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[博士论文] 姚贻华
眼科学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:先天性白内障是指在胚胎发育过程中由于多种因素导致的晶状体形态或功能发育异常,具有显著的临床和遗传异质性,临床表现多种多样且致病基因众多,对其进行精准高效的遗传学筛查显得尤为必要。目标区域外显子捕获测序技术能够有效筛查先天性白内障的致病基因,是快速有效地发现遗传性疾病的检测方法。本课题收集了一个先天性白内障大家系的信息和血样,应用目标区域外显子捕获测序筛查白内障致病基因,分析突变位点的生物信息学特征,寻找到位于GJA3基因上一个新的致病突变GJA3/p.T148I。根据目的基因GJA3的野生型和突变型序列,成功构建了表达载体和稳定转染细胞系,最后对GJA3/p.T148I突变进行致病的分子机制研究。该家系中GJA3/p.T148I新致病突变的发现,不仅扩展了GJA3致病位点的图谱和发病机制,也为目标区域外显子捕获测序技术在先天性白内障遗传学诊断中的应用提供了可靠依据。
  第一部分 一个先天性白内障家系致病基因筛查
  目的:先天性白内障的遗传方式多样,并以常染色体显性遗传先天性白内障最为常见。分子遗传学技术的进步加快了白内障致病基因研究的进展,迄今为止共发现了70个与之相关的致病基因或候选位点。本部分的研究拟对一个来自福建厦门地区的常染色体显性遗传先天性白内障家系进行致病基因筛查,明确导致其白内障的致病基因。
  方法:研究对象来自在福建医科大学附属第一医院眼科中心诊治过的一个先天性白内障家系,对所有入组的患者和家系其他成员进行详细的病史采集和临床检查。详尽调查了所有家系成员的健康状况和家庭成员关系,完善了眼科专科体检和全身一般体格检查,详细记录成员的病史和眼部临床表型。根据家系成员病史及体检情况绘制成家系图谱,以此确定其遗传模式和进行遗传学分析。高质量提取入组家系成员的外周血DNA,构建高通量基因组测序文库,对先天性白内障的相关致病基因的外显子及相邻内含子区域进行目标区域外显子捕获与富集,利用IlluminaNext Seq500高通量测序仪对其进行测序并分析结果。
  结果:该家系现存四代成员,共收集到34位家系成员的临床资料,其中有5位先天性白内障患者,29位正常表型的家庭成员,符合常染色体显性遗传先天性白内障的遗传特征。先证者同其它家系成员疾病的表型均为双眼绕核性粉尘状白内障。对该家系的高通量测序结果的数据量和深度均符合进一步生物信息学分析的要求,可用于后续分析基因突变的位点。
  结论:本研究收集了一个来自福建省的先天性白内障家系,晶状体表现为粉尘状绕核性混浊,对该家系先证者和家系成员进行了目标区域外显子捕获测序,其中包含了134个与先天性白内障发病相关的基因,测序结果可用于后续分析疾病的基因突变和致病机制。
  第二部分 致病基因鉴定、生物信息学分析和载体构建
  目的:对家系成员的测序结果进行分析,结合Sanger测序验证其致病突变位点,并以此构建体外真核细胞的表达载体,用于探讨突变致病的分子机制。
  方法:测序结果中筛选出的高质量数据以人类基因组为参考序列,进行突变位点的比对,用BWA和GATK软件找出其中的SNP和InDel突变位点,并与突变数据库比对进行注释。对初步筛查出的候选位点进行Sanger测序验证,应用DNAMAN软件在家系中进行共分离分析。对发现的GJA3/p.T148I突变,进行致病性预测、疏水性评价和蛋白质同源建模等分析。通过DNA克隆和重组的方法,构建含有Cx46/EGFP和Cx46/Flag序列的野生型和突变型表达载体。
  结果:该突变位于GJA3基因第443位碱基,使原有位点上的胞嘧啶C转换为胸腺嘧啶T(c.443,ACC→ATC),在此家系中呈现共分离的状态。GJA3/p.T148I位点的PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster氨基酸改变预测结果均提示该突变有致病性。疏水性评价结果显示:GJA3/p.T148I突变蛋白的CL区域的疏水性较野生型有明显升高。同源建模结果显示:GJA3/p.T148I突变蛋白的C端的α-螺旋结构缺失。构建质粒的模板来源于人类的GJA3序列,在插入EGFP和Flag等序列后,成功构建了pEGFP-N1-Cx46-WT、pEGFP-N1-Cx46-T148I、pEGFP-N1-Cx46-G143R、pSin-Cx46/Flag-WT和pSin-Cx46/Flag-T148I等真核细胞表达载体,用于后续的致病分子机制研究。
  结论:在该家系中发现了先天性白内障新的致病突变位点GJA3/p.T148I,致病性预测、疏水性评价和同源建模等分析结果均提示该突变有致病性。以GJA3野生型序列为模板,成功构建了细胞表达的质粒用以进一步分析该突变致病的分子机制。
  第三部分 GJA3/p.T148I基因突变的分子机制研究
  目的:将成功构建的真核细胞表达载体转染入HLEC和HEK-293细胞内,分析细胞增殖、相关蛋白表达量和缝隙连接通道功能的改变,研究GJA3/p.T148I基因突变的分子机制。
  方法:将pEGFP-N1-Cx46-WT、pEGFP-N1-Cx46-T148I、pSin-Cx46/Flag-WT、pSin-Cx46/Flag-T148I和pEGFP-N1-Cx46-G143R等真核细胞表达载体转染HLEC和HEK-293后,使用倒置荧光显微镜观察目的蛋白在细胞内的定位和Cx46缝隙连接通道的形成。构建HEK-293稳转细胞系,用于检测缝隙连接半通道功能和缝隙连接蛋白的表达量,并使用CCK-8检测细胞增殖活性。H2O2诱导HLEC细胞和HEK-293稳定转染细胞系的氧化损伤,应用AnnexinV-FITC/PI研究细胞凋亡,检测MAPK通路相关蛋白的改变。
  结果:GJA3/p.T148I能影响Cx46蛋白的细胞内定位,使其在胞内异常聚集,并且可以显著增加Cx46蛋白表达,但Cx43的表达量并未受到影响。GJA3/p.T148I可以形成缝隙连接通道,但其减弱了Cx46的缝隙连接半通道功能,且加速了细胞增殖活性。氧化损伤可以诱导HLEC的GJA3基因表达下调,并且GJA3/p.T148I突变不仅能够诱导细胞凋亡和减弱细胞抵抗氧化损伤的能力,而且可以导致MAPK通路在细胞中出现异常表达。
  结论:在基因突变的功能研究中,GJA3/p.T148I突变不仅可以导致Cx46蛋白高表达并异常聚集于胞内,也可以减弱Cx46的通道功能、加速细胞增殖活性、诱导细胞凋亡和减弱细胞抵抗氧化损伤的能力等途径,导致先天性白内障的发生。GJA3/p.T148I新致病突变的发现,不仅扩充了该基因致病位点的突变图谱和发病机制,也进一步证实了缝隙连接通道蛋白功能改变和细胞凋亡参与先天性白内障致病的分子机制。
[硕士论文] 李娟
眼科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨黑豆提取物花青素对大鼠晶状体上皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响。
  方法:
  1.利用H2O2诱导制备大鼠白内障模型,获取氧化后大鼠晶状体上皮细胞。
  2.采用微波辅助法提取黑豆花青素,并选用D101大孔吸附树脂进行纯化。
  3.选取已筛选出的大鼠晶状体上皮细胞,同时设对照组,加入10 ug/ml、20 ug/ml、30 ug/ml、50 ug/ml、80 ug/ml、100 ug/ml、150 ug/ml浓度的黑豆花青素提取物,采用MTT法观察大鼠晶状体上皮细胞的增殖;采用流式细胞仪检测大鼠晶状体上皮细胞的凋亡;采用划痕法检测大鼠晶状体上皮细胞的迁移。
  结果:
  1.在正常的组织培养条件下,大鼠晶状体上皮细胞可以迅速地增殖、生长。
  2.加入10 ug/ml、20 ug/ml、30 ug/ml、50 ug/ml、80 ug/ml、100 ug/ml、150 ug/ml浓度的花青素提取物后大鼠晶状体上皮细胞的增殖出现不同程度的抑制效果,抑制作用与浓度呈正相关性,且随着时间的增加,抑制效果越明显。花青素提取液处理细胞48h后的IC50为98.43ug/ml,数据差异有统计学意义(P<0.05)。
  3.随着花青素作用时间的增加,大鼠晶状体上皮细胞凋亡率逐渐升高,且凋亡率呈时间依赖关系,当黑豆提取物花青素作用6h、12h、24 h、48 h、72h时,正常组的细胞凋亡率分别为5.6±1.3%、13.1±8.2%、25.3±4.7%、34.6±9.4%、41.5±13.4%,花青素处理组的细胞凋亡率分别为12.6±3.4%、26.8±4.6%、64.1±8.4%、85.3±5.7%、92.1±5.2%,其中48h和72h时差异具有统计学意义(P<0.05)。
  4.不同浓度药物对细胞培养皿进行划痕后,LECs迁移能力有所不同。随着花青素组质量浓度升高,划痕面积移行愈合率均明显低于其相邻的低质量浓度组,50 ug/ml和100 ug/ml时差异均有统计学意义(P<0.05)。花青素(100 ug/ml)对大鼠LECs划痕处理后,与初始划痕面积相比较,24h、48h及72h的细胞移行率增加,48h和72h组间总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。花青素组的细胞移行愈合率明显低于正常组,且随着时间推移,细胞移行愈合率与正常组的差异均明显增大,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1、黑豆提取物花青素对大鼠晶状体上皮细胞的增殖、迁移有着明显抑制作用;
  2、黑豆提取物花青素对大鼠晶状体上皮细胞的凋亡有着一定的诱导作用;
  3、黑豆提取物花青素可能对后发性白内障有防治作用。
[硕士论文] 陶蕾
护理 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:了解老年性白内障患者的一般状况、自尊、自我效能及生活质量的现状;分析老年性白内障患者自尊、自我效能以及生活质量在一般人口学特征上的差异;明确老年性白内障患者的自尊、自我效能以及生活质量的相关关系;探讨老年性白内障患者的自尊、自我效能对生活质量的影响。
  方法:采用便利抽样方法,选取吉林医药学院附属医院眼科2017年1月-8月门诊和住院部诊断为老年性白内障的患者作为研究对象。共发放270份调查问卷,收集有效问卷264份,有效回收率为97.8%。主要研究工具包括一般资料调查表、自尊量表、一般自我效能感量表、中文版低视力者生活质量量表。所有数据利用SPSS21.0统计软件进行整理分析。运用均数、标准差、百分比等描述研究对象人口学特征、自尊、自我效能、生活质量的现状;运用t检验、ANOVA检验分析研究对象的自尊、自我效能、生活质量在不同人口学特征上的差异;运用Pearson相关分析,确认研究对象的自尊、自我效能、生活质量的相关性;运用分层逐步回归分析研究对象的自尊、自我效能对生活质量的影响。
  结果:
  (1)研究对象的自尊量表平均得分为(2.68±0.40)。老年性白内障患者自尊处于偏低水平。其中年龄分组、文化程度、月收入、婚姻状况、生活自理情况、长期服药特征上老年性白内障患者的自尊存在差异,此差异具有统计学意义(P<0.05)。其中年龄70岁~79岁、文化程度高、月收入大于3000元、有配偶、生活能够自理的老年人自尊水平较高。
  (2)研究对象的自我效能总量表平均得分为(1.92±0.78)。老年性白内障患者的自我效能处于中等偏低水平,不同的文化程度、退休前职业、月收入、医疗保险、生活自理情况,慢性病的老年性白内障患者自我效能存在差异,此差异具有统计学意义(P<0.01)。其中文化程度高、退休前是干部、月收入3000元以上、有市医保报销、生活能够自理、没有慢性病的老年性白内障患者的自我效能状况相对较高。
  (3)研究对象的生活质量总量表平均得分为(2.16±0.86)。老年性白内障患者的生活质量处于偏低水平,不同的文化程度、退休前职业、月收入、医疗保险、婚姻状况、居住情况照顾情况,慢性病的老年性白内障患者的生活质量存在差异,此差异具有统计学意义(P<0.01)。其中文化程度高、退休前是干部、月收入3000元以上、有市医保报销、有配偶、与老伴及子女同住、生活能够自理、没有慢性病的老年性白内障患者的生活质量得分较高,生活质量较好。
  (4) Pearson相关性分析显示,自尊与自我效能正相关性呈显著差异(r=0.262,P<0.01),自尊与生活质量正相关性呈显著差异(r=0.223,P<0.01),生活质量得分随着自尊的得分增加而增加。自我效能感与生活质量正相关性呈显著差异(r=0.487,P<0.01),生活质量的得分随着自我效能感得分的增加而增加。
  (5)分层逐步回归分析结果显示,生活质量的影响因素有医疗保险、自我效能、婚姻状况、文化程度、慢性病、自尊,有统计学意义(P<0.05)。影响程度大小排序依次为有自我效能(β=0.308)、市医保(β=0.303)、有配偶(β=0.257)、文化程度(β=-0.197)、自尊(β=-0.188)、其他慢性病(β=0.130),它们共同解释老年性白内障患者生活质量总变异的34.6%。
  结论:
  (1)老年性白内障患者自尊水平偏低,自我效能处于中等偏低水平,生活质量总体处于偏低水平。
  (2)老年性白内障患者的自尊水平与年龄、文化程度,月收入、婚姻状况、居住情况、生活自理情况有关;自我效能与文化程度、退休前的职业、月收入、医疗费用支付、生活自理情况、慢性病情况有关;生活质量与文化程度、退休前职业、月收入、医疗费用支付、婚姻状况、居住情况、生活自理情况、慢性病情况有关。
  (3)老年性白内障患者自尊、自我效能与生活质量状况呈显著正相关。
  (4)老年性白内障患者的生活质量的主要影响因素自我效能、有医疗保险、婚姻状况、文化程度、自尊、其他慢性病,其中对生活质量影响最大的是自我效能。
[硕士论文] 陈曦
眼科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:观察调控衰老标记蛋白30(Senescence Marker Protein30,SMP30)含量的改变对人晶状体上皮细胞株(Human Lens Epithelial Cells,HLEC)SRA01/04增殖和凋亡的影响,为白内障病因和预防机制的研究提供新的思路。
  方法:①预感染实验确定SRA01/04细胞是否易于被慢病毒感染及其最佳感染条件:将处于对数生长期的SRA01/04细胞按2×103/孔的密度接种96孔板,待细胞密度增至20%时,用慢病毒GV115-NC(pGcsil-004)在四种培养液(完全培养基、含5μg/ml助感染试剂的完全培养基、感染增强液、含5μg/ml助感染试剂的感染增强液)及三种复感染指数(1、10、100)的培养条件下感染SRA01/04细胞,每组三个样本、所有实验至少重复三次。②SMP30过表达和沉默稳定株构建:确定好感染条件和最佳病毒滴度后,将处于对数生长期的SRA01/04细胞按5×104/孔接种6孔板,待细胞密度增至20%时采用两组RGN(Regucalcin,SMP30)慢病毒LV-RGN(Lentivirus-Regucalcin)和LV-RGN-RNAi(Lentivirus-Regucalcin-RNA interference)以及相应的阴性对照组病毒感染细胞,24h后将感染溶液换成正常完全培养基,感染后72h在荧光显微镜下观察荧光强度。当细胞密度达到90%时,加入2μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)杀死未感染细胞,后续细胞传代培养中维持1μg/ml嘌呤霉素持续筛除未被慢病毒感染的细胞。转染成功后,运用WB(Western Blot,蛋白质印迹)和q-PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,实时定量聚合酶链反应)检测SMP30/RGN过表达和沉默效率,以明确细胞株构建成功。③细胞增殖和凋亡检测:使用细胞计数试剂盒Kit-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)测量细胞活力,运用5-溴脱氧尿苷(BrdU)测定各组细胞增殖;通过PI FACS周期试剂盒测量细胞周期,并运用流式细胞术通过膜联蛋白-ⅤAPC测定细胞凋亡;运用western印迹测定SRA01/04中caspase-3的含量,间接反映细胞凋亡率。
  结果:①通过转染预实验,确定Normal Medium+Polybrene(5μg/ml)(含5μg/ml助感染试剂的完全培养基)和病毒滴度MOI=5为SRA01/04细胞的最佳转染条件。②使用q-PCR和WB技术来确定SMP30过表达(Overexpression,OE)和沉默(Knock Down,KD)SRA01/04细胞系的转染效率,OE组(19.373±1.445)的RGN表达量为NC-OE(Overexpression Negative Control Group)组(1.023±0.253)的19.373倍(t=-21.659,p<0.01),相对于NC-KD(Knock Down Negative Control Group)组(1.003±0.1),KD组(0.039±0.003)的沉默效率为96%(t=16.729,p<0.01)。与相应空载组相比,OE组SMP30蛋白表达量(1.338±0.186)显著增高(t=-9.039,p<0.01),KD组SMP30蛋白表达量(0.137±0.048)下降(t=13.006,p<0.01)。③通过CCK-8测定,与NC-KD(0.398±0.011)相比,KD组(0.355±0.008)细胞活力下降(t=7.466,p<0.01),OE组(0.415±0.01)与NC-OE组(0.402±0.009)相比没有差异(t=-2.189,p>0.05);Brdu增殖实验显示,与NC-OE组(0.682±0.006)相比,OE组(0.857±0.023)的细胞增殖有所增加(t=6.49,p<0.05),KD组(0.664±0.01)和NC-KD组(0.676±0.008)相比没有差异(仁1.61,p>0.05);PI FACS细胞周期测定结果显示,与相应空载组相比,KD组S期细胞减少(t=11.18,p<0.01)、G1期细胞增多(t=-12.97,p<0.01)、G2/M期细胞无明显变化(t=0.288,p>0.05),OE组S期细胞减少(t=12.643,p<0.01)、G1期细胞增多(t=-11.849,p<0.01)、G2/M期细胞增多(t=-12.447,p<0.01);膜联蛋白VAPC信号染色检测显示,与相应空载组比较,KD组细胞凋亡率较高(t=-5.986,p<0.01),OE组细胞凋亡率降低(t=13.181,p<0.05)。通过Western Blot检测发现,与各自对照组相比,OE组caspase-3的表达显著增加,KD组caspase-3的表达明显下降。
  结论:SRA01/04细胞易于被慢病毒感染,最佳感染条件为用病毒滴度等于5的病毒液在含5μg/ml助感染试剂的完全培养基中感染细胞。慢病毒转染SRA01/04细胞的沉默和过表达效率佳,成功构建的稳定株可以用于后续实验。衰老标记蛋白30含量的增加可以促进人晶状体上皮细胞SRA01/04增殖并抑制其凋亡,增加SMP30的表达量或许可以保护HLEC SRA01/04免受凋亡引起的白内障。
[博士论文] 马成霞
眼科学 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:本研究共分为三部分论述:
  第一部分 不同浓度地塞米松对人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响和EphA2的表达变化
  目的:
  观察不同浓度地塞米松作用后,人晶状体上皮细胞(HLE-B3)增殖和凋亡的变化及细胞中EphA2的表达变化。
  方法:
  根据地塞米松浓度的不同,分为以下5组:0mol/L组(空白对照组)、10-7mol/L组、10-6mol/L组、10-5mol/L组和10-4mol/L组。地塞米松作用人晶状体上皮细胞(HLE-B3)48h后,CCK-8试剂盒检测各组细胞的存活率;Tunel检测凋亡指数,流式细胞仪检测凋亡率;Western blot检测EphA2蛋白的表达水平。
  结果:
  1.CCK-8结果显示:0mol/L组(空白对照组)、10-7mol/L组、10-6mol/L、10-5mol/L组和10-4mol/L组细胞存活率分别为(98.24±1.74)%、(108.62±1.32)%、(73.13±3.41)%、(53.36±3.75)%和(44.85±3.18)%。5组的总体比较差异有统计学意义(F=1497.598,P=0.001);5组中任意两组比较,差异亦有统计学意义(P值均为0.001)。与对照组比较,10-7mol/L组细胞存活率明显升高;10-6mol/L组、10-5mol/L组及10-4mol/L组HLE-B3存活率逐渐下降。10-5mol/L组HLE-B3的存活率为(53.36±3.75)%,接近半数致死剂量。
  2.Tunel检测结果:0mol/L组(对照组)、10-7mol/L组、10-6mol/L组、10-5mol/L组和10-4mol/L组HLE-B3凋亡指数分别为(4.9±1.2)%、(4.8±0.8)%、(17.1±3.0)%、(25.3±3.6)%和(28.4±4.1)%。5组的总体比较差异有统计学意义(F=1972.95,P=0.001)。10-7mol/L组的凋亡指数略低于0mol/L组(对照组),但差异无统计学意义(P=0.756);余任意两组比较,差异均有统计学意义(P值均=0.001)。
  3.流式细胞术检测结果:0mol/L组(空白对照组)、10-7mol/L组、10-6mol/L、10-5mol/L组和10-4mol/L组HLE-B3凋亡率分别为(5.9±1.0)%、(5.7±1.5)%、(25.4±4.3)%、(30.8±5.5)%和(33.7±4.7)%。5组的总体比较差异有统计学意义(F=438.99,P=0.001)。10-7mol/L组的凋亡率略低于0mol/L组(对照组),但差异无统计学意义(P=0.916),余任意两组比较,差异均有统计学意义(P值均=0.001)。与Tunel检测结果检测结果一致。
  结论:
  1.地塞米松浓度为10-7mol/L时,可促进晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的增殖;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时,可抑制晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的增殖。
  2.地塞米松浓度为10-7mol/L时,对晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的凋亡无影响;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时,可促进晶状体上皮细胞HLE-B3的凋亡,且呈剂量依赖性。
  3.地塞米松浓度为10-7mol/L时,晶状体上皮细胞HLE-B3中EphA2蛋白的表达上调;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时,晶状体上皮细胞HLE-B3中EphA2蛋白的表达下调。
  第二部分 人EphA2基因慢病毒表达载体构建及体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的实验研究
  目的:
  构建人EphA2基因表达载体,包装慢病毒。探索人EphA2基因慢病毒表达载体体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的最佳MOI值;CCK-8检测载体的细胞毒性;嘌呤霉素筛选转染阳性细胞;Western blot检测筛选细胞及筛选细胞传代后EphA2蛋白的表达水平。
  方法:
  1.慢病毒介导的人EphA2基因表达载体的构建以人cDNA-EphA2为模板,设计含NOTⅠ和XbaⅠ酶切位点的上下游引物,PCR扩增EphA2的CDS区。载体pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP双酶切后和扩增的目的基因EphA2以CE重组酶进行连接。转化感受态细菌后挑选正确的克隆行PCR、酶切及测序鉴定。应用Lipofectamine2000共同转染HEK293T/17细胞,包装慢病毒。72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定滴度。
  2.分别以MOI值0、20、50、100、200转染人晶状体上皮细胞HLE-B3,转染72h后荧光显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测转染效率,探索最佳MOI值。
  结果:
  1.PCR、酶切和测序均证实EphA2慢病毒表达载体序列正确。HEK293T/17细胞包装后获得了病毒储存液,病毒的滴度为2.3×107TU/ml至2.7×107TU/ml。
  2.MOI为0、20、50、100和200时,转染效率分别为0.0%、(38.6±3.9)%、(49.2±4.2)%、(79.5±5.5)%和(80.2±6.0)%,总体比较差异有统计学意义(F=2600.845,P=0.001);MOI=200与MOI=100比较,转染效率无明显提高(P=2.507)。MOI为0、20、50、100时,细胞形态无改变;MOI为200时,部分细胞形态不规则。
  结论:
  1.成功构建人EphA2慢病毒表达载体。
  2.人EphA2慢病毒表达载体转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的最佳MOI值为100,转染效率为(79.5±5.5)%。
  3.外源性EphA2蛋白可在人晶状体上皮细胞HLE-B3中稳定高效表达。
  4.EphA2基因过表达对人晶状体上皮细胞HLE-B3的增殖有促进作用。
  第三部分 EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响
  目的:
  探讨EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响及作用机制。
  方法:
  根据第一部分的实验结果,选择10-5mol/L地塞米松作为实验浓度。实验分为以下四组:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组。CCK-8检测各组细胞的存活率。Tunel检测凋亡指数,流式细胞术检测凋亡率,Western blot检测各组细胞BCL-2、Bax和Caspase-3的表达水平。
  结果:
  1.CCK-8结果显示:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组HLE-B3的存活率分别为(98.18±1.85)%、(122.01±3.89)%、(52.32±1.99)%、和(76.18±3.74)%。组间比较,差异有统计学意义(F=497.557,P=0.001);EphA2过表达细胞组存活率高于正常细胞组,差异有统计学意义(P=0.001);EphA2过表达细胞联合地塞米松组存活率高于正常细胞联合地塞米松组,差异有统计学意义(P=0.001)。
  2.Tunel检测结果:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组的凋亡指数分别为(5.4±1.5)%、(5.0±1.3)%、(23.0±3.9)%、和(14.4±2.7)%。组间比较,差异有统计学意义(F=397.638,P=0.001);EphA2过表达细胞组凋亡指数略低于正常细胞组,但差异无统计学意义(P=0.415);正常细胞联合地塞米松组凋亡指数较正常细胞组高,差异有统计学意义(P=0.026);EphA2过表达细胞联合地塞米松组凋亡指数低于正常细胞联合地塞米松组,差异有统计学意义(P=0.018)。
  3.流式细胞术检测结果:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组的凋亡率分别为(6.4±1.3)%、(6.1±1.5)%、(28.8±3.4)%和(18.5±2.0)%。4组总体比较,差异有统计学意义(F=2194.309,P=0.001);正常细胞组与EphA2过表达细胞组比较,差异无统计学意义(P=0.421);EphA2过表达细胞联合地塞米松组凋亡率高于EphA2过表达细胞组(P=0.001),但低于正常细胞联合地塞米松组(P=0.015)。
  结论:
  1.EphA2基因过表达对正常状态下的人晶状体上皮细胞HLE-B3具有促增殖作用;对地塞米松导致的HLE-B3增殖抑制具有保护作用。
  2.EphA2基因过表达对HLE-B3生理状态下的细胞凋亡无保护作用;对地塞米松导致的HLE-B3的凋亡具有保护作用。
  3.EphA2通过上调BCL-2和阻止Bax和Caspase-3过表达发挥对地塞米松导致的HLE-B3凋亡的保护作用。
[硕士论文] 孟婷
眼科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨散瞳是否会对白内障患者眼前节生物学参数产生影响,进而使人工晶体计算产生偏差,影响术后裸眼视力;动态观察散瞳前后眼前节拥挤程度等解剖变化。
  方法:
  本研究为前瞻性观察性研究,选取在我院住院欲行白内障手术的患者,术前进行全身和双眼局部检查,测量散瞳前后眼前节生物学参数,计算人工晶体度数。所有测量均由同一经验丰富的操作者完成,使用美多丽(复方托吡卡胺滴眼液,日本参天)对患者进行散瞳,瞳孔大于6mm时,应用A超分别采集散瞳前后眼轴长度(Axial length,AL)、晶体厚度(lens thickness,LT)、前房深度(anterior chamber depth,ACD),并计算人工晶体度数,前房拥挤率CCR(LT/ACD)、晶状体位置LP(ACD+1/2LT)、晶状体厚度眼轴长度系数等,散瞳前后测量结果的差异性分别做配对t检验或配对秩和检验。
  结果:
  散瞳前ACD的值为:2.71±0.49,散瞳后ACD的值为:2.93(2.69,3.16),t=12.5,P<0.01,差异有统计学意义;散瞳前AL的值为:23.27±0.94,散瞳后AL的值为:23.14±0.90,t=3.9558,p<0.01,差异有统计学意义;散瞳前LT的值为:4.82±0.59,散瞳后LT的值为:4.36(3.89,4.69);对散瞳前后LT的比较采用秩和检验,t=40.5,P<0.01,差异有统计学意义;散瞳前ACD/AL的值为:0.12(0.11,0.12),散瞳后ACD/AL的值为:0.13(0.12,0.14),对散瞳前后ACD/AL差异的比较采用秩和检验,t=0,P<0.01,差异有统计学意义。散瞳前LT/AL的值为:0.21±0.03,散瞳后LT/AL的值为:0.18±0.04,对散瞳前后LT/AL差异的比较采用两配对样本t检验,t=4.1079,p=0.0003,差异有统计学意义;散瞳前LT/ACD的值为:1.81(1.55,2.04),散瞳后LT/ACD的值为:1.44±0.41,对散瞳前后LT/ACD的比较采用秩和检验,t=16,P<0.01,差异有统计学意义;散瞳前目标晶体度数为:19.27±2.28D,散瞳后目标晶体度数为:20.23±2.25D,对散瞳前后目标人工晶体度数的比较采用配对样本t检验,t=4.6009,p=0.0001,差异有统计学意义。
  结论:
  1、应用睫状肌麻痹剂后,白内障患者前房深度加深、晶状体厚度变薄、眼轴变短、ACD/AL变大、LT/AL减小、LT/ACD减小。
  2、白内障患者散瞳后计算的人工晶体度数较散瞳前增加,提示测量生物学参数、计算人工晶体度数应在未散瞳情况下进行。
  3、白内障患者散瞳后可全面观察晶状体情况,提示以动态变化的角度观察白内障患者眼前节拥挤程度,排除术前可能存在的晶体不全脱位、悬韧带松弛等疾病,制定详尽的手术计划,避免出现不必要的并发症。
  4、散瞳后眼前节多个生物学参数发生改变,提示年龄相关性白内障患者仍存在残余调节力。
[博士论文] 马芳芹
临床医学(眼科学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:儿童白内障是一种严重的致盲性眼病,是导致儿童盲的主要病因之一,被全球“视觉2020”行动列为需重点关注的疾病。在儿童视力发育的关键期内,混浊的晶状体遮挡视轴使视网膜无法得到足够的形觉刺激,从而影响视力的正常发育。因此,早期发现和早期手术致密性是儿童白内障治疗的关键,也是防止儿童严重视力损伤、改善患儿预后的重要措施。手术治疗的目标是恢复并保持眼球视轴区的透明性,以保证外界物体可以在视网膜上清晰地聚焦成像。婴儿出生后6-12周是视力发育的关键期,在此时期内手术对于白内障患儿的视力恢复至关重要。但是,由于儿童眼球的解剖结构较为特殊,其眼球较小、角巩膜硬度低,且角膜相对扁平,术后容易产生眼内炎症反应、后发性白内障等一系列近期和远期并发症;同时儿童白内障术后的屈光不正、斜视、眼球震颤等情况也较为常见,对视力的恢复均有不同程度的影响,因此儿童白内障术后并发症的处理以及弱视、斜视的治疗也至关重要。目前在很多国家和地区,由于儿童白内障的发现和诊断相对较晚;部分地区由于医疗条件落后、患儿长期随访的依从性较差等原因,导致白内障患儿术后的视力恢复程度仍不理想。为了解儿童白内障的治疗和视力恢复状况,我们对2007年1月至2012年12月在山东大学附属省立医院眼科中心手术治疗的致密性白内障儿童的视力和术后并发症情况进行了随访观察,报告如下。
  目的:评估致密性儿童白内障术后的视力恢复情况及其相关影响因素。
  方法:前瞻性研究。研究对象为2007年1月至2012年12月在山东大学附属省立医院眼科中心接受手术治疗的致密性白内障儿童。纳入标准为:(1)晶状体完全混浊、或在自然瞳孔下且覆盖整个视轴区的混浊包括核性、前极性、后极性单眼或双眼白内障。(2)行超声乳化白内障吸出术,根据手术年龄同时行前部玻璃体切除术,或人工晶体植入术。(3)无晶体眼患儿白内障摘除术后早期戴镜进行屈光矫正。(4)术后积极遮盖健眼。(5)术后随访至少2年。门诊就诊时查视力、眼压、裂隙灯、眼底、A超、B超。不能配合检查的婴幼儿口服10%的水合氯醛辅助镇静后行检查。致密性儿童白内障一旦确诊即全麻下行手术治疗。6岁以上的患儿可仅行白内障联合IOL植入术,6岁以下的患儿同时行后囊环形撕囊和前部玻璃体切除术。双眼白内障患儿2岁以上手术时可同时行IOL植入术,单眼白内障患儿1岁以上即可同时行IOL植入术。术后给予抗生素、糖皮质激素滴眼液及散瞳剂点眼,并积极进行屈光矫正、弱视治疗,定期随访。记录患儿术前、术后的各项相关指标如性别、手术眼别、手术年龄、术后屈光矫正情况、术后并发症、斜视、眼球震颤、随访时间和最佳矫正视力。分析比较不同手术年龄组之间的最佳矫正视力的差别;分析比较同一年龄组单、双眼间的最佳矫正视力的差别;分析比较三种屈光矫正方式之间的最佳矫正视力的差别;分析影响最佳矫正视力的风险因素。利用SPSS18.0软件来进行数据的处理。所应用的统计学方法包括统计性描述、T检验、卡方检验、非参分析及有序回归分析。
  结果:符合受试条件的致密性白内障患儿共105例(181只眼),其中双眼白内障忠儿76例,单眼白内障患儿29例。平均随访年龄为46.77个月(范围24~96个月)。105例(181眼)中有90例(158眼)能够客观的采集到术后最佳矫正视力。其中4.43%(7/158)的患眼术后最佳矫正视力能够达到或者高于0.1LogMAR;15.19%(24/158)的患眼术后最佳矫正视力介于0.3LogMAR~0.1LogMAR之间;18.99%(30/158)的患眼术后最佳矫正视力介于0.5logMAR~0.3logMAR之间;46.84%(74/158)的患眼术后最佳矫正视力介于1logMAR~0.5logMAR;14.55%的患眼术后最佳矫正视力低于1logMAR。出生后3个月内行白内障切除术的患儿最佳矫正视力明显高于出生后3~12个月内行白内障切除术的患儿(P=0.001)。在同一手术年龄组内,单、双眼患儿之间的术后最佳矫正视力差别无统计学意义(P>0.05)。一期IOL植入的患儿最佳矫正视力明显优于二期IOL植入及无晶体眼患儿,二期IOL植入忠儿的最佳矫正视力优于无晶体忠儿。晚于3月龄行白内障摘除术、发生术后并发症、眼球震颤和斜视都是影响致密性白内障患儿视力预后的潜在危险因素。
  结论:出生后3个月内行白内障摘除术、早期行IOL植入、及时处理术后并发症、术后早期进行屈光矫正并积极进行遮盖治疗有助于提高致密性儿童白内障患儿术后的视力。
[博士论文] 王华君
眼科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:本研究共分为三部分:
  第一部分 Smac与内质网应激相关蛋白在白内障及正常人晶状体上皮细胞内表达的差异
  目的:
  观察白内障患者晶状体前囊片和正常的透明晶状体前囊片Smac及ERS相关标志蛋白和下游蛋白的表达差异。
  方法:
  白内障晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月来我院眼科中心行Phaco+IOL植入术的单纯老年性白内障患者33例(50眼),手术均由同一位手术经验丰富的教授完成。30例透明晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月于我院及外院行角膜移植捐献者。免疫组化半定量分级检测两组间Smac、Cyt-c、JNK、Caspase-9、GRP78、GRP94、Caspase-12、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4表达差异。
  结果:
  免疫组化结果显示:正常人晶状体上皮细胞除Cyt-c、GRP94表达为强阳性至阳性;Caspase-9、Caspase-12表达为弱阳性之外,余蛋白完全没有阳性着色,均不表达。白内障患者晶状体上皮细胞中,Smac、JNK、GRP78、CHOP、ATF4、Cyt-c、GRP94表达从阳性至强阳性不等,Caspase-9、Caspase-12表达为阳性,XBP1、GADD34表达从弱阳性至阳性不等。对比后可以发现,Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4这几种蛋白在白内障患者LECs中表达,在正常入LECs中不表达,这一结果表明Smac及ERS相关蛋白的表达与白内障的发生和发展具有相关性。
  结论:
  1.Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4在白内障患者LECs中表达,在正常入LECs中不表达。
  2.Caspase-12与Caspase-9在白内障患者LECs细胞浆内高表达,在正常人LECs细胞浆内仅少量表达。
  3.Smac及JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4、Caspase-12、Caspase-9的表达与白内障的发生和发展具有相关性。
  第二部分 Smac基因过表达及干扰慢病毒载体构建及体外转染HLE-B3的实验研究
  目的:
  构建Smac基因过表达及下调表达载体,进行慢病毒包装,体外转染HLE-B3进行表达,观察Smac的过表达及下调对HLE-B3增殖的影响,根据Smac表达情况及细胞增殖情况,筛选出稳定表达的Smac基因过表达及下调表达细胞系。
  CCK-8检测载体的细胞毒性;Western blot检测转染后各组中及传代后细胞中Smac及ERS相关蛋白的表达水平。嘌呤霉素筛选转染阳性细胞。
  方法:
  1.慢病毒介导的Smac基因过表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含NheⅠ和NotⅠ酶切位点的上下游引物, PCR扩增。载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。
  2.慢病毒介导的Smac基因干扰表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含Age1和EcoR1酶切位点的上下游引物,PCR扩增。载体pLenti-hU6-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。
  3.配制浓度分别为2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.0μg/ml和10.0μg/ml的嘌呤霉素筛选转染细胞。
  结果:
  1.经酶切和测序鉴定Smac慢病毒表达载体序列正确。HEK293TF细胞包装后获得了病毒储存液,GTP-SMAC过表达载体病毒的滴度为4×108TU/ml:PM7.1-SMAC-sh1、PM7.1-SMAC-sh2、PM7.1-SMAC-sh3病毒的滴度分别为3×108TU/ml、2×108TU/ml、2×108TU/ml。
  2.筛选2天后,8μg/ml嘌呤霉素组未转染成功的细胞刚好全部死亡,为最佳筛选浓度。
  结论:
  1.成功构建Smac过表达和干扰慢病毒表达载体。
  2.慢病毒转染对HLE-B3无细胞毒性。
  第三部分 Smac基因过表达及干扰对HLE-B3内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响及作用机制
  目的:
  以稳定的Smac过表达及下调晶状体上皮细胞系为模型,筛选合适的H2O2浓度构建氧化应激模型,探讨Smac基因过表达及干扰对HLE-B3增殖、内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响,并根据相关蛋白表达的差异,利用免疫共沉淀及质谱分析,寻找其中可能存在的桥梁蛋白及其可能的作用途径和作用机制。
  方法:
  1.加入H2O2后以CCK-8检测各组细胞的存活率,根据实验结果,选择200μM的H2O2作为实验浓度。
  2.细胞根据处理因素的不同分为两个大组:第一大组为无H2O2处理组,分为:空白对照细胞组HLE-B3、Smac过表达空载质粒组GTP、Smac过表达细胞组GTP-SMAC、Smac干扰空载质粒组PM7.1、Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组;第二大组为H2O2处理组,分为:H2O2处理空白对照细胞组HLE-B3、H2O2处理Smac过表达空载质粒组GTP、H2O2处理Smac过表达细胞组GTP-SMAC、H2O2处理Smac干扰空载质粒组PM7.1、H2O2处理Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组。
  结果:
  1.MTT结果显示:不同浓度的H2O2对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,呈剂量依赖关系,半数抑制浓度(IC50)为270μM,高浓度(1000pM)H2O2处理24h时见细胞几乎全部死亡,不同浓度的H2O2对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系。由于外源H2O2改变了细胞原有的大小和形态,且本实验同时对Smac进行过表达和下调,因此将浓度为200μM的H2O2作为推荐剂量构建体外氧化损伤模型。
  2.CCK-8结果显示:无H2O2作用时,HLE-B3组、GTP组、GTP-SMAC组、PM7.1组、PM7.1-SMAC-sh3组的存活率分别为(99.56±5.12)%、(98.61±4.22)%、(93.96±2.75)%、(97.86±3.97)%、(104.56±5.12)%,统计学结果与第二部分相同;加入200μM的H2O2后,5组存活率分别为(59.339±4.895)%、(63.943±5.125)%、(39.960±3.683)%、(61.193±33.065)%、(90.560±3.574)%。组间比较,差异有统计学意义(F=57.06,P<0.001);200μM H2O2+GTP-SMAC组细胞存活率低于正常细胞组,差异有统计学意义(P=0.001);200μM H2O2+PM7.1-SMAC-sh3组细胞存活率高于正常细胞组和GTP-SMAC组,差异均有统计学意义(P=0.001);200μMH2O2+HLE-B3组、200μM H2O2+GTP组、200μM H2O2+PM7.1组之间比较无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  1.Smac过表达或下调,对正常状态下的HLE-B3增殖率无影响;Smac过表达会加剧氧化应激下的HLE-B3凋亡,Smac下调对氧化应激下的HLE-B3凋亡起保护作用。
  2.正常状态下的HLE-B3,Smac过表达后能通过上调内质网应激相关蛋白的表达,加剧内质网应激,加重HLE-B3凋亡;而Smac下调后能够抑制内质网应激相关蛋白,对细胞的氧化损伤具有一定的保护作用,减少HLE-B3的凋亡。
  3.HLE-B3氧化损伤后,Smac过表达能通过上调内质网应激途径的效应蛋白来加剧内质网介导的细胞凋亡;Smac下调能通过下调内质网应激途径的凋亡相关蛋白,来抑制内质网途径介导的细胞凋亡。
  4.PDE1C、IGFBP5可能是Smac与ERS间的桥梁蛋白。
[博士论文] 代杰
无机化学 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:半乳糖性白内障与糖尿病性白内障合称为“糖性白内障”。半乳糖性白内障大鼠作为一种实验性动物模型,常用于糖性白内障发病机理的研究以及抗白内障药物的筛选。大量研究发现半乳糖性白内障的发生发展与晶状体上皮细胞的凋亡及晶状体的氧化损伤有着密切联系。适量补硒可以提高机体的抗氧化能力,硒蛋白 R(SelR)作为蛋氨酸亚砜还原酶家族中唯一的硒蛋白,其保护细胞抵抗氧化损伤的生物学功能已见报道。但是,SelR和一些常用的硒补充剂如 ebselen(依布硒啉),在抑制半乳糖性白内障的发生发展上所起到的保护作用及其潜在的作用机制依然鲜为人知。
  本文以人晶状体上皮(hLE)细胞 SRA01/04和半乳糖诱导的白内障大鼠为研究对象,采用基因沉默技术探讨了 SelR在保护 hLE细胞抵抗氧化损伤和细胞凋亡上所起的作用,并调查了 Na2SeO3和 ebselen对半乳糖性大鼠的晶状体中氧化应激的调控和对 SelR蛋白表达的影响,以及对半乳糖大鼠肝、肾、脑中氧化还原平衡的影响。主要研究结果如下:
  (1)采用蛋白质印迹、流式细胞术和荧光显微镜等方法研究了 SelR基因沉默对半乳糖诱发的hLE细胞凋亡的影响,调查了细胞内的氧化应激水平,并对线粒体膜电位、细胞色素 c向胞质的释放以及 caspase-3酶活的变化进行了分析。结果显示,半乳糖和 SelR沉默均可诱导 hLE细胞产生氧化应激。当半乳糖作用于 SelR基因沉默细胞时,葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的蛋白表达水平显著升高,线粒体膜电位明显降低,并伴随着线粒体细胞色素 c向胞质的释放;与此同时,细胞凋亡率和 caspase-3酶活也明显升高。这些结果表明,SelR可保护细胞和线粒体抵抗半乳糖诱导的氧化应激、内质网应激和细胞凋亡,暗示了硒作为微量元素在保护 hLE细胞中可能发挥着重要作用。
  (2)为了探索 Na2SeO3和 ebselen在预防和减缓糖性白内障的形成和发展上所起的作用,我们在透射电镜(TEM)下对半乳糖模型大鼠的晶状体纤维细胞(LFC)和晶状体上皮细胞(LEC)进行形态观察,并调查了大鼠晶状体中的氧化应激水平以及一些蛋白质的表达水平,如 SelR、15 kDa硒蛋白(Sep15)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、过氧化氢酶(CAT)、β-晶状体蛋白,醛糖还原酶(AR)和 GRP78。结果表明,过量的半乳糖注射使大鼠的晶状体细胞形态受到损伤并导致白内障的形成,然而,Na2SeO3和 ebselen的补充能明显缓解 LFC和 LEC超微结构的损伤。此外, Na2SeO3和 ebselen的补充可以明显减轻大鼠晶状体内的氧化损伤,并增加 SelR、Sep15、SOD1、CAT和β-晶状体蛋白的表达以及减少 AR和 GRP78的蛋白质表达。这些研究结果首次揭示了 Na2SeO3和 ebselen在半乳糖模型大鼠中的抗白内障潜力,并为 Na2SeO3和 ebselen在糖性白内障中所起的作用及作用机制提供重要的新见解。
  (3)在给大鼠腹腔注射10 g/kg BW半乳糖30天后成功得到半乳糖性白内障大鼠模型;在给大鼠腹腔注射半乳糖的同时分别注射1 mg/kg BW Na2SeO3和3 mg/kg BW ebselen,30天后取其肝、肾、脑用于后续研究。采用试剂盒测定了半乳糖性白内障模型大鼠中肝、肾、脑中 GPx的活性及 MDA、TSH、PC含量的变化。结果显示模型大鼠的肝和肾中 GPx活性和 TSH含量显著降低,MDA和 PC水平大幅度提高,说明大鼠的肝和肾中均发生了严重的氧化损伤;但 Na2SeO3和 ebselen的补充则使 GPx活性和 TSH水平升高,MDA和PC水平降低,说明 Na2SeO3和ebselen能在一定程度上保护肝脏和肾脏抵抗半乳糖诱导的氧化应激;而大鼠的脑组织中 GPx活性及 MDA、PC、TSH含量无明显变化。
[博士论文] 刘超
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLE B-3,观察TGF-β2对晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响。
  2、观察不同浓度的NF-κB p65ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect对晶状体上皮细胞的影响。
  3、通过应用NF-κB p65ASODN在体外转染人晶状体上皮细胞,检测其对由TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响,研究NF-κB p65ASODN在体外对晶状体上皮细胞的影响。
  4、采用眼前房内注射法转移NF-κB p65ASODN至新西兰大白兔后发性白内障模型眼内,观察其对后发性白内障的作用,探讨后发性白内障的基因治疗方法。
  方法:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLE B-3,用不同浓度的TGF-β2处理后,在不同的时间点用细胞划痕法观察细胞的移行能力,ELISA法处理细胞爬片后,检测细胞爬片中的阳性细胞数和吸光度值,检测α-SMA蛋白的变化。
  2、将NF-κB p65ASODN行全程硫代磷酸化修饰,不同浓度的NF-κB p65ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect两两混合,探讨细胞活性不受明显影响的情况下,最佳的转染效率时所需的NF-κB p65ASODN的浓度和转染剂的剂量。
  3、细胞同步培养后分五组:(1)空白对照组(单纯FSM培养),(2)阴性对照组(HiPerFect转染试加入到FSM中共同培养),(3)TGF-β2组(T组)(10ng/ml TGF-β2),(4)TGF-β2加ASODN组(T+A组)(TGF-β2、HiPerFect转染试和ASODN加入到FSM中共同培养),(5)TGF-β2加MSODN组(T+M组)(TGF-β2、HiPerFect转染试和MSODN加入到FSM中共同培养)。不同组细胞继续培养,6h、12h、24h、48h四个不同时间点收集上清液检测α-SMA的含量,采用RT-PCR检测细胞NF-κB mRNA的表达情况。
  4、将16只新西兰大白兔进行晶状体囊外摘除术制作后发障活体眼动物模型,手术后随即分为四组,每组4只。A组:空白对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射BSS液100ul;B组:阴性对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul;C组:ASODN一次注射组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul;D组:ASODN两次注射组4只白兔8眼:术毕和术后第2天分别经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul。术后第7、14、21、28天用超声角膜测厚仪测量中央角膜厚度,用裂隙灯显微镜观察前房炎症反应和后囊膜的混浊情况,并于实验结束时行HE染色观察后囊膜的病理变化、检测α-SMA的表达和进行RT-PCR检测晶状体上皮细胞中NF-κB p65mRNA的表达。
  结果:1、TGF-β2是晶状体上皮细胞重要的促移行和转分化生长因子,其作用呈现明显的浓度和时间依赖性。不同浓度的TGF-β2作用48h后,移行距离随着TGF-β2浓度的增加而增加,当浓度为10ng/ml时作用最强;晶状体上皮细胞在10ng/ml TGF-β2作用下,其移行距离随着作用时间的延长而增加,在48h达到高峰。晶状体上皮细胞在TGF-β2作用下由单层立方形变为长梭形,伸出伪足,逐渐呈现纤维细胞样形态。不同浓度的TGF-β2作用48h后,细胞爬片中α-SMA的阳性细胞数和吸光度值随着TGF-β2浓度的增加而增加,当浓度为10ng/ml时数值最大;晶状体上皮细胞在10ng/ml TGF-β2作用下,细胞爬片中α-SMA的阳性细胞数和吸光度值随着作用时间的延长而增加,在48h达到最大值。
  2、NF-κB p65ASODN对HLE B-3细胞的导入率随时间的延长而增加,48h导入率可达60%以上,并且细胞的活性不受影响;随着浓度增加,NF-κB p65ASODN对HLE B-3细胞的导入率增加,10μg/ml的转染率最高,再增加浓度转染率增加不明显,对细胞活性影响不明显;当剂量≤3ul时,随着转染剂HiPerFect的增加,对细胞的转染率增加,无明显细胞毒性,当剂量增加为4u时,对细胞的转染率增加不明显,并且表现出细胞毒性。HiPerFect的剂量为3ul,ASODN的浓度为10nmol/L对细胞存活率影响小(80.4%),同时细胞的转染率可高达70.8%,为最理想转染条件。
  3、在6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T+A组上清液α-SMA的浓度增加不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与T+A组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);T组与T+M组上清液α-SMA的浓度之间的差异不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。NF-κB p65mRNA出现在364bp处。6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与阴性对照组相比,T+A组NF-κB p65mRNA的含量增加不明显,差异无统计学意义(P>0.05);与T+A组相比,T组、T+M组NF-κB p65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);T组与T+M组NF-κB p65mRNA的含量之间的差异不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。
  4、眼前节炎症反应均在一周内消失,组间无统计学差异。术后1周左右,A、B组开始出现后囊膜混浊,随时间延长而逐渐加重,C、D组后囊混浊发生时间均迟于A、B组,混浊程度也较A、B组为轻,差异有显著统计学意义(P<0.05)。C、D组之间差异无统计学意义。HE染色后观察到A、B组后囊表面可见多层成纤维细胞生长,细胞排列较为紧密,囊袋周边部皮质增生,同时可见明显纤维素样物质沉积,C、D组后囊表面相对干净,仅有少量细胞增殖,细胞排列较为疏松。A、B组后囊膜α-SMA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。RT-PCR分析结果发现A、B组NF-κB p65mRNA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。
  结论:1、TGF-β2可促进晶状体上皮细胞的移行,同时反应细胞间质转分化的α-SMA蛋白的表达增加,应用TGF-β2刺激体外培养的晶状体上皮细胞可成功建立后发障的细胞模型。
  2、HiPerFect的剂量为3ul,ASODN的浓度为10nmol/L对细胞存活率影响小(80.4%),同时细胞的转染率可高达70.8%,为最理想转染条件。
  3、NF-κB p65ASODN可特异性阻断NF-κB p65mRNA的表达,抑制TGF-β2诱导的α-SMA的表达和晶状体上皮细胞出现移行和间质转分化。
  4、采用眼前房内注射法转移NF-κB p65ASODN可抑制新西兰大白兔后发性白内障模型眼内后囊膜上α-SMA的表达和NF-κB p65mRNA的表达,抑制后囊膜的混浊,并且不增加炎症反应和对角膜的影响。
[硕士论文] 龚元元
眼科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过分析享受政府“百万贫困白内障患者复明工程”资助的贫困白内障患者手术效果及其相关影响因素,为提高适宜有效、方便可及、费用低廉、可持续的贫困白内障手术效率提供依据。
  方法:
  运用回顾性分析方法,采用内容包括:基本信息、术前视力、白内障类型、核硬度、相关全身疾病、眼部其他疾病、视力差(年)、术中并发症、手术方式、术后早期并发症、术后3d视力、费用等信息的白内障临床效果调查表,随机抽取2012年4月至2012年2月在山西省眼科医院受“百万贫困白内障复明工程”资助行白内障手术治疗的贫困组205例205眼、非贫困组226例226眼进行术后效果、成本/效果的比较分析。所收集数据经过复核无误后,采用多重回归模型进行术后视力影响因素分析。手术医师、护理标准无区别,所有信息采集及信息录入由同一位具有一定专业知识人员完成。
  结果:
  1.贫困组和非贫困组术前术后视力比较:⑴贫困组与非贫困组术前视力比较差异有统计学意义(P<0.001),贫困组术前视力平均值低于非贫困组;⑵贫困组与非贫困组术后3d视力比较差异有统计学意义(P<0.001),且两组较术前视力提高程度之间差异有统计学意义(P<0.001),非贫困组较贫困组视力提高更为明显,手术效果好;⑶贫困组与非贫困组术前视力与术后3d视力比较差异均具有统计学意义(P<0.001),两组患者手术后视力均明显提高;⑷贫困组术后脱盲率为94.1%,脱残率为76.6%;非贫困组术后脱盲率为98.7%,脱残率为89.4%,达到国家扶贫白内障手术相关标准要求。
  2.贫困组与非贫困组术中术后并发症比较:⑴贫困组术中并发症有后囊膜破裂、玻璃体丢失、晶状体核沉入玻璃体1例及悬韧带断裂1例,非贫困组未见术中并发症发生,两组术中并发症发生率无明显差异(P>0.05);⑵贫困组术后38例有角膜水肿、2例有高眼压表现,非贫困组术后角膜水肿9例、黄斑水肿2例,两组术后并发症发生率差异具有统计学意义(P<0.001),贫困组术后早期并发症发生率高于非贫困组。
  3.贫困组与非贫困组术后视力影响因素分析:⑴贫困组术后3d视力影响因素有视力差(年)、白内障分类、核硬度及眼部其他疾病(P<0.05),而年龄、性别对术后视力无明显影响(P>0.05);⑵非贫困组术后3d视力主要影响因素有白内障分类及眼部其他疾病(P<0.05),年龄、性别及核硬度对术后视力无明显影响;⑶综合组术后3d视力影响因素主要有白内障分类、核硬度及眼部其他疾病(P<0.05),年龄、性别对术后视力无明显影响。
  4.贫困组与非贫困组多重回归模型对术后视力影响因素进行分析:⑴眼部其他疾病、核硬度是贫困组术后视力的影响因素,回归方程为Y=3.817-0.384X1+0.159 X2;⑵眼部其他疾病是非贫困组术后视力的影响因素,回归方程为 Y=2.793+0.15 X。
  5.贫困组手术成本及成本/效果分析:⑴贫困组患者总费用为(2098.707±353.478)元,非贫困组(5077.190±1753.448)元,差异具有统计学意义(P<0.001);⑵贫困组治愈的成本/效果为3284.362元,低于非贫困组治愈成本/效果6154.170元;⑶贫困组白内障患者手术脱盲的成本/效果为2220.854元,低于非贫困组白内障患者手术成本/效果5144.063元;⑷贫困组白内障患者手术脱残的成本/效果为2739.826元,低于非贫困白内障患者脱残手术成本/效果5679.183元。
  结论:
  1.白内障分类、眼部其他疾病、核硬度是贫困组影响术后视力的主要因素;2.贫困组手术费用低于非贫困组,且贫困组手术成本/效果较非贫困组低。3.贫困组术后视力较术前视力明显提高,效果确切。脱盲率为94.1%,脱残率为76.6%,达到国家相关对贫困患者复明手术的相关要求,“百万贫困白内障患者复明工程”是费用低廉、效果确切的白内障扶贫复明策略之一。
[硕士论文] 章佳
计算机科学与技术 西安电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:小儿白内障是一种严重影响儿童视觉发育的眼部疾病,它是当今导致儿童失明的主要原因之一,对患者的健康和生活构成了极大的威胁。随着裂隙灯图像技术逐渐应用到眼部疾病诊断中,以及近年来机器学习和人工智能领域的大规模兴起,以图像识别为关键技术的计算机辅助诊断成为了一种新型的小儿白内障医疗模式。此外,经历晶状体摘除和人工晶状体植入手术后,很大一部分小儿白内障患者在一年内会出现术后并发症症状,妨碍了患者的术后恢复和视觉再发育,甚至可能二次致盲,但引起小儿白内障术后并发症的因素还暂时未得到定论。然而,由于白内障的多发群体仍以老年居多,且目前关于小儿白内障的样本病历数据保存不多,相关研究还暂时处于起步阶段。
  本文采用中山大学眼科中心收集的小儿白内障红反图像数据和术后并发症结构化病历数据对疾病诊断问题进行研究。基于样本的术前红反图像,文章通过将颜色矩及灰度共生纹理、小波变换、局部二值模式、词袋模型等视觉特征提取手段与分类学习算法SVM、k近邻、LDA相互结合,构建出多个小儿白内障分级预测模型,并将深度学习算法DBN也加入到实验对比中,最终使用9种不同的方法对小儿白内障的三个分级标准(面积大或小、密集程度稠密或稀薄和分布位置是否覆盖中央)进行学习和预测。通过仿真实验,本文将不同特征抽取方法的分类性能和时间性能进行了比较,并针对红反图像诊断问题,评估了使用传统机器学习算法和深度学习算法进行分类的优劣,最后还对9种方法的参数敏感性进行了较为详尽地分析。另外,本文还以小儿白内障术后并发症的结构化病历数据为依据,分别采用朴素贝叶斯和随机森林分类模型对患者的两种术后并发症(后发障和高眼压)进行预测,并通过SMOTE过采样方法对样本进行平衡处理。
  本文研究工作的前期成果已发表在Nature Biomedical Engineering中,并被IEEE Spectrum报道。在本文的红反图像分级诊断研究中,使用BOW模型进行图像特征提取并以SVM作为分类器的组合方法在小儿白内障的三个分级预测问题中均得到了高达95%以上的准确率,而且误诊和漏诊的情况较少。因此,经方法比对后本文提供的最优小儿白内障分级预测模型具有较高的识别率和可靠性,可以作为一种自动化诊断工具辅助医生完成初步的病情判断。此外,在术后并发症的预测研究中,经过样本均衡化处理,朴素贝叶斯和随机森林两种分类模型对三个并发症问题的预测结果基本均达到了80%以上的准确率。
[硕士论文] 安莹莹
计算机科学与技术 西安电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:小儿白内障是一种典型的小儿眼科病,已成为影响小儿视力发育最常见的眼科疾病之一。小儿白内障大多发生于患者出生前后和婴幼儿时期,若不及时接受治疗,将会给患者带来不可逆转的眼睛损伤,严重者可导致失明。由于婴幼儿的眼睛尚处于发育阶段,小儿白内障的临床个体差异较大,导致患者在手术后需要长期定时到医院进行复查。小儿白内障的这些特点不仅会造成医疗资源紧张,而且给患者的家庭带来了沉重的医疗负担。随着机器学习领域的不断发展,计算机医疗已经成为辅助医生进行医疗诊断的重要手段,这为改善小儿白内障的医疗现状提供了一个新的研究方向。裂隙灯图像可以直观反映晶状体中白内障的形态,在小儿白内障的诊断中起着关键的作用,同时也为计算机辅助诊断小儿白内障提供了丰富的数据资源,使得将计算机技术应用于小儿白内障的诊断成为可能。
  本文的研究包含了小儿白内障术前裂隙图像的分级和术后红反时间序列图像的预测两个部分。在裂隙图像分级中,本文首先通过Canny边缘检测和霍夫变换检测圆的方法对小儿白内障术前裂隙图像进行晶状体定位和识别,去除图像噪声。接着根据眼科医生制定的裂隙图像分级标准,训练了三个不同的CNN(Convolutional Neural Network)模型,分别从白内障的面积、密度和位置三个角度对小儿白内障裂隙图像进行严重程度的分级。此外,本文以裂隙图像在面积角度的分级为例,重点探讨了CNN网络中不同的参数和网络结构对裂隙图像分级性能的影响,进而对网络进行优化。最后,本文将CNN与对比实验的裂隙图像分级结果进行了对比验证。在红反时间序列图像预测中,本文使用了LSTM(Long Short-Term MemoryNetwork)深度学习模型来预测小儿白内障患者是否需要再次接受手术治疗,探究小儿白内障手术后复发情况的动态规律。
  在小儿白内障裂隙图像的分级中,CNN分类器在白内障的面积、密度和位置三个角度的分级准确率分别达到了92.77%、89.55%和76.63%,整体分级效果超过了图像特征提取和SVM(Support Vector Machine)分类器组合的方法。在红反时间序列图像预测中,LSTM模型预测下一时刻复发的准确率为91.58%,实验结果说明了小儿白内障术后复发存在一定的规律性并可以对其进行预测。与本文相关的前期工作已在Nature BiomedicalEngineering等期刊发表,并且被IEEE Spectrum媒体报道。从整体来看,本文研究的CNN和LSTM模型的结果可以作为眼科医生诊断小儿白内障的参考。
[硕士论文] 董艺
生物学、细胞生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  眼睛晶状体(lens)是一个高度透明的器官,它在整个生命过程中是不断生长的。其发育过程为上皮细胞不断分化为细长的纤维细胞,这些纤维细胞层层覆盖在同心层上,并且去除细胞核和其他的细胞器,称为终末分化细胞。晶状体纤维细胞中含有较高浓度的晶状体蛋白,这些晶状体蛋白在整个生命过程中必须保持可靠的稳定性和可溶性。晶状体分化异常和晶状体蛋白可溶性等的改变都会导致白内障的发生。白内障分为先天性白内障和老年性白内障。研究表明,热休克转录因子4(heat shock factor4,Hsf4)的基因突变会导致先天性常染色体显性白内障和隐性白内障的发生,但是由于Hsf4的功能异常而导致白内障发生的分子机制并不清楚。
  细胞为避免自身受到包括热休克和氧化应激等的外界环境的刺激,会产生大量高度保守的蛋白质,即热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)。这一反应过程称为热休克反应(heat shock response,HSR)。真核生物中,HSPs在转录水平上主要是受热休克转录因子(heat shock factors,HSFs)调控的。HSFs结合在HSPs基因启动子上的热休克元件(heat shock elements,HSEs)上启动HSPs的转录表达。HSEs是由多个保守的反向重复五核苷酸序列nGAAn组成的。热休克转录因子家族共有4个成员,分别为Hsf1、Hsf2、Hsf3和Hsf4。其中,Hsf4是晶状体中调控热休克反应的主要转录因子。敲除Hsf4的小鼠晶状体上皮细胞增殖异常,纤维细胞分化存在障碍,但其调控机制仍不清楚。本课题通过寻找Hsf4新的下游靶基因,并对其分子功能进行研究,基于此可以为我们深入理解Hsf4介导的晶状体发育过程提供新思路。
  目的:
  本课题以敲除和过表达 Hsf4b的小鼠晶状体上皮细胞系 mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b为研究对象,通过转录组测序筛选Hsf4新的下游靶基因并对其分子机制进行探讨。
  方法:
  1.使用转录组测序技术,筛选出敲除和过表达Hsf4b的小鼠晶状体上皮细胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b中差异表达的基因;
  2.使用实时荧光定量PCR技术,进一步验证转录组数据中差异表达的基因;
  3.通过双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀实验检测Hsf4与Aim-1启动子的结合情况;
  4.在敲除和过表达Hsf4b的小鼠晶状体上皮细胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b中检测在43℃热激刺激下Aim-1的mRNA水平;
  5.在过表达Hsf4b的晶状体上皮细胞系mlec-HA-Hsf4b中敲低Aim-1后,检测Hsf4下游靶基因的表达;
  6.构建融合GFP的Aim-1不同结构域片段质粒,通过免疫荧光观察其在细胞中的亚定位;
  7.制备Aim-1的多克隆抗体及抗体的验证;
  8.使用实时荧光定量PCR和半定量PCR技术,检测Aim-1在小鼠不同组织中和在晶状体不同发育时期的表达;
  9.在野生型和敲除Hsf4的斑马鱼中,使用实时荧光定量PCR技术,检测zAim-1的表达情况。
  结果:
  1.转录组测序和实时荧光定量PCR筛选并验证Aim-1为Hsf4的新下游靶基因。
  2.Hsf4通过直接结合在Aim-1的启动子上调控其表达。
  3.Aim-1的表达不受热休克刺激的调控。
  4.敲低Aim-1导致Hsf4下游基因alphaB-crystallin的表达下降。
  5.Aim-1不同截短体在细胞内呈现不同的亚定位方式。
  6.制备的Aim-1抗体可以正确识别Aim-1蛋白。
  7.Aim-1主要在成年小鼠晶状体上皮细胞中表达。
  8.Aim-1a在敲除Hsf4的斑马鱼中表达量下降。
  结论:
  1.Hsf4通过直接结合在Aim-1启动子上调控其表达。
  2.Aim-1可能作为细胞骨架蛋白,通过与Hsf4其它下游基因如alphaB-crystallin相互作用,共同调控晶状体的发育。
[硕士论文] 邵陈沙
眼科学 桂林医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  后发性白内障(posterior capsule opacification,PCO)也称后囊膜混浊,是白内障术后及晶状体外伤后最常见的并发症。研究表明残留的晶状体上皮细胞增殖在PCO的发病机制中发挥着十分重要的作用,但其增殖的具体原理尚未完全阐明,本研究探讨体外应用血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)及PI3K(phosphatidylinositols-kinase)信号通路抑制剂LY294002分别或同时刺激人源晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)株SRA01/04,以探讨PI3K-AKT信号通路在PDGF促进人晶状体上皮细胞增殖中的作用。
  方法:
  人晶状体上皮细胞株SRA01/04常规传代培养,用不同浓度的PDGF(0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml),不同浓度LY294002(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)以及不同浓度的PDGF(10ng/ml)+LY294002(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)分别作用于SRA01/04细胞24小时,MTT法检测各组细胞的增殖率或增殖抑制率;根据MTT结果,选定各药物组浓度,将实验分为四组,即空白对照组、PDGF组(PDGF浓度为10ng/ml)、LY294002组(LY294002浓度为40μM)、PDGF+LY294002组(10ng/ml的PDGF+40μM的LY294002),各组细胞培养24h,倒置显微镜下观察各组晶状体上皮细胞增殖、抑制的情况;蛋白印迹法检测各组细胞中总AKT及P-AKT的蛋白表达量差异。
  结果:
  1、人晶状体上皮细胞SRA01/04的增殖率与PDGF的浓度呈正相关(P<0.001);
  2、人晶状体上皮细胞SRA01/04的增殖的抑制率与LY294002的浓度呈正相关(P<0.001);
  3、PDGF促人晶状体上皮细胞SRA01/04的增殖作用与LY294002的浓度呈负相关(P<0.001);
  4、PDGF、LY294002分别或同时干预人晶状体上皮细胞SRA01/04时细胞总AKT表达无明显差异(P=0.066);
  5、PDGF单独干预人晶状体上皮细胞SRA01/04时细胞p-AKT表达量增加,差异有统计学意义(P<0.001);
  6、LY294002单独干预人晶状体上皮细胞SRA01/04时细胞p-AKT表达量减少,差异有统计学意义(P<0.001);
  7、PDGF和LY294002同时干预人晶状体上皮细胞SRA01/04时细胞p-AKT表达量较PDGF单独干预时减少而较LY294002单独干预时增加,差异有统计学意义( P<0.001)。
  结论:
  1、PDGF能促进人晶状体上皮细胞的增殖;
  2、LY294002能抑制人晶状体上皮细胞的增殖;
  3、PDGF促进人晶状体上皮细胞的增殖作用能被LY294002抑制;
  4、PDGF通过激活PI3K/AKT信号通路促进人晶状体上皮细胞的增殖。
[硕士论文] 陈丹丹
中医五官科学(眼科) 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过分析内障眼病,包括高风内障、视瞻有色及络瘀暴盲患者中医体质类型分布情况,观察其中医体质类型分布规律,初步探讨内障眼病与中医体质的内在联系,为临床病因病机分析及防治提供科学的思路与依据。
  方法:选择2016年03月至2017年3月间于江苏省中医院眼科确诊高风内障、视瞻有色及络瘀暴盲患者132例作为受试对象,指导其自主填写中医体质调查表中基本信息及相关问题,按《中华中医药学会标准—中医体质分类与判定标准》中相关标准进行体质类型判定,初步分析内障眼病与中医体质类型相关性。
  结果:1.高风内障患者性别与年龄间没有明显差异,视瞻有色患者集中在中青年男性,且男性发病时间略早于女性,络瘀暴盲患者发病人数随年龄呈递增趋势;2.对比正常人群,内障眼病患者的体质类型存在明显的偏颇倾向。高风内障病例除外未收集到痰湿质与特禀质,各体质比例由高到低依次为:阳虚质47.5%、气虚质20%、气郁质15%、平和质7.5%、血瘀质5%、阴虚质和湿热质均为2.5%。总体虚性体质共28例,占70%,显著多于实性体质者;视瞻有色病例除外未收集到特禀质,各体质比例由高到低依次为:痰湿质26.09%、气郁质21.74%、阳虚质15.22%、气虚质13.04%、湿热质10.87%、阴虚质6.52%、平和质4.35%、血瘀质2.17%。总体实性体质略多于虚性体质,分别为60.9%及34.8%;络瘀暴盲患者各体质比例由高到低依次为:血瘀质19.57%、痰湿质17.39%、气郁质15.22%、阳虚质15.22%、气虚质13.04%、平和质6.52%、阴虚质6.52%、湿热质4.35%、特禀质2.17%。总体病理体质实性略多于虚性者,分别为56.5%和34.8%。3.内障眼病患者中男性偏颇体质以阳虚质、气虚质及痰湿质为多,分别为15例、14例、14例,女性偏颇体质以阳虚质和气郁质为主,分别为18例和15例。各年龄段患者体质病理体质明显高于正常人群,均以阳虚质多见,青年患者痰湿质和气郁质者也较为多见。
  结论:内障眼病患者具有一定的体质偏颇倾向,总体以气虚质和阳虚证为主。高风内障患者存在明显的体质偏颇,主要为阳虚质;视瞻有色患者中偏颇体质以痰湿质和气郁质多见;络瘀暴盲患者的偏颇体质主要为血瘀质。偏颇体质的分布在性别和年龄上均有所差别,男性以阳虚质、气虚质及痰湿质为多,女性以阳虚质和气郁质为主,对比中老年患者,青年患者除阳虚质分布较多,痰湿质和气郁质也多见。
[硕士论文] 惠靖雯
临床医学;眼科学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  眼内炎是一种凶险的感染性致盲性眼后段疾病,常常造成严重的视力损害,内源性眼内炎是一种眼外感染后经过血源性播散引起的凶险的感染性致盲性眼病,起病急骤,一旦病原菌侵入眼内,迅速破坏眼内组织,症状严重,虽然总体发病率低,但常造成严重的视力损害。细菌或真菌通过血液循环播散进入眼内,引起脉络膜、视网膜、玻璃体等眼内组织的炎症,其中细菌性眼内炎居多,患病的危险因素主要包括糖尿病、免疫抑制、静脉导管滞留、长期使用抗生素等。在临床上,眼科医师掌握内源性眼内炎的病原分布及其致病特点对于疾病的诊断、治疗及预后改善至关重要。内源性眼内炎致病菌谱近年来不断发生着变化,新兴出现高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)引起的眼内炎,虽然最常见的症状亦是眼部肿胀、充血、视力模糊的突然发作,但其致病力明显高于经典肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumonia,cKP),更难治愈,视力恢复较差,预后不良,本研究将高毒力肺炎克雷伯菌与经典肺炎克雷伯杆菌的特性进行比较,探讨高毒力肺炎克雷伯菌毒力的相关特性及其对视网膜色素上皮细胞炎症相关因子表达的影响。
  方法:
  收集8株高毒力肺炎克雷伯菌及8株经典肺炎克雷伯菌,分成高毒力肺炎克雷伯菌组和经典肺炎克雷伯菌组,首先分别检测其高黏性特征、基因型特性、抗血清杀伤及抗巨噬细胞吞噬能力;再通过酶联免疫吸附实验检测细菌侵袭视网膜色素上皮细胞后炎症细胞因子的表达水平,具体如下:
  1.细菌毒力检测:
  ①粘液丝实验:将受试菌接种于5%羊血琼脂平板,于37℃孵育过夜,用细菌接种环向上挑起菌落,观察记录挑起的粘液丝长度;
  ②基因rmpA(regulator ofmucoid phenotype gene A)检测:提取细菌基因组DNA,按25uL反应体系和反应流程进行PCR反应扩增rmpA基因,检测两组细菌的基因表达情况;
  ③细菌抗血清实验:培养至对数后期的细菌107CFU/L,与血清按比例1∶1混合培养2h,将混合培养液梯度稀释检测细菌的存活数量,计算细菌的存活率;
  ④细菌抗吞噬细胞吞噬实验:将培养至对数后期的细菌107CFU/L,按感染复数(multiplicity of infection,MOI)100∶1比例与鼠源巨噬细胞Raw264.7混合孵育1h,检测细菌存活数量,计算巨噬细胞内细菌的存活率。
  2.酶联免疫吸附实验:两组细菌分别感染视网膜色素上皮细胞10h,通过酶联免疫吸附实验检测上清液中单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)及白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)两种炎症细胞因子产生的水平。
  结果:
  1.细菌毒力检测:
  ①高毒力肺炎克雷伯菌组在粘液丝实验中均表现为阳性,而经典肺炎克雷伯菌组均表现为阴性;
  ②rmpA基因检测结果显示:高毒力肺炎克雷伯菌组均有rmpA基因543BP的表达,而经典肺炎克雷伯菌组没有该基因的表达;
  ③细菌抗血清实验结果显示:高毒力肺炎克雷伯菌组的存活率(18.2%)明显高于经典肺炎克雷伯菌组的存活率(5.3%),且差异有统计学意义(t=1.872,P<0.05);
  ④细菌抗巨噬细胞吞噬实验结果显示:巨噬细胞胞内高毒力肺炎克雷伯菌组的细菌存活率(1.1%)明显低于经典肺炎克雷伯菌组(7.5%),存在统计学差异(t=5.434,P<0.05)。
  2.酶联免疫吸附实验:高毒力肺炎克雷伯菌组感染视网膜色素上皮细胞后,细胞上清液中MCP-1(1177pg/mL)、IL-6(119pg/mL)均高表达,而经典肺炎克雷伯菌组MCP-1(670pg/mL)、IL-6(54pg/mL)则低表达,RPE细胞被高毒力肺炎克雷伯菌侵袭后分泌的MCP-1和IL-6的量分别是被经典肺炎克雷伯菌侵袭后的1.76倍和2.20倍,差异有统计学意义(tMCP-1=5.670,tIL-6=3.968,P均<0.05)。
  结论:
  相对于经典肺炎克雷伯菌,高毒力肺炎克雷伯菌的毒力更强,感染视网膜色素上皮细胞后,可引起更严重的炎症反应。
[硕士论文] 李璐
病理学 桂林医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  五没食子酰基葡萄糖(1,2,3,4,6-Pentagalloylglucose,PGG)是一种天然多酚类化合物,它广泛存在于中草药植物中,五倍子、牡丹皮和白芍等植物含量较高。研究表明,PGG具有抗炎、抗肿瘤及抗糖尿病等作用。后发性白内障是白内障囊外摘除术后最常见的并发症,目前认为术中残留的晶状体上皮细胞的增殖是引起后发性白内障的主要原因。本研究拟探讨PGG对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用及其作用机制。
  方法:
  ①PGG的浓度设为0、25、50、75μmol/L,作用SRA细胞的时间为24、48、72 h,采用MTT法检测PGG对人晶状体上皮细胞增殖的影响,显微镜观察细胞形态变化。
  ②PGG作用SRA细胞48 h后,采用Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞技术分析PGG对人晶状体上皮细胞凋亡率的影响。
  ③PGG作用SRA细胞48 h后,采用PI单染,流式细胞技术分析PGG对人晶状体上皮细胞周期的影响。
  ④PGG作用SRA细胞48 h后,采用Western blotting检测PGG对人晶状体上皮细胞NF-κB p65、phospho-NF-κB p65、phospho-stat3和cyclin D1蛋白表达的影响。
  结果:
  ①PGG孵育后,贴壁的SRA细胞数量明显减少,细胞变圆、变小,细胞增殖受到明显的抑制,且具有时间和剂量依赖性。在同一时间段,药物浓度越大,PGG对SRA细胞增殖的抑制率越大,其中72 h最明显。72 h时,药物浓度为25μmol/L时,抑制率为(30.75±2.63)%,药物浓度为50μmol/L时,抑制率为(39.69±0.67)%,药物浓度为75μmol/L时,抑制率达到(47.84±0.98)%,以对照组(药物浓度为0)增殖抑制率为0做参照,不同药物浓度组抑制率明显增加,差异有统计学意义(F=1842.49,P<0.01)。同一药物浓度时,PGG作用时间越长,SRA细胞的增殖抑制率越大。药物浓度为75μmol/L作用24 h时,SRA细胞的增殖抑制率为(11.14±1.29)%,作用48 h时,抑制率为(30.42±2.42)%,72 h时,抑制率高达(47.84±0.98)%,抑制率明显增加,差异有统计学意义(F=716.26,P<0.01)。
  ②与对照组比较,PGG处理的SRA细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均增加,随PGG浓度的增加细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。
  ③与对照组比较,随着PGG药物浓度的增加,S期细胞所占百分率增加,药物浓度为75μmol/ L时,S期细胞百分率为(44.28±1.33)%,药物浓度为50μmol/ L时,S期细胞百分率为(37.67±1.29)%,与对照组(28.58±1.27)%比较,S期细胞所占百分率明显增加,差异有统计学意义(F=77.11, P<0.01)。
  ④PGG浓度增加,PGG孵育的SRA细胞的NF-κB p65的表达无明显改变,但phospho-NF-κB p65表达上调,phospho-stat3与cyclin D1表达下调。
  结论:
  PGG可抑制晶状体上皮细胞的增殖,促进晶状体上皮细胞的凋亡,阻滞晶状体上皮细胞于S期。PGG的这些作用可能与其上调蛋白phospho-NF-κB p65,降低phospho-Stat3、cyclin D1的表达有关。因此,PGG有望成为防治后发性白内障的有效药物。
[硕士论文] 万思敏
生物学、细胞生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  热休克反应(heat shock response,HSR)是机体在外界环境应激状态下,以大量表达热休克蛋白为特征的适应性保护反应。热休克蛋白通过其分子伴侣活性帮助变性蛋白结构正确折叠或促进变性蛋白降解,从而稳定细胞的蛋白内稳态。热休克转录因子(heat shock factor,HSF)是调控热休克反应的主要转录因子。热休克转录因子通过结合靶基因启动子的热休克元件(HSE)来调控其表达。哺乳类动物共有4个HSF家族成员,Hsf1、Hsf2、Hsf3、Hsf4。而Hsf4具有组织特异性,是晶状体中执行热休克反应的主要转录因子。Hsf4突变导致先天性和老年性白内障的发生,同时小鼠中敲除Hsf4导致晶状体发育异常和白内障。但是,Hsf4调控晶状体分化和白内障发生的分子机制并不清楚。
  CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的一种天然免疫机制,主要用来对抗入侵细菌的病毒和外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵病毒或质粒的DNA片段整合到CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)中,并利用转录产生相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来引导Cas9蛋白对同源序列的降解,从而保护细菌。CRISPR/Cas9系统能够完成对靶序列的精确酶切,很快被应用到基因编辑中。利用这一原理,设计针对Hsf4的gRNA(guide RNA),引导Cas9蛋白在基因组中预期的位点进行精确酶切。同时,为了筛选方便、快捷,利用细胞内的同源重组修复,导入设计的Hsf4-GFP融合片段为模板,在Hsf4基因切割位点完成同源重组,以获得带有GFP荧光的敲除Hsf4细胞系。
  晶状体中的晶状体上皮细胞在维护晶状体内稳态和维持晶状体功能上发挥着重要作用。有研究发现,年龄老化影响晶状体上皮细胞的终生生长,白内障的发生与晶状体上皮细胞的衰老有关。衰老的晶状体上皮细胞中,与细胞增殖和分化相关的基因NDRG2的上调导致人老年性白内障。Hsf4的失活诱导肿瘤细胞衰老,同时抑制体内肿瘤发生。鉴于Hsf4在晶状体中的功能,Hsf4是否通过调控细胞衰老来维持老年晶状体的功能并不清楚。本课题利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠晶状体上皮细胞Hsf4,探讨Hsf4缺失导致细胞衰老的分子机制。
  目的:
  利用CRISSPR/Cas9系统在晶状体上皮细胞中敲除小鼠Hsf4基因研究Hsf4调控晶状体细胞衰老的分子机制。
  方法和结果:
  1.首先,我们成功构建针对小鼠Hsf4基因的CRISPR/Cas9 gRNA质粒和小鼠Hsf4-GFP融合片段质粒。为增加切割效率,我们在Hsf4编码区ATG下游设计了2个gRNA位点。
  2.之后,将小鼠Hsf4的两个CRISPR/Cas9 gRNA质粒和小鼠Hsf4-GFP融合片段质粒共转入小鼠晶状体上皮细胞(mLEC)中。
  3.通过PCR扩增切割位点基因组序列,western blot检测Hsf4下游基因的表达水平,以及观察细胞的绿色荧光情况,证明Hsf4基因在设计位点处发生重组。
  4.通过有限稀释法和单克隆培养法筛选Hsf4带有绿色荧光的Hsf4敲除单克隆细胞株。
  5.利用western blot检测绿色荧光单克隆细胞中GFP、Hsf4下游基因hsp25、αB-crystallin的表达情况,发现GFP在单克隆细胞中高表达,Hsf4下游基因明显下降,这表明单克隆细胞中Hsf4已经敲除。
  6.为证明Hsf4是否参与细胞衰老过程,我们分别利用β-半乳糖苷酶染色实验、衰老相关异染色质点(SAHF)检测、MTS检测细胞增殖来确定Hsf4敲除是否导致晶状体上皮细胞衰老。我们的结果显示, Hsf4敲除后,β-半乳糖苷酶染色明显增强, SAHF增多,细胞增殖减缓,这些数据表明Hsf4敲除导致晶状体上皮细胞衰老。
  7.p21和p16是细胞衰老过程中的主要调控因子,因此为探究Hsf4调控细胞衰老的分子机制,我们检测了Hsf4敲除细胞中二者的表达情况。western blot检测发现衰老相关基因p16表达不变,而p21的表达明显增加,同时q-PCR检测发现p21 mRNA水平明显增加。
  8.为体内验证Hsf4在晶状体细胞衰老中的作用,我们收取了青年和老年小鼠的晶状体组织。利用realtime PCR检测发现,小鼠老年晶状体中热休克反应能力明显降低、Hsf4 mRNA水平下降、同时p21 mRNA水平明显增高。
  结论
  通过CRISPR/Cas9系统在mLEC细胞中成功构建小鼠Hsf4敲除细胞系,并且细胞中Hsf4基因的敲除会导致晶状体上皮细胞衰老,细胞内p21的表达量上升。
[硕士论文] 胡少莉
眼科学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:目的:不同照明条件对渐进衍射型人工晶体全程视力及对比敏感度的影响。
  方法:回顾性分析了自2010年1月~2012年12月在胶南市开发区医院眼科中心行白内障超声乳化吸出联合植入Alcon Restore+3D多焦点人工晶体(Monofocal intraocular lens, MIOL)植入的白内障病例45例(45眼)作为Restore组。选取行白内障超声乳化吸出联合植入单焦人工晶体植入的白内障患者32例(32眼)作为单焦点组,在术后3个月在弱(50Lux)、中(250Lux)、强(500Lux)三种照明条件下,四种不同对比度(100%,25%,10%和5%)下,对视远状态(5m)、视近状态(33cm)和中程视力表下,记录两组患者的单眼裸眼近视力、单眼裸眼远视力及单眼最佳矫正远视力。同时分别在术后1个月和3个月时对两组患者进行视觉质量调查问卷,记录得分。
  结果:术后1个月单焦点组和ReStore组视功能生存质量调查总评分平均值分别为49.12±2.86和51.32±3.12,差异具有统计学意义(p=0.032);随着时间的推移,ReStore组患者的视功能生存质量有着一定程度的改善。术后1个月和3个月时 ReStore组在远脱镜、看近脱镜以及中距离脱镜和满意度上均优于单焦点组(P<0.05),且发现在ReStore组中有5位患者显示在术后3个月时的在眩光及光晕主观感觉上比术后1个月时有明显改善。spearman秩相关分析结果显示提示随着背景亮度的下降及对比度的下降,白内障患者术后的全程视力,无论裸眼近视力、裸眼远视力还是最佳矫正远视力、中程视力均是逐渐下降,裸眼近视力、裸眼远视力及最佳矫正远视力与背景光强度及对比度成正相关(r>0,P<0.05)。无论在弱、中、强照明条件下,其CS均值均低于单焦点组,只是在弱照明条件下两组CS值差异并没有统计学差异;在中和强照明条件下,Restore组患者在1.5cpd,3 cpd,6 cpd,12 cpd下CS均值均低于单焦点组,均属于正常的CS范围内,两组间无统计学差异(P>0.05)。而只有在高空间频率18cpd下,Restore组患者的CS值显著性低于单焦点组(P<0.05)。
  结论:DMIOL可以获得良好的全程视力及视觉质量满意度。裸眼远视力、最佳矫正远视力和裸眼近视力与光照强度和对比度成正相关。DMIOL在各个空间频率下的CS值会有所下降,尤其在高空间频率DMIOL的CS下降更为显著。
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