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[硕士论文] 刘颖
肿瘤学(肿瘤放射治疗学) 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究发现,AngⅡ主要存在于肿瘤的乏氧区域,并且是由肿瘤细胞通过糜蛋白酶(chymase,CMA)依赖的途径产生,而不是ACE依赖的经典RAS途径。并进一步揭示了糜蛋白酶依赖途径受到糖酵解代谢产物——乳酸水平调节,而且在乏氧肿瘤细胞中AngⅡ水平的增加对于HIF-1α在细胞内的累积起重要作用,并介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗。这不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据,而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。
  方法:
  1.检测头颈部肿瘤中血管紧张素Ⅱ在肿瘤乏氧区域的表达
  运用ELISA实验及细胞免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞株和乳腺癌细胞株在体外不同氧环境(常氧及乏氧)下的血管紧张素Ⅱ表达情况。构建裸鼠皮下移植瘤模型,结合HIF-1α抗体,利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在肿瘤组织中的分布与HIF-1α表达区域的相关性,进而分析AngⅡ与肿瘤乏氧区域的相关性。利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在人鼻咽癌标本中的分布与HIF-1α表达区的相关性,进而分析AngⅡ与肿瘤乏氧区域的相关性。
  2.检测乏氧情况下肿瘤细胞产生血管紧张素Ⅱ的机制
  利用AGT慢病毒载体构建稳定抑制血管紧张素原表达的鼻咽癌细胞株CNE2和5-8F,并运用ELISA实验检测鼻咽癌细胞培养基中AngⅡ的表达。通过皮下注射上述细胞株建立小鼠移植瘤模型,运用免疫荧光技术分析移植瘤组织内AngⅡ与哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域的相关性。通过荧光定量PCR及Western B1ot技术检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素原(AGT)、肾素(Renin)和血管紧张素转换酶(ACE)的基因及蛋白的表达水平。针对RENIN和ACE各设计3条短干扰RNA片段(siRNA),使用细胞转染技术抑制细胞中RENIN和ACE的表达。然后利用ELISA实验检测不同氧环境(常氧及乏氧)下鼻咽癌细胞株RENIN和ACE沉默后AngⅡ的表达情况。利用基因表达微阵列分析的方法找出显著影响肿瘤细胞AngⅡ形成的糜蛋白酶(chymase,CMA),并使用Western Blot进一步证实。然后通过构建CMA的慢病毒载体抑制其表达,使用ELISA实验检测不同氧环境(常氧及乏氧)下鼻咽癌细胞株CMA沉默后的AngⅡ表达情况。
  3.检测改变培养基pH或加入乳酸是否影响肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的表达
  通过使用1%盐酸(HCl)和5%碳酸氢钠(NaHCO3)将常氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至乏氧条件培养的水平,或者将乏氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平,然后使用ELISA实验检测pH调整后肿瘤细胞培基中AngⅡ表达情况。使用乳酸检测试剂盒检测不同氧环境下(常氧及乏氧)鼻咽癌细胞中乳酸的表达情况,并运用ELISA的实验方法检测不同氧环境(常氧及乏氧)的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后鼻咽癌细胞的AngⅡ表达情况。
  4.检测肿瘤细胞产生的乳酸是否影响糜蛋白酶的表达
  5.检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素Ⅱ与HIF-1α表达的关系
  6.检测血管紧张素Ⅱ与头颈部肿瘤细胞辐射敏感性关系
  7.统计分析
  结果:
  1.肿瘤乏氧区域存在局部血管紧张素Ⅱ
  利用ELISA试剂盒检测鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、5-8F及乳腺癌细胞株MDA-MB-231不同氧浓度下的AngⅡ生成情况。结果显示在体外普通培养条件(常氧)下,肿瘤细胞培养基中可检测到少量AngⅡ生成,而在乏氧培养条件下,肿瘤细胞培养基中AngⅡ水平显著升高。运用细胞免疫荧光技术检测发现常氧条件下培养的CNE2及MDA-MB-231仅有极少量的AngⅡ表达在胞浆中,而乏氧条件下培养的肿瘤细胞胞浆中AngⅡ表达明显升高。在裸鼠的CNE2移植瘤模型中的荧光检测发现AngⅡ主要集中在乏氧诱导因子HIF-1α高表达的乏氧区域。另外我们还收集了13例鼻咽癌肿瘤标本,用激光共聚焦显微镜观察到AngⅡ与HIF-1α表达于鼻咽癌肿瘤标本的同一区域。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中,我们通过组织免疫荧光检测发现在哌莫硝唑指示的肿瘤乏氧区域AngⅡ的表达明显下降。这些结果均提示局部RAS存在于肿瘤的乏氧微环境中。
  2.乏氧肿瘤细胞不是通过经典的RAS途径产生血管紧张素Ⅱ
  荧光定量PCR及Western Blot技术检测发现在鼻咽癌CNE2细胞株中只有肾素在乏氧条件下其基因及蛋白水平显著升高,而AGT与ACE在乏氧条件下与常氧相比具有相似的表达水平。在特异性敲除肾素的CNE2和5-8F鼻咽癌细胞株中,通过ELISA检测发现乏氧情况下两细胞株培养基中的AngⅡ水平降低。而特异性敲除血管紧张素转换酶的CNE2和5-8F细胞株中则无此种改变。这些结果提示我们,在乏氧的肿瘤细胞中AngⅡ的产生可能并不依赖典型的RAS途径。
  3.乏氧肿瘤细胞通过糜蛋白酶依赖途径产生血管紧张素Ⅱ
  基因表达微阵列分析结果显示,在乏氧的CNE2细胞中糜蛋白酶转录显著增加,并通过Western Blot进一步得到了证实。我们利用慢病毒载体,构建了稳定敲除CMA的CNE2和5-8F细胞株。ELISA实验结果显示,乏氧培养环境中的鼻咽癌细胞株在CMA沉默后其AngⅡ表达较常氧情况下显著降低。以上研究结果表明,在肿瘤的乏氧微环境中,糜蛋白酶介导AngⅡ的生成途径可能是ACE依赖AngⅡ生成途径的替代通路。
  4.肿瘤来源的乳酸介导了乏氧肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的产生
  运用ELISA检测不同氧环境(常氧及乏氧)中鼻咽癌细胞CNE2及5-8F的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后其AngⅡ的表达水平。结果显示,用HC1酸化培养基后并未显著增加培养基中AngⅡ的含量,相反,利用5%碳酸氢钠(NaHCO3)将乏氧条件下培养的肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平后AngⅡ的含量上升。以上研究结果表明酸性pH并不是影响乏氧肿瘤细胞CMA依赖途径生成AngⅡ的主要因素。而乳酸测定的结果显示,乏氧条件培养的CNE2及5-8F细胞中乳酸水平较常氧条件下显著升高。在CNE2及5-8F细胞的培养基中加入乳酸盐后,ELISA检测发现常氧及乏氧条件下的培养基中AngⅡ水平显著增高,加入草氨酸钠后抑制胞内乳酸生成后AngⅡ水平则降低,而挽救实验可恢复两种培养条件下培养基中的AngⅡ水平。这就说明是乳酸而不是pH的降低引起乏氧肿瘤细胞中AngⅡ水平的增加。
  5.肿瘤产生的乳酸调节肿瘤细胞中糜蛋白酶的表达
  Western Blot检测结果显示,无论常氧还是乏氧培养条件,在CNE2细胞培养基中加入乳酸盐后其糜蛋白酶的表达增加,加入草氨酸钠后则发生抑制。在CNE2细胞培养基中加入碳酸氢钠碱化培养基后,两种培养条件下的糜蛋白酶亦有所增加。此外,乳酸盐及培养基的碱化也使肾素的表达一定程度上升高。这些研究结果表明,乏氧肿瘤细胞中乳酸水平的增加可能是造成糜蛋白酶表达升高的重要因素。
  6.血管紧张素Ⅱ调节乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白的累积
  Western Blot实验显示,AngⅡ处理及乏氧条件下的CNE2细胞中HIF-1α蛋白显著升高,而加入坎地沙坦后可抑制HIF-1α蛋白的升高。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中,我们通过组织免疫荧光检测发现AGT沉默后,大大减弱了HIF-1α蛋白在哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域中的积累。这些实验结果说明在乏氧肿瘤微环境中AngⅡ参与调节HIF1-α蛋白的累积。
  7.局部生成血管紧张素Ⅱ介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗
  克隆形成实验显示,乏氧条件下鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的辐射抵抗能力较常氧条件下显著增加,而AT1R特异性拮抗剂坎地沙坦能逆转乏氧条件造成的肿瘤细胞辐射抵抗,显著增加其辐射敏感性。裸鼠的CNE2细胞株皮下成瘤实验发现AT1R拮抗剂坎地沙坦处理组较对照组显著减小了10Gy辐射后的肿瘤体积。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的动物移植瘤模型中,AGT沉默组小鼠的移植瘤体积在10Gy辐射后较阴性对照组显著降低。这些结果均表明,肿瘤乏氧微环境中AngⅡ的增加介导了肿瘤的辐射抵抗,使用AT1R拮抗剂坎地沙坦可以特异地在乏氧环境下增加肿瘤细胞的辐射敏感性。
  结论:
  本研究揭示了局部RAS主要存在于肿瘤的乏氧区域,肿瘤细胞可能主要通过糜蛋白酶(chymase,CMA)依赖的途径产生AngⅡ,而不是ACE依赖的途径,并以自分泌或旁分泌的方式发挥作用。肿瘤细胞来源的乳酸,而非乏氧环境的pH降低,通过激活乏氧肿瘤细胞的肾素及糜蛋白酶的表达引起AngⅡ的生成增加。最后,我们发现AngⅡ可使乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白增加,从而介导了肿瘤细胞的辐射抵抗,而坎地沙坦可以特异的增加乏氧肿瘤细胞的辐射敏感性。我们的研究结果不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据,而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。
[硕士论文] 马玉婷
头颈外科学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨头颈部鳞癌患者手术前后细胞免疫水平及意义。
  方法:该研究回顾性分析了在2015年1月至2017年1月期间收住于广西医科大学附属肿瘤医院头颈外科手术的52例初治头颈部鳞癌患者的临床资料,选择同一时期内在广西医科大学附属肿瘤医院体检的52例健康者作为对照组,应用流式细胞术检测,比较对照组及在病例组手术前3天、手术后第7天、手术后第14天以及手术后第21天组间外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD19+细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)水平以及CD4+/CD8+比率的变化。
  结果:
  1.病例组患者CD4+、NK细胞水平均明显低于健康者,而CD19+细胞水平显著升高(P<0.05);
  2.病例组患者术后7d的外周血淋巴细胞CD8+、CD19+显著低于术前(P<0.05),CD3+、CD4+、NK细胞水平以及CD4+/CD8+比率显著高于术前(P<0.05);
  3.病例组患者术后14d外周血淋巴细胞CD3+,CD4+、NK细胞水平以及CD4+/CD8+比率显著高于术前(P<0.05),CD8+、CD19+细胞水平显著低于术前(P<0.05);
  4.术后21d的外周血淋巴细胞CD3+,CD4+、NK细胞水平以及CD4+/CD8+比率显著高于术前(P<0.05),CD8+、CD19+细胞水平显著低于术前(P<0.05);
  5.术后14d的NK细胞水平较术后7d显著性增高(P<0.05),其余组无统计学差异(P>0.05);
  6.术后21d的外周血淋巴细胞CD19+、NK细胞水平显著高于术后7d(P<0.05),CD8+低于术后7d(P<0.05);
  7.病例组头颈部鳞癌患者术后14d与21d外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK细胞水平及CD4+/CD8+比率无统计学差异;
  8.Ⅲ~Ⅳ期患者的外周血淋巴细胞CD3+、CD4+细胞水平低于Ⅰ~Ⅱ期的患者(P<0.05),CD8+细胞水平显著升高(P<0.05);
  9.有淋巴结转移的患者外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比率细胞水平显著降低(P<0.05),CD8+、CD19+细胞水平显著升高(P<0.05)。
  结论:
  1、与健康者比较,头颈部鳞癌患者术前的细胞免疫水平相对较低;
  2、手术切除肿瘤后,头颈部鳞癌患者的细胞免疫水平可逐渐改善;
  3、晚期、有淋巴结转移的头颈部鳞癌患者细胞免疫水平均较低,提示头颈部鳞癌患者的细胞免疫水平与临床分期、有无淋巴结转移相关。
[硕士论文] 杨博
口腔临床医学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:90%以上的头颈肿瘤为头颈鳞状细胞癌。全球每年约有50多万新发的头颈鳞状细胞癌患者,而每年因头颈鳞状细胞癌死亡的患者有20万左右[1,2]。其中头颈鳞状细胞癌的治疗方式以手术治疗为主,辅以放疗、化疗及分子靶向治疗等[3]。尽管许多的治疗手段在不断的更新和进步,但是头颈鳞状细胞癌患者五年的总生存率并没有得到明显的改善,维持在50%左右。患者如果出现病灶的远处转移,那五年生存率则下降至20%左右[4],严重危害人类的健康和生命。因此,本文利用生物信息学数据库对头颈鳞状细胞癌中基因从分子水平进行研究,为了解头颈鳞状细胞癌的发病机制和临床预防和抑制头颈鳞状细胞癌提供有效措施和方法。
  生物信息学是一个涉及多个领域的交叉学科,其核心内容之一是研究基因表达调控的内在机制,揭示人类疾病的本质规律,为更快速、准确的诊断和有效治疗疾病创造条件。本研究旨在对基因芯片数据进行生物信息学分析找到与头颈鳞状细胞癌发生发展相关的差异基因和其功能。首先我们从GEO(GeneExpression Omnibus)数据库下载基因表达谱GSE6791[5],其包括42个头颈鳞状细胞癌和与正常的癌旁组织。与正常组织相比,结合Bioconductor中的Affy包和根据其注释平台通过Affy芯片探针注释文件对探针水平数据进行预处理后,用R语言中的limma包对预处理过后的表达矩阵进行差异基因寻找(logFC>1,p<0.05)。然后用DAVID数据库对上调和下调的差异基因进行GO功能注释和KEGG通路分析差异基因的生物学功能和涉及的信号通路,然后应用STRING数据库对差异基因(综合分数≥0.8)构建蛋白互作网络图,通过Cytoscape软件将其可视化,利用MCODE插件对蛋白互作网络进行模块分析,并对不同的模块进行GO功能注释和KEGG通路分析。最后,根据网络拓扑分析(节点度)选取蛋白互作网络中重要的核心蛋白,通过TCGA数据库验证这些核心基因的表达水平是否与头颈鳞状细胞癌生存预后有明显的相关性。
  通过上述方法,我们得到811个差异基因,其中有550个是表达上调的,而261个表达下调。GO功能注释和KEGG通路分析显示这些差异基因主要富集在蛋白酶体和ECM-受体相互作用通路中。用STRING数据库将符合标准的差异基因构建成蛋白互作网络后,利用MCODE插件得出三个重要的模块,而它们主要富集在蛋白酶体和ECM-受体相互作用通路中。在蛋白互作网络中,根据节点度的大小,我们得到15个核心蛋白,而这15个核心蛋白大部分处于上述的模块中。另外利用TCGA头颈鳞状细胞癌数据库显示,4个mRNA高表达的核心基因与患者总的生存率有明显的负相关性,如PSMA7,ITGB4,ITGA6和APP。以上研究表明,这4个核心基因可能通过上述通路对头颈鳞状细胞癌发生发展起到重要作用,为我们进一步研究头颈鳞状细胞癌潜在的机制提供了的方向,而且这些核心基因也可能成为头颈鳞状细胞癌诊断和治疗潜在的靶点,当然我们仍然需要通过进一步的实验研究来验证我们的结论。
[博士论文] 孙姗姗
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  本研究旨在探究转录因子STAT3-长链非编码RNA HOTAIR信号通路在人头颈部鳞癌生长和药物(顺铂、西妥昔单抗)敏感性的调控机制。
  研究方法:
  MTT实验检测头颈部鳞癌细胞经过处理后的活性。Brdu实验、克隆形成实验用于检测经过处理后的肿瘤细胞增殖能力。蛋白印迹(Western blot)实验、免疫组织化学(IHC)实验用于检测肿瘤细胞和组织中STAT3(pSTAT3),EZH2(pEZH2),MDR1,AKT(pAKT),细胞周期相关蛋白(p16,p21,cyclin-D1),凋亡相关蛋白(Bcl2,Bax,cleaved caspase3),H3K27me3的表达。实时定量PCR实验和荧光原位杂交(FISH)实验检测细胞和组织中非编码RNA HOTAIR的表达情况。流式细胞术用于检测靶向STAT3/HOTAIR后肿瘤细胞周期的变化情况。免疫共沉淀(IP)实验和荧光素酶报告基因实验探究STAT3,HOTAIR和EZH2三者之间的调控关系。构建头颈部鳞癌HOTAIR过表达稳定细胞株后,用原位小鼠模型证明HOTAIR过表达对头颈部鳞癌增殖的意义。
  研究结果:
  头颈部鳞癌细胞中,STAT3,HOTAIR和PIK3CA存在高表达,对顺铂和西妥昔药物敏感性差异。人头颈部鳞癌组织与细胞标本中,STAT3表达水平与PIK3CA表达水平正相关,HOTAIR表达水平与肿瘤大小差异具有统计学意义。Western blot实验结果表明,头颈部鳞癌细胞中,IL-6/STAT3信号通路与长链非编码RNA HOTAIR表达呈正相关。应用WP1066小分子抑制剂抑制STAT3活性后可影响HNSCC克隆形成能力和细胞增殖能力;过表达STAT3或者HOTAIR可使细胞周期S期比率增加。荧光素酶报告基因实验显示STAT3通过与HOTAIR启动子区结合从而调控HOTAIR转录。免疫共沉淀实验证实STAT3与EZH2丝氨酸21位点磷酸化相互结合。WP1066或者敲低HOTAIR使STAT3/HOTAIR信号通路受抑制后,可使HNSCC细胞对顺铂和西妥昔单抗药物的敏感性提高(影响细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡通路相关蛋白表达)。体内实验UM-SCC1裸鼠原位模型证明HOTAIR过表达促进肿瘤生长。
  研究结论:
  研究表明:
  STAT3/HOTAIR,EZH2过表达与头颈部鳞癌药物敏感性相关。头颈部鳞癌细胞中,IL-6/STAT3信号通路与长链非编码RNA HOTAIR表达呈正相关。抑制STAT3/EZH2可影响HNSCC细胞周期和增殖能力。STAT3通过与磷酸化EZH2丝氨酸21位点结合,促进HOTAIR转录。抑制IL-6/STAT3/HOTAIR信号通路可增加HNSCC细胞对顺铂和西妥昔单抗的药物敏感性。体内试验证实,HOTAIR过表达可促进HNSCC增殖。
  综上,IL-6/STAT3信号通路通过与EZH2丝氨酸21位点磷酸化结合从而调控HOTAIR转录,这或将成为头颈部鳞癌治疗的新靶标。
[博士论文] 王宇
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)是人类发病率排行第六位的恶性肿瘤。HNSCC患者的5年生存率不超过50%。超过70%的患者会出现不同程度的术后复发以及淋巴结转移。因此,研究与探索HNSCC有效的治疗方案变得至关重要!
  Signal Transducer and Activator of Transcription3(STAT3)信号通路的异常激活已被证实与头颈部鳞癌的生长和侵袭转移都密切相关。目前,STAT3的研究已取得长足的发展,然而目前尚没有靶向抑制剂上市。因此,急需一种安全有效的STAT3抑制剂来改善当前的困局。HJC0152是一种新型的STAT3靶向抑制剂,为探讨药物 HJC0152在头颈鳞癌中的抗肿瘤效果,以及其抗肿瘤效果的可能机制,本课题研究分为以下四个部分:
  方法
  第一部分:应用蛋白质免疫印迹检测各细胞株中STAT3基础表达情况。MTT法检测HJC0152的半数致死量(IC50)。检测细胞HJC0152处理后STAT3,p-STAT3(Tyr705)表达差异以及定位变化。
  第二部分:MTT实验检测细胞活性的抑制能力;平板克隆实验分析肿瘤细胞增殖能力;流式细胞方法分析头颈鳞癌细胞凋亡、周期变化;蛋白质免疫印迹检测增殖,凋亡相关蛋白。Transwell实验与scratchtest分析肿瘤细胞运动能力;明胶酶谱检测胞外基质金属蛋白酶分泌情况;免疫荧光观察EMT相关指标的定位差异。
  第三部分:qPCR技术,检测药物HJC0152处理后miR-21变化;Western blot技术检测STAT3下游VHL,β-catenin变化情况;免疫荧光检测β-catenin定位变化;Top/Fop荧光素酶报告实验检测β-catenin通路活性。恢复实验验证VHL在HJC0152抗癌机制中的重要作用。
  第四部分:建立裸鼠头颈鳞原位动物模型。小动物成像系统检测肿瘤大小变化;TUNEL实验检测肿瘤凋亡情况;免疫组织化学检测相关蛋白表达变化。
  结果
  1、SCC25以及CAL27细胞系STAT3与p-STAT3明显高于其他细胞系。MTT法检测HJC0152半数致死量,选取SCC25(IC50=2.18μmol/L)和CAL27(IC50=1.05μmol/L)。Western blot检测发现,HJC0152显著抑制p-STAT3磷酸化水平。通过对比转染STAT3 si的HNSCC细胞系,我们发现HJC0152与si-STAT3效果一致。Western blot表明,药物对Akt,Erk1/2通路没有抑制活性,证明药物特异性地抑制STAT3信号通路。应用HJC0152处理HNSCC细胞系,免疫荧光发现p-STAT3发生定位变化,药物有效抑制其入核。且抑制作用具有浓度依赖性与时间依赖性。
  2、我们通过transwell迁移实验和划痕实验,发现HJC0152可浓度依赖地抑制HNSCC细胞株的迁移能力(P<0.05);transwell侵袭实验证明HJC0152可抑制HNSCC细胞株的侵袭能力(P<0.05);明胶酶谱实验证明HJC0152可有效降低基质金属蛋白酶的胞外分泌;免疫荧光与western blot都证明药物可有效抑制EMT相关标志蛋白的表达水平。MTT与克隆形成实验检测在HJC0152处理后,能显著抑制HNSCC细胞株的增殖能力(P<0.05);HNSCC细胞株细胞周期分布明显变化,表现为 G0/G1期阻滞,细胞凋亡比率较对照组升高,并具有浓度依赖性(P<0.05);western blot检测提示Cleaved Caspase-3、BAX、p21蛋白的表达水平升高;而Bcl-2、Cyclin D1的表达水平受到抑制。
  3、药物HJC0152处理HNSCC细胞株后,对比STAT3 si,两者对miR-21的表达水平都有明显的抑制效果(P<0.05)。药物HJC0152处理细胞24h后,有效抑制细胞株中miR-21的表达水平(P<0.05);下游VHL表达升高,β-catenin表达下降。Top/Fop荧光素酶报告实验证实,HJC0152处理细胞后,β-catenin转录活性下调(P<0.05);核浆分离蛋白检测发现,总β-catenin和磷酸化β-catenin表达下调;免疫荧光提示药物有效抑制β-catenin入核转移;western blot检测发现VHL的降表达可抵抗HJC0152的抗肿瘤活性。
  4、HNSCC原位动物模型结果提示,给药组肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05),肿瘤质量明显低于对照组(P<0.05);TUNEL结果显示,HJC0152能够诱导体内肿瘤细胞凋亡;颈部局部解剖发现,HJC0152有效抑制HNSCC局部侵犯与淋巴结转移;IHC结果示,给药组中 p-STAT3(Tyr705)、β-catenin、MMP2/9、Ki-67、CyclinD1、Bcl-2表达水平下降,VHL、Cleaved Caspase-3的表达水平上调。
  结论
  1、在人头颈鳞状细胞癌中,HJC0152可选择性地抑制p-STAT3磷酸化及其核转移进程。
  2、HJC0152有效抑制头颈鳞癌侵袭与转移能力。同时,可明显抑制头颈鳞癌增殖能力,并诱导其凋亡。
  3、HJC0152可通过抑制STAT3磷酸化,调控下游miR-21/β-catenin信号通路。
  4、HJC0152通过STAT3/miR-21/β-catenin生物轴抑制头颈鳞癌原位肿瘤的增殖与侵袭能力。
[硕士论文] 赵明慧
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  每年全球新增头颈部恶性肿瘤病人有50多万。近年来,头颈部恶性肿瘤发病率呈上升趋势,其中90%以上的病理类型为鳞状细胞癌。随着医学科学技术的发展,针对恶性肿瘤的诊断及治疗有了很大的进步,以手术、放疗、化疗为基础的综合治疗日趋完善,但晚期头颈部鳞状细胞癌病人治疗效果仍不佳。复发和转移是头颈部鳞状细胞癌病人预后不良的重要因素。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在恶性肿瘤转移过程中发挥重要作用。因此研究头颈部鳞状细胞癌转移机制,寻找新的治疗靶点成为提高病人预后的重点问题。研究表明,Zeste同源增强子(enhancer ofzeste homologue2,EZH2)在多种恶性肿瘤中过表达,具有调控肿瘤新生血管形成及促进肿瘤细胞迁移、侵袭的能力。EZH2能激活信号转导与转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3),使STAT3的活化形式p-STAT3表达水平上调。STAT3参与肿瘤EMT进程,能够提高血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2,KDR)的表达进而促进肿瘤新生血管形成以及肿瘤转移。有报道称,VEGFR2信号通路能激活STAT3信号通路。然而,关于在头颈部鳞状细胞癌中EZH2/STAT3/VEGFR2轴是否诱导EMT进程及其具体调控机制尚不明确。
  方法:
  本课题选用UM1和CAL27两种头颈部鳞癌细胞系,采用EZH2特异性小分子抑制剂DZNEP下调EZH2的表达,EZH2过表达质粒上调EZH2的表达,另外还使用小干扰RNA分别敲低STAT3及VEGFR2,对 EZH2/STAT3/VEGFR2轴调控头颈鳞癌上皮间质转化的能力进行了体内外实验研究。实验研究分为两部分:
  第一部分:
  Western blot法检测DZNEP、EZH2过表达质粒及siSTAT3、siKDR处理后两种头颈部鳞癌细胞系UM1和CAL27中EZH2、STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGFR2及EMT相关蛋白的表达变化;细胞划痕实验检测DZNEP、siSTAT3及siKDR处理后,两种HNSCC细胞系迁移能力的改变;Transwell体外侵袭实验检测两种HNSCC细胞系迁移、侵袭能力的改变;免疫荧光技术检测DZNEP、siSTAT3及siKDR处理后两种HNSCC细胞系EMT相关指标的变化;细胞骨架染色方法检测两种HNSCC细胞系处理前后细胞骨架的改变。
  第二部分:
  应用头颈鳞癌细胞系CAL27建立免疫缺陷裸鼠皮下荷瘤动物模型,使用DZNEP瘤内注射治疗,每次注射药物前测量肿瘤大小,称量小鼠体重,密切观察肿瘤生长变化,待观察结束,剥离裸鼠荷瘤,采用免疫组织化学方法检测EZH2、STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGFR2及EMT相关蛋白表达水平变化情况,通过体内实验,进一步验证体外实验的结果。
  结果:
  与对照组相比,使用EZH2过表达质粒转染细胞后,p-STAT3、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平升高,STAT3表达水平无明显变化。使用DZNEP处理细胞降低EZH2表达后,p-STAT3、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平降低,STAT3表达水平无明显变化, EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示, N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,细胞骨架形成减少,呈现张力型骨架。使用siSTAT3处理细胞降低STAT3表达后,p-STAT3、EZH2、VEGF、VEGFR2表达水平均降低,EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示,N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,骨架形成减少,呈现张力型骨架。使用siKDR处理细胞降低VEGFR2表达后,EZH2、p-STAT3、VEGF表达水平均降低,STAT3表达水平无明显变化,EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示,N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,骨架形成减少,呈现张力型骨架。荷CAL27头颈鳞癌裸鼠动物模型结果示:DZNEP药物治疗后,能够显著抑制EZH2、p-STAT3、VEGF、VEGFR2的表达,STAT3表达无明显变化,同时EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调。体内外实验结果一致。
  结论:
  头颈鳞癌细胞系中存在EZH2/STAT3/VEGFR2轴,分别抑制EZH2、STAT3及VEGFR2三者中任何一个的表达能够影响其他两个蛋白的表达,逆转EMT进程,降低头颈鳞癌细胞系的迁移、侵袭能力。
  用DZNEP治疗荷CAL27头颈鳞癌裸鼠后,能下调p-STAT3及VEGFR2的表达,抑制EMT进程;EZH2/STAT3/VEGFR2网络可能成为治疗头颈部鳞状细胞癌新的靶点。
[硕士论文] 周华群
耳鼻咽喉科学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:从姜黄素和白藜芦醇对凋亡相关蛋白表达的影响的角度探讨其对人头颈部肿瘤细胞系增殖和凋亡的影响机制。
  方法:用姜黄素联合白藜芦醇联合处理Hep2(人喉癌上皮细胞)和Fadu(人下咽鳞癌细胞),采用MTT(噻唑蓝)比色法检测细胞存活率,平板克隆形成实验检测单个细胞集落形成能力,Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况,Westernblot检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,同时应用Real-time PCR法检测Bax和Bcl-2mRNA表达水平。
  结果:
  1.姜黄素和白藜芦醇可抑制Hep2细胞和Fadu细胞的存活率。
  在Hep2细胞和Fadu细胞中,不同浓度的姜黄素和白藜芦醇可使细胞存活率降低,并有剂量效应;当20μM的白藜芦醇与不同浓度姜黄素联合处理时,Hep2细胞和Fadu细胞的存活率显著降低。
  2.姜黄素和白藜芦醇可抑制Hep2细胞和Fadu细胞的集落形成。
  与空白对照相比,10μM的姜黄素和20μM的白藜芦醇均可抑制Hep2和Fadu细胞集落的形成;10μM姜黄素和20μM白藜芦醇联合处理24小时后,Hep-2细胞和Fadu细胞集落形成率显著降低。
  3.姜黄素和白藜芦醇促进Hep2细胞和Fadu细胞的凋亡。
  与空白对照相比,10μM的姜黄素和20μM的白藜芦醇均可促进Hep2细胞和Fadu细胞的凋亡;10μM姜黄素和20μM白藜芦醇联合处理细胞24小时后,Hep2细胞和Fadu细胞的凋亡率明显增加。
  4.姜黄素和白藜芦醇促进Hep2细胞和Fadu细胞中Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。
  10μM的姜黄素和20μM白藜芦醇可以促进Hep2细胞和Fadu细胞中促凋亡蛋白Bax的表达,同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达;10μM姜黄素和20μM白藜芦醇联合处理后,Bax的蛋白表达水平和mRNA表达水平均显著增加,而Bcl-2的蛋白表达水平和mRNA表达水平均显著降低。
  结论:姜黄素与白藜芦醇联合处理可降低Hep2细胞和Fadu细胞的存活率,抑制细胞集落的形成并促进细胞的凋亡。姜黄素与白藜芦醇促进Hep2细胞和Fadu细胞凋亡的作用机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达有关。
[硕士论文] 王礼华
流行病与卫生统计学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部肿瘤(Head and neck carcinoma,HNC)为全球范围内第六大常见肿瘤类型,约占全部恶性肿瘤的6%。每年新发病例超过60万,其中2/3在发展中国家。头颈部肿瘤主要起源于上呼吸道、上消化道黏膜,包括口腔、咽(鼻咽、口咽、喉咽)及喉部,其中约90%的病理类型是鳞状细胞癌(Head and necksquamous cell carcinoma,HNSCC)。除鼻咽癌(与EB病毒感染有关)以外,吸烟、饮酒以及HPV感染等通常被认为是头颈部鳞癌的重要危险因素。
  线粒体中进行的有氧呼吸和氧化磷酸化过程是真核细胞的主要能量来源。通过参与能量和物质代谢等过程,线粒体影响着真核细胞和生物的生长、发育以及功能实现等众多方面。影响线粒体的遗传物质统称为线粒体基因组,包括部分核DNA和线粒体DNA,二者的共同作用才能确保线粒体发挥正常的功能。相对于核DNA,线粒体DNA由于其特殊的结构和高浓度活性氧外环境,更容易发生突变,突变率高出10-200倍。线粒体DNA中的点突变以及拷贝数变异都可能导致线粒体的功能异常。线粒体功能异常会抑制细胞的氧化磷酸化过程,导致机体内ROS大量产生和富集,从而引起机体氧化应激反应和核DNA与线粒体DNA突变与损伤,最终引起和促进肿瘤的发生。正常组织中会因为能量需求的不同,导致组织间线粒体DNA拷贝数的差异,但是同一种组织中拷贝数会相对保持稳定,以维持正常的生理功能。线粒体DNA拷贝数可以受到遗传因素和环境因素两方面共同调控,其变化一定程度上反映了年龄、吸烟、氧化损伤反应等多种影响肿瘤发生发展的因素对细胞、组织以及机体的作用情况。因此线粒体DNA拷贝数有可能成为一种预测肿瘤发生风险的生物标志物。目前,多篇流行病学研究已经对外周血中线粒体DNA拷贝数与不同肿瘤发病风险的关系进行了探讨,但这些研究结论相互之间并不一致。6篇报道线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌以及癌前病变发病风险关联的研究相互之间的结果也不一致。因此,还需要进一步开展大样本研究明确线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌发病风险之间的关系。
  本研究采用病例对照设计研究外周血线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌发病风险的关系。病例为江苏地区医院来源的570例新发头颈部鳞癌病例,对照样本为来源于江苏地区社区慢病筛查人群的597例健康个体。采用定量PCR方法检测线粒体DNA拷贝数,利用特异性引物分别扩增同一个体外周血线粒体DNA中ND1序列的拷贝数和核基因HGB序列拷贝数,通过ND1序列和HGB序列拷贝数的比值相对定量线粒体DNA拷贝数。采用盲法、复孔平行设置和重复检测等质量控制措施以保证线粒体DNA拷贝数检测的准确性。采用Logistic回归模型以及限制性立方样条函数分析线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌发病风险的关联,计算比值比(OR)和95%可信区间(95%CI)。
  研究结果显示,病例组线粒体DNA拷贝数的中位值为4.33(1.38-29.85),对照组的中位值为3.50(1.93-11.19),前者高于后者,差异有统计学意义(P=0.016)。按照对照组线粒体DNA拷贝数值将研究对象四等分为四组,关联分析结果显示,头颈部鳞癌发病风险与线粒体DNA拷贝数之间呈U型相关。以线粒体DNA拷贝数第二等分位点线粒体DNA拷贝数个体作为对照组,第一等分位点和第四等分位点的个体其头颈部鳞癌发病风险显著增加,OR(95%CI)值分别为1.95(1.37-2.76)和2.16(1.53-3.04)。此外,限制性立方样图的结果发现二者关联成U型相关。
  本研究在中国汉族人群中探讨了线粒体DNA拷贝数变化与头颈部鳞癌发病风险之间的关联,发现线粒体DNA拷贝数过高或者过低都有可能与头颈部鳞癌发病风险升高有关。本次研究的结论为指导头颈部鳞癌高危人群的筛查和早期诊断提供了理论和技术支持,也为进一步研究头颈部鳞癌发病机制提供了一定线索。
[博士论文] 曲鑫
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC),是威胁人类健康的主要肿瘤之一,已成为全球第六大好发肿瘤。HNSCC患者的5年生存率不足50%,世界范围内致死率排名第五。恶性增殖和化疗抵抗是HNSCC重要的临床表现。因此,探究HNSCC增殖及化疗抵抗的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,将成为改善头颈部鳞癌患者治疗效果的重要突破口。
  EGFR是一种广泛分布于哺乳动物的细胞表面受体,在细胞的分化、生长和增殖等各个生理过程发挥重要作用。在多种恶性肿瘤的细胞中,EGFR的表达均高于正常细胞。在90%以上的头颈鳞癌中,EGFR表达升高。以此为基础,临床上使用针对EGFR的靶向药物,进行靶向治疗。但当EFGR发生突变时,便会导致临床药物的耐药。现已发现许多EGFR突变型,其中最常见的是EGFRvIII型(the type III EGF deletion-mutants receptor)。
  β-catenin作为Wnt的信号传导途径,是其重要的组成成分,主要参与了基因的表达,和介导细胞的黏附。目前的研究表明,β-catenin基因突变及过表达,与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。而作为一种丙酮酸激酶的同工酶,PKM2(Pyruvate kinase isozyme thpe M2)不仅在糖酵解过程中发挥重要功能,还能够影响β-catenin的活性及下游基因的转录。
  本研究对头颈鳞癌中EGFR wt/vIII调控肿瘤细胞生长及化疗抵抗的功能和分子机制进行了以下实验研究。研究共分为三个部分:
  第一部分:我们分别对5个头颈鳞癌细胞系处理并提取蛋白,采用Western blot的方法检测细胞中EGFR的表达水平,并选取了UM1和SCC25两个细胞系,建立了野生型及vIII突变型的两种细胞系,应用克隆形成实验和CCK8细胞增殖实验来检测其细胞的增殖能力;通过流式细胞术及药敏实验,来检测细胞对顺铂的抵抗能力。
  第二部分:对EGFR野生型细胞进行EGF处理后,应用Western blot及免疫荧光检测PKM2入核的水平。然后对EGFR野生型及突变型细胞同时进行EGF处理,通过Western blot检测PKM2入核情况及β-catenin的活性。通过分析GEO数据库,探究头颈鳞癌中PKM2与β-catenin的表达情况及相关性。
  第三部分:根据文献报道,R399/400位点对PKM2入核至关重要,因此,我们建立了PKM2高表达及R399/400A突变型稳定克隆,应用Western blot方法检测 PKM2入核对β-catenin通路、下游基因表达的影响。通过CCK8增殖实验、克隆形成实验、流式细胞术检测头颈部鳞癌细胞中PKM2入核对细胞增殖及顺铂抵抗的影响。
  结果:
  在UM1、SCC25野生型及vIII突变型的两种细胞系中,我们发现,无论有无EGF的刺激,vIII突变型细胞系的生长、增殖速度更快。vIII突变型细胞系的平板克隆形成能力及顺铂抵抗能力也强于野生型细胞系。在UM1、SCC25野生型及vIII突变型的细胞系中,应用β-catenin抑制剂FH535进行处理后发现,两种细胞系的增殖均受到了抑制,但EGFR vIII突变型的细胞系可抵抗β-catenin抑制剂的抑制效果。这表明,在头颈鳞癌中,EGFR vIII突变型细胞系的β-catenin活性更高。因此我们认为,EGFR vIII可能通过调控β-catenin通路介导了头颈鳞癌的增殖和顺铂抵抗。
  通过对HNSCC细胞系的检测和GEO数据库的分析,我们发现在头颈鳞癌中, PKM2和β-catenin均高表达,且二者呈正相关关系。在应用EGF刺激后,EGFR被激活,从而介导PKM2的入核。同时我们发现,相比于野生型细胞系,EGFR vIII能够促进PKM2的入核,并增加β-catenin的磷酸化水平,也再一次证明了EGFR vIII突变型细胞系的β-catenin活性更高。
  在R399/400位点突变后,PKM2的入核受到了抑制,导致β-catenin通路活性降低,且β-catenin下游基因CCND1的表达下调。我们发现PKM2高表达后,头颈鳞癌细胞的细胞增殖能力、克隆形成能力及顺铂抵抗能力显著升高,而R399/400位点突变后,上述功能则与对照组无明显差异。
  结论:
  1.在头颈鳞癌中,EGFR wt/vIII介导细胞的增殖与顺铂抵抗。
  2.在头颈鳞癌中,EGFR wt/vIII型细胞的β-catenin通路活性升高。
  3.在头颈鳞癌中,PKM2与β-catenin呈正相关关系。EGFR wt/vIII可促进PKM2入核,激活β-catenin通路。
  4. PKM2 R399/400对其入核至关重要,从而影响β-catenin通路活性及下游基因的表达,介导头颈鳞癌细胞的增殖与耐药。
[硕士论文] 李跃楠
生物工程 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部肿瘤(head and neck cancer,HNC)是世界范围内第六大常见的恶性肿瘤,位居肿瘤相关死亡原因第八位。90%以上的HNC属于由粘膜上皮发展形成的鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC),恶性程度较高,在癌症早期即可浸润转移至远端组织器官。目前,HNC临床治疗以患者发病部位和肿瘤浸润转移分级为基础,大多采用手术、放疗和化疗等治疗策略。虽然近几年,手术、化疗和放疗已取得很大进展,但是临床上HNC患者的生存率和生活质量并没有得到显著改善。因此,急需开发针对HNC新型的治疗方案。
  目前,生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种最有效的肿瘤治疗策略。其中,复制选择性溶肿瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus, RSOA)是肿瘤生物治疗研究中发展较快、极具前景的一种新型抗肿瘤药物。以RSOA为载体的病毒免疫基因治疗不仅可以发挥溶肿瘤病毒自身对肿瘤细胞的裂解、杀伤作用,而且可以通过基因工程技术插入外源免疫调节基因,使其随着病毒的选择性复制,在肿瘤组织局部高表达,从而增强 RSOA抗肿瘤作用。2005年,我国首次批准了世界上第一个溶肿瘤腺病毒药物H101(上海三维公司),在临床上主要用于HNC的治疗。越来越多的研究结果提示RSOA有望成为下一个最具突破性的肿瘤免疫治疗方法。
  白介素-12(Interleukin-12,IL-12)是最具抗肿瘤潜能的细胞因子之一,通过对肿瘤微环境中不同的免疫细胞产生多重效应,成为连接先天性免疫和适应性免疫的桥梁。IL-12持久有效的抗肿瘤反应往往伴随严重的血液学毒性,因此,需要研究有效的策略,降低IL-12系统性表达。基于此,本实验室前期构建了表达非分泌型IL-12(Non-secreting IL-12,nsIL-12)的新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001(Ad-TD-nsIL-12),即以Ad-TD(专利号ZL200910066130.4)为骨架病毒,采用基因工程技术,在腺病毒基因组中插入nsIL-12基因。在前期胰腺癌动物模型中证实BioTTT001具有高效、低毒的抗肿瘤效果。
  免疫缺陷小鼠荷人源移植瘤模型,因为其不能支持人5型腺病毒(Adenovirus5,Ad5)复制,所以无法全面评价溶肿瘤腺病毒的安全性和有效性,而且也无法研究溶肿瘤腺病毒对机体免疫系统的影响。与小鼠类动物模型相比,叙利亚仓鼠支持Ad5复制,因此作为支持腺病毒复制的免疫健全的动物模型广泛应用于溶肿瘤腺病毒的研究中。
  为了研究新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001对HNC的治疗作用,本课题通过一系列体外和体内实验,分析BioTTT001在HNC细胞中的复制、杀伤能力以及在叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤模型中的抗肿瘤效果,初步探讨其抗肿瘤作用机制,该研究为BioTTT001的临床转化奠定基础。
  第1章:新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001体外抗肿瘤能力的研究
  方法:
  1.采用不含抗生素的LB液体细菌培养基,37℃过夜摇菌,检测该课题所用病毒是否存在细菌污染;采用聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR),利用支原体特异性引物,检测病毒是否存在支原体污染。
  2.采用结晶紫染色法、MTS法及流式Annexin V-FITC/PI双染色法,检测新型溶肿瘤腺病毒 BioTTT001对不同肿瘤细胞的杀伤作用以及对细胞凋亡水平的影响。
  3.采用半数组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)和酶联免疫反应方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测BioTTT001在肿瘤细胞中的复制能力及人IL-12(human IL-12,IL-12)表达水平。
  4.统计学处理:实验数据采用Graphpad Prism5.0进行分析处理,对于多个样本的均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)并进行多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test),P<0.05表示具有统计学差异。
  结果:
  1.本课题所用新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001、骨架病毒Ad-TD-Luc及对照病毒dl1520均不存在细菌和支原体污染。
  2.叙利亚仓鼠HNC细胞HCPC I及人鼻咽癌细胞C666-1感染三种病毒后,细胞发生不同程度的病变,HCPC I及C666-1细胞EC50值显著低于SCC7;新型溶肿瘤腺病毒 BioTTT001在多种不同来源的人肿瘤细胞中的 EC50值小于0.5。病毒感染48h,HCPC I细胞及C666-1细胞均发生不同程度的凋亡,而小鼠鳞状细胞癌SCC7则无明显凋亡。
  3.新型溶肿瘤腺病毒 BioTTT001的复制能力与对照病毒 dl1520相似;病毒在C666-1细胞中的复制水平在48h即可达到峰值,而在HCPC I细胞中复制水平较低,随感染时间的延长逐渐升高。hIL-12在HCPC I和C666-1均有表达,表达量随感染时间的延长而逐渐升高。多种不同组织来源的人肿瘤细胞均支持hIL-12表达。
  第2章:新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001体内抗肿瘤效果及机制的研究
  方法:
  1.分别将5.0×106和1.0×107HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,观察并测量皮下肿瘤形成的时间及大小;采用苏木素-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察肿瘤组织内部细胞形态。
  2.将1.0×107HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,当肿瘤体积达到350mm3时,进行分组,分别为PBS、dl1520、Ad-TD-Luc和BioTTT001组,每组7只,进行瘤内治疗;第一个动物实验采用2.0×108PFU病毒,六次连续治疗,即d1、2、3、4、5和6;第二个动物实验采用2.0×108PFU病毒,六次间隔治疗,即d1、3、5、7、9和11;第三个动物实验采用5.0×107PFU病毒,六次间隔治疗,即d1、3、5、7、9和11;每周测量两次肿瘤体积大小,采用Graphpad Prism5.0绘制肿瘤生长曲线。
  3.将1.0×107HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,当肿瘤体积达到350mm3时,分为四组,即PBS、IgG、GK1.5和4F11组,分别腹腔注射PBS、对照抗体IgG、删除抗体4F11(抗CD3抗体)和删除抗体GK1.5(抗CD4抗体);24h后,瘤内注射PBS或BioTTT001(5.0×107PFU病毒,d1、3、5、7、9和11);每周注射两次抗体,至实验结束。
  4.经过BioTTT001治疗后,皮下肿瘤完全清除的叙利亚仓鼠,在其左侧重新接种两倍剂量的HCPC I细胞(2.0×107),同时腹腔注射删除抗体4F11,观察肿瘤细胞二次接种后的成瘤情况。
  5.统计学处理:实验数据采用Graphpad Prism5.0进行分析处理,对于多个样本的均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)并进行多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test),P<0.05表示具有统计学差异。
  结果:
  1.皮下接种1.0×107HCPC I细胞成瘤效果优于低剂量5.0×106;HE染色后,肿瘤组织呈现典型的肿瘤结构形态。
  2.在叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤模型治疗中,瘤内间隔治疗,其抗肿瘤效果优于连续治疗;降低病毒治疗剂量后,BioTTT001治疗组肿瘤清除率达到85.7%,抗肿瘤效果显著优于骨架病毒和对照病毒。
  3.删除叙利亚仓鼠体内CD4+T淋巴细胞后,新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001依然具有较强的抗肿瘤作用,而删除CD3+T淋巴细胞后,BioTTT001抗肿瘤作用则显著降低。
  4.新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001治疗后,皮下肿瘤完全清除的叙利亚仓鼠左侧背部皮下再次接种HCPC I细胞,不能再次成瘤;而同时接受腹腔注射4F11抗体的叙利亚仓鼠,则可以再次成瘤,且肿瘤生长迅速。
  结论:
  1.新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001对叙利亚仓鼠HNC细胞HCPC I及人鼻咽癌细胞C666-1敏感程度高于小鼠鳞状细胞癌细胞,且对一系列人源肿瘤细胞有很强的杀伤作用,有望在临床上用于多种不同肿瘤的治疗。
  2.溶肿瘤腺病毒瘤内间隔治疗,其抗肿瘤效果优于连续治疗;新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001能够有效地抑制叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤的生长,且抗肿瘤效果显著优于第一代溶肿瘤腺病毒dl1520。
  3.新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001可以引发机体长期的抗肿瘤免疫保护作用,且BioTTT001发挥抗肿瘤作用主要由CD3+T淋巴细胞所介导。
[博士论文] 李慧
耳鼻咽喉科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部鳞状细胞癌占全身恶性肿瘤发病率的第六位,2015年我国头颈部恶性肿瘤癌发病约225,000例,死亡77,500例,其中以头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)最为常见,常发生于鼻腔、鼻窦、口腔、咽部和喉部等部位的黏膜上皮,具有发病隐匿、侵袭性强、容易复发和转移、预后差、有较高的致死率和致残率等特点,手术治疗为主辅以放、化疗的联合治疗方法虽然有效地改善了患者的生活质量,但不能显著地提高患者术后5年生存率。因此,研究者的关注点正在逐渐转向靶向精确治疗,弥补传统治疗策略的不足,达到提高患者生存率目的。
  近年来,随着纳米医学的不断发展,学者们相继报道了许多应用纳米载体制剂提高HNSCC诊断治疗效率的研究,如:口腔癌周局部注射高载药量淋巴结靶向平阳霉素活性炭纳米微粒,相较平阳霉素取得更好治疗效果;用载反义表皮生长因子受体(EGFR)寡核苷酸纳米颗粒转染小鼠人头颈鳞癌SCC VII细胞,阻断EGFR表达并联合4Gy放射治疗,具有放疗增敏效应;纤维连接蛋白模拟肽(FMP)与羧基化氧化铁纳米粒子(IO)共轭结合并搭载光动力疗法(PDT)药物PC4,靶向肿瘤整合素β1配体,对人头颈鳞癌鼠移植瘤给药后药物靶向肿瘤富集,较游离PC4具有更高的抑瘤作用并且可明显减少PC4用药剂量,有效降低机体药物毒性。
  纳米载体药物的优点包括:
  1、纳米药物经化学或物理修饰,如:肿瘤特异性抗体,肽,小分子和寡核苷酸,可实现靶向给药;
  2、纳米载体可提高药物的生物相容性,制备不溶或难溶于水药物的注射剂型,提高靶细胞对药物的摄取率;
  3、减小用药剂量,有效降低药物毒副作用;
  4、保护药物活性:在循环过程中可起到与机体组织隔绝的作用,避免体内某些活性成分对药物活性的降解和破坏。
  大量的体外或动物实验证实DHA对多种肿瘤具有杀伤作用,其中DHA具有明确的杀伤HNSCC作用。但要开发DHA为抗肿瘤药物,将受到DHA自身物化特性的限制,如:DHA不溶于水、难溶于脂质,普通固态制剂不能达到有效抑瘤血药浓度;血浆T1/2仅有34~90min等,促使当今国内、外对DHA的研究不断深入,期待通过改变剂型实现延长DHA有效血药浓度时间、提高DHA生物相容性的目的。DHA与纳米载体结合,就是一种有效的改善手段。
  基于上述观点,本研究设计磁性纳米粒与脂质体结合搭载DHA(DHA-Mag-NL)纳米粒,提高DHA的生物相容性、保护DHA活性,达到提高DHA血药浓度、延长DHA T1/2的目的,为开发DHA作为临床抗肿瘤药物提供条件和实验基础。实验大体分为三部分:
  第一部分:磁性双氢青蒿素纳米脂质体的制备及表征特性鉴定
  目的:
  优化纳米磁性载药脂质体的合成条件,构建DHA-Mag-NL并检测相应关键表征,以达到静脉用药要求。
  方法:
  1.采用改良化学沉淀法合成Fe304,观察其磁响应性和磁稳定性。
  2.通过路易斯酸催化反应合成PEG-DHA,定量后建立浓度标准曲线方程。
  3.采用逆向蒸发法合成DHA-Mag-NL磁靶向纳米脂质体,通过检测其包封率优化合成配方。
  4.检测优化配方合成的DHA-Mag-NL磁靶向纳米脂质体相应关键表征参数,作为载药系统评价指标。
  结果:
  1.磁性Fe3O4纳米粒子具有很好的磁响应性和超顺磁性。
  2.建立PEG-DHA溶液标准浓度曲线回归方程,y=55.48x-1.571,R2=0.999,线性良好。
  3.L9(34)正交实验得到最佳配方为PC:CH(w/w)4:1, PC: DHA(w/w)20:1,PC:Mag(w/w)10:1,DHA:PEG(m/m)1:10,可制得具有较高包封率的DHA-Mag-NL磁性脂质体纳米粒;影响磁性脂质体包封率的各影响因素的重要性依次递减为:PC:CH(因素A)> DHA:PEG(因素D)>PC:Mag(因素C)>PC:DHA(因素B)。
  4.DHA-Mag-NL纳米脂质体最佳配方的PEG-DHA包封率为82.12±0.91%;载药量为5.87±0.06%;PEG-DHA含药量为2.46±0.03mg;粒径在209.10±4.92nm范围,PDI=0.25±0.02,粒径均匀;粒子所带电荷数为
  -37.13±1.01mV。
  5.DHA-Mag-NL纳米粒在4℃条件下保存3个月,其粒径与包封率两项关键物理参数经统计学分析与初始合成完毕时没有明显差异(P>0.01);DHA-Mag-NL纳米粒在-20℃和室温(25℃)条件下保存3个月,其粒径与包封率两项关键物理参数经统计学分析与初始合成完毕时有明显差异(P<0.01)。
  结论:
  成功合成DHA-Mag-NL磁靶向纳米脂质体DHA载药系统。
  第二部分:磁性双氢青蒿素纳米脂质体体外靶向作用的研究
  目的:
  观察磁场作用下DHA-Mag-NL的靶向分布情况,初步验证DHA-Mag-NL的靶向作用。
  方法:
  1.Hep-2和Cal-27细胞给予 DiI标记DHA-Mag-NL,在磁场和无磁场作用下共孵育取1h,DAPI复染,荧光显微镜观察DHA-Mag-NL磁靶向作用。
  2.KM Mice小鼠麻醉后,尾静脉注射等剂量 DiI荧光标记的DHA-Mag-NL悬液,左肾暴露于4500高斯磁场中1h,对比左、右侧肾脏铁染色组织切片;对比左、右侧肾组织冰冻切片荧光染色图像。
  结果:
  1.在磁场作用下Hep-2、Cal-27细胞给予DiI荧光标记的DHA-Mag-NL悬液共孵育1h,DiI荧光强度和细胞结合磁粒(Fe3O4)数量均明显高于无磁场作用下的Hep-2、Cal-27细胞。
  2.尾静脉注射DiI荧光标记的DHA-Mag-NL悬液,小鼠左肾在磁场作用下与无磁场作用的右肾组织相比荧光强度有显著差异;常规组织切片铁染色观察,左肾在磁场作用下与无磁场作用的右肾组织相比,左肾局灶可见明显蓝色颗粒;右肾未见明确蓝色颗粒,两者差别显著。
  3.体内外靶向实验结果提示DHA-Mag-NL纳米颗粒在体内外都具有较强的磁靶向性。
  结论:
  初步验证磁性双氢青蒿素纳米脂质体具有体内外靶向作用。
  第三部分:磁性双氢青蒿素纳米脂质体对人舌鳞癌CAL-27细胞系及喉癌Hep-2细胞系的体外增殖抑制作用的研究
  目的:
  观察DHA-Mag-NL磁性纳米脂质体对Cal-27及Hep-2细胞系的体外抑制作用。
  方法:
  1.MTT法检测不同干预时间时,DHA-Mag-NL浓度梯度对Hep-2和Cal-27细胞增殖的影响。
  2.设立实验分组:对照组、DHA组、DHA-Mag-NL组和磁场作用DHA-Mag-NL组,流式细胞技术检测DHA浓度40μM在不同干预时间对Hep-2和Cal-27细胞周期的影响。
  3.设立实验分组:对照组、DHA组、DHA-Mag-NL组和磁场作用DHA-Mag-NL组,流式细胞技术检测DHA浓度40μM在不同干预时间对Hep-2和Cal-27细胞凋亡的影响。
  结果:
  1.MTT法检测DHA-Mag-NL对Hep-2和Cal-27肿瘤细胞作用24h和48 h,可抑制肿瘤细胞增殖,且与药物剂量及干预时间呈依赖关系。IC50值分别为28.66μM和15.67μM,41.75μM和11.86μM。相对于Hep-2细胞,DHA-Mag-NL对Cal-27细胞干预24h的增殖抑制作用稍弱。
  2.以DHA浓度为准(60μM),药物作用24h后,流式细胞技术检测细胞周期,两种HNSCC细胞在DHA和磁场中DHA-Mag-NL靶向干预下与对照组相比,具有明确的细胞周期 G0/G1期阻滞作用(P<0.01);Hep-2细胞在DHA-Mag-NL干预下与对照组相比,具有细胞周期G0/G1期阻滞作用(P<0.01);Cal-27细胞在DHA-Mag-NL干预下与对照组相比,细胞周期分布比例无统计学差异(P>0.05)。检测结果表明:DHA-Mag-NL对Cal-27细胞抑制作用相应较弱。
  3.以DHA浓度为准(60μM),药物作用24h后,流式细胞技术检测细胞凋亡,两种HNSCC细胞在DHA、DHA-Mag-NL和磁场中DHA-Mag-NL靶向干预下与对照组相比,早期和晚期凋亡细胞比例显著增加(P<0.01);DHA-Mag-NL在非靶向作用下对细胞凋亡影响明显弱于DHA和磁场中DHA-Mag-NL靶向干预作用(P<0.01);统计学分析显示,DHA-Mag-NL靶向作用24h对Cal-27肿瘤细胞的促凋亡作用弱于DHA的促凋亡作用(P<0.01)。
  结论:
  DHA-Mag-NL可抑制Hep-2和Cal-27肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,且与药物剂量及干预时间呈依赖关系。
[博士论文] 姚春萍
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:通过研究18F-FLT PET/CT在头颈部鳞癌中的成像,分析肿瘤原发灶的18F-FLT摄取与TNM临床分期、Ki-67指数的相关性;结合18F-FLT PET/CT功能影像结果重新进行临床分期,探讨功能影像对基于解剖学影像技术的临床分期的影响。
  通过研究头颈部鳞癌抗肿瘤治疗前肿瘤原发灶的18F-FLT摄取情况,比较不同摄取值勾画的肿瘤体积与大孔径CT定位勾画的大体肿瘤区(Gross Tumor Volume,GTV)体积,寻找最适合评价头颈部鳞癌放射治疗生物靶区的18F-FLT界值,以指导肿瘤生物靶区的精确勾画,从而指导个体化的生物调强放射治疗的精确实施。
  通过18F-FLT PET/CT在头颈部鳞癌治疗前、治疗中、治疗后的多次成像,分析18F-FLT摄取变化与放射治疗疗效的相关性。研究放射治疗前的18F-FLT摄取(增殖参数)与解剖学影像的肿瘤退缩的相关性,探讨功能影像可否为放射治疗GTV内需要局部加量的区域提供有用信息。
  研究方法:纳入标准:病理确诊为头颈部鳞癌拟行放射治疗的初诊患者。排除标准:kps评分<60分;临床或影像学证实有远处转移;既往接受过手术或放化疗;既往或目前合并有其他恶性肿瘤。入选患者治疗前均接受常规病史采集、体格检查、咽部颈部MRI/CT、胸部X线片、心电图、腹部B超、全身骨放射性核素扫描、血常规、血型、肝肾功能、电解质、血糖、梅毒及病毒血清学,电子咽喉镜并活检,组织病理学检查,活检组织行免疫组化染色测Ki-67指数。完善检查后对所有患者按照AJCC第七版进行cTNM分期。抗肿瘤治疗前给予18F-FLT PET/CT扫描检查,18F-FLT PET/CT扫描条件为:静脉注射3.7MBq/Kg(0.lmci/Kg)放射性核素,注射造影剂后休息60分钟然后给予扫描。读取原发灶18F-FLT显像部位的标准摄取值(Standard Uptake Value,SUV)、包括最大SUV(maximal SUV, SUVmax)、平均SUV(mean SUV,SUVmean),分析其与TNM分期、Ki-67指数的相关性。本课题均使用SPSS Statistics Software19.0统计分析。变量间的相关性使用Spearman检验。P值<0.05定义为具有统计学意义。结合18F-FLT PET功能影像检查结果,临床肿瘤医生对所有患者重新按AJCC TNM分期系统进行分期。
  入组患者给予大孔径CT定位,影像资料传输至ADAC Pinnacle放射治疗计划系统,肿瘤放射治疗科医生在对18F-FLT PET结果不知情的情况下勾画肿瘤原发灶的GTV,定义为GTVTPS。已勾画GTV的定位CT资料和18F-FLT PET/CT的资料都导入MIMvista software。刚性融合CT和18F-FLT PET/CT,软件自动读取勾画并结合肿瘤放射治疗科医生目视判读法修改,获得以下不同阈值的体积:30%SUVmax、40%SUVmax、50%SUVmax、60%SUVmax、70%SUVmax、SUV1.3、SUV1.4、SUV1.5;分别定义为V30%SUV、V40%SUV、V50%SUV、V60%SUV、V70%SUV、VSUV1.3、VSUV1.4、VSUV1.5并与GTVTPS融合比较。采用SPSS Statistics19.0进行统计分析。应用配对T检验比较不同勾画方式所得的体积与GTVTPS的体积;再把无统计学差异的组别与GTVTPS采用秩和检验进行分析,以期找到功能影像18F-FLT PET最适合评价头颈部鳞癌原发灶的FLT界值。
  入组患者于放射治疗50-56Gy行诊断性MRI/CT检查,对肿瘤原发灶进行疗效评价,采用实体瘤的疗效评价标准1.1(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors、RECIST)对肿瘤原发灶进行评估。在放射治疗前、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy、70Gy给予连续18F-FLT PET/CT扫描,每例患者至少行3次扫描,监测肿瘤原发灶18F-FLT摄取变化,探讨其与临床疗效的关系。每例患者于放射治疗56Gy行大孔径CT复位,影像资料传输至ADAC Pinnacle放射治疗计划系统,肿瘤放射治疗科医生勾画肿瘤原发灶的GTV2,定义为GTVTPS2。已勾画GTV的复位CT资料导入MIMvista software,将基线18F-FLT PET/CT的V60%SUV、V70%SUV、VSUV1.5与GTVTPS2比较。采用SPSS Statistics19.0进行统计分析。应用配对T检验比较不同勾画方式所得的体积与GTVTPS2,以期找到功能影像18F-FLT PET可以预测头颈部鳞癌原发灶解剖学影像退缩的FLT界值,为局部加量提供功能影像信息。结果:本课题为前瞻性研究,研究方案已经上报山东省肿瘤医院伦理委员会审批,获得批准后执行。所有入组的患者均给予知情告知,并签署知情同意书。2010年10月到2014年7月共30例头颈部鳞癌患者入组,其中男性25例(83.3%),女性5例(16.7%),年龄在32-69岁(中位年龄:51岁),鼻咽癌22例,下咽癌8例,所有患者根据AJCC第七版TNM分期标准进行临床分期,其中Ⅱ期2例(6.7%),Ⅲ期14例(46.7%),Ⅳ期14例(46.7%)。抗肿瘤治疗前行18F-FLT PET/CT扫描成像,30例患者的肿瘤原发灶均呈18F-FLT放射性浓集, SUVmax范围为3.53-8.29,中位数4.58;SUVmean范围为1.05-3.53,中位数2.56。肿瘤原发灶的SUVmax、SUVmean与T分期有相关性,SUVmax、SUVmean与T分期的r分别为0.801和0.542,p分别为<0.001和0.002,均<0.05;SUVmax、SUVmean与总分期无相关性,r分别为0.349和0.326,p分别为0.058和0.079,均>0.05。SUVmax、SUVmean与Ki-67指数无相关性,r分别为0.022和0.167,p分别为0.909和0.377。
  结合18 F-FLT PET/CT对入组患者重新行cTNM分期,共11例患者的T分期和/或N分期发生改变,其中4例T分期发生改变,8例N分期发生了改变。最终使9例患者总分期发生改变,其中5例表现为总分期的降期;4例表现为总分期的升期:III期降为II期2例,IVb期降为IVa期1例,IVa期降为III期2例;II期升为III期1例,III期升为IVa期2例,IVa期升为IVb期1例。
  配对t检验示V30%SUV、V40%SUV、V50%SUV、V60%SUV、V70%SUV、VSUV1.5与GTVTPS的体积的差别具有统计学意义,p均<0.001。VSUV1.3和VSUV1.4与GTVTPS体积的差别均无统计学意义,p分别为0.610、0.226。VSUV1.3、VSUV1.4和GTVTPS再采用秩和检验,p=0.713,差别无统计学意义。
  通过在放射治疗前、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy、70Gy给予连续18F-FLT PET/CT扫描,表明动态18F-FLT摄取可以很好的监测头颈部鳞癌治疗过程中肿瘤增殖的逐渐降低。Spearman相关分析结果示,基线18F-FLT摄取SUVmax与临床疗效无相关性,r=0.236,p=0.209。21例患者放射治疗DT20Gy时重复18F-FLT PET/CT,SUVmax明显下降,其差异有统计学意义。SUVmax下降48.59%是预测头颈部鳞癌放射治疗疗效的最佳阈值。30例入组患者肿瘤原发灶基线18F-FLT的70%SUVmax勾画的体积和放射治疗DT56Gy时肿瘤退缩后的GTVTPS2无统计学差异。
  结论:本课题通过对头颈部鳞癌患者行18F-FLT PET/CT扫描研究显示:所有原发肿瘤均有18F-FLT摄取。肿瘤原发灶18F-FLT PET的SUVmax、SUVmean与T分期有相关性,与总分期无相关性;与Ki-67指数无相关性。结合18F-FLT PET/CT可以为患者基于解剖学影像的临床分期提供有关肿瘤细胞增殖的信息,获得更准确的分期,从而指导治疗策略的选择和优化。
  18F-FLT PET/CT的SUV1.3,SUV1.4勾画的GTV体积与大孔径CT勾画的GTVTPS体积之间无统计学差异。依据功能影像18F-FLT PET/CT资料指导的生物靶区勾画需要待放射生物学的研究、手术切取病变组织的病理学检查结果和免疫组化结果的进一步验证,从而真正应用于临床,更好的指导BIMRT的真正实现。
  序贯的18F-FLT PET/CT检查中动态的18F-FLT摄取可以很好的监测头颈部鳞癌治疗过程中肿瘤增殖的逐渐降低。放射治疗至DT20Gy时SUVmax下降48.59%是预测头颈部鳞癌放射治疗临床疗效的最佳阈值。肿瘤原发灶基线18F-FLT的70%SUVmax勾画的体积和放射治疗DT56Gy时肿瘤退缩后的GTVTPS2无统计学差异。下一步可继续深入研究探讨此高增殖活性区域用于临床放射治疗局部加量的可行性。
[硕士论文] 龚文丹
耳鼻咽喉头颈外科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  循环血液中活性肿瘤细胞的检测被看作是液体活检,具有动态监测的功能,在肿瘤早期诊断、个体化治疗、疗效评价、预后判断等方面具有重要的临床意义,然而由于其在血液中数量很少,循环肿瘤细胞(circlulating tumor cells,CTCs)的分离和鉴定成为临床应用的难点。复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad11-5ETel-GFP是一种通过同源重组获得的病毒,可以选择性的在具有端粒酶活性的细胞内复制并表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)。本研究旨在利用该病毒捕获循环肿瘤细胞,从而建立一种可重复、简单、无创的检测方法,并对该检测方法的可靠性和临床应用价值进行探讨。
  方法:
  首先通过实验验证我们所建立的方法能够有效捕获到肿瘤细胞,包括:将AD11-5ETel-GFP病毒加入正常人外周血中,观察GFP在正常白细胞的表达情况;将A549(肺癌细胞系),SKBR3(乳腺癌细胞系)分别以10、50、100个细胞三个梯度加入1ml人外周血中,建立循环肿瘤细胞的模型并检测其回收率;使用抗人CD45抗体进行细胞免疫染色,荧光显微镜下观察结果。以上结果说明本实验建立的新型检测方法能有效的捕获循环细胞。将该方法应用于头颈部恶性肿瘤的患者,收集临床标本48例,将标本中红细胞裂解,加入病毒于37℃条件下孵育24h,固定涂片后于荧光显微镜下观察计数。并分析不同临床参数头颈部肿瘤患者术前外周血CTCs的检出情况。
  结果:
  1.复制选择性溶肿瘤病毒不感染正常人白细胞。
  2.分别于正常人外周血中加入的10,50,100个A549、SKBR3细胞,其检出率分别为77.5%,84.0%,80.25%;80.0%,82.5%,81.25%,应用pearson卡方检验比较两组间差异,结果显示用溶肿瘤腺病毒法检测两组不同的肿瘤细胞,其检出率无显著差异,即本实验所研究的方法对各肿瘤细胞系均敏感且回收率较高。并通过细胞免疫染色实验进一步验证所捕获的细胞为循环肿瘤细胞。
  3.在收集的48例头颈部恶性肿瘤的临床标本中,19例患者CTCs阳性,检出率为39.6%,且CTCs的检出率与性别、年龄、肿瘤分期、肿瘤的发病部位、淋巴结转移与否等临床参数无关,与肿瘤分化程度相关,肿瘤分化越差,CTCs的检出率越高。
  结论:
  本研究建立了一种新型循环肿瘤细胞的检测方法,初步确定了溶肿瘤腺病毒检测CTCs的标准,并对该方法的可靠性及临床应用价值进行了评估。该方法能够特异性示踪循环肿瘤细胞,具有重要的临床应用价值。
[硕士论文] 李睿聪
耳鼻咽喉科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:头颈部癌(HNC)是世界上第六大最常见的癌症,且为全世界癌症死亡相关的第八大死因。头颈部癌主要包括:口腔癌、涎腺癌、口咽癌、下咽癌、喉癌等。头颈部癌包括来自不同组织细胞和解剖部位的各种肿瘤类型。其中,超过90%是鳞状细胞癌。转移性颈部淋巴结的存在是影响头颈部癌治疗方法、治疗结果和治疗预后的最重要因素。文献中报道,超过50%的头颈鳞状细胞癌患者在诊断时存在区域性淋巴结受累。并且,颈淋巴结的转移减小了总体生存率将近50%。而颈动脉的受累是头颈部进展性鳞癌颈淋巴结转移的潜在结果,在进展期患者中,颈动脉(颈总动脉和/或颈内动脉)受累占头颈部鳞状细胞癌的颈淋巴结转移的5-10%。因此相当一部分患者,尤其为晚期癌、复发性癌,发现时已侵犯周围重要血管,这不仅可能会造成颈动脉的破裂出血,出现偏瘫,甚至死亡,而且外科手术造成以上风险也是极大的。文献中报道,涉及颈动脉受累外科手术的主要方式为:1)颈动脉壁外膜的剥离;2)与瘤体一起切除涉及的颈动脉并结扎颈动脉;3)在动脉切除时重建颈动脉。目前国内外专家所推崇的方式是切除并进行颈动脉的重建,主要优点是病灶切除的干净彻底,重建了颈部血运,脑部血供得到了保证。而沿动脉壁外层剥离,只有部分相对受累轻未侵及弹力膜的部分患者有可能采取此种方法。而颈动脉的结扎对于患者的影响是极大的,部分者可致偏瘫、死亡,临床采用时非常谨慎。而颈动脉的重建所要求的技术及条件较高,此外,不可忽视的是手术的相关并发症,如颈动脉的再出血,血栓栓塞事件,假性动脉瘤形成以及脑偏瘫的风险等等。
  近年来介入技术的发展为解决颈动脉受累难题提供了新方法,目前覆膜支架在头颈部血管病变中的应用已成为热点。部分研究报道了覆膜支架挽救晚期头颈部癌侵及颈动脉导致动脉破裂出血的案例,取得了不错的临床效果。我们临床使用也取得了满意的即时效果,但覆膜支架在头颈部癌方面的应用也仅仅局限于抢救性的止血以挽救生命,而未从根本上切除病灶进行探索。基于此项技术我们设想是否在受累区域以覆膜支架置入,保障血供、切除病变及受累动脉管壁,达到根治目的,为此我们开展了一系列探索。第一步试验验证覆膜支架替代颈动脉的可行性、安全性,通过动物试验实施验证。本研究在通过绵羊颈动脉模型中预置覆膜支架于局部假定受侵颈动脉处,而后手术切除受侵犯血管,观察术后出血情况及脑部血供是否能保证,以达到根治病灶的目的,延长其良好的生存状态。基于此设想,覆膜支架可以跨越血管破损处,而因“覆膜”的原因,支架可以起到“修复”作用,保证血流畅通。在此基础上,切除受侵部分动脉管壁,而支架可以保证受侵区段动脉壁切除后的血流的畅通及管壁因覆膜支架的作用而无渗漏、出血,为将来临床上肿瘤侵犯动脉管壁后,既能应对突发患者因局部动脉破裂出血的即时抢救,又能通过病灶区域预置覆膜支架,达到安全切除,提高临床根治率,为患者长期生存提供证据支持。
  方法:取自健康绵羊(85kg)的颈动脉作为试验模型(与正常人体颈动脉直径较为接近)。通过髂总动脉将自膨式覆膜支架置入颈动脉区域,而后手术打开支架所覆盖的颈动脉区域,切除覆膜支架覆盖的部分动脉壁,观察术区有无出血及支架松动;后期通过影像设备和手术观察术区有无出血、外漏及支架的扭曲、松脱及移位,记录实验动物的意识、活动等。
  结果:
  1.支架的置入
  剖腹经右侧髂总动脉,成功地运用导管、导丝将自膨式覆膜支架置入右侧颈总动脉,术后观察试验羊只未发现四肢运动障碍,进食和行为异常。影像设备监测显示:支架放置稳定,无松脱,扭曲及移位,血流状态稳定。
  2.手术切除拟定区域全周动脉壁
  通过影像学定位,于其体表定位区段,行外科手术,暴露支架所在的颈总动脉区域,成功地环形切除覆膜支架覆盖的全周动脉管壁(长约1cm),术中、术后观察覆膜支架区域切除后局部无血流渗漏,动脉血流完全通畅,观察绵羊生命体征平稳,无偏瘫、四肢活动障碍等。而影像设备监测显示术区在术中、术后再次开放复查无出血外漏,支架保持原位稳定,无扭曲、松脱及移位。
  结论:
  通过试验动物模型,该试验认为:1)覆膜支架在受侵颈动脉破裂时可以通过置入出血区段,从而保障颈动脉的完整性,保证其血流的通畅,可作为受侵颈动脉破裂时的抢救性的治疗手段。2)对于拟行受侵颈动脉切除患者,通过预先植入覆膜支架,再联合手术切除头颈部癌受侵颈动脉,达到在保证颈动脉血流通畅,保护脑部供血无明显影响情况下根治性切除病灶,延长患者生存期及生活质量的目的,为颈动脉受侵的进展期头颈癌的治疗提供安全有效地技术支持。
[硕士论文] 黄则雷
耳鼻咽喉科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过系统回顾的方法,对既往研究进行总结,评估二甲双胍对头颈鳞癌的抗肿瘤作用,根据系统评价的结果,为二甲双胍未来应用于头颈鳞癌的治疗中提供循证医学证据。
  方法:通过PICO原则预先制定检索策略,检索中文数据库:中国生物医学文献数据库(CBM),英文数据库:Cochrane Library, Pubmed, Embase。检索国内外二甲双胍与头颈鳞癌相关的所有文献,严格按照纳入标准及排除标准对检索结果进行筛选,使用Cochrane协作网偏倚风险评估工具对纳入文献进行方法学质量评价并提取纳入文献的基本信息(按预提表格,对纳入文献进行信息提取),并对纳入文献进行结果的分析与讨论。
  结果:通过对检索文献进行筛选后,最终符合纳排标准的文献共29篇,包含临床研究8篇,基础研究22篇(其中一篇既有基础研究又有临床研究),由于所纳入文献的同质性较差不符合Meta分析数据合并的条件,因而本次研究只采用了定性的系统综述分析方法,分为两部分:
  1.二甲双胍对头颈鳞癌的临床相关研究,共纳入8篇文章,包含回顾队列研究6篇,病例对照研究2篇。结果显示:在头颈鳞癌患者中应用二甲双胍可以减少肿瘤的局部复发和转移,改善患者整体生存率和无病生存率;在糖尿病患者中应用二甲双胍比不应用二甲双胍具有较低的头颈鳞癌发病率。
  2.二甲双胍对头颈鳞癌的基础相关研究,共纳入22篇文章,包含体外细胞试验和(或)裸鼠移植瘤模型试验。这些研究结果表明二甲双胍单用或者联合其他治疗对头颈鳞癌细胞系具有显著的抗肿瘤作用,包括:抑制癌细胞增殖,促进癌细胞凋亡,诱导细胞周期G0/G1期阻滞以及调节肿瘤相关信号通路基因、蛋白的表达。虽然相关研究非常有限,但是,目前的可利用的证据显示二甲双胍对头颈鳞癌具有潜在的影响。证实了二甲双胍在细胞及移植瘤模型中潜在的抗肿瘤作用,并在一定程度上揭示了相关抗肿瘤生物机制。
  结论:本篇系统综述通过回顾性方式收集相关研究,从临床以及基础方面阐述了二甲双胍对头颈鳞癌的预防和治疗作用,提示二甲双胍具有较好的临床应用前景。为将二甲双胍应用于临床抗头颈鳞癌治疗中提供了可行性依据。虽然只有很少的相关研究,但目前可利用的证据已经表明二甲双胍对头颈鳞癌的作用是引人瞩目的。
[硕士论文] 李金恒
口腔医学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  舒尼替尼是一种多靶向酪氨酸激酶抑制剂,因其可抑制与血管形成有关的多种受体酪氨酸激酶的活性,具有较好的抗血管生成作用,被应用于治疗多种肿瘤。近来研究发现,舒尼替尼能够诱导肿瘤细胞凋亡而不依赖于其抑制血管生成作用。信号转导及转录激活因子(signal transduction and activatorof transcription,STAT)家族中成员STAT3作为多种酪氨酸激酶信号通路的重要组成部分,其活化后在包括头颈癌等多种恶性肿瘤细胞中表达较高。STAT3异常活化并持续高表达与这些恶性肿瘤凋亡的抑制、肿瘤细胞增殖、肿瘤微环境血管形成及转移关系密切。舒尼替尼能否诱导头颈癌细胞凋亡,STAT3在此过程中是否发挥作用,目前相关报道较少。本实验通过使用舒尼替尼分别处理UM-22B和SCC90两种头颈癌细胞系,观察肿瘤细胞增殖和凋亡情况,以及STAT1和STAT3的变化,从而进一步了解舒尼替尼对头颈癌的作用及机制,为舒尼替尼在临床治疗头颈癌提供理论基础。
  方法:
  体外培养的SCC90和UM-22B细胞,经过不同浓度舒尼替尼处理不同时间后,分别采用MTT试验、倒置显微镜观察等方法,检测细胞增殖抑制情况;并且采用流式细胞术检测STAT1和STAT3磷酸化水平。
  结果:
  1.舒尼替尼对两种细胞增殖的影响:MTT显示,舒尼替尼对SCC90细胞增殖的抑制率最高可达92.89%,24,48,72h的IC50分别是2.37、1.17和0.93μmol/L;对UM-22B细胞抑制率最高可达82.56%,24,48h的IC50分别是6.30和2.31μmol/L。用药组不同浓度不同处理时间其生长抑制率有显著差异,抑制率的时间-浓度依赖性明显;
  2.形态学变化:倒置显微镜下,SCC90、UM-22B细胞均显示:对照组细胞生长较用药组迅速,细胞贴壁生长呈“铺路石”状,细胞呈扁平状多角形,胞质饱满,胞质近中央部位有圆形细胞核;用药组细胞增殖受到抑制,贴壁细胞体积变小而呈圆形,连接松解,核颜色较对照组加深;
  3.舒尼替尼对STAT1和STAT3磷酸化水平的影响:SCC90细胞经过0.25,0.5,1μmol/L的舒尼替尼处理2,8,16,24小时后,各实验组中p-STAT1阳性表达与对照组相比,无统计学差异;而p-STAT3阳性表达与对照组相比明显降低,并且随着浓度增高,阳性率显著下降,差异有统计学意义。UM-22B细胞经过0.5,1,2,4μmol/L的舒尼替尼处理30分钟和2小时后,各实验组中p-STAT3阳性表达与对照组相比降低,并且随着浓度增高,阳性率显著下降。其中,两个时间段中,0.5和1μmol/L组与对照组相比无统计学差异,而2和4μmol/L组有显著性差异。
  结论:
  1.舒尼替尼可以抑制头颈鳞癌UM-22B和SCC90细胞的增殖。
  2.舒尼替尼可以下调UM-22B和SCC90细胞STAT3磷酸化水平。
  3.STAT1在舒尼替尼抑制头颈癌细胞增殖过程中磷酸化水平未见明显升高。
[硕士论文] 白静
耳鼻咽喉科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过Meta分析,客观评估诱导化疗联合同步放化疗与单纯同步放化疗治疗局部晚期头颈部鳞状细胞癌的疗效和安全性,为临床治疗提供指导。
  方法:按照Cochrane协作组要求,计算机检索PUBMED、EMBASE、Cochrane Library、CBM等数据库中的随机对照临床试验。选择治疗组为诱导化疗联合同步放化疗,对照组为单纯同步放化疗。由2名评价员分别独立按以上检索策略收集相关文献,并按纳入、排除标准入选。主要提取指标为总体生存时间(OS)、无进展生存时间(PFS)、总体反应率(ORR),次要提取指标为3-4级不良反应如:白细胞减少、中性粒细胞减少、血小板减少、口腔粘膜炎、皮肤反应、恶心及呕吐、吞咽困难等。结果采用危险比(RR)、比值比(OR)、平均差(MD)及其95%可信区间(CI)表示。
  结果:最终共纳入6篇随机对照研究,其中英文5篇,中文1篇,共计1141例患者,诱导化疗联合同步放化疗组:659例,同步放化疗组482例。两组患者的肿瘤完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定进展(SD)、疾病进展(PD)以及总体反应率情况均无显著统计学差异(OR=2.04,95%CI:0.85~4.89, P=0.11;OR=0.50,95%CI:0.22~1.18, P=0.11;OR=0.66,95%CI:0.34~1.27, P=0.21; OR=0.89,95%CI:0.43~1.84, P=0.76; OR=1.03,95%CI:0.69~1.53, P=0.89)。1年、2年、3年和5年 OS均无显著统计学差异(RR=1.05,95%CI:0.97~1.14, P=0.25;RR=0.97,95%CI:0.85~1.11, P=0.71;RR=0.96,95%CI:0.82~1.13, P=0.66;RR=0.95,95%CI:0.71~1.27, P=0.71)。1年PFS、2年PFS、3年PFS和5年PFS均无显著统计学差异(RR=1.01,95%CI:0.91~1.13,P=0.85;RR=1.08,95%CI:0.91~1.28,P=0.37;RR=1.04,95%CI:0.87~1.26, P=0.65;RR=1.01,95%CI:0.73~1.40,P=0.95)。诱导化疗联合同步放化疗组较同步放化疗组有较明显的发热性中性粒细胞减少症及口腔炎/口腔粘膜炎发生率,其他不良反应事件的发生率两组未见显著统计学差异。
  结论:目前对于局部晚期头颈鳞癌患者,诱导化疗联合同步放化疗较同步放化疗治疗,前者并不能有效提高患者总体反应率及总体生存率,不能有效延长无进展生存时间,其发热性中性粒细胞减少症及口腔炎/口腔粘膜炎发生率增加,其他不良反应事件的发生率两组未见显著统计学差异。
[博士论文] 沈丽芳
耳鼻咽喉科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部鳞状细胞癌是常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤发病率中位居第六,全球每年新发病例数超过50万。一些头颈部鳞状细胞癌具有起病隐匿、侵袭力强、易复发和转移以及预后差的特点。尽管治疗手段不断改善,患者生活质量有了极大提高,但近40年一些头颈鳞癌患者的5年生存率并未得到明显提高。因此,深入研究头颈部鳞癌的发病机制以及寻求新的治疗方法具有重要的科学意义及临床转化应用价值。
  Otto Warburg及其团队发现肿瘤组织相比正常组织在有氧条件下的葡萄糖消耗和乳酸产生均增加,表现为有氧糖酵解供能的能量代谢方式,即Warburg效应。因此,阻断此糖酵解途径可能成为治疗肿瘤的新方法。葡萄糖转运蛋白(glucosetransporter,GLUT)是介导Warburg效应的重要能量转运体。葡萄糖转运蛋白是介导细胞葡萄糖跨膜转运的蛋白,其表达增高是恶性肿瘤细胞葡萄糖代谢增高的主要原因。GLUT-1是GLUT家族代表性的蛋白,在全身组织细胞中广泛表达。GLUT-1在很多恶性肿瘤中过度表达以满足恶性肿瘤细胞能量需要。研究发现GLUT-1表达水平与恶性肿瘤患者的预后、TNM分期、分化程度、转移、复发有关。我们的前期研究发现GLUT-1高表达与头颈部癌淋巴结转移、癌进展、预后差有关。因此,抑制GLUT-1表达可能是恶性肿瘤治疗的新靶点。
  乏氧是实体肿瘤普遍存在的现象,乏氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是重要的乏氧诱导因子,已发现乏氧微环境诱导HIF-1α高表达与食管癌、肉瘤、肺癌、肝癌等恶性肿瘤的放射抵抗有关,并促使癌细胞更具侵袭性,导致其远处转移。我们前期研究及其它研究亦表明HIF-1α与喉癌淋巴结转移、T分期、预后以及喉癌放射抵抗有关。因此,抑制HIF-1α表达同样是恶性肿瘤治疗的靶点之一。
  研究发现GLUT-1和HIF-1α高表达与恶性肿瘤放射抵抗有关,抑制GLUT-1或HIF-1α表达能提高恶性肿瘤治疗的疗效。我们前期发现采用反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS-ODN)抑制Hep-2喉癌细胞株GLUT-1表达能抑制喉癌细胞对葡萄糖的摄取及喉癌细胞增生;进一步研究发现GLUT-1高表达与喉癌的放射抵抗有关,通过AS-ODN抑制GLUT-1表达能增强喉癌的放射敏感性。一些研究也发现抑制GLUT-1或HIF-1α表达可提高恶性肿瘤的放射敏感性。但目前还没有联合抑制GLUT-1和HIF-1α的表达增强喉癌放疗敏感性的研究报道。
  Warburg效应已经被临床应用的正电子发射计算机断层显像技术(positronemission tomography,PET)所证实,最广泛使用的显影剂是18F-氟代脱氧葡萄糖(2'-deoxy-2'-[18F] fluoro-D-glucose,18F-FDG),是葡萄糖的类似物,其工作原理就是18F-FDG静脉注射后,由GLUT转运进入细胞内,在糖酵解酶己糖激酶(hexokinase,HK)的作用下磷酸化形成18F-FDG-6-磷酸,其不再进一步代谢,沉积于细胞内,在PET图像上表现为浓聚的高代谢。PET/CT已广泛应用于恶性肿瘤早期诊断、疗效判断,及监测恶性肿瘤复发、转移和治疗后残留等,并有研究发现其标准摄取最大值(maxium of standard uptake value,SUVmax)与一些恶性肿瘤的预后、复发、转移等有关。
  本文研究术前行18F-FDG PET/CT的喉癌、下咽癌患者GLUT-1、HIF-1α表达情况,并探索GLUT-1、HIF-1α表达及SUVmax与喉癌、下咽癌患者的临床病理因素、预后之间相关性。
  通过体内实验研究AS-ODN联合抑制GLUT-1、HIF-1α表达提高喉癌放射敏感性的机制,并通过microPET/CT的SUVmax评估AS-ODN联合抑制GLUT-1、HIF-1α表达的放射增敏效果。
  第一部分喉癌下咽癌GLUT-1和HIF-1α表达及18F-FDG摄取与预后的关系
  目的:
  分析喉癌下咽癌组织细胞GLUT-1和HIF-1α表达和18F-FDG摄取与患者临床病理因素以及预后的关系。
  方法:
  免疫组织化学方法检测55例术前行18F-FDG PET/CT检查的喉癌、下咽癌患者癌组织GLUT-1和HIF-1α蛋白表达情况,并分析GLUT-1和HIF-1α表达和SUVmax与喉癌、下咽癌患者临床病理和预后的相关性。
  结果:
  单因素分析发现头颈部鳞癌患者(喉癌下咽癌)的治疗方式(p=0.004)、肿瘤大小(p=0.002)与患者生存率相关,而SUVmax(p=0.306)、Glut-1表达(p=0.919)、HIF-1α表达(p=0.083)、年龄(p=0.929)、临床分期(p=0.249)、淋巴结转移(p=0.924)、肿瘤分化程度(p=0.875)均与患者生存率无关。HIF-1α表达与肿瘤大小呈相关性(r=0.351,p=0.009)。Glut-1和HIF-1α在头颈部鳞癌中的阳性率分别为49.1%和56.4%。Glut-1和HIF-1α在声带息肉中无一例表达。Glut-1和HIF-1α在头颈部鳞癌中的表达均较声带息肉中的表达明显增高(p<0.05)。头颈鳞癌患者Glut-1和HIF-1α表达呈相关性(r=0.571,p<0.001),Glut-1表达和SUVmax呈相关性(r=0.495,p<0.001),HIF-1α表达和SUVmax无相关性(p=0.199)。多因素分析结果显示头颈鳞癌患者治疗方式(p=0.025)、肿瘤大小(p=0.008)、Glut-1(p=0.032)和HIF-1α表达(p=0.032)均与患者生存率相关。
  小结:
  1.头颈鳞癌组织Glut-1和HIF-1α的表达较声带息肉组织明显增高。HIF-1α表达与肿瘤大小呈相关性。
  2.头颈鳞癌患者Glut-1和HIF-1α表达相关,Glut-1表达和SUVmax相关,而HIF-1α表达和SUVmax无相关性。
  3.Cox比例风险模型多因素分析发现头颈鳞癌患者治疗方式、肿瘤大小、Glut-1和HIF-1α表达与预后差相关。
  第二部分联合抑制GLUT-1和HIF-1α表达提高喉癌放射敏感性的体内研究
  目的:
  体内实验研究AS-ODN联合抑制GLUT-1、HIF-1α表达提高喉癌放射敏感性的机制。
  方法:
  本实验我们进行了23的析因设计,对裸鼠皮下种植Hep-2和Tu212喉癌细胞株致瘤成功后,各选取24只裸鼠进行实验(每组3只),治疗后8天安乐死裸鼠,通过AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α及放疗3个因素2个水平(AS-ODN100μg或0μg,放疗10Gy或0Gy),对应变量如肿瘤体积、肿瘤重量、微血管密度(microvesseldensity,MVD)、凋亡率(apoptosis index,AI)和坏死等的作用评估AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α和放疗对喉癌的治疗效果及有无交互作用。
  结果:
  AS-ODN GLUT-1,AS-ODN HIF-1α和放疗三者均未能减小喉癌移植瘤体积(p>0.05)。治疗8天后,10GyX线照射能降低Hep-2(p=0.002)和Tu212(p=0.038)喉癌移植瘤的瘤重。AS-ODN GLUT-1,AS-ODN HIF-1α和放疗三者能协同增加Hep-2移植瘤细胞凋亡率(p=0.018)。AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α,AS-ODNGLUT-1和放疗能协同增加Tu212移植瘤细胞凋亡率(p分别为p<0.001,p=0.047)。AS-ODN GLUT-1,AS-ODN HIF-1α和放疗三者能协同减少Tu212移植瘤组织微血管密度(p=0.045)。AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α,AS-ODN GLUT-1和放疗,AS-ODN HIF-1α和放疗能协同减少Hep-2移植瘤组织微血管密度(p分别为p=0.015,0.002,0.026)。AS-ODN GLUT-1,AS-ODN HIF-1α和放疗三者能协同增加Hep-2和Tu212移植瘤细胞坏死率(p分别为p<0.001,p=0.004)。Hep-2、Tu212移植瘤GLUT-1和HIF-1α mRNA和蛋白表达呈线性相关(p<0.05)。
  小结:
  1.AS-ODN联合抑制GLUT-1和HIF-1α表达能增强喉癌放射敏感性,机理可能是通过AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α和放疗协同增加喉癌细胞凋亡、坏死,以及减少微血管密度而发挥作用。
  2.喉癌Hep-2、Tu212移植瘤GLUT-1和HIF-1α mRNA和蛋白表达呈线性相关,AS-ODN HIF-1α能降低Hep-2和Tu212裸鼠移植瘤细胞GLUT-1 mRNA和蛋白表达。
  第三部分 Micro PET/CT评估喉癌移植瘤放射敏感性的体内研究
  目的:
  18F-FDG PET/CT在恶性肿瘤的检测和分期及治疗方案的选择中起到重要的作用,但18F-FDG PET/CT能否作为恶性肿瘤治疗疗效的评估手段目前仍有争议,且肿瘤细胞对18F-FDG的摄取增高的机制不明,本次研究联合抑制GLUT-1和HIF-1α表达对治疗后12天的裸鼠移植瘤的放射增敏作用,同时探索18F-FDG PET/CT能否评估喉癌移植瘤放射敏感性,同时探索HIF-1α和GLUT-1表达和18F-FDG摄取三者之间的相关性。
  方法:
  本实验我们进行了23的析因设计,对裸鼠皮下种植Hep-2和Tu212喉癌细胞株致瘤成功后,各选取24只裸鼠进行实验(每组3只),行治疗前18F-FDG PET/CT检查,然后对裸鼠移植瘤予以AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α及放疗3个因素2个水平(AS-ODN100μg或0μg,放疗10Gy或0Gy)治疗,治疗后第8天、第12天分别行治疗后18F-FDG PET/CT检查,第12天PET/CT检查结束后安乐死裸鼠。检测移植瘤的体积,瘤量,微血管密度,凋亡率和坏死率以再次评估AS-ODN联合抑制GLUT-1和HIF-1α表达的放射增敏作用;通过治疗前后三次micro PET/CT检查评估移植瘤GLUT-1和HIF-1α表达与18F-FDG摄取的相关性及18F-FDGPET/CT能否评估喉癌放射敏感性。
  结果:
  AS-ODN GLUT-1,AS-ODN HIF-1α和放疗三者均未能减小喉癌移植瘤体积(p>0.05)。治疗12天后,10GyX线照射能降低Hep-2喉癌移植瘤的瘤重(p=0.022),AS-ODN GLUT-1能降低Tu212喉癌移植瘤的瘤重(p=0.006)。AS-ODN GLUT-1,AS-ODN HIF-1α和放疗三者能协同增加Tu212移植瘤细胞凋亡率(p<0.001)。AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α,AS-ODN GLUT-1和放疗能协同增加Hep-2移植瘤细胞凋亡率(p均为p<0.001)。AS-ODN GLUT-1,AS-ODN HIF-1α和放疗三者能协同减少Hep-2和Tu212移植瘤组织微血管密度(p均为p<0.001),增加 Hep-2和Tu212移植瘤细胞坏死率(p分别为p<0.001,p=0.041)。Hep-2、Tu212移植瘤GLUT-1和HIF-1α mRNA和蛋白表达均呈线性相关(p<0.05)。但GLUT-1和HIF-1α的mRNA和蛋白表达与标准最大摄取值肿瘤组织/对侧正常组织2(standardized uptake value tumor/normal tissue2,SUVmaxT/N2)均无显著相关性(p>0.05)。SUVmaxT/N和肿瘤治疗后疗效(坏死率,凋亡率)也无显著相关性(p>0.05)。
  小结:
  1.AS-ODN GLUT-1和AS-ODN HIF-1α和放疗能协同增加治疗后12天的裸鼠移植瘤细胞凋亡、坏死及减少肿瘤组织微血管密度,联合抑制GLUT-1和HIF-1α表达能增强喉癌的放射敏感性。
  2.治疗后12天喉癌移植瘤GLUT-1和HIF-1α mRNA和蛋白表达呈线性相关性。
  3.治疗前后18F-FDG microPET/CT SUVmaxT/N的变化尚不能作为评估裸鼠移植瘤治疗疗效的手段,SUV的相关指标是否作为放射敏感性的指标尚待继续研究。
[硕士论文] 潘遥
口腔颌面外科学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:归纳颈侧区非甲状腺、非腮腺、非下颌下腺、非舌下腺及其解剖区域肿块的临床病理特点及与性别、年龄的相关性。
  方法:对我科2008年1月至2016年11月间收治的经病理组织确诊的252例颈侧区非甲状腺、非涎腺的病例资料进行回顾性分析。应用SPSS17.0分析年龄、性别与颈部肿块临床病理因素之间的关系。
  结果:252例颈侧区肿块中,40岁以下者各组良性肿瘤多见,40岁以上者各组恶性肿瘤多见,并且男性多于女性(P<0.05),差异有统计学意义。另外,各肿块中恶性肿瘤84例,占33.33%(84/252),包括原位性34例和转移性50例;良性肿瘤99例,占39.29%(99/252),其中先天性肿块67例;炎性肿块69例,占27.38%(69/252),包括非特异性炎症和特异性炎症。不同类型肿块的影像及临床表现又有各异。
  结论:颈侧区非甲状腺、非涎腺肿块病种多样,且与性别及年龄存在一定关系,40岁以上的男性其恶性肿瘤发病率较高。因此,对于40岁以上的男性患者,颈部出现无活动、渐大地、质硬等临床表现的包块,需要注意其恶性肿瘤的发生。再者,临床工作中我们不仅需要掌握其发病特点及规律,完善辅助检查,而且还需要进行多参数综合分析,对于提高颈部肿物的诊断率有一定的指导意义。
[硕士论文] 孙超南
肿瘤学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察Salburinall对人头颈部鳞癌细胞内质网应激通路(endoplasmicreticulum stress ERS)核心蛋白-葡萄糖调节蛋白78(GRP78)活化的影响,并检测GRP78调控凋亡相关蛋白及DNA修复相关蛋白,探讨Salburinal影响人头颈部鳞癌细胞放射敏感性的作用机制。
  方法:头颈部鳞癌细胞系(KB、Fadu、Detroit562)射线照射后不同时间点(0、20 min、1h、3h、6h、12h、24 h和48 h)采用Westernblot法检测头颈部鳞癌细胞中GRP78的表达;3种细胞系设立空白对照组(control组)和ERS通路抑制剂(Salburinal)组(sal组),采用Westernblot法检测头颈部鳞癌细胞中GRP78的表达;将3种细胞系分别设立control组、sal组、单纯照射组(IR组)和sal联合照射组(IR+sal组),采用Westernblot法检测头颈部鳞癌细胞DNA损伤修复相关蛋白p-ATM/ATM、DNA-PK及凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达,采用放射自显影技术以相应蛋白条带的平均吸光度值与β-actin吸光度值的比值表示各组蛋白表达水平;集落克隆形成法检测3种细胞系不同剂量照射(0、2、4、6 Gy)对10 mmol/L Salburinal处理后不同时间(12、24、36h)细胞存活分数的影响。流式细胞仪检测control组、sal组、IR组和IR+sal组细胞凋亡分数。
  结果:1、Western blot结果显示,照射后20 min~1 h,3种头颈部鳞癌细胞GRP78蛋白表达增加,照射后3h达到高峰,与0 min组比较,差异有统计学意义(t=12.72、13.37、18.31,P<0.05)。采用Salubrinal处理细胞后,sal组GRP78的表达较control组下调,差异有统计学意义(t=14.25、5.34、3.12,P<0.05)。2、集落克隆形成实验结果提示,Salubrinal增强射线抑制细胞增殖,3种细胞系加药12h的放射增敏比分别为1.16、1.05和1.06。3、细胞凋亡检测结果提示与IR组相比,Salubrinal增加射线诱导的人头颈部鳞癌细胞凋亡,差异有统计学意义(t=5.67、6.95、7.28,P<0.05)。与IR组相比,IR+sal组增加DNA损伤相关蛋白ATM磷酸化水平增加,差异有统计学意义(t=3.5、10.62、10.27,P<0.05,P<0.05),DNA双链修复蛋白DNA-PK的表达较IR组相比下调,差异有统计学意义(t=4.35、6.34、8.61,P<0.05)。放射联合Salubrinal增加凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3表达,差异有统计学意义(t=14.23、13.61、13.72, P<0.05)。
  结论:Salburinal抑制射线诱导ERS信号通路活化增加人头颈部鳞癌细胞放射敏感性,作用机制可能与其抑制射线导致DNA双链断裂损伤修复,增加射线诱导的头颈鳞癌细胞凋亡相关。
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