织表达模式和逆境诱导表达模式进行了分析。同时,我们从陆地棉中克隆到GhNAC3基因,氨基酸序列多重比对结果显示该基因具有保守的NAC结构域;亚细胞定位实验表明GhNAC3编码一个核定位蛋白;酵母反式激活实验揭示GhNAC3 BD结构域(1-160aa)不具有转录激活能力,AD结构域(161-298aa)具有转录激活能力。组织表达模式分析发现GhNAC3在根和花中优势表达;非生物逆境表达模式分析表明,GhNAC3受PEG和NaCl诱导显著上调表达。另外,对GhNAC3启动子的cis-element分析,发现该基因的启动子区域具有响应干旱、盐和ABA的一些顺式作用元件,如 ERD1(early responsive to dehydration)、 DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat)等。
  在拟南芥中超表达GhNAC3,萌发实验及根长实验表明超表达该基因可以增强转基因拟南芥对渗透压胁迫和盐胁迫的耐受性,对ABA的敏感性降低。利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS)沉默GhNAC3的表达,ABA含量在干涉材料中显著降低;干旱处理后,在干涉材料中积累较多的过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA);离体叶片失水处理、自然干旱和叶盘实验表明在棉花中沉默该基因可以降低棉花对干旱和盐胁迫的耐受性。通过农杆菌侵染棉花下胚轴转化技术,我们获得了稳定转化的超表达材料,与阴性分离材料和野生型一起进行PEG6000模拟的渗透胁迫实验,结果表明,超表达材料较对照材料表现出更好的生长势。
  以上结果表明,GhNAC3是一个参与调控棉花响应非生物逆境的基因,我们推测该基因可能通过介导ABA信号参与棉花响应干旱和盐胁迫。本研究棉花抗逆育种提供基因资源和理论基础。
[硕士论文] 王宏蕾
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:胞壁相关的类受体蛋白激酶WAKs胞外结构域可以绑定细胞壁果胶成分,能够感受胞壁结构发生变化的信号并参与植物生长及免疫的的过程。根据本实验室前期研究发现的一种受多种病原菌共同诱导表达的蛋白激酶[1]6683,推测该激酶可能是棉花响应广谱抗性的蛋白。聚类发现其与拟南芥胞壁相关的类受体蛋白激酶AtWAK3同源度较高,再将其于本课题组海岛棉数据库进行序列分析,将其在棉花中编码蛋白的基因进行克隆并命名为GbWAK3。对GbWAK3有关抗病作用研究的主要结果如下:
  表达分析表明GbWAK3在海岛棉不同组织中均有一定程度表达,其在棉花的根部组织中表达量最高,叶部组织次之。通过生物信息学方法对棉花接种黄萎病菌后GbWAK3受病原菌诱导的表达模式进行分析发现:海岛棉中GbWAK3受黄萎病菌诱导表达;外施SA处理后,GbWAK3表达变化并不明显;外施茉莉酸甲酯后,GbWAK3表达量迅速上升。因此GbWAK3在海岛棉根部优势表达,并且受黄萎病菌诱导,其表达水平受外源茉莉酸甲酯诱导迅速上升。
  利用病毒介导的基因沉默技术抑制GbWAK3表达后,海岛棉对黄萎病的抗病性降低;同时拟南芥突变体对黄萎病菌也更加感病。表达分析发现抑制棉花GbWAK3表达或拟南芥中wak3突变均导致JA路径相关基因和木质素合成相关基因的表达量降低,同时JA含量和木质素含量明显降低。接种灰霉后,抑制GbWAK3表达的棉花叶片发病更严重。以上结果表明GbWAK3可能通过调控JA信号路径及木质素代谢影响棉花免疫反应。
[硕士论文] 李南南
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物的生长和抗性通常处于对立的地位,植物免疫系统的激活通常影响生长发育,从而影响作物的产量,因此抗病基因在抗病育种上的应用需要有精确的时空表达调控元件,一方面可以使作物获得抗性,另一方面不影响作物的产量。组织特异型启动子使抗性基因仅在特异的组织中表达,从而使植株获得抗性的同时能够正常生长。
  依赖于钙离子的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)不仅在生长发育中具有重要作用,在植物的免疫系统中也具有重要的作用。前期工作是对棉花参与JA合成的GhOPR3(1,2-氧-植物二烯酸(OPDA)还原酶)酵母双杂交结果进行分析,获得一个与GhOPR3互作的蛋白,同源比对分析后发现该蛋白的编码基因与GhCPK33like相似度度最高,因此命名为GhCPK33。
  本研究开展了棉花根优势表达启动子的分离与鉴定,并对GhCPK33的在棉花抗病方面的功能进行了初步探究,取得的主要结果如下:
  1.我们通过海岛棉组织表达数据库分析,筛选到22个可能在根中优势表达的基因,并克隆了这些基因。通过PCR扩增,获得了2个根优势表达的启动子,构建了表达载体分别转化拟南芥和棉花。
  2.表达分析发现GhCPK33在棉花的各个组织中均有表达,接种黄萎病菌后GhCPK33的表达变化不明显;Me-JA处理1h时该基因的表达量明显增加,但对于外源SA的处理,该基因的响应没有明显的规律。
  3.利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中抑制GhCPK33基因的表达后,增强了植株对黄萎病的抗性;同时发现在GhCPK33表达量下调的棉株中内源茉莉酸活化形式荣莉酸异亮氨酸的含量升高,并且JA信号路径的关键基因被激活;接种死体营养型真菌-灰霉菌后发现,GhCPK33表达量下调后增强了植株对灰霉菌的抗性。因此推测该基因可能通过影响茉莉酸信号路径来调控棉花对黄萎病的抗性。
  筛选根中优势表达的启动子,利用该启动子驱动抗性基因,如GhCPK33,在根中优势表达,是目前获得抗性品种的一个好的方法和方向。
[硕士论文] 赵午斌
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:本研究以含有非洲栽培稻核基因的非洲新稻和非洲栽培稻基因渗入系共50份材料及其与普通栽培稻品种胜泰1号测交的部分种间杂交F1材料作为研究对象,通过对水稻结实率、单株有效穗数、千粒重等11个农艺性状的的考察分析,结合亲本的简化基因组测序(RRGS),对其农艺性状和杂种优势进行了全基因组关联分析(GWAS),其目的是为了开发分子标记,为进一步选育综合农艺性状好、杂种优势强的部分种间杂交稻新品种提供理论和实践依据。主要研究结果如下:
  1.对海南、武汉两地种植的亲本和杂交种的农艺性状及其杂种优势考察分析表明,在武汉部分种间杂交种F51,F55,F57,F59,F69,F81,F83的杂种优势较强;在海南部分种间杂交种F9,F31,F57,F63,F83,F91,F17-1的杂种优势表现较强;部分种间杂交种F57和F83在两地表现均较强的杂种优势。
  2.对50份亲本材料DNA样品的产出数据进行统计,样品clean data数据量均达标(每个样品clean data不低于0.52G),Clean data中已经不存在低质量碱基(Q≦20)占比20%以上的reads,测序质量达到较高水平(所有合格样品Q20不低于99%,GC含量在40%左右,大部分样品的比对率在95%以上,覆盖度在15%左右)。
  3.根据对50份亲本材料的群体结构分析,可分为4个组,Group1为非洲新稻;Group2、3、4为非洲栽培稻基因渗入系。以结实率、千粒重、有效穗数、穗粒数和单株产量为主要参考,对非洲栽培稻基因渗入系产量性状的多重比较结果,海南表现依次为Group4>Group2>Group3>Group1武汉表现依次为Group4>Group3>Group2>Group1。结合海南武汉两地的数据可以看出,非洲栽培稻基因渗入系Group2、3、4表现均优于非洲新稻Group1,最好的为Group4。
  4.对50份水稻亲本材料重要农艺性状数据进行全基因组关联分析,采用混合线性模型,共检测到与7个农艺性状(粒长、籽粒长宽比、千粒重、播始历期、穗长、穗粒数)相关的27个QTLs(qGL-1-2、qLWR-3-1、qTWG-1、qDSH-1、qSL-7、qGNPS-6、qSSR-7等),分别分布在9条染色体(Chr1,Chr2,Chr3,Chr5,Chr6, Chr7, Chr8, Chr9, Chr11)上。
  5.对50份测交种农艺性状杂种优势数据进行全基因组关联分析,采用混合线性模型,共检测到与4个农艺性状(粒长、籽粒长宽比、穗长、株高)杂种优势相关的23个HLs(hSL-1、hPH-2、hLWR-1、hGL-5等),分别分布在Chr1,Chr2,Chr3, Chr4, Chr5, Chr8, Chr9, Chr11, Chr12上。
[硕士论文] 李群
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:菜籽油是我国的传统食用油,因其较高的营养价值而得到国民的青睐。但是,目前我国每年进口的菜籽油占需求的30%以上。提高油菜的含油量,推广高含油量品种是提高我国菜籽油自给率的有效手段。一般地提高含油量的办法是通过改变脂肪酸合成路径中某些基因的表达来促进脂肪酸合成,从而达到增加油脂积累的目的,如何降低TAG在作物中合成后的分解对于油脂的积累也显得十分重要的。GDSL型酶是一类广泛存在于动植物中的水解酶,可以水解硫基酯、芳香酯、磷脂和氨基酸等多种类型的底物。本研究主要在拟南芥中鉴定了AT1G71250(GDSLlipase like,GLIPL)和AT5G15720(GDSL-motif lipase7,GLIP7)及油菜同源基因(BnGLIPL,BnGLIP7)对含油量的影响,结果如下:
  1)在油菜中克隆到GLIPL以及GLIP7的同源基因的CDS全长和完整启动子。
  2)在几种芸薹属植物中比对同源基因的DNA和氨基酸序列,发现GLIPL和GLIP7在芸薹属不同植物中的保守性非常高,序列相似度达90%,且都存在4个保守的结构域,也预示两个基因具有相似的功能。
  3)对拟南芥根、茎、叶、花蕾、角果做qRT-PCR,发现GLIPL在拟南芥各器官中都有不同程度的表达,在开花后4天的角果中表达量显著提高;对GUS阳性苗染色发现:BnGLIPL在萌发的种子、花器官以及发育的种子中表达量比较高;BnGLIP1在幼苗、花序以及幼嫩角果中有明显的表达。
  4)在拟南芥中得到GLIPL的纯合突变体;构建GLIPL以及GLIP7油菜同源基因的含双35s启动子的CDS过表达载体并得到阳性单株。
  5)通过检测过表达株系、纯合T-DNA插入突变体以及野生型的种子含油量发现:BnGLIPL比对照含油量下降9.54%,达到极显著水平;突变体与对照相比含油量上升7.63%,达到极显著水平;BnGLIP7的过表达株系含油量比对照低4.66%,差异显著。
[博士论文] NGUYEN BA HOANH
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一,为世界一半以上的人口提供主要食物。然而,全球气候的不断变化给水稻生产带来重大挑战,特别是干旱环境,这严重影响了世界经济和粮食安全。对水稻的抗逆性状进行遗传改良是应对这一状况的主要策略之一。根据已有报道,水稻抗旱性状是由多基因控制的,因此,多基因聚合的策略在理论上可以用于改善水稻的抗旱性。然而,目前这种策略仍然缺乏实验证据。在本研究中,我们通过MISSA(multiple-round in vivo site-specific assembly)系统组装了从水稻中分离的几个干旱应答基因,并且通过农杆菌介导转化法将聚合载体以及对应的单基因超表达载体导入KY131水稻品种中。之后,我们鉴定了T1代转基因植株中的目的基因转录水平和插入片段拷贝数,并选取单拷贝、超量表达目的基因的转基因家系和阴性转基因材料(KY131-N)用于大田干旱胁迫的预实验和之后的进一步实验中。
  在预实验期间,通过对叶片死亡程度和结实率的目测,我们发现共表达两个基因OsbZIP46CA1(编码bZIP转录因子OsbZIP46的组成型激活形式)和SAPK6(编码蔗糖非发酵1[SNF-1]相关蛋白激酶家族SnRK)的转基因材料在成株期的抗旱性明显高于相应的单基因超表达材料(CA1-OE与SAPK6-OE)和KY131-N。
  与相应的超量表达单基因的材料以及KY131-N相比,共表达两个基因的材料(称为XL22)对ABA的敏感性有明显增强。这一结果表明OsbZIP46CA1和SAPK6可能在水稻对ABA的应答过程中存在加性效应。
  利用大田中的农艺性状进一步对XL22,CA1-OE,SAPK6-OE超量表达转基因材料和KY131-N的抗旱性进行评估。结果表明XL22在中等干旱胁迫条件下具有更高的产量,干重,总粒数和实粒数。苗期的抗旱性和失水率试验表明,转双基因的株系XL22的耐旱性明显优于转单基因的株系CA1-OE和SAPK6-OE。此外,RNA-Seq的表达谱分析显示,在干旱处理的XL22家系中,涉及应答逆境的许多基因被特异上调,并且在CA1-OE和SAPK6-OE中激活的一些逆境相关基因是不同的,这可以部分地解释这些材料对于抗旱性的不同性能。
  另外,我们还在苗期对上述超量表达材料和KY131-N的高温(42℃)和低温(4℃)胁迫的耐受性进行了测试。结果显示,在以上逆境处理后,XL22与CA1-OE、SAPK6-OE以及KY131-N相比具有更高的存活率。此外,在高温胁迫条件下,我们还发现XL22植株的丙二醛(MDA)含量和相对离子渗漏率显著低于其他材料。这表明XL22植株在高温胁迫条件下膜脂质氧化程度更低,部分解释了其更强的高温抗性。以上结果表明共表达这两个基因可以显著增强水稻对高温以及低温环境的抗性。
  综上所述,本研的结果表明,将合适的抗逆相关基因进行聚合是水稻抗逆性状遗传改良的有效的策略。
[博士论文] 马孝松
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativa L.)是最重要的粮食作物之一,全球一半以上人口以水稻作为主粮。但水稻抗旱性差,水稻生产耗水量大,随着全球气候变暖,干旱、高温等极端环境气候对水稻生产造成了极大的威胁,因而研究水稻的抗旱性,培育节水抗旱稻尤为重要。
  尽管水稻抗旱性研究已经取得了重要进展,发现了一些抗旱基因,同时也培育了一些抗旱品种。但是水稻的抗旱性是复杂的数量性状,而且水稻有多种不同的抗旱策略,因而关于水稻的抗旱性仍然有很多未解之谜待我们去探索。
  本研究尝试两种不同研究方法去发现一些新的水稻抗旱基因和探讨水稻的耐旱机制:一、通过对水稻微核心种质和节水抗旱核心资源的全基因组关联分析,发掘水稻种质资源中存在的抗旱性位点;二、利用转录组学和代谢组学相结合的方法探讨水稻的耐旱机制。主要研究结果如下:
  1.对270份种质资源进行抗旱性鉴定,发现水稻的株高、生物量、单株产量、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、结实率、每穗颖花数、叶长、叶宽等表型性状都显著或极显著受到干旱胁迫的抑制,干旱胁迫使抽穗期极显著延迟,而叶绿素含量(SPAD值)则是受到干旱胁迫诱导上升。
  2.分别采用土壤水分梯度鉴定法、桶栽试验法、“篮子”实验法对14份综合抗旱性较好的水稻品种进行复原抗旱性、耐旱性和避旱性鉴定,发现6个品种属于避旱品种,3个品种属于耐旱品种,1个品种属于复原抗旱品种,2个粳稻品种同时具有较高的耐旱性和避旱性,2个籼稻品种同时具有避旱性、耐旱性、复原抗旱性。粳型旱稻品种IAC1246的综合抗旱性、避旱性与粳型旱稻品种IRAT109接近,但是耐旱性极显著强于IRAT109。因而IAC1246既可以作为水稻耐旱性研究的遗传材料,也可以作为水稻耐旱性改良的亲本。
  3.通过全基因组关联分析定位到sd1、GH3-2、OsGA2ox3、OsSAP11/OsDOG、OsGNA1、OsCYP51G3、OsRRMh、OsPYL2、OsGA2ox9等控制株高、抗旱性的已知功能基因,在抗旱系数关联位点附近发现了28个可能参与抗旱的候选基因,其中,OsPYL2、OsGA2ox9与抗旱性或者根系发育有关。本研究对候选基因OsRLK5进行了基因敲除,突变体的失水速率更快;在干旱条件下,突变体的结实率、产量等相关性状都显著或者极显著低于野生型。
  4.IAC1246具有更强的渗透调节能力和抗氧化能力,在干旱胁迫条件下枯死叶率极显著低于IRAT109,相对光合速率(旱/水)高于IRAT109,因而在干旱条件下形成较高的产量。通过转录组分析发现IRAT109水/旱处理间的差异基因数量多于IAC1246,而且二者共有的差异基因只占少部分。KEGG富集分析表明,在严重干旱胁迫期间,IRAT109的差异基因被显著富集在糖代谢和氨基酸代谢通路;而IAC1246的差异基因被显著富集在谷胱甘肽代谢、黄酮和类黄酮合成代谢、抗坏血酸代谢、类胡萝卜素代谢等抗氧化相关代谢通路。GO富集分析表明,不同时期IRAT109的差异基因都能被显著富集到水通道活性相关基因,而IAC1246在任何时期的差异基因都不能富集这一GO分类。表明在干旱胁迫期间IAC1246通过提高抗氧化能力来应对干旱胁迫,而IRAT109则通过调节水分运输来应对干旱胁迫。
  5.与光合作用相关的差异基因在两个品种中存在明显不同的调控模式。在干旱胁迫早期(Period I)绝大部分光合作用相关的差异基因在IAC1246中呈上调表达趋势,而在IRAT109中呈下降表达趋势。而且叶绿体基因在IAC1246和IRAT109中也呈现出类似于光合作用相关的差异基因的表达模式。
  6.在IRAT109中检测到的差异代谢物多于IAC1246,共有的差异代谢物仅有9个,而且相同差异代谢物在不同品种中含量变化模式不同。特别是阿魏酸(光合保护剂)和4-羟基肉桂酸的含量在IAC1246中受到干旱胁迫而被诱导上升最为明显,而在IRAT109中的含量变化不大。
[硕士论文] 韩艳婧
作物学;作物遗传育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:7S球蛋白(β-Conglycinin)是大豆种子贮藏蛋白的主要组分之一,是由α-(57~58KD)、α'-(57~72KD)和β-(45~52KD)三个主要亚基组成的三聚体糖蛋白,以上3个亚基均是大豆主要的致敏原。目前的研究表明,7S球蛋白亚基缺失突变体可以在除去致敏蛋白的同时,改良大豆蛋白的营养及加工品质,但是,各个亚基对大豆种子蛋白营养及加工品质的作用及贡献大小尚无定论,其分子机理尚未解析。到目前为止,国内尚没有见到具有中国大豆遗传背景的α'-亚基缺失型大豆新材料的相关报道,单一α'-亚基缺失的遗传效应尚未明确。本研究利用回交转育法获得了具有中国大豆遗传背景的α'-亚基缺失型大豆新品系以及近等基因系,并对其主要农艺性状、营养与加工品质进行全面系统的评价,明晰α'-亚基缺失遗传效应;对α'-亚基缺失基因进行初步定位,为该基因的分子标记辅助育种及图位克隆与功能验证奠定基础。
  本研究主要内容包括:⑴利用回交选育法获得12个具有中国大豆遗传背景低致敏蛋白α'-亚基缺失型大豆新品系:C0909、C4802、C4808、C4809、C4819、C4821、C4833、C4840、C5206、C5210、C5211、Cc5-7,以上各品系的α'-亚基缺失特性稳定遗传,C4802、C4808、C4833、C5210的单株产量显著高于亲本东农47;营养品质方面,Cc5-7的蛋白含量显著高于亲本东农47,C4802、C4840的油分含量显著高于亲本东农47,所有品系17种氨基酸组分含量不同程度升高,游离精氨酸含量成倍增加,游离丙氨酸、游离缬氨酸、游离蛋氨酸、游离苯丙氨酸、游离组氨酸等5种游离氨基酸组分含量显著升高;加工品质方面,各品系豆腐产品的凝胶硬度和豆腐蛋白浓度显著增加,粘性等质构特性得到显著改善。⑵以东农47为轮回亲本,通过回交6代,自交4代(BC6F4),构建了一套α'-亚基缺失型近等基因系群体,将其命名为NIL-Δα',遗传效应分析结果表明:单一α'-亚基缺失提高了近等基因系大豆的株高和单株产量,α'-亚基的缺失导致17种氨基酸和游离氨基酸组分含量不同程度的升高,氨基酸和游离氨基酸总量升高;加工品质方面,α'-亚基缺失导致豆腐制品凝胶硬度显著增加,豆腐干重和豆腐蛋白浓度显著升高,弹性、咀嚼性等质构特性得到显著改善。⑶利用BSA(Bulked segregant analysis)法组建基因池,对α'-亚基缺失基因进行初步定位,通过SSR(Simple Sequence Repeat)标记分析,mapmaker3.0软件作图,将α'-亚基缺失基因(cgy-1)初步定位于大豆第10号染色体(O连锁群)上,介于Sat307和Sat231之间,α'-亚基缺失基因(cgy-1与Sat307间的遗传距离约为6.1cM。
[硕士论文] 周晓琳
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:泛素蛋白酶体降解系统是植物降解蛋白质的主要方式,泛素活化酶、泛素结合酶、泛素连接酶三种酶共同参与了蛋白质的泛素化过程。泛素连接酶E3能够特异地识别靶蛋白并使其泛素化,而多泛素化的靶蛋白进一步被26S蛋白酶体识别后降解成肽段。在植物生长发育的各个过程中泛素连接酶E3都起着极其重要的作用。
  棉纤维是由棉花的外珠被细胞分化而来,是探究植物细胞发育的良好模型,然而泛素连接酶E3在棉花纤维发育方面的研究较少。本研究通过分析陆地棉各组织表达谱,筛选到一个在纤维快速伸长期优势表达的泛素连接酶基因,并根据拟南芥的同源基因将该基因命名为GhATL68。利用农杆菌介导的遗传转化方法获得相应的转基因棉花,并对GhATL68在棉花纤维发育中的功能进行了探究。具体结果如下:
  1.GhATL68序列分析
  利用NCBI网站的BLASTP功能寻找GhATL68的同源蛋白,表明GhATL68与拟南芥AtATL68、雷蒙德氏棉GrATL67及可可TcATL67较为同源。对GhATL68的保守结构域分析,发现GhATL68含有泛素连接酶E3家族特有的C3H2C3类型的RING结构域。
  2.GhATL68转基因棉花表型鉴定
  获得了GhATL68的超表达棉花和干涉棉花,并进行拷贝数检测和表达量筛选,最终获得了低拷贝、表达量符合要求的超表达系及干涉系各2个。对转基因T2代植株表型进行观察,发现在8DPA时干涉系棉桃发育开始变缓,到10DPA,与对照系相比,其棉桃发育明显迟缓,纤维长度显著短于阴性对照系和野生型,而超表达系棉桃发育及纤维长度都没有明显变化。对成熟纤维进行鉴定,发现干涉系纤维长度明显短于阴性对照系和野生型,而超表达系纤维长度没有明显变化。对纤维的品质进行鉴定发现干涉系纤维的断裂比强度和整齐度都明显低于阴性对照系和野生型,而超表达系的纤维品质没有明显改变。由此可以确定,GhATL68表达量的降低导致棉桃发育迟缓,纤维品质变差;GhATL68表达量的升高对纤维发育无明显影响。
  3.GhATL68影响纤维发育的可能机制
  为了探寻GhATL68影响纤维发育的机制,运用酵母双杂交系统筛选纤维快速伸长期的酵母文库,得到了一个可能与GhATL68互作的蛋白GhSTP7。GhSTP7为糖转运蛋白,对GhSTP7的组织表达模式进行分析发现GhSTP7在纤维伸长期5DPA、10DPA、15DPA优势表达,与GhATL68的优势表达时期一致。对GhATL68进行亚细胞定位分析,发现在细胞核、细胞质以及细胞膜中该基因均发挥功能,而STP类糖转运蛋白定位于细胞膜上,两者表达部位相符。这说明GhATL68可能通过GhSTP7影响细胞中的糖类转运系统进而影响纤维发育。
[硕士论文] 胡刚
遗传学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻是重要的粮食作物,其较小的基因组大小,丰富的遗传多样性等优点使其成为遗传和基因组研究的单子叶模式植物。水稻粒形以及株型等重要农艺性状的遗传解析一直是育种家们研究的重点内容,定位更多的与粒形、株型相关联的QTLs,挖掘其优良等位基因型,为分子设计育种提供技术指导服务。传统的双亲本群体已经广泛应用于QTL定位,但受其遗传组成狭窄、重组发生有限、作图分辨率不高等影响,很难满足当前的需求。MAGIC群体作为新一代作图群体,凭借其丰富的遗传组成、较小的群体结构以及可以直接或间接的应用于育种进程等优点,开始新兴于各种植物研究中。本研究基于一个包含248个株系的四亲本水稻多亲本高世代回交MAGIC群体的低丰度的全基因组重测序,获取了1231431个高质量的SNP,对该群体进行了遗传多样性分析、主成分分析以及连锁不平衡分析(LD),并结合表型数据对粒形、株型进行了全基因组关联分析(GWAS)。同时,利用本实验室韩忠民博士基于SNP数据构建的高密度的binmap对粒形以及株型数据进行bin水平的关联分析,并进行了两种关联分析方法的比较。在bin水平基础上进行了等位基因间的多重比较,确定优良等位基因型。主要研究结果如下:
  1.利用Hiseq-3000对群体家系进行了平均深度为2X的测序,对四个亲本材料进行了平均测序深度为10X的测序。利用bwa、samtools、vcftools等生物学工具共获取1231431个高质量的SNP,并用Mendel_Impute软件基于家系亲缘关系进行了数据的补缺工作,获取完整的群体基因型。
  2.对群体进行了系统发生树分析,表明群体存在较低的群体结构。PCA分析结果显示前10个成分仅解释25%的样本方差,群体没有出现分层现象,即群体内不存在明显的群体结构。并比较了双亲本和本试验四亲本MAGIC群体的LD衰减图,结果得出:四亲本MAGIC群体LD衰减速度明显低于双亲本材料。
  3.利用粒形数据,我们分别采用SNP水平以及bin水平对两年三个重复的粒长、粒宽数据进行关联分析。粒长表型中,两种方法分别检测到5个和4个QTLs,其中已克隆基因GS3以及GL3.2在两种方法三个重复中均检测到。bin水平关联分析将GS3限定在10kb的bin内,该bin内仅含有一个基因,即GS3。SNP水平单独关联到了已知基因GL7,bin水平并没有显著检测到。SNP水平三个重复均检测到两个新的SNP位点chr03_19636931和chr03_22449318,均位于3号染色体上。bin水平也检测到两个新的QTLs,一个是位于2号染色体上的B2_275,另外一个是位于8号染色体的B8_350,在该区间内没有报道的粒长基因。粒宽表型中,两种方法分别检测到7个和6个QTLs,其中GW5以及GL7被两种方法均检测到。其中GW5被限定在大小为10kb的bin区间内,在SNP水平也是将GW5锁定在单基因水平。SNP水平上新关联的5个QTLs均只在单个重复中检测得到,bin水平共关联到4个新的位点,至少在两个重复中检测到。有趣的是SNP水平关联到的新的位点chr10_10645936和bin水平关联到的B1093相距很近,我们认为是一个新的QTL位点。
  4.利用株型中的株高、分蘖角以及剑叶叶夹角数据,同时采用SNP水平和bin水平进行相对应的关联分析。株高表型中,SNP水平关联到4个QTLs,对应的bin水平也关联到4个QTLs。其中TAD1两种方法均有检测到,SNP水平还关联到已知QTL Psd1。SNP水平关联到的新的SNP位点chr07_24813588与bin水平关联到的B7_247共定位,该区间大小为230kb。对应的在分蘖角表型中两种方法分别检测到2个和3个QTLs,均为已克隆QTL/基因,其中ONAC106以及TAC1为两种方法所共有,bin水平额外还检测到ta9。剑叶叶夹角表型在两种方法分别检测到9个和2个QTLs,新的SNP位点chr07_21605018与bin所检测到的B7_210距离较近,该区间可能含有控制剑叶叶夹角的基因。
  5.我们利用本室构建的bin map,在bin水平对已知QTL GS3、GW5、TAC1、ONAC106和新的候选区间B10_93、B7_247进行多重比较。确定优良等位基因型以及亲本来源,为分子标记辅助选择育种提供技术指导。
[硕士论文] 姜少芸
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:稻瘟病是一种在世界范围广泛发生的水稻病害。目前,培育和选用抗病品种以及品种合理布局是防治稻瘟病最经济有效的方法。由于稻瘟病菌生理小种繁多且极易发生变异,导致现有抗病品种在推广种植3~5年即会丧失抗性。因此,了解不同区域内稻瘟病菌无毒基因组成、明确适用于当地种植水稻品种所含抗瘟基因类型、筛选抗病品种等对水稻抗瘟品种利用和合理布局具有重要意义。
  为明确24个已知抗瘟基因在湖北省的利用价值,在宜昌和恩施地区自然病圃对24个水稻单基因系进行田间抗瘟性鉴定。综合2014~2016年三年鉴定结果,2015年的发病情况普遍高于2014和2016年。在宜昌地区单基因系品种K8、K10、K17、K18和K25对叶瘟和穗瘟的抗性较好,说明其含有的抗瘟基因Pikh、Piz5、Pish、Pi1、Pikm在宜昌地区具有推广价值,而K8和K18在恩施地区的抗性高,表明抗瘟基因Pikh和Pi1在恩施地区具有较好利用价值,含有这些抗瘟基因的水稻品种可在恩施地区布局种植。
  2014~2016年利用24个水稻单基因系对恩施地区300个稻瘟菌单孢菌株的无毒基因型进行鉴定。结果表明,来自恩施地区的稻瘟菌菌株致病力普遍较强,24个无毒基因在三年中均有出现,出现频率最高的组合数目为2个无毒基因的组合,且组合数目越少,致病力越强。其中Avr-Pikm、Avr-Pikh和Avr-Pi1出现频率最高且稳定,含有对应抗瘟基因Pikm、Pikh和Pi1的水稻品种适合在湖北省恩施地区推广应用。
  采用16个稻瘟菌标准鉴别菌株对60个湖北省主栽水稻品种进行抗瘟基因型推导,发现供试水稻品种只有科优21与Pi19的抗感反应型完全相同,确定其只含有这一个抗瘟基因,另外有35个品种能够确定推导出可能含有的抗性基因;通过对接种结果进行聚类分析,将60份水稻品种划分为12类,同一类水稻品种含有相同的一个或多个抗瘟基因。
  2014~2016年在宜昌和恩施地区稻瘟病常发病圃对湖北省主栽水稻品种的田间抗瘟性进行评价。在宜昌地区鉴定湖北省主推水稻品种314份,对叶瘟和穗瘟都表现抗(R)或中抗(MR)的品种有123个,其中C两优华占、D优202、曾抗一号、川抗993和金科优651等18个品种经过了2~3年鉴定,抗性稳定,是最为理想的抗源材料。在恩施地区鉴定水稻主栽品种143份,对叶瘟和穗瘟都表现高抗(HR)、抗病(R)或中抗(MR)的品种有41个,绵5优142、全丰2155、全优5138等22个品种在恩施病圃经2年以上的田间抗性鉴定,抗性较为稳定,可在恩施地区推广种植。
[硕士论文] 龙霏
生物化学及分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:组蛋白修饰、DNA甲基化、组蛋白变体和核小体排布等表观修饰是调控基因表达的重要方式。固着生长的高等植物,在逆境胁迫下,可以通过自身的逆境应答机制感知环境的变化并且做出相应的应激反应,以利于自身在逆境中的生存。表观修饰因子在调控植物逆境胁迫应答中扮演了非常重要的角色。H2A.Z是组蛋白H2A的一种变体,具有自身独特的分子调控机制和功能,在调控植物开花、环境应答、生长发育、免疫应答、有丝分裂、DNA修复以及温度感应等方面均发挥了重要作用。本课题的主要研究内容是围绕组蛋白变体H2A.Z及相关染色质重塑因子PIE1和INO80在水稻适应非生物逆境胁迫中的功能研究而展开的。所获得的主要结果如下:
  1.表达谱的分析发现OsH2A.Z、OsPIE1、OsINO80、OsARP6均为组成型表达基因,它们的表达量受盐、干旱和胁迫激素(ABA、SA、JA)的影响。说明以上H2A.Z及相关的基因可能参与水稻的胁迫反应。
  2.转基因材料染色质重塑因子的编码基因OsPIE1RNAi、H2A.Z的编码基因OsHTA705RNAi、染色质重塑因子的编码基因OsINO80RNAi均表现出抽穗期比野生型晚2-3周;OsPIE1RNAi同时还表现出穗稀疏,而且植株变矮,茎节长度变短,籽粒变长且不饱满等表型,OsPIE1可能参与种子的发育。
  3.通过苗期NaCl胁迫处理,发现OsPIE1RNAi和OsHTA705RNAi比野生型更耐盐,OsINO80RNAi比野生型对盐更敏感,并且适宜的NaCl浓度可以提高OsPIE1RNAi和OsHTA705RNAi的发芽率。
  4.通过用200mmol/LNaCl处理的12d野生型全苗做ChIP-PCR和RT-qPCR检测比较ChIP-seq数据,结果显示经过NaCl处理后,H2A.Z在盐诱导全基因组上的富集减少,并且盐诱导基因受诱导表达。正常状态下,在OsINO80RNAi中的H2A.Z盐诱导基因的富集高于野生型;在OsPIE1RNAi中的H2A.Z在盐诱导基因上的富集低于野生型。当OsINO80表达量被抑制后,NaCl处理过程中H2A.Z并不能被有效地去除,导致盐诱导基因的表达量弱于野生型;说明正常状态下,H2A.Z在盐诱导基因的富集对该基因的表达起到抑制作用;PIE1和INO80在分配H2A.Z上有不同的功能;高盐下,INO80可能通过影响H2A.Z去除来调控基因表达。
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