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[博士论文] 柳云霞
口腔临床医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  唾液腺腺样囊性癌(SACC)是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一,好发于腭部小唾液腺及腮腺,其特点是虽生长相对缓慢,但侵袭性强,肿瘤易沿神经扩散,浸润性极强,与周围组织无明显界限,肿瘤易侵入血管,造成血行性转移,转移率高达40%,转移部位以肺为最多见。由于上述特性,该肿瘤常不易手术切净,术后局部复发和远处转移率高,远处转移患者的生存率低于未转移者。目前尚无确切的判断预后的指标。随着基因组学等生物科学的发展,寻找对于腺样囊性癌侵袭和转移具有特异性的肿瘤标记物可能会对该病的治疗和预后评估产生重要意义。
  肿瘤的侵袭、转移机制非常复杂。近年来的研究发现肿瘤微环境(TumorMicroenvironment)对肿瘤细胞的侵袭和转移有促进作用,肿瘤微环境可以通过改变细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的组成成分,从而改变细胞的粘附、迁移;然而肿瘤微环境对肿瘤的进展也可能起到抑制作用,从而降低其侵袭和迁移的能力。在肿瘤向邻近组织浸润以及远隔脏器转移的过程中,发挥关键作用的不仅是肿瘤对基底膜的浸润还有其与细胞外基质的相互作用。纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)是位于基底膜表面的常见受体,当肿瘤细胞发生远处转移时,肿瘤细胞膜受体先与其结合,继而通过分泌基质金属蛋白酶等降解酶来降解基底膜和细胞外基质,肿瘤细胞才能突破细胞外基质向远处转移,最终实现肿瘤的远处转移。肿瘤细胞在转移过程中与ECM的关系主要表现为与ECM的黏附及对ECM的侵袭,尤其与ECM中纤维粘连蛋白的结构和功能变化有关。
  纤维粘连蛋白是一种多功能的糖蛋白,具有多种生物学活性和功能。它是基底膜的重要组成部分,也是细胞外基质中的重要细胞粘附分子,在细胞与细胞外基质的粘附过程中充当媒介,对细胞的生长及分化和运动能力的改变发挥调控作用,与此同时,还能左右肿瘤细胞的粘附与远处转移,在细胞的迁移与增殖等功能方面发挥促进作用。近年来,肿瘤的侵袭及转移一直都是研究的热点问题,现已证实在此过程中肿瘤细胞不可避免要与细胞外基质相接触并相互作用,FN的粘附与介导在此过程中起着不容忽视的作用。在以往腺样囊性癌的相关研究中显示肿瘤细胞巢细胞外基质中的FN为强阳性表达;SACC细胞能够生成FN的作用也已经被体外实验所证实;原本呈现低转移潜能的SACC细胞系在加入外源性FN后,其移动性和粘附率被发现明显升高。鉴于以上研究结果学者们一致认为FN在SACC的发生发展过程中起重要的调节作用,可能是其侵袭和转移的关键因素,但是关于FN在SACC中基因调控的机制等方面的研究仍需进一步探讨。
  BTB/POZ结构域蛋白7(BTB/POZ domain containing7,BTBD7)为含有两个保守BTB/POZ蛋白序列的蛋白质,其内包含明显的转录因子结合位点,研究发现BTBD7蛋白能促进唾液腺和肺脏、肾脏等器官的分支结构的形成。在上皮细胞分支形态发生变化的过程中,基质中的FN调控着上皮细胞中BTBD7的变化,大量FN的聚集会导致BTBD7的表达,进而促进形成分支结构,沉默BTBD7会使唾液腺、肺、肾等分支器官的发育明显受到抑制。后有研究显示BTBD7在调控肿瘤细胞发生上皮-间质转化(EMT)中起关键性作用,BTBD7促进了EMT的进程,加快了肿瘤的侵袭和转移。相关的研究在肝癌、肺癌、乳腺癌中均有报道,在肝癌的研究过程中发现沉默BTBD7会导致纤维粘连蛋白表达降低,然而,在唾液腺腺样囊性癌中BTBD7和FN这两个均能影响肿瘤侵袭和转移的基因的表达及二者之间的调控关系至今未见报道。
  本研究通过免疫组化技术检测BTBD7和FN在正常唾液腺组织及唾液腺腺样囊性癌组织中的表达,分析BTBD7和FN的表达与临床病理因素和预后之间的关系,旨在检测这两种蛋白表达水平的高低在SACC病情进展中所表达的意义。通过免疫荧光技术检测人唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83及由其克隆出的高转移细胞系SACC-LM中BTBD7和FN的表达情况,以确定采用哪种细胞系进行基因沉默,然后利用小干扰RNA技术分别沉默SACC-LM细胞系中的BTBD7和FN基因,通过qRT-PCR技术和Western Blot技术检测细胞中对应的FN和BTBD7的mRNA和蛋白表达水平,以确定两种蛋白之间的调控关系。通过Transwell侵袭实验和细胞划痕实验验证沉默BTBD7对高转移细胞系SACC-LM体外侵袭、转移能力等生物学行为的影响,进一步探讨BTBD7和FN在SACC中的调控机制,确定对于腺样囊性癌侵袭和转移具有特异性的肿瘤标记物,为SACC的治疗提供新的靶点进行干预,降低肿瘤发生侵袭和转移的机率,提高肿瘤患者的生活质量。
  方法:
  1.收集16例正常的唾液腺组织蜡块和手术切除的SACC组织蜡块70例及其相关的临床资料,采用免疫组织化学染色法检测BTBD7及FN蛋白在正常唾液腺组织中和唾液腺腺样囊性癌组织中的表达,统计学分析两种蛋白在唾液腺腺样囊性癌中表达的相关性,以及与患者临床病理特征(肿瘤类型、TNM分期等)之间的相关性。
  2.采用Kaplan-Meier生存分析法分析BTBD7阴性表达和阳性表达SACC患者生存率的差异性。
  3.细胞免疫荧光技术检测BTBD7及FN在SACC-83细胞系及SACC-LM细胞系中的表达情况。
  4.利用SiRNA技术对SACC-LM细胞中的BTBD7基因进行沉默,通过qRT-PCR技术和Western Blot技术检测细胞中FN基因的mRNA和蛋白的改变情况。
  5.利用SiRNA技术对SACC-LM细胞中的FN基因进行沉默,通过qRT-PCR技术和Western Blot技术检测细胞中BTBD7基因的mRNA和蛋白的改变情况。
  6.采用Transwell侵袭实验和细胞划痕试验检测BTBD7基因沉默后SACC-LM细胞侵袭和迁移能力的改变情况
  结果:
  1.免疫组化结果显示,在正常唾液腺组织中,BTBD7表达阴性或呈弱表达,阳性表达率仅为12.5%,而FN的阳性表达率高达93.8%,在SACC组织中,BTBD7蛋白呈高表达,其阳性表达率为55.7%,而FN多为低表达或不表达,其阳性表达率仅为27.1%,尤其在实体型肿瘤组织中,FN的阳性表达率为10.0%,BTBD7的阳性表达率为70.0%,结果显示无论在正常组织还是SACC组织中BTBD7和FN的表达均呈显著负相关。BTBD7和FN的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小无显著相关性,与肿瘤的区域性淋巴结转移、病理类型及远处转移呈显著相关。
  2.腺样囊性癌患者术后的随访时间平均为六年(12-89月),29名患者死于腺样囊性癌肿瘤的复发或转移,9名患者失访,32名患者到随访截止日仍存活。Kaplan-Meier生存曲线显示,BTBD7表达阳性患者的总体生存率明显低于阴性患者。
  3.细胞免疫荧光染色显示,BTBD7和FN在SACC-LM细胞系和SACC-83细胞系中均有表达。但两种蛋白均在高转移细胞系SACC-LM中表达更强。
  4.沉默SACC-LM细胞中的BTBD7基因,利用qRT-PCR技术和Western Bolt技术检测发现,BTBD7基因沉默后,FN的mRNA及蛋白的表达明显升高。
  5.沉默SACC-LM细胞中的FN基因,利用qRT-PCR技术和Western Bolt技术检测发现,FN基因沉默后,BTBD7的mRNA及蛋白的表达无明显变化。
  6.BTBD7基因沉默后,明显抑制了SACC-LM细胞的侵袭和迁移能力。
  结论:
  在唾液腺腺样囊性癌组织中,BTBD7和FN的表达呈负性相关,BTBD7的高表达和FN的低表达与腺样囊性癌的病理类型及是否发生转移显著相关;在SACC-LM细胞系中,BTBD7基因沉默后FN的表达显著提高,肿瘤细胞的侵袭和迁移能力减弱,提示我们BTBD7可能通过调控FN的表达改变了唾液腺腺样囊性癌肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,减少肿瘤侵袭及远处转移。通过本研究,为唾液腺腺样囊性癌的临床诊断、预后判断以及生物治疗方案的制定提供新的方案。
[硕士论文] 鄢灵君
流行病与卫生统计学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨口腔癌发病的环境影响因素,构建口腔癌发病风险预测模型;筛选口腔癌组织和癌旁组织中差异表达的长链非编码RNA,扩大样本验证并进行体外细胞功能学实验的机制研究.
  方法:
  1.采用病例对照研究设计,面访调查1012例口腔癌新发病例和3087例健康对照,收集研究对象的饮食和生活方式等环境暴露资料.采用非条件Logistic回归模型方法评估环境因素对口腔癌发病风险的调整比值比及其95%的可信区间.
  2.根据多因素Logistic回归筛选出的口腔癌独立影响因素,基于OR值、β系数及nomogram方法构建三种口腔癌发病风险预测模型,利用ROC曲线下面积评估预测模型的预测效能.
  3.利用Agilent Human lncRNA4×180K基因芯片技术筛选3对口腔癌组织和癌旁组织中表达差异的lncRNAs,采用qRT-PCR方法在81对口腔癌和癌旁组织中验证其中5条lncRNAs的表达水平.采用t检验或Wilcoxon秩和检验、X2检验分析两组间的差异及与患者肿瘤病理特征的关联.
  4.构建lncRNA ENST00000470447.1过表达重组质粒和空白对照质粒,通过CCK-8、Transewell、细胞划痕以及流式细胞术等实验探讨lncRNA ENST00000470447.1过表达对舌鳞癌细胞Tca-8113增殖、迁移、侵袭和调亡能力的影响.
  结果:
  1.吸烟、饮酒、中重度烹饪油烟、高口腔卫生指数(不良口腔卫生状况)是口腔癌发病的危险因素.饮茶、较高频率摄入鱼类、其他海鲜、新鲜蔬菜水果和蛋类可降低口腔癌的发病风险.
  2.根据nomogram构建的口腔癌发病风险预测模型表现出最佳的预测效能(AUC=0.721,95%CI:0.702~0.739),且该预测模型的分值与口腔癌的关联强度呈非线性剂量-反应关系.Nomogram预测模型分值与肿瘤家族史之间存在相乘及相加交互作用(OR相乘=2.83,95%CI:2.20~3.64).
  3.通过lncRNA表达谱芯片检测发现口腔癌与癌旁组织之间差异表达的lncRNAs,总共2617条,约占总lncRNA的8.97%(2617/29187):其中上调280条,下调2337条.
  4.ENST00000470447.1、ENST00000412353.1和ENST00000506106.1在口腔癌组织中的相对表达水平均低于配对癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.001),且验证结果与芯片检测结果的表达方向一致.
  5.ENST00000470447.1表达水平与口腔癌患者的病理类型和分化程度相关(P<0.05),ENST00000506106.1的表达与患者的病理类型和淋巴结转移有关(P<0.05).
  6.体外细胞实验结果显示:与空白对照质粒相比,ENST00000470447.1过表达重组质粒可降低舌鳞癌细胞Tca-8113的存活率、迁移率和侵袭率,且细胞早期凋亡率明显增高.
  结论:
  1.吸烟、饮酒、中重度烹饪油烟和不良口腔卫生状况是口腔癌发病的主要危险因素.规律饮茶、多食鱼类、其他海鲜、新鲜蔬菜水果和蛋类是口腔癌的保护因素.
  2.根据nomogram构建的口腔癌风险预测模型具有最佳的预测效果和应用价值.
  3.ENST00000470447.1、ENST00000412353.1和ENST00000506106.1在口腔癌中表达下调.
  4.ENST00000470447.1和ENST00000506106.1与口腔癌患者的病理类型、分化程度和淋巴结转移存在关联.
  5.ENST00000470447.1过表达可抑制Tca-8113细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进其凋亡,在口腔癌的发生进程中发挥重要调控作用.
[硕士论文] 胡雪刚
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探究在口腔鳞状细胞癌干细胞中差异表达miRNA和TCGA/GEO数据库中口腔鳞状细胞癌差异表达miRNA及lncRNA,筛选与口腔鳞状细胞癌相关的miRNA/lncRNA生物标志物,为探索与口腔鳞癌相关的miRNA及lncRNA机制研究和新的生物治疗靶点提供有力的实验依据。
  方法:
  1.以CD133为表面标志,应用免疫磁珠法分选、流式细胞术检测,通过克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测干细胞特性。应用二代测序检测并筛选差异表达的miRNA。对差异表达miRNA运用生物信息学方法进行靶基因预测和功能分析。
  2.从TCGA数据库中下载人口腔鳞状细胞癌的miRNA高通量数据,使用R软件筛选差异miRNA,然后使用DAVID在线工具对选定的差异miRNA进行生物信息学分析。
  3.从TCGA数据库下载具有临床信息的口腔鳞状细胞癌患者的lncRNA表达谱。通过Kaplan-Meier生存分析,单因素和多因素Cox比例风险回归分析评估总生存和无病生存率与差异表达lncRNA之间的关联,并通过基因组富集分析对显著异常的lncRNA进行生物学功能和分子途径的富集分析。最后利用另一个基因表达数据集(Gene Expression Omnibus;GEO)的来验证候选基因的预后稳定性。
  结果:
  1.筛选得到口腔鳞状细胞癌肿瘤干细胞较口腔鳞状细胞癌细胞表达上调超过1.5倍的miRNA共有2个,分别是miR-1248和miR-1273g-3p;表达下调的miRNA有10个,分别是miR-3651、miR-188-5p、miR-1285-1、miR-6737-3p、miR-663a、miR-2276-3p、miR-4466、miR-494-3p、miR-1290、miR-6889-3p。miRanda和RNAhybrid靶基因预测共得到2490个靶基因,GO注释显示他们主要涉及与干细胞分化、血管生成、细胞增殖等有关的过程。Pathway注释显示他们主要参与Wnt信号途径、癌症途径、FC受体信号途径等信号通路。
  2.表达上调差异超过10倍的miRNA有11个,分别是miR-105-1、miR-105-2、miR-767、miR-1269b、miR-548f-1、miR-1269a、miR-615、miR-196a-1、miR-196a-2、miR-374c、miR-196b,表达下调的miRNA6个,分别是miR-135a-1、miR-378i、miR-5089、miR-885、miR-375、miR-135a-2。差异miRNA靶基因预测共得到564个共同靶基因,GO功能注释显著富集于钙离子结合、金属离子、转换生长因子受体结合、磷脂酶的活动等功能。
  3.与正常对照组织相比,在口腔鳞状细胞癌中有2493种差异表达的lncRNA,其中1638个上调,855个下调(倍数变化>2,p<0.05)。通过Kaplan-Meier生存分析发现21个lncRNA表达水平与口腔鳞状细胞癌患者的总生存率和无病生存率相关(p<0.05),尤其是lncRNA AC012456.4的下调表达导致较差的无病生存率(log-rank test,p=0.00828)和总生存率(log-rank test,p=0.00987)。多因素Cox比例风险回归分析显示lncRNA AC012456.4表达下调可以作为独立预后危险因素(DFS:p=0.004,hazard ratio(HR)=0.600,95%confidence interval(CI)=0.423-0.851;OS:p=0.002,HR=O.672,95%CI=0.523-0.863)。在GEO数据库中同样表明AC012456.4可以作为潜在的预测总生存率的预后生物标记物。GSEA分析表明lncRNA AC012456.4显著富集于肿瘤相关的重要的生物学功能和分子途径,如调节细胞活化,非编码RNAs加工,淋巴细胞活化,JAK-STAT信号通路,MAPK信号通路和肿瘤通路。
  结论:
  1.miRNA在口腔鳞状细胞癌肿瘤干细胞中存在特异性的表达谱,且差异表达miRNA能够调控与肿瘤相关的细胞功能和信号通路,有可能成为口腔鳞状细胞癌新的治疗靶点。
  2.通过整合来自TCGA中口腔鳞癌的miRNA高通量数据并进行深度分析,确定了显著差异表达的17个miRNA,通过差异表达miRNA靶基因预测、功能富集等生物信息学分析,为研究口腔鳞癌的分子调控机制提供了重要的生物信息学证据,筛选出可作为口腔鳞癌研究的潜在分子标志物。
  3.通过对TCGA和GEO数据库中口腔鳞癌lncRNA表达谱及病人临床信息的系统性分析,首次发现lncRNA AC012456.4在口腔鳞癌中低表达且与口腔鳞癌患者存活率下降显著相关,对口腔鳞状细胞癌患者的早期诊断,治疗和预后生物标志的研究具有重要的临床价值。
[硕士论文] 袁硕
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题的研究旨在探索基质金属蛋白酶1和7(MMP1\7)是否为人舌鳞状细胞癌的促癌基因以及其是否影响舌癌细胞增殖迁移及侵袭,以期为舌癌的早期分子诊断以及靶向治疗提供实验基础和临床证据。
  方法:
  第一部分:选取收集的五对人舌鳞状细胞癌术后标本进行癌和癌旁组织的转录组二代测序,得到相应的差异基因MMP1\7,为了验证结果的可靠性,另选53对舌癌标本运用RT-PCR技术检测其mRNA表达的情况,并通过免疫组化实验进一步确认其在蛋白水平表达是否存在差异。
  第二部分:体外合成相应的siRNA干扰序列和经过测序鉴定序列正确的过表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1–Puro-MMP1\7(以下简称pCDH-MMP1\7),转染人舌癌细胞CAL27\SCC9后利用RT-PCR技术和蛋白免疫印迹实验分别在mRNA和蛋白水平验证MMP1\7的干扰和过表达效果;通过CCK8增殖实验和平板克隆形成实验探讨当抑制和过表达MMP1\7基因后舌癌细胞增殖能力的变化;采用划痕愈合实验以及侵袭小室实验研究抑制和过表达MMP1\7基因对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。
  第三部分:本课题组前期研究发现,Notch信号通路和WNT信号通路与舌癌细胞株的增殖、迁移和侵袭密切相关,且相关文献报道MMPs可作为这两个信号通路的下游靶基因共同调控恶性肿瘤的迁移侵袭[1,2],因此分别抑制Notch信号通路和WNT信号通路后,利用蛋白免疫印迹技术在蛋白水平上检测MMP1表达的变化,探究MMP1是否作为Notch信号通路和WNT信号通路的靶基因影响舌癌的迁移侵袭;鉴于TIMP1为MMPs的天然抑制剂分子,两者表达失衡被认为是很多肿瘤迁移侵袭的原因之一,选取15对舌癌标本检验TIMP1mRNA在舌癌组织与癌旁组织表达情况,探讨MMP1\7及TIMP1在舌癌中可能的关系;另外根据之前相关文献报道,干扰MMP7基因后基质金属蛋白酶其他家族成员MMPs、其天然抑制剂TIMPs以及CDH1的表达将发生改变,因此在CAL27\SCC9人舌癌细胞中干扰MMP7后利用RT-PCR法检测这些分子在mRNA水平的变化情况。
  第四部分:经过前面体外细胞学实验得到MMP7基因可影响舌癌细胞的迁移和侵袭能力,为了探索其在体内是否也发挥了相似的作用,利用前期课题组经体内筛选得到的舌鳞状细胞癌裸鼠正位淋巴道高转移细胞株(LN4),shRNA沉默MMP7基因后观察舌癌细胞转移能力的变化。
  结果:
  第一部分:通过对人舌癌术后标本的转录组测序得到MMP1\7在癌组织中较癌旁组织为高表达,而RT-PCR结果显示其中的50对标本MMP1在癌组织表达量高于癌旁,MMP7则有45对;免疫组化结果同样显示MMP1\7在癌组织中表达较高。
  第二部分:siRNA和pCDH-MMP1\7质粒转染CAL27\SCC9细胞后,RT-PCR和蛋白免疫印迹实验结果显示,与对照组相比,实验组MMP1\7表达明显下调和上调;CCK8增殖曲线和平板克隆实验证明经MMP1\7siRNA处理后的细胞增殖能力明显降低,质粒过表达后增殖能力增强;划痕愈合实验、侵袭小室实验证实,抑制MMP1\7后CAL27\SCC9细胞的迁移侵袭能力随之降低,质粒过表达后迁移能力则增强。
  第三部分:抑制Notch信号通路和WNT信号通路后MMP1蛋白表达明显下调;RT-PCR实验结果表明CAL27细胞干扰MMP7后在mRNA水平MMP1\3\10\13、TIMP1以及CDH1表达上调,而MMP9、TIMP2\3\4则相应的下调,在SCC9细胞干扰MMP7后MMP3\10\13、TIMP1以及CDH1表达上调,而MMP9的表达则下调;15对标本中发现其中的13对(86.7%)癌旁组织中的TIMP1表达较癌组织高,而这13例癌组织全部同时高表达MMP1且其中有11例(73.3%)的癌组织同时高表达MMP7和低表达TIMP1,相关性分析发现MMP1与TIMP1在舌癌中呈现负相关性。
  第四部分:裸鼠舌癌正位高转移模型移植瘤中抑制MMP7表达,转移率随之降低
  结论:
  1.人舌癌标本RT-PCR及免疫组化实验发现MMP1\7在舌癌组织的表达高于癌旁组织;
  2.通过siRNA干扰技术和基因过表达技术,抑制和过表达MMP1\7基因后,舌癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力相应的降低和增强;
  3.MMP1可作为Notch信号通路和WNT信号通路的下游靶基因或通过降低TIMP1的表达促进舌癌的增殖、迁移、侵袭;MMP7可能与MMP1\3\9\10\13、TIMP1、E-cadherin共同作用参与舌癌的发生发展、迁移、侵袭;
  4.MMP7在裸鼠舌癌正位高转移模型移植瘤中促进舌癌细胞的转移。
  这说明MMP1\7基因可能在人舌鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭等生物学行为中起关键作用,因此MMP1\7可能是舌癌的早期分子诊断、预后评估和靶向治疗的关键分子,具有重要的研究价值。
[硕士论文] 李群
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察骨膜蛋白(Periostin、PN或OSF-2)在口腔白斑和鳞状细胞癌患者组织及血清中的表达,分析其在口腔鳞癌发生发展过程中的作用,为监测口腔癌前病变白斑及鳞状细胞癌的发生、发展及预后等提供参考指标。
  方法:
  第一部分:(1)选择门诊和住院患者,收集40例口腔白斑和45例口腔鳞癌组织的石蜡切片,并以30例口腔正常黏膜作为对照,进行骨膜蛋白免疫组织化学染色(IHC)从蛋白的水平对骨膜蛋白的表达部位以及表达量进行检测,同时分析其表达与临床病理因素的相关性;(2)收集25例口腔白斑和45例口腔鳞癌新鲜组织,以30例口腔正常黏膜作为对照,进行实时荧光定量-聚合酶链式反应(Q-PCR),观察骨膜蛋白mRNA水平的表达。
  第二部分:(1)选择门诊和住院患者,收集25例口腔白斑和45例口腔鳞癌患者血清,并以30例健康人群作为对照,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中骨膜蛋白的浓度;(2)对口腔鳞癌患者中骨膜蛋白的表达与患者的年龄、性别、TNM分期、分化程度、浸润深度以及淋巴结有无转移进行相关性分析。
  结果:
  第一部分:(1)骨膜蛋白免疫组织化学染色显示,正常口腔黏膜、单纯增生白斑、异常增生白斑和口腔鳞癌组组织骨膜蛋白阳性细胞面积指数和积分光密度值(integrated optical density,IOD)分别为(2.51±1.30/15.41±1.63)、(2.70±1.26/15.66±1.17)、(14.23±0.42/33.13±1.07)、(33.47±1.77/51.29±2.67),口腔正常黏膜组、单纯增生白斑组、异常增生白斑组和口腔鳞状细胞癌组中骨膜蛋白的阳性细胞面积指数和IOD值逐步升高,除单纯增生白斑组与正常口腔黏膜组无统计学意义外,其余各组间均有统计学意义(P<0.05)。在口腔鳞癌组织中骨膜蛋白的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期以及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。(2)三组组织中均有骨膜蛋白mRNA的表达,正常口腔黏膜、异常增生白斑和口腔鳞癌组组织骨膜蛋白mRNA分别为0.326074±0.412194、0.751156±0.250896、1.37044±0.500052,与正常口腔黏膜组织相比,口腔白斑、口腔鳞癌组织中骨膜蛋白mRNA升高,表达水平亦有统计学差异(P<0.05);(3)免疫组化实验方法和荧光定量PCR方法对骨膜蛋白检测结果一致性较好(Kappa=0.932>0.81)。
  第二部分:(1)通过酶联免疫吸附试验测得健康人群血清中骨膜蛋白的浓度为20.64±5.3ng/ml、异常白斑患者血清中骨膜蛋白的浓度为54.23±3.8ng/ml,口腔鳞癌患者血清中骨膜蛋白的浓度为81.06±10.1ng/ml。口腔白斑和鳞癌患者血清中骨膜蛋白的表达水平显著高于健康人群(P<0.05);(2)将鳞癌患者的基本临床信息与血清中骨膜蛋白的表达水平进行相关性分析,发现鳞癌患者肿瘤的TNM分期、侵袭浸润深度以及有无淋巴结转移等因素影响着血清中骨膜蛋白的表达(P<0.05)。
  结论:
  1.mRNA基因和蛋白水平均证明骨膜蛋白从正常口腔黏膜发展为口腔白斑最后恶变成鳞癌的过程中表达逐渐增强,提示骨膜蛋白参与口腔黏膜癌变的发生发展。
  2.通过对免疫组化法与荧光定量PCR法相关性进行分析发现两者具有一致性,可以采用免疫组化这种相对简便且低廉的方法对骨膜蛋白基因的表达变化进行初步检测。
  3.血清中骨膜蛋白的表达水平可作为监测口腔黏膜白斑向口腔鳞状细胞癌发展的参考指标,同时也可为口腔鳞癌侵袭以及预后提供判断依据。
[硕士论文] 吴晓婷
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:在世界范围内,口腔癌约占全世界恶性肿瘤的3%,口腔癌中以舌癌最常见。虽然科学技术的飞速发展使医疗水平不断提升,舌癌的治疗手段也因此得到不断改善,但患者的五年生存率仍然不高,术后的生存质量也不尽如意。因此,从分子水平研究舌癌发生发展、侵袭转移的分子机制,以期望实现舌癌的分子靶向治疗、提高患者生存质量和预后成为研究的热门。本课题组前期通过转录组测序发现基质金属蛋白酶MMP-10、MMP-13在舌癌组织中相对高表达,与舌癌密切相关。因此,本课题拟通过研究抑制MMP-10、MMP-13基因后舌癌细胞CAL-27增殖、侵袭、迁移能力的变化,进一步明确它们在舌癌中发挥的作用,并探讨其可能的机制,为舌癌的治疗提供新思路。
  目的:研究抑制MMP-10、MMP-13对舌癌细胞CAL-27增殖、侵袭迁移能力的影响,为舌癌基因靶向治疗提供理论基础和临床依据。
  方法:第一部分:筛选及进一步验证舌癌癌及癌旁组织差异基因。由上海众信生物技术有限公司通过对5对舌癌患者的癌组织和癌旁组织进行基于NGS的RNA-seq测序,初步筛选出部分差异基因MMPs;将收集的舌癌及癌旁组织标本应用qRT-PCR方法对差异基因MMPs进行进一步验证。第二部分:探讨抑制MMP-10、MMP-13基因对舌癌细胞株CAL-27生物学行为的影响。用针对MMP-10和MMP-13基因序列分别设计合成相应的siRNA,转染CAL-27细胞,通过Real-time PCR技术检测两个基因在RNA水平的表达变化,筛选出两条干扰效果较好的siRNA;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)验证两个基因在蛋白水平的表达变化。运用CCK8法和平板克隆形成实验研究MMP-10、MMP-13被干扰后CAL-27细胞增殖能力的改变;采用划痕愈合实验及侵袭小室法研究MMP-10、MMP-13被干扰后CAL-27细胞迁移、侵袭能力的改变。第三部分:建立动物模型观察抑制舌癌高转移细胞株MMP-10表达后癌细胞在裸鼠体内转移能力的改变。构建靶向抑制MMPs基因的慢病毒载体,感染舌癌高转移细胞株,建立裸鼠舌部原位癌模型,观察及计算各组的淋巴结转移率。
  结果:第一部分:RNA-seq测序结果显示5对癌组织中MMP-10、MMP-13相对高表达,应用qRT-PCR方法进一步验证也发现两个基因在大部分舌癌组织中相对高表达。第二部分:siRNA-MMP-10/siRNA-MMP-13转染CAL-27细胞后,Real-time PCR及Western blot结果显示相应的MMP-10/MMP-13在RNA水平及蛋白水平表达下调;CCK8法和平板克隆形成实验显示siRNA-MMP-13转染后细胞增殖能力明显低于阴性对照组;划痕愈合实验、侵袭小室结果表明,MMP-10/MMP-13表达下降后CAL-27细胞的迁移、侵袭能力也随之下降。第三部分:慢病毒抑制稳转细胞组1336组MMP-10蛋白较NC组表达下调,迁移能力较NC组降低,我们选择1336组稳转细胞和NC组稳转细胞进行动物实验发现1336组裸鼠淋巴结转移率较NC组下降。
  结论:MMP-10、MMP-13在癌组织中相对高表达;抑制MMP-13基因后CAL-27细胞的增殖、迁移、侵袭能力均减弱;抑制MMP-10基因后CAL-27细胞的迁移、侵袭能力均减弱;MMP-10、MMP-13基因可能对人舌鳞癌的增殖、迁移和侵袭起到一定的促进作用。
[硕士论文] 刘晓静
口腔医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSSC)是一种五年生存率较低的口腔恶性肿瘤。随着分子生物学研究领域的不断深入,靶向药物治疗逐渐占据重要位置。寻找有效的治疗靶点,制定相应的靶向治疗计划,对提高口腔鳞癌患者的生存率有着非常重要的价值。
  研究发现:BET蛋白可以使细胞核大分子复合体到达染色质的特定区域,从而调节一系列重要的生命活动。BRD4,近年来是BET蛋白的研究热点,在许多恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。我们实验组已经证实BRD4与口腔鳞状细胞癌的增殖、侵袭、转移密切相关,可以成为抗癌治疗的重要靶点。BRD4蛋白抑制剂在一些恶性肿瘤的治疗中,正在逐渐应用于临床。尽管BRD4蛋白抑制剂在口腔鳞癌中单独使用有一定的治疗作用,但遗憾的是,效果并不十分理想。
  提高BRD4蛋白抑制剂在恶性肿瘤中的治疗效果,尽管国内外学者开展了一系列研究,但主要围绕在卵巢癌以及肺癌,在口腔鳞癌中迄今未见有相关论文发表。基于以上事实,进一步研究BRD4蛋白抑制剂在口腔鳞癌中的作用机制,寻找提高治疗效果的方法,有可能获得更大的治疗益处。
  本研究的目的如下:1、检测BRD4在口腔鳞癌组织中的表达量。2、检测BRD4蛋白抑制剂与EGFR介导的EGFR/PTEN/PI3K/AKT信号通路之间的关系。3、采用PI3K抑制剂BKM120与JQ1协同使用,检测对口腔鳞癌治疗效果的影响。4、探究PI3K抑制剂与JQ1协同作用的机制。5、探究EGFR介导的信号通路对JQ1在口腔鳞癌中治疗效果的影响。
  第一章:BRD4在口腔鳞癌组织中高表达
  目的:
  取30例口腔鳞癌组织以及癌旁组织,检测BRD4表达量,进一步验证BRD4可以作为口腔鳞癌的有效的治疗靶点。
  方法:
  30例口腔鳞癌组织以及癌旁组织标本均由山东大学口腔医院口腔颌面外科提供,经过伦理委员会许可,所有病人均知情同意并签署知情同意书。采用免疫组织化学技术(SP法),检测BRD4在30例口腔鳞癌组织以及癌旁组织中的表达量,并进行统计学分析。
  结果:
  免疫组织化学结果显示:30例口腔鳞癌标本中,BRD4在28例中高表达,表达率高达93%;30例切取的癌旁组织标本中,BRD4均为低表达。与癌旁组织相比,BRD4在口腔鳞癌组织中明显高表达。
  结论:
  BRD4在口腔鳞癌组织中高表达,可以作为一个有效的治疗靶点。
  第二章:BRD4蛋白抑制剂JQ1可以通过EGFR介导的EGFR/PTEN/PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用
  目的:
  检测在口腔鳞癌细胞系中,BRD4蛋白抑制剂JQ1对EGFR介导的EGFR/PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响。
  方法:
  在口腔鳞癌Ca127以及Scc25细胞系中,均采用BRD4的小分子抑制剂JQ1进行治,本实验采用的JQ1浓度分别为0μM,0.2μM,1μM,5μM,治疗24h后,分别采用RT-PCR与Western-blot技术检测EGFR、pEGFR、P-AKT、AKT以及抑癌基因PTEN的表达量,检测JQ1在口腔鳞癌中的治疗机制。
  结果:
  RT-PCR与Western-blot结果均显示:在总的AKT无明显改变的基础上,JQ1可以明显抑制EGFR、pEGFR、P-AKT的mRNA以及蛋白表达量,增加了EGFR下游的抑癌基因PTEN的表达量。随着JQ1浓度的升高,改变EGFR、pEGFR、P-AKT、PTEN表达的效果逐渐增强。
  结论:
  在口腔鳞癌细胞系中,BRD4蛋白抑制剂JQ1可以通过EGFR介导的EGFR/PTEN/PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。
  第三章:采用BKM120与JQ1协同使用,可以显著提高口腔鳞癌的治疗效果
  目的:
  分别采用体内实验与体外实验检测PI3K的抑制剂BKM120与JQ1协同使用,对口腔鳞癌治疗效果的影响。
  方法:
  在口腔鳞癌Ca127以及Scc25细胞系中,采用1μM的PI3K抑制剂BKM120与不同浓度梯度的JQ1协同治疗,体外实验中,采用CCK8检测Ca127以及Scc25细胞的增殖,采用流式细胞术检测Ca127细胞的凋亡,并且采用Western-blot检测凋亡相关指标caspase-3的表达量。体内实验建立Ca127裸鼠成瘤模型,分别采用BKM120、JQ1或者两者协同治疗,检测治疗效果。
  结果:
  体外实验中,CCK8结果显示:与单独使用JQ1或者BKM120相比,协同治疗可以更大程度抑制口腔鳞癌的增殖;流式细胞术显示:采用JQ1与BKM120两种抑制剂协同治疗,能够显著增加Ca127细胞系的凋亡水平;Western-blot结果显示:采用JQ1与BKM120两种抑制剂协同治疗,可以使凋亡相关指标caspase-3明显增强。体内实验结果显示:与单独使用JQ1或者BKM120相比,JQ1与BKM120协同治疗组中裸鼠的肿瘤体积明显减小。
  结论:
  在口腔鳞癌中,与JQ1单独用药相比,采用JQ1与BKM120协同治疗,效果显著。
  第四章:JQ1与BKM120协同治疗的机制在于进一步抑制BRD4与EGFR的表达
  目的:
  探究JQ1与BKM120协同作用的治疗机制。
  方法:
  在口腔鳞癌Ca127与Scc25细胞系中,实验组采用浓度分别为0.2μM,1μM,5μM的JQ1与1μM的BKM120协同治疗;对照组采用JQ1或者BKM120单独治疗。治疗24h后,分别采用RT-PCR与Western-blot检测EGFR、P-EGFR与BRD4的表达量。
  结果:
  与单独使用JQ1或者BKM120相比,两者协同治疗可以显著降低EGFR、P-EGFR、BRD4的mRNA与蛋白表达量。
  结论:
  JQ1与BKM120协同治疗,可以进一步抑制BRD4与EGFR的表达。
  第五章:EGFR影响口腔鳞癌对BRD4蛋白抑制剂的敏感度
  目的:
  探究EGFR介导的信号通路对JQ1在口腔鳞癌中治疗效果的影响。
  方法:
  在口腔鳞癌Ca127以及Scc25细胞系中,我们一组采用siRNA抑制EGFR的表达,一组采用2ug/ml的EGF蛋白激活EGFR,另设空白对照组。三组均采用5μM的JQ1治疗后,分别检测肿瘤细胞的增殖与凋亡;检测BRD4的mRNA以及蛋白表达量,确认各组细胞对JQ1的敏感度。
  结果:
  CCK8以及流式细胞仪分析发现:EGFR敲除组可以显著地抑制口腔鳞癌的增殖能力,增加凋亡水平,提高JQ1的治疗效果;采用EGF配体激活EGFR组,得到相反的效果,即可以促进口腔鳞癌的增殖,抑制凋亡。而RT-PCR以及Western-blot结果显示:与EGF蛋白组相比,EGFR敲除组中BRD4的表达量显著降低。
  结论:
  EGFR的表达量可以显著影响口腔鳞癌对BRD4蛋白抑制剂的敏感度。
[硕士论文] 杨宗澄
口腔种植学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是全球常见的恶性肿瘤之一,一经确诊大多为晚期,生存率低,预后差,因此,解析OSCC诊断和预后标志物是有效防控的前提。生物信息学是发现肿瘤标志物的筛选工具,本课题运用生物信息学挖掘OSCC诊断与预后相关分子标志物,探究被发现候选分子AUNIP在OSCC中表达状况及其与患者生存率、相关临床因素之间的关系,评估其作为诊断和生存预测标记物的价值,为OSCC的诊疗提供初步参考。
  方法:
  1.差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)分析:
  (1)在基因表达汇编(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中,选择与OSCC相关且具备较全面样本信息与临床信息的数据集,其中样本信息包含肿瘤组患者和正常对照组的基因表达数据,临床信息包含生存状态和生存时间等数据,整理原始文件和平台文件,用R语言(Language R)分析得到具有统计学意义的OSCC肿瘤组织与正常对照组织的差异表达基因。
  (2)整理筛选癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中OSCC的相关文件,使用Perl语言(Language Perl)进行处理和分析,得到口腔部位鳞状细胞癌组与正常对照组患者的相关基因表达信息和生存相关临床信息。对数据进行数据的处理与分析,选择差异表达基因。
  (3)将GEO数据库和TCGA数据库分析得出的差异表达基因根据表达水平,进行筛选和构建矩阵,并且对该部分差异表达基因进行交集选取。
  2.生存分析
  (1)利用Perl语言,我们将TCGA里下载并且整理好的文件进行生存状态和生存时间的数据处理,得到OSCC患者的生存信息。同时,将上述已经得出的基因表达信息按照患者的编号与临床信息进行匹配,随后进行Kaplan-Meier生存分析,并作Log-Rank检验。
  (2)选择具有患者生存时间和生存状态信息的GEO数据集,整理相关文件,表达信息与患者的临床信息匹配,将上述生存分析具有统计学意义的基因再次进行验证,用Graphpad Prism工具对该部分基因进行Kaplan-Meier生存分析,并作Log-Rank检验。
  3.单因素和多因素的COX比例风险模型(Cox Proportional-Hazards Model)分析
  从TCGA数据库中下载完整的OSCC患者临床信息,并将其进行排列和标识。同时,整合上述基因表达信息,使用统计产品与服务解决方案(Statistical Product and Service Solutions,SPSS)软件做相关单因素和多因素的COX回归分析,构建比例风险回归模型,选择统计学有意义的变量进行下一步处理。
  4.目的基因的选取与相关数据分析
  综合生物信息数据分析结果和当前学术研究前沿,选择理论上与OSCC相关性最佳,可行性最大,前瞻性最优的基因进行深度的数据分析和实验研究。相关实验方法如下:
  (1)将目的基因带回GEO数据库和TCGA数据库中,使用Graphpad Prism工具进行差异表达分析,观察比较变化趋势和分析结果。
  (2)使用SPSS工具对目的基因进行单因素COX回归分析,观察与第一部分结果是否一致,并做出受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC),观察曲线下方的面积(Area Under the Curve,AUC)大小以及是否具有统计学意义。
  (3)依据目的基因表达水平将TCGA中OSCC相关临床指标进行分组,用Graphpad Sprim工具对其表达水平进行组内对比,检验统计学意义。
  (4)将目的基因按照表达量的高低对患者进行分组,用SPSS工具比较其与TCGA中OSCC临床因素的相关性,进行卡方检验。
  (5)蛋白互作网络(Protein-Protein Interaction,PPI)分析
  为了研究该基因在口腔鳞状细胞癌中发生的作用和分子机制,我们构建相关蛋白互作网络,并对此进行富集分析,包括Gene Ontology(GO)分析,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathway分析和Disease Ontology(DO)分析,观察这些蛋白可以被注释于哪些生物学功能通路和疾病谱中。
  (6)整理TCGA中基因表达文件,根据目的基因表达量的高低,选取排名前25%和后25%的患者,以此分为基因高表达的实验组与基因低表达的对照组,用R语言对涉及到的所有基因进行表达差异分析,验证统计学意义,得到差异表达基因,并对它们进行富集分析,方法同上。
  5.免疫组织化学染色方法检测目的分子表达
  取132例OSCC患者肿瘤组织及42例正常对照(癌旁)组织石蜡切片,检测目的基因的表达水平,及与患者部分临床指标间的联系。
  结果:
  1.通过GEO数据库和TCGA数据库中差异表达基因分析和整合,选择表达变化大于2倍以及具有统计学意义的基因,得到192个OSCC中差异表达的基因。
  2.在TCGA数据库中进行192个差异表达基因进行Kaplan-Meier生存分析,经Log-Rank检验得到8个统计学差异最为显著的基因,分别是HOXC6,DKK1,CEP55,AUNIP,MCM2,GALNT6,ISOC1,HOPX。其中HOXC6,DKK1,CEP55,MCM2,HOPX都已被证实在OSCC中参与调控作用。
  3.将上述8个基因在GEO数据库中再次进行Kaplan-Meier生存分析,并作Log-Rank检验,共有2个具有统计学意义的基因AUNIP和CEP55。
  4.COX单因素回归分析中,发现患者生存状态、时间与首次治疗效果、是否进行放射性治疗、是否具有淋巴血管浸润及周围神经浸润、病理分期、以及临床分期均具有统计学意义,再加入与OSCC发病相关的常见自变量,如年龄,性别,是否具有饮酒史,人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染情况,临床分期,临床原发肿瘤范围(Tumor,T)分期,临床淋巴结转移(Lymph Node,N)分期,临床远处转移(Metastasis,M)分期等因素进行COX多因素回归分析,得出AUNIP可以作为独立的预后影响因子。
  5.综合国内外研究情况,我们选择AUNIP作为本实验的研究目的基因,将其表达水平带回GEO数据库和TCGA数据库中做差异表达分析,证明AUNIP在OSCC组织中呈高表达。
  6.使用SPSS工具进行COX单因素回归分析,证实高表达AUNIP患者的生存率较低,预后较差。
  7.具有饮酒史,存在HPV感染,临床分期为iii+iv,临床T分期为T3+T4,病理T分期为T3+T4的患者肿瘤组织中AUNIP呈高表达。
  8.按照目的基因表达量高低分组,对OSCC患者临床指标进行相关性分析得出HVP感染情况,淋巴血管浸润与否,临床分期,临床T分期,病理T分期这五个因素与AUNIP的表达差异具有联系。
  9.PPI分析得出与AUNIP有关联的蛋白有AURKA、TRIP13、POLQ、KIF2C、MCM10、OIP5、CDCA8、POLE2、EXO1、CDC45,富集到的功能主要有细胞周期、DNA复制、DNA修复等。
  10.按照AUNIP表达量的前25%和后25%水平对患者进行分组后,所作基因差异表达分析,选择表达变化大于2倍以及具有统计学意义的基因,我们得到3136个差异表达基因。富集到Gene Ontology-Biological Process(GO-BP)238项,Gene Ontology-Cellular Component(GO-CC)62项,Gene Ontology-Molecular Function(GO-MF)87项,KEGG pathway37项,Disease Ontology(DO)18项,其中与口腔肿瘤相关的项目如:细胞外基质受体相互作用,细胞周期,尼古丁成瘾,上皮细胞分化,口腔疾病和牙齿疾病等。
  11.免疫组织化学染色结果显示口腔鳞状细胞癌细胞中AUNIP呈高表达,且患者的年龄、性别和病理分级与AUNIP的表达水平具有联系,<60岁、男性、病理分级为非G1的患者肿瘤细胞中AUNIP的表达水平更高。
  结论:
  通过生物信息学方法对数据库信息进行处理和分析,得到CEP55,AUNIP2个差异表达且与OSCC预后相关的基因。其中AUNIP在口腔肿瘤细胞中呈高表达,与OSCC患者的生存情况和相关临床因素相关,临床OSCC患者标本显示AUNIP较癌旁正常组织表达增高。上述研究提示AUNIP有可能作为OSCC独立的诊断和生存预测标记物。
[博士论文] 侯超
口腔临床医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:舌鳞状细胞癌(TSCC)是口腔癌中最常见的类型,其特点是高转移和侵袭性生长的能力。以往研究表明,在不同的癌症类型中,包括TSCC,肿瘤相关microRNA的异常表达可能与肿瘤的发生、发展有关。MiRNAs通过RNA诱导的沉默复合体的作用,将miRNA分子与靶mRNA的3'非翻译区(UTR)结合来抑制靶基因的表达;这导致靶mRNA降解或抑制mRNA翻译。研究表明,原癌基因的激活和肿瘤抑癌基因的失活可能与舌鳞癌发病密切关联。然而,TSCC潜在的发生和发展相关的详细的分子学机制尚未阐明。因此,必须更深入了解调控舌鳞状细胞癌发病的相关机制,以期更有效防止疾病的发生及复发,最终提高患者的生存率。miR-509因其在人类许多常见肿瘤中的肿瘤抑制作用,已被确定为在肿瘤发生和发展中的一个关键调节因子。在本研究中,我们通过实时荧光定量PCR检测TSCC肿瘤组织和细胞系中miR-509的表达。通过MTT和侵袭实验分别评估miR-509对舌鳞癌细胞增殖和侵袭的影响。另外,我们通过实时荧光定量PCR、westernblot和双荧光素酶报告基因实验等一系列实验鉴定在TSCC组织中miR-509的直接靶基因。本研究发现,miR-509在舌鳞癌组织标本和细胞系(Tca8113,SCC-15,CAL-27)中表达下调,在体外过表达miR-509则抑制舌鳞癌细胞增殖,侵袭和转移。通过网络计算机预测软件预测在舌鳞癌组织中miR-509靶基因为表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor,EGFR)。下调EGFR表达能抑制TSCC肿瘤细胞的增殖和侵袭,其作用类似于过表达miR-509所引起的TSCC肿瘤细胞生物学变化。另外,在Tca8113和Cal-27中,过表达miR-509下调EGFRmRNA和蛋白的表达,且下调EGFR下游信号分子P-AKT和P-ERK1/2表达。EGFRmRNA在TSCC组织中高表达,miR-509在TSCC组织中低表达,Spearman相关分析显示在舌鳞癌组织中miR-509的表达与EGFR的表达呈负相关。总之,miR-509通过直接靶向EGFR可抑制舌鳞癌细胞增殖和侵袭,从而表明,miR-509/EGFR轴可能具有作为一种新的治疗舌鳞癌病人的靶向治疗方法的潜能。
  第一部分 miRNA-509抑制TSCC增殖、迁移及侵袭的体外实验研究
  目的:
  miR-509因其在人类许多常见肿瘤中的肿瘤抑制作用,已被确定为在肿瘤发生和发展的一个关键调节因子。本部分实验来检测miR-509异常表达所引起的舌鳞癌细胞的生物学变化。
  方法:
  1)通过荧光定量PCR检测miR-509在TSCC肿瘤组织及细胞系中的表达。
  2) MTT法检测过表达miR-509对TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)增殖的影响。
  3)Transwell小室迁移和侵袭实验分析过表达miR-509对TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)迁移和侵袭的影响。
  结果:
  1) miR-509在28个配对的TSCC组织及TSCC细胞系(Tca8113,SCC-15,CAL-27)中表达下调。
  2)在TSCC细胞系(Tca8113,Cal-27)中,过表达miR-509能抑制细胞增殖。在转染2天和3天后细胞增殖出现显著下降,差异均有统计学意义。
  3) Transwell小室迁移和侵袭实验显示,过表达miR-509显著抑制了Tca8113,Cal-27细胞的迁移和侵袭。
  结论:
  miR-509在TSCC肿瘤组织及TSCC细胞系(Tca8113,SCC-15,CAL-27)中表达下调。过表达miR-509抑制Tca8113,CAL-27的细胞增殖、迁移和侵袭,在TSCC中发挥抑癌基因作用。
  第二部分 鉴定直接靶向miR-509的靶基因
  目的:
  通过靶基因预测软件找寻TSCC中直接靶向miR-509的靶基因,在TSCC组织及细胞系中验证所选的靶基因EGFR其mRNA及蛋白表达是否受miR-509调节,并对相关机制做进一步分析。
  方法:
  1)应用靶基因预测软件microma.org(http://www.microrna.org)和TargetScan(www.targetscan.org)筛选可能直接靶向miR-509的靶基因,根据mirSVR值进一步筛选。
  2)通过Westernblot检测在TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)中转染miR-509模拟剂后EGFR蛋白及EGFR下游信号通路的关键分子(AKT、 P-AKT、ERKI/2、P-ERKI/2)的表达情况,并通过qRT-PCR检测转染miR-509模拟剂后EGFR mRNA的表达情况。
  3)通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-509是否直接靶向EGFR mRNA的3'UTR端。
  4) RNA干扰分析沉默EGFR后是否能模拟miR-509过表达所引起的TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)的细胞增殖、迁移及侵袭能力下降改变。
  5) qRT-PCR检测EGFR在28对TSCC组织及正常组织中mRNA表达,通过Spearman相关分析评估在TSCC组织中EGFR mRNA表达与miR-509表达的相关性。
  结果:
  1)通过靶基因预测软件microma.org(http://www.microrna.org和TargetScan(www.targetscan.org),预测miR-509的靶基因为EGFR。
  2) Westernblot实验显示转染miRNAs模拟剂和阴性对照(miR-509mimics、miR-NC)72小时后,转染miR-509mimics组显著抑制Tca8113和CAL-27细胞中EGFR蛋白表达。过表达miR-509显著抑制EGFR下游的信号分子。在Tca8113和Cal-27中,过表达miR-509显著下调P-AKT和P-ERK1/2表达,但对AKT和ERK1/2表达无影响。qRT-PCR证实,转染miR-509mimics组下调Tca8113和CAL-27细胞中EGFR mRNA表达。
  3)双荧光素酶报告基因实验证实miR-509直接作用于EGFRmRNA的3'UTR端,从而抑制EGFR的表达。
  4)RNA干扰沉默EGFR后,Tca8113,CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭均受到抑制,与过表达miR-509所引起的肿瘤细胞的生物学变化结果相似。
  5) EGFRmRNA在28对TSCC组织中高表达,Spearman相关分析显示EGFR mRNA和miR-509在TSCC组织中表达呈负相关。
  结论:
  1)过表达miR-509能下调TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)中EGFR的表达,且对EGFR下游信号通路有不同程度的抑制作用。
  2) EGFR mRNA的3'UTR端是miR-509的直接作用靶点
  3) miR-509通过负调控EGFR的表达而参与TSCC肿瘤的发生和发展。
[硕士论文] 吴海涛
口腔医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是常见的唾液腺恶性肿瘤之一,约占头颈部恶性肿瘤的1%[1]。目前对于该肿瘤的治疗还是以手术为主的综合治疗,但是因为该肿瘤恶性程度高,侵袭性强以及转移率高,患者的预后较差。近年来,随着分子生物学发展,Ki-67、Bcl-2等靶点基因治疗应用较多,但治疗效果却不尽人意。尽管如此,新的分子标记物及分子靶点的研究方兴未艾,继续探寻新的分子标志物及基因靶点疗法意义深远。
  本文主要分为以下几个部分:
  第一部分:BRD4在涎腺腺样囊性癌组织中的表达量
  目的:
  探究BRD4在涎腺腺样囊性癌组织及其对应的癌旁组织中的表达量,确定BRD4可以作为一个有效的治疗靶点。
  方法:
  选择30例腺样囊性癌患者肿瘤组织以及对应癌旁组织,采用了免疫组织化学方法检测BRD4在其中的表达情况。
  结果:
  免疫组织化学结果显示:在取得的30例肿瘤组织中,BRD4表达率高达80%。而在30例癌旁组织中,BRD4均为低表达。
  结论:
  BRD4在涎腺腺样囊性癌组织中高表达,可以作为肿瘤治疗的一个有效靶点基因。
  第二部分:腺样囊性癌对BRD4蛋白抑制剂JQ1的治疗不敏感
  目的:
  在涎腺腺样囊性癌的治疗中,采用BRD4蛋白抑制剂JQ1单独治疗时的效果如何?据此设计进一步的实验。
  方法:
  先将Acc-83细胞孵育24小时后,分别给予0.2μM,1μM,5μM剂量的JQ1,用CCK8检测1-4天肿瘤细胞的增殖情况。24h后,流式细胞术检测Acc-83细胞的凋亡水平。同时检测凋亡相关指标cleaved caspase-3的表达水平。
  结果:
  JQ1能抑制Acc-83的细胞活性,但是当JQ1浓度达到5μM时,Acc-83细胞活性降低到最大,仅有对照组的30%。
  结论:
  涎腺腺样囊性癌中,当采用JQ1单独治疗时,效果不佳,即肿瘤细胞对JQ1不敏感。
  第三部分:JQ1抑制BRD4和c-Myc的表达,激活EGFR信号通路
  目的:
  探究JQ1在单独治疗腺样囊性癌中,与c-Myc和EGFR信号通路是否有关,并检测相应的通路变化,探寻治疗机制。
  方法:
  使用western blot分别检测0.2μM,1μM,5μM剂量的JQ1治疗后BRD4、c-Myc、pEGFR及EGFR相关蛋白表达水平,再用qRT-PCR检测c-Myc及EGFR mRNA的表达水平。
  结果:
  Western blot结果显示:随着JQ1浓度的升高,BRD4和c-Myc的表达逐渐降低,而EGFR及pEGFR蛋白的表达升高;qRT-PCR结果示:随着JQ1浓度升高,c-Myc的表达逐渐降低,而EGFR表达水平却升高,这与前面western blot结果一致。
  结论:
  JQ1能够通过c-Myc信号通路,发挥抗癌作用;但同时激活了EGFR的激酶通路,引起治疗抑制。
  第四部分:采用JQ1与PI3K的抑制剂BKM120联合治疗,可以显著提高治疗效果
  目的:
  将采用JQ1和PI3K抑制剂BKM120行联合治疗,并检测联合治疗后涎腺腺样囊性癌效果如何,初步探究其潜在机制。
  方法:
  实验分为JQ1(5μM)组,BKM120(1μM)组,联合治疗组以及对照组,分别检测了Acc-83细胞系的增殖及凋亡水平;用western blot检测BRD4,c-Myc,EGFR以及pEGFR蛋白的表达水平,用qRT-PCR检测EGFR和c-Myc mRNA的表达。
  结果:
  CCK8检测结果显示:与单一药物治疗相比,JQ1和BKM120联合治疗组显著抑制了Acc-83细胞的增殖。Western blot显示:JQ1和BKM120联合治疗组中,BRD4和c-Myc的蛋白表达量均明显下降;联合治疗组中,EGFR的表达量明显低于JQ1单独用药组(P<0.05),但略高于BKM120组;qRT-PCR进一步证实了这结果。
  结论:
  JQ1和BKM120协同用药治疗,能够同时抑制EGFR和c-Myc两条信号通路,提高Acc-83对JQ1的敏感度,显著提高治疗效果。
  第五部分:EGFR的表达量显著影响腺样囊性癌对JQ1治疗的敏感度
  目的:
  涎腺腺样囊性癌中,探讨EGFR的表达量是否影响JQ1的治疗效果。
  方法:
  先用siRNA沉默了EGFR,将实验分为siEGFR组,JQ15μM组,siEGFR+JQ15μM组以及对照组。Acc-83细胞转染成功2天后,CCK8检测了1-4天各组肿瘤细胞增殖;24h后,检测各组凋亡水平。采用qRT-PCR以及Western-blot检测BRD4、c-Myc的表达水平。
  结果:
  CCK8检测结果示:JQ1+siEGFR组细胞增殖降低明显低于其他组(P<0.05);同时cleaved caspased-3的表达水平明显增加。Western blot结果显示JQ1+siEGFR组中BRD4和c-Myc表达明显降低,qRT-PCR结果也证实了western blot结果。
  结论:
  涎腺腺样囊性癌中,EGFR的表达量可以显著影响JQ1的治疗效果,即影响肿瘤细胞对JQ1的敏感度。
[硕士论文] 路振宁
药理学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  口腔癌是一种不断增长的、严重威胁人类健康的全球恶性疾病。目前,临床上口腔癌常规的治疗方法主要有手术、放疗、化疗以及不同方法联合治疗。近年来,尽管在临床诊断及治疗方面都有了很大的进展,但口腔癌患者的五年生存率仍处于较低水平。长春新碱(Vincristine,VCR),一种微管蛋白聚合抑制剂,是口腔癌治疗的基础化疗药物之一。与大多数抗肿瘤药物一样,多药耐药是限制VCR在临床应用的主要因素。质子泵抑制剂(Proton pump inhibitors,PPIs),是通过降低胃壁细胞H+-K+-ATPase活性而抑制胃酸分泌的一类药物,近年来其抗肿瘤活性受到研究者的广泛关注,并且与化疗药物合用能够增强治疗效果,但其作用机制并不完全明确。PPIs安全性较好,本身具有抗肿瘤作用,在联用中可减小化疗药物剂量,降低毒性,还有临床实验报道PPIs联用镇吐剂可减轻化疗导致的胃肠道反应。在本论文中,我们从细胞和动物两个方面观察研究了质子泵抑制剂泮托拉唑(Pantoprazole,PPZ)与VCR合用对人口腔上皮癌KB/V耐药细胞的增殖、凋亡、周期、侵袭转移以及肿瘤组织生长的影响,并对其可能的作用机制进行了探讨。
  研究方法:
  1.检测PPZ预处理是否能增加VCR对KB及KB/V细胞的细胞毒性。本论文首先采用MTT方法观察PPZ对KB及KB/V细胞增殖的影响,筛选合用中PPZ的剂量。接着采用MTT方法和克隆形成实验观察PPZ预处理24h是否可增加VCR对KB及KB/V细胞的细胞毒性。同时,检测了PPZ与VCR合用对人正常组织细胞的毒性作用。
  2.检测PPZ与VCR合用对KB/V细胞凋亡的影响。采用Hoechst33342核酸染色方法及AnnexinⅤ-FITC/PI双染实验检测PPZ预处理24h与VCR合用后KB/V细胞的凋亡变化,并采用Western blotting方法检测PPZ和VCR对凋亡相关蛋白表达水平的影响。
  3.检测PPZ与VCR合用对KB/V细胞周期分布的影响。采用PI染色法检测PPZ预处理与VCR合用后KB/V细胞周期分布变化,进一步检测细胞周期调控蛋白表达水平的变化。
  4.检测PPZ和VCR合用对KB/V细胞迁移和侵袭能力的影响。采用划痕实验和Transwell实验检测PPZ和VCR合用后KB/V细胞迁移和侵袭能力的变化,并采用Western blotting方法检测PPZ和VCR对KB/V细胞中MMPs表达的影响。
  5.探讨PPZ增强KB/V细胞对VCR化疗敏感性的分子机制。
  采用罗丹明123胞内蓄积实验和Western blotting方法检测PPZ和VCR合用对KB/V细胞中P-gp蛋白功能和表达的影响。
  采用pH计检测在非缓冲体系中,不同浓度PPZ处理不同时间后KB/V细胞的上清培养基pH值作为胞外pH(pHe)值,并与Ⅴ-ATPase抑制剂Baf-A1的作用做对比,观察PPZ是否抑制KB/V细胞泌酸功能,并对PPZ处理后KB/V细胞的Ⅴ-ATPase表达水平进行检测。为了进一步检测PPZ对VCR细胞毒性的协同作用与Ⅴ-ATPase的关系,实验中采用MTT方法观察加入Baf-A1后对PPZ与VCR合用的协同生长抑制作用的影响。
  通过Western blotting实验观察PPZ和VCR合用对KB/V细胞中EGFR/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控情况。
  6.检测PPZ与VCR合用对体内KB/V细胞移植瘤的生长抑制作用
  将KB/V细胞接种到裸鼠体内建立移植瘤模型,观察PPZ和VCR对移植瘤生长和重量的影响;检测PPZ预处理能否提高VCR的抗肿瘤疗效及对裸鼠体重和胃部组织形态的影响;检测PPZ预处理能否降低VCR治疗的毒副作用,采用Western blotting实验检测瘤体组织中凋亡相关蛋白的表达变化。
  研究结果:
  1.PPZ显著增强KB及KB/V细胞对VCR的敏感性。实验结果发现PPZ对VCR抗肿瘤生长的协同增强作用在KB/V细胞中更加突出,且对人正常细胞HUVECs,GES-1及HL-7702均无明显细胞毒作用。
  2.PPZ和VCR联合应用可诱导KB/V细胞凋亡。两药合用可通过促进Caspase3和PARP裂解,上调Bax表达以及下调Bcl-xL和Bcl-2蛋白表达,从而诱导KB/V细胞线粒体通路相关的细胞凋亡。
  3.PPZ与VCR合用促进KB/V细胞阻滞于G2/M期。细胞周期阻滞作用可能与上调p21及下调Cyclin B1,cdc2及p-cdc2的表达有关。
  4.PPZ与VCR合用能通过下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达,从而抑制KB/V细胞的侵袭和转移能力。
  5.PPZ与VCR合用对药物外排蛋白P-gp的表达及外排功能都有抑制作用,其中主要是PPZ的作用。
  6.PPZ处理后KB/V细胞的胞外pH没有明显升高,对Ⅴ-ATPase的表达无明显抑制作用,而且,Baf-A1的干预不仅增强了PPZ对KB/V细胞的生长抑制作用,也显著增强了PPZ与VCR合用对KB/V细胞的协同抑制作用。综合以上结果表明,在KB/V细胞中,PPZ可能并不是通过抑制Ⅴ-ATPase以减弱细胞泌酸功能而发挥抗肿瘤作用以及逆转耐药作用。
  7.PPZ与VCR合用能够协同抑制KB/V细胞中的EGFR/MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路。
  8.体内实验证实,PPZ和VCR合用对KB/V移植瘤有明显的协同生长抑制作用,且PPZ能减轻VCR治疗中导致的毒副反应。
  研究结论:
  PPZ和VCR合用能够协同抑制KB/V细胞及移植瘤的生长增殖,诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞,抑制KB/V细胞的侵袭转移。进一步探讨其分子机制,PPZ和VCR的协同抗肿瘤作用可能与抑制P-gp的表达和外排活性,以及下调EGFR/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关,与PPZ的抑酸作用以及Ⅴ-ATPase的表达水平无关。
  研究意义
  PPZ有望成为一种新型肿瘤化疗佐剂,PPZ和VCR的联合应用将为口腔癌(尤其是针对VCR产生耐药性的口腔癌)的治疗提供一种有前景的治疗策略。
[硕士论文] 林阳
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)感染与头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)关系密切。与非HR-HPV相关HNSCC相比,HR-HPV相关HNSCC具有特殊的临床表现、分子生物学特性和预后。唾液腺肿瘤(salivary gland tumors,SGTs)在头颈部肿瘤中有着举足轻重的地位,在现仅有的数篇关于HPV感染、病毒癌基因表达与唾液腺肿瘤关系的研究中,二者是否存在明确的关系,依旧存在较大的争议。本次研究基于大规模临床样本,旨在通过多种方法相结合以明确福建地区HPV感染与唾液腺肿瘤发生发展的关系。本次研究主要分为两部分,分述如下:
  一、福建地区70例唾液腺肿瘤患者人乳头瘤病毒与唾液腺肿瘤关系的初步研究。
  研究目的:初步探讨福建地区HPV感染与唾液腺肿瘤的关系。
  研究方法:本次队列研究共纳入2016年至2017年间就诊于福建医科大学附属第一医院口腔颌面外科的原发性唾液腺上皮源性肿瘤患者70例。通过通用引物GP5+/GP6+引物的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合PCR产物直接测序检测冻存组织样本中HPV感染情况。在此基础上的,通过HR-HPV16/18E6逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、PIK3CA高频突变位点直接测序进一步探讨在70例唾液腺肿瘤中HPV感染状态和与潜在突变位点的变化情况。
  研究结果:1.在本次研究纳入的2016年至2017年的70例原发性唾液腺上皮源性肿瘤中,通过高灵敏度的通用引物PCR方法检测出的9例(12.9%)唾液腺肿瘤存在HPV感染,其中腮腺区肿瘤感染率明显高于瘤旁组织(P=0.005),感染类型以HR-HPV18感染为主(55.5%)。2.在本次研究中未发现HPV感染与PIK3CA高频突变位点的突变频率之间存在显著相关性。3.在2016年至2017年全部140例唾液腺肿瘤及瘤旁冻存组织样本中,通过RT-PCR方法均未检出HPV16/18E6转录活性。
  二、福建地区133例唾液腺肿瘤患者人乳头瘤病毒与唾液腺肿瘤关系的研究。
  研究目的:进一步初步探讨福建地区HPV感染与唾液腺肿瘤发生发展的关系。
  研究方法:共纳入2007年至2017年间就诊于福建医科大学附属第一医院口腔颌面外科的原发性唾液腺上皮源性肿瘤患者133例。通过HR-HPV16/18显色原位杂交(chromogenic in situ hybridization,CISH)技术检测唾液腺恶性肿瘤中HPV感染;HR-HPV16/18E6和p16INK4a免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)方法评估在唾液腺肿瘤中HR-HPV16/18感染状态和与癌蛋白表达情况;在此基础上,本次研究进一步探讨HR-HPV16/18相关分子标志物在唾液腺恶性肿瘤中的潜在预后价值。
  研究结果:1.2007年至2017年共78例石蜡包埋唾液腺恶性肿瘤组织中通过CISH技术均未检出HR-HPV16/18感染。2.通过IHC技术在133例唾液腺肿瘤患者的石蜡包埋组织及40例正常对照唾液腺组织中均未检出HPV16/18E6蛋白表达。3.与HR-HPV相关HNSCC中p16INK4a蛋白的表达模式不同,本次研究中HR-HPV16/18感染状态与p16INK4a蛋白表达之间没有显着相关性。4.基于本次78例唾液腺恶性肿瘤的生存分析证实组织病理分型、肿瘤大小和区域淋巴结转移是唾液腺恶性肿瘤的预后危险因素,但不同于HR-HPV相关HNSCC,本次研究中未发现HR-HPV16/18感染及p16INK4a蛋白表达在唾液腺恶性肿瘤中的独立预后值。
  研究结论:福建地区唾液腺肿瘤是HPV感染的潜在靶标,其中以HR-HPV18感染为主。但不同于HR-HPV相关HNSCC,本次研究证实福建地区HPV感染与唾液腺肿瘤发生发展无直接相关性。
[硕士论文] 方亦鸿
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:课题组前期研究发现miR-30a是靶向LRP6的潜在miRNA。为了进一步研究miR-30a靶向LRP6对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响及作用机制,本研究在口腔鳞状细胞癌细胞系水平上探讨miR-30a表达与LRP6表达的相关性;以HSC-3、Cal-27细胞为研究对象,检测miR-30a靶向抑制LRP6对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响;本研究将可能发现miR-30a/LRP6信号作为新的口腔鳞状细胞癌致病机制,并为口腔鳞状细胞癌及其他恶性肿瘤的诊断治疗提供新思路和新靶标。
  方法:(1)分别应用Western blot和QPCR检测6株口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9和正常口腔鳞状细胞HOK中LRP6和miR-30a的表达,利用Pearson法分析miR-30a与LRP6表达的相关性;(2)TragetScan在线生物信息学数据库预测miR-30a与LRP6靶向调控关系;双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a与LRP6靶向作用;HSC-3和Cal-27细胞中过表达miR-30a分别利用Western blot和QPCR检测LRP6蛋白和mRNA表达变化;(3)构建过表达LRP6的pcDNA3.1-LRP6质粒,转染HSC-3和Cal-27细胞,建立过表达LRP6细胞株;MTT和克隆形成实验分别检测过表达miR-30a及miR-30a联合外源过表达LRP6对HSC-3和Cal-27细胞增殖和克隆形成能力影响;(4)转染siLRP6构建沉默LRP6的HSC-3和Cal-27细胞,MTT和克隆形成实验分别检测沉默LRP6对HSC-3和Cal-27细胞增殖和克隆形成能力影响;(5)Western blot检测沉默LRP6、过表达miR-30a及过表达miR-30a联合外源表达LRP6后LRP6及其下游Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、Cyclin D1、FGF8表达变化。
  结果:(1)Western blot检测发现LRP6在正常口腔鳞状细胞HOK中低表达,在6株口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9中相对高表达,QPCR检测发现miR-30a在正常口腔鳞状细胞HOK中高表达,在6株口腔鳞状细胞癌细胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9中普遍低表达,两者表达水平呈显著的负相关;(2)在线数据库TargetScan发现LRP6是miR-30a的潜在靶标,LRP6的3’UTR中含有与miR-30a互补结合的核苷酸位点;双荧光素酶报告基因实验发现,转染miR-30a后pmirGLO-LRP6-3'UTR-WT组荧光素酶活性显著下降,而将LRP6的3'UTR中miR-30a结合位点突变后,其荧光素酶活性无显著变化;HSC-3、Cal-27细胞中转染miR-30a后LRP6mRNA和蛋白表达均显著下调,证实在口腔鳞状细胞癌细胞中LRP6确实是miR-30a的靶标;(3)HSC-3、Cal-27细胞过表达miR-30a显著地抑制细胞增殖和克隆形成能力;过表达miR-30a联合外源表达LRP6后细胞增殖和克隆形成能力部分恢复;(4)HSC-3、Cal-27细胞沉默LRP6后细胞增殖能力和克隆形成能力均被显著抑制,得到与过表达miR-30a一致变化;(5)在HSC-3细胞中,miR-30a能够靶向抑制LRP6及其下游Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Cyclin D1、FGF8的表达。
  结论:miR-30a能够靶向抑制LRP6及其下游Wnt/β-catenin信号转导来发挥抑制口腔鳞状细胞癌的作用,揭示口腔鳞状细胞癌发生进展潜在新机制,为其临床诊断和治疗提供了新思路和新靶标。
[硕士论文] 陈希彦
口腔临床医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤之一,每年有超过28万新增的病例。中国是口腔鳞癌的高发地区,近年来的发病呈上升趋势。虽然目前已有新型的化疗方法和靶向治疗药物应用于临床,但其效果不甚理想,因此我们需深入了解口腔鳞癌的发生发展机制。Hippo信号通路下游的关键效应分子YAP已被报道在肝癌、肺癌等肿瘤组织中表达异常。因此,本课题旨在探讨YAP对口腔鳞癌细胞CAL27的增殖和凋亡的影响,并研究其在体内体外促肿瘤的作用和机制,为YAP基因作为口腔鳞癌治疗新的靶点提供理论依据。
  方法:
  1.用免疫组化法检测不同分化程度的口腔鳞癌和正常口腔上皮组织中YAP蛋白的表达情况。
  2.检测YAP在4株口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达水平,并选择CAL27作为进一步的实验材料。利用慢病毒载体转染CAL27细胞,分别构建敲除和过表达YAP基因及对照组的口腔鳞癌细胞系。通过QRT-PCR及Westem blot检测敲除和过表达效率。
  3.利用CCK-8细胞活力实验,EdU染色法,克隆形成实验来检测敲除和过表达YAP对CAL27细胞增殖的影响;流式细胞术检测YAP对细胞周期和细胞凋亡的影响。通过QRT-PCR及Western blot技术检测C-MYC、BCL-2等周期和凋亡相关因子随YAP表达改变时的情况。
  4.以不同浓度的Hippo-YAP信号通路抑制剂维替泊芬处理CAL27细胞,利用CCK-8细胞活力实验、流式细胞术来检测细胞增殖、凋亡和周期的改变;利用QRT-PCR及Western blot技术检测C-MYC和BCL-2等因子随抑制剂浓度改变情况。
  5.利用裸鼠成瘤实验,将敲除组、过表达组及相应对照组CAL27细胞注入到裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况,分析YAP的不同表达水平对口腔鳞癌发生发展的影响。
  结果:
  1.YAP蛋白在正常口腔上皮组织中基本不表达,或表达较弱;口腔鳞状细胞癌中,YAP蛋白的表达水平较高,与肿瘤分化程度有关。
  2.在CAL27细胞中,YAP基因和蛋白表达水平适中。在敲除YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表达水平明显降低,同时细胞中总YAP和细胞核中YAP表达水平均降低。过表达YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表达水平明显升高,而细胞中总YAP和胞核中YAP表达水平均升高。
  3.与对照组相比,敲除YAP基因后,CAL27细胞增殖较慢,细胞周期阻滞,同时早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均升高;C-MYC和BCL-2mRNA及蛋白表达水平均降低;周期相关蛋白CyclinD1表达水平下降,促凋亡蛋白BAX、Caspase7表达水平升高。过表达YAP基因后,CAL27细胞增殖加快,细胞周期进展加速,早、晚期凋亡细胞比例均降低;C-MYC和BCL-2表达水平升高;CyclinD1蛋白表达水平升高,BAX、Caspase7蛋白表达水平下降。
  4.以不同浓度的Hippo-YAP信号通路抑制剂维替泊芬处理CAL27细胞。利用CCK-8细胞活力实验检测细胞增殖情况,利用流式细胞术来检测细胞周期和凋亡的改变;利用QRT-PCR及Western blot技术检测C-MYC和BCL-2等因子随抑制剂浓度改变情况。
  5.敲除YAP基因后,CAL27细胞在裸鼠体内形成肿瘤速度较慢,肿瘤体积较小,且肿瘤重量较轻;而过表达YAP基因后,肿瘤形成速度较快,肿瘤体积较大,同时肿瘤重量较重。
  结论:
  YAP在口腔鳞癌中高表达且与肿瘤的分级相关;YAP能通过调节C-MYC和BCL-2的表达,来影响细胞的增殖和凋亡,从而调控肿瘤的进展。提示YAP在口腔鳞状细胞癌的发生发展中具有重要意义,为口腔鳞癌的分子靶向治疗提供了新思路。
[硕士论文] 邵婷如
口腔医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  筛选出口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的血清肿瘤标志物,并在OSCC中对筛选出的lncRNA-AC007271.3进行初步功能研究。
  方法:
  1.采用lncRNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片,筛选出OSCC及癌旁对照口腔黏膜组织中差异性表达的lncRNAs,并行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,qPCR)检测验证芯片结果。
  2.检测分析OSCC患者组织和对应血样,以及OSCC细胞中lncRNAs的表达情况,进一步筛选出OSCC血清中特异性表达的lncRNA(AC007271.3)。
  3.分别以qPCR及酶联免疫吸附法(ELISA)单独及联合检测80例OSCC患者及70例健康成人血清中AC007271.3和鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)、恶性肿瘤特异性生长因子(tumor supplied group of factors,TSGF)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和程序性细胞死亡蛋白(programmed death-ligand1,PD-L1)的表达水平,结合OSCC患者的临床参数,分析其临床意义。同时,应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)和决策曲线分析(decision curve analysis,DCA)评估单独或联合检测血清中各标志物的诊断价值;采用Kaplan-Meier生存曲线评估OSCC患者总体生存情况。
  4.以荧光原位杂交技术明确AC007271.3在OSCC细胞中的定位,进一步探讨AC007271.3的功能;敲减及过表达AC007271.3后,采用CCK-8、细胞克隆形成、划痕损伤修复、transwell基质胶侵袭及细胞凋亡实验,初步探讨AC007271.3对OSCC细胞生物学功能的影响。
  5.采用免疫印迹及免疫荧光检测并探讨AC007271.3通过Wnt/β-catenin信号通路在OSCC发生发展过程中的重要作用。
  结果:
  1.基因芯片检测筛选出691条差异性表达的lncRNAs和816条差异性表达的mRNAs(433条lncRNAs表达上调,258条lncRNAs表达下调;342条mRNAs表达上调,474条mRNAs表达下调)。通过GO和pathway等生物信息学分析及qPCR实验,进一步筛选出在OSCC及癌旁对照口腔黏膜组织中存在显著差异的4条lncRNAs(AC007271.3,AC007182.6,LOC283481和RP11-893F2.9)(n=30,P<0.05)。
  2.AC007271.3在OSCC患者组织及对应血清中的表达存在相关性(r=0.639,P<0.001),在OSCC细胞系及对应细胞外培养液中均上调,且术后患者血清中AC007271.3水平明显下降(P=0.002)。OSCC患者与健康成人血清中AC007271.3呈明显差异性表达(n=80and n=70,P<0.0001),其表达水平与患者肿瘤临床分期、分化程度和淋巴结转移密切相关。
  3.将AC007271.3和SCCA进行联合检测,其诊断价值(AUC=0.902,P<0.001)明显优于二者单独检测,尤其在OSCC的早期阶段;OSCC患者血清中AC007271.3及SCCA高表达,提示其预后相对较差。此外,血清AC007271.3,SCCA和TSGF联合检测时的敏感度(77.6%,55%,63.3%)和特异性(84.5%,93.3%,66.7%)均具有优势。
  4.AC007271.3在OSCC细胞质及细胞核中均有表达,体外实验结果显示,敲减AC007271.3,可以抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而过表达AC007271.3,可以促进OSCC细胞增殖、迁移和侵袭能力。
  5.AC007271.3可以通过上调β-catenin及其下游分子Cyclin D1、c-myc及Bcl-2,激活Wnt/β-catenin信号通路。
  结论:
  AC007271.3是OSCC早期诊断的肿瘤标志物,可作为OSCC独立的预后因子。AC007271.3,SCCA和TSGF联合检测可用于OSCC的诊断。AC007271.3能促进OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,影响细胞凋亡,并且可通过Wnt/β-catenin信号通路在OSCC的发生发展过程中起作用。
[博士论文] 巴鹏飞
口腔临床医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  舌鳞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一。它通常表现为恶性程度高、生长快、以及易发生淋巴结转移的特点。经典的肿瘤生物学理论认为,肿瘤的发生是某种或某些细胞因基因改变而导致其生长失控,缺乏分化以致恶性增生的结果。基于此理论,肿瘤治疗的主要策略是通过手术治疗,结合放疗、化疗以及生物治疗等手段,尽可能清除机体内的肿瘤细胞。虽然治疗的方法和手段不断进步,肿瘤治疗获得很大的成功,但是,对于处于舌鳞癌中晚期或者发生淋巴结转移的患者来说,其5年生存率依然很低。随着对肿瘤研究的不断深入和扩展,人们对肿瘤微环境的认识逐步加深。研究表明,肿瘤的发生发展进程不是由肿瘤细胞单独决定,而是由相互影响的肿瘤微环境和肿瘤细胞共同决定。癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中“活化”的成纤维细胞,也是肿瘤间质细胞中最主要的细胞成分。与正常组织中的成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)或癌旁组织成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs)相比,CAFs高表达α-SMA,其分泌功能、运动能力和增殖能力更强。CAFs通过旁分泌形式(分泌多种生长因子或细胞因子,如MMPs、HGF、VEGF和TGF-β)或者通过和肿瘤细胞直接接触的方式来参与调节肿瘤组织血管生成、细胞外基质重建、上皮-间质化,甚至影响肿瘤的复发和耐药。因此,以CAFs为靶点,通过调控肿瘤微环境来影响肿瘤的生物学进程,在肿瘤防治方面有重要的研究价值。
  姜黄素是从植物姜黄中提取的天然色素,作为传统药物在中国和印度等国家广泛应用。在美国和日本,它通常被当成食品添加剂供人们食用。姜黄素安全性高,毒副作用少,单独或者和其他药物联合应用对于多种肿瘤(例如:结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌及头颈部恶性肿瘤)治疗有效。
  以往,关于姜黄素抑制肿瘤方面的研究,多集中于关注其对肿瘤细胞的影响。实际上,除了肿瘤细胞,肌成纤维细胞也是姜黄素发挥作用的靶细胞之一。在非肿瘤组织中,姜黄素能够以“活化”的成纤维细胞-即肌成纤维细胞为靶点,抑制多个组织器官(肝、肺、肾、皮肤和口腔黏膜)的纤维化。CAFs作为肿瘤微环境中“活化”的成纤维细胞,姜黄素对舌鳞癌CAFs有何影响,目前还不清楚。
  因此,本研究首先获取舌鳞癌组织及癌旁组织,通过原代培养、分离、纯化出舌鳞癌CAFs和PTFs;观察姜黄素对舌鳞癌CAFs表型、促癌相关细胞因子的分泌表达以及增殖能力、运动能力影响;通过体外实验和体内实验观察姜黄素对CAFs促癌活性的影响,并初步探讨其可能的机制。为深入理解肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互影响,甚至为肿瘤的防治提供实验和理论基础。
  方法:
  1.舌鳞癌及癌旁组织相关成纤维细胞的分离、纯化和鉴定
  新鲜的组织标本取自山东大学齐鲁医院颌面外科的临床手术切除的舌鳞癌组织及癌旁组织。采用组织块法培养,获得舌鳞癌CAFs和PTFs。在第一次和第二次细胞传代时,利用酶消化法和反复贴壁法对细胞进行分离和纯化。采用免疫组化技术检测α-SMA、vimentin和CK19表达,应用CCK8试剂盒检测CAFs和PTFs增殖能力。
  2.姜黄素对CAFs细胞表型和功能特征的影响
  采用CCK8试剂盒检测不同浓度0、5、10、20、40、60、80μM姜黄素对CAFs和PTFs细胞活性的影响,筛选出对细胞活性无影响的最大药物浓度用于后续实验。CAFs和PTFs中分别加入姜黄素(对照组加入等量DMSO)处理后,Western blot检测细胞内仅-SMA及p-Smad2/3的蛋白表达;采用CCK8检测细胞增殖情况;RT-PCR检测MMP2、SDF-1、TGF-β1mRNA表达;ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中MMP2、SDF-1、TGF-β1蛋白表达;利用Transwell小室检测姜黄素对CAFs和PTFs迁移和侵袭能力的影响。
  3.姜黄素对CAFs促癌活性的影响及可能的机制
  制备条件培养基:利用(经过或未经过姜黄素处理的)CAFs或PTFs条件培养基配制成含有4%FBS的完全培养基。体外培养Cal27细胞1、3和5d,采用CCK8试剂盒检测各条件培养基对舌癌细胞Cal27增殖的影响;利用Transwell小室检测各条件培养基对舌癌细胞系Cal27迁移和侵袭的影响;将(经过或未经过姜黄素处理的)CAFs或PTFs与Cal27细胞按照1∶2比例混合后,注入裸鼠腋下,建立混合移植瘤模型。根据移植瘤的体积和重量,分析CAFs对移植瘤生长的影响。HE染色观察移植瘤组织学的表现,免疫组化方法检测Ki67和α-SMA表达,初步探讨CAFs促进移植瘤组织生长的可能机制。
  结果:
  1.成功分离纯化培养出CAFs和PTFs
  CAFs呈长梭形,与PTFs相比,CAFs形成的细胞突起较少且形态不均一,增殖能力更强;CAFs高表达α-SMA,同时也表达vimentin。PTFs表达vimentin,不表达或微弱表达α-SMA。CAFs和PTFs均不表达CK19。
  2.姜黄素促进CAFs表型向PTFs转化,抑制其增殖、分泌功能和运动能力
  本研究使用不同浓度的姜黄素处理CAFs和PTFs24h,采用CCK8试剂检测细胞活性,结果显示:当浓度低于10μM时,姜黄素不影响CAFs、PTFs和Cal27的细胞活性;当浓度大于20μM时,姜黄素以剂量依赖形式抑制CAFs和PTFs的活性。姜黄素对CAFs、PTFs和Cal27的半数有效抑制浓度(IC5024h)分别是39.79、41.81、49.90μM。我们选择10μM作为后续实验的药物浓度。在10μM姜黄素的作用下,姜黄素抑制CAFs增殖、抑制促癌相关细胞因子MMP2、SDF-1、TGF-β1的分泌表达、使其运动能力下降;同时降低CAFs细胞内α-SMA的表达,促进CAFs表型逆转化成类似PTFs表型。伴随着CAFs表达α-SMA的水平降低,细胞内p-Smad2/3的水平也降低;而在此条件下,姜黄素对PTFs分泌功能、侵袭、迁移和α-SMA表达无显著影响。
  3.经过姜黄素处理的CAFs对舌癌细胞系Cal27增殖、迁移、侵袭和成瘤能力的促进作用降低
  细胞增殖实验、细胞迁移和侵袭实验结果显示:与仅含有4%FBS的对照组相比,各实验组条件培养基均促进舌癌细胞Cal27的增殖、迁移和侵袭。其中,CAFs条件培养基的作用最强;表型转化的CAFs条件培养基的促增殖作用降低,与PTFs条件培养基作用相当;姜黄素不影响PTFs对Cal27的增殖、迁移和侵袭的促进作用。相比于单纯的注入Cal27,混合CAFs后,形成的移植瘤体积和重量明显增加;混合表型转化的CAFs或混合(经过姜黄素处理和未经姜黄素处理的)PTFs,均不影响移植瘤体积和重量。HE染色结果显示,各组混合移植瘤组织中的间质成分增加;免疫组织化学染色结果显示,与CAFs混合,所形成的移植瘤组织中Ki67及α-SMA的表达高于其余各组。
  结论:
  1.舌鳞癌CAFs和PTFs在细胞形态、功能特征以及细胞表型方面存在差异。
  2.低浓度姜黄素抑制CAFs表达α-SMA,诱导其表型转化成为类似PTFs表型;同时降低CAFs增殖能力、运动能力以及促癌相关细胞因子的分泌表达。
  3.低浓度姜黄素显著降低CAFs的促癌活性,CAFs可能通过促进Cal27的增殖促进移植瘤的生长。
[博士论文] 吴亚东
外科学(整形) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。临床上治疗以手术为主,辅以放化疗,但治愈率仍不令人满意,早期诊断和治疗是提高治愈率最有效的手段。基因发生突变后可引起肿瘤的发生,从分子水平探索口腔癌的发生机制,可以明确口腔癌分子标志,进行靶向治疗,对提高口腔癌患者生存率具有重要意义。
  MicroRNA(miRNA)是一类短核苷酸序列非编码RNA,对肿瘤有重要的调控作用。MiR-375在多种癌症中呈现差异表达,具有抑癌基因的作用。SLC7A11编码胱氨酸/谷氨酸转运蛋白xCT亚基,在多种肿瘤中呈高表达。在口腔癌中,这两个分子的作用还不十分明确。本课题研究miR-375和SLC7A11在口腔癌中的表达以及miR-375/SLC7A11调控癌细胞增殖和侵袭能力,为口腔癌的诊断和治疗提供新思路。
  目的:
  本研究检测miR-375以及SLC7A11mRNA和蛋白在口腔癌组织中的表达,探讨miR-375差异表达对口腔癌患者预后的影响。通过分子表达水平及细胞功能研究,探究miR-375是否调控SLC7A11表达,并通过SLC7A11对口腔癌细胞的增殖和侵袭产生影响。本研究有利于了解miR-375在口腔癌的发生发展起何种作用,为口腔癌的早期诊断提供分子标志,为分子靶向治疗提供实验依据。
  方法:
  (1)收集口腔癌及癌旁临床组织样本各40例,并对1种人正常黏膜细胞和4种口腔癌细胞进行培养。用RT-qPCR检测上述组织样本和细胞系中miR-375表达,分析miR-375的表达变化与患者临床参数相关性。
  (2)用生物信息软件预测miR-375的靶基因,用RT-qPCR和western blot检测上述组织样本和细胞系中SLC7A11和蛋白的表达,明确SLC7A11在口腔癌组织和细胞中有差异表达。
  (3)双荧光素酶基因报告实验验证miR-375靶向调控SLC7A11的3'UTR区域。将CN1,miR-375mimics,CN2,si-SLC7A11,SLC7A11和miR-375mimics+SLC7A11组转染CAL-27和Tca8113细胞,RT-qPCR检测转染后细胞中miR-375和SLC7A11的表达;用MTT法和细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况,划痕实验和Transwell实验检测细胞运动和侵袭能力,流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化。
  结果:
  (1)RT-qPCR结果显示口腔癌组织和细胞中miR-375的表达量低于癌旁组织和正常黏膜细胞(P<0.05)。
  (2)RT-qPCR和western blot检测,在口腔癌组织和细胞中SLC7A11的mRNA和蛋白的表达量均增高(P<0.05)。
  (3)SLC7A11被预测并证实为miR-375的靶基因。增加miR-375或降低SLC7A11表达可降低细胞的增殖和迁移能力,引起G1/G0期阻滞,诱导细胞凋亡(P<0.05),过表达SLC7A11能增加细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05),miR-375可以抑制SLC7A11的促增殖和侵袭能力。
  结论:
  在口腔癌临床组织和细胞中miR-375低表达,SLC7A11高表达。MiR-375低表达是口腔鳞癌患者的病理分级、临床分期及淋巴结转移的不良预后因素。MiR-375能够通过抑制SLC7A11表达来实现对口腔癌细胞的增殖、侵袭、凋亡及细胞周期进行调控。
[博士论文] 王剑锋
外科学(整形-口腔医学) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:舌鳞状细胞癌是口腔癌中最常见的类型,具有高度局部侵袭和向远处转移的特点,是头颈部癌症患者死亡率居高不下的主要原因。传统的舌癌治疗多是以手术为主、化疗与放疗为辅的综合治疗,由于手术涉及范围大常导致患者咀嚼、吞咽及语音等功能受损,生活质量和预后极差。而放化疗药物,无法有效区分癌细胞和正常细胞,常给正常组织器官带来严重的副作用。因此,迫切需要开发一种具有新型作用的抗癌药物,在准确地杀死舌癌细胞同时,维持健康的口腔组织结构和功能。
  纳米生物技术被认为有潜力提供更有针对性的抗癌药物,显著提高癌症患者的预后。作为一种多功能的纳米金属氧化物,纳米氧化锌在口腔医学、化妆品等领域得到了广泛的应用。最近的研究中,纳米氧化锌被发现对一些肿瘤细胞具有毒性作用。那么纳米氧化锌是否会引起舌癌细胞的毒性?其毒性作用的机制又是什么?目前尚未有相关研究对其进行探讨。
  目的:
  本项目以人舌鳞状细胞癌CAL27细胞系为体外研究对象,通过分析对比纳米氧化锌处理组与对照组细胞的增殖、抑制率异同、两组细胞内线粒体膜电位的高低异同、细胞内氧化还原指标ROS的水平变化、细胞内自噬相关蛋白以及选择性的线粒体自噬相关蛋白的表达水平变化,来分析和探索纳米氧化锌致癌细胞CAL27毒性的最佳浓度和作用时间,以及明确在其毒性作用过程中,PINK1/Parkin蛋白信号轴介导的线粒体自噬所扮演的角色。
  方法:
  首先,采用透射电镜、动态光散射仪,比表面积测量仪等对实验中使用的市售纳米氧化锌颗粒的理化特征进行分析;其次,用含不同浓度的纳米氧化锌溶液培养CAL27细胞,通过细胞增殖能力实验得到纳米氧化锌致细胞毒性的50%抑制浓度;然后,采用上述浓度分别处理细胞0、4、8、12、24h后,采用细胞内活性氧荧光探针、线粒体膜电位检测试剂盒、细胞内自噬溶酶体探针等手段检测细胞内的应激性改变;最后,采用Western Blotting、质粒转染、细胞免疫荧光、透射电镜、激光扫描共聚焦显微镜等动态及静态检测并分析纳米氧化锌对细胞内自噬体的数量的影响,以及对自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1、线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin表达水平的影响。
  结果:
  1.纳米氧化锌原始颗粒呈六棱柱形,颗粒原始尺寸50nm左右,水合粒径500.8nm左右,Zeta电位32.9mV。衍射图谱分析结果与标准品基本一致。
  2.纳米氧化锌致CAL27细胞抑制率与浓度成正相关关系,计算得出50%抑制浓度为25μg/mL。
  3.25μg/mL纳米氧化锌可引起细胞内活性氧水平显著升高、线粒体膜电位减少、细胞内自噬体荧光颗粒数量增加,且与刺激时长有相关关系;差异均有统计学意义。(均P<0.01)
  4.25μg/mL纳米氧化锌刺激细胞不同时长后,细胞免疫荧光结果显示,LC3Ⅱ、PINK1荧光颗粒数量增加(P<0.05)。Western Blotting结果显示自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1、PINK1表达显著增加,P62表达显著下调(P<0.05)。线粒体自噬相关蛋白Parkin在胞浆的表达下降,而在线粒体的表达上调。激光扫描共聚焦结果发现处理组细胞内存在较多的PINK1与GFP-LC3荧光颗粒共定位(P<0.05)。透射电镜结果在处理组细胞内发现较多双层膜结构的自噬体和肿胀变形的线粒体。
  结论:
  1.50nm粒径纳米氧化锌颗粒对CAL27细胞具有一定的细胞毒性。
  2.50nm纳米氧化锌颗粒可以引起CAL27细胞线粒体损伤和氧化应激。
  3.PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬的过度激活可能在纳米氧化锌引起的CAL27细胞凋亡中起关键作用。
[硕士论文] 邓丽霞
肿瘤学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:起源于涎腺的粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)发病率居涎腺恶性肿瘤之首,但基于国内患者的相关研究较少,且样本数普遍偏小,本研究回顾性分析近十年在四川省肿瘤医院治疗的涎腺MEC患者,探讨影响涎腺MEC预后的相关临床因素。
  方法:收集近十年在四川省肿瘤医院住院治疗的涎腺MEC患者的病例资料并对其生存情况进行随访,由一位高年资病理医师根据Armed Forces Institute of Pathology(AFIP)病理评分系统对病理切片进行评分分级,对影响涎腺MEC患者预后的临床因素进行回顾性分析。采用SPSS23.0软件用于统计描述与推断,Kaplan-Meier法估计各时间点生存率并绘制生存曲线图,Log-Rank检验用于比较不同临床特征患者组间差异的显著性,多因素COX回归模型用于分析影响患者预后的独立因素,检验水准α=0.05,当P<0.05时,认为差异具有统计学意义。
  结果:2006年02月至2017年02月期间,四川省肿瘤医院共收治涎腺MEC148例,排除病理及随访资料不完整52例,最终96例涎腺MEC纳入研究。患者中位年龄为46岁(11-80岁),男女比例约为1∶1.5。来源于小涎腺20例,其中腭腺15例,磨牙后腺3例,颊粘膜腺2例。来源于腮腺63例,颌下腺8例,舌下腺5例。原发灶分期:pT1期26例,pT2期38例,pT3期10例,pT4期22例。淋巴结分期:N0期76例,N1期17例,N2期3例。临床分期:Ⅰ期23例,Ⅱ期30例,Ⅲ期20例,Ⅳ期23例。根据AFIP病理评分系统,病理高级别21例,中级别15例,低级别60例。96例涎腺MEC患者全部接受手术治疗,31例患者接受术后辅助放疗,17例患者接受术后辅助化疗。中位随访48个月(4-135个月),随访期间11例患者出现复发,其中8例单纯原发灶复发,3例同时出现颈部区域淋巴结复发;2例患者出现远处转移;6例患者因疾病进展死亡。全组患者3年、5年、10年无疾病生存率和总生存率分别为:90.3%和94.8%、85.7%和94.8%、68.6%和79.9%。单因素分析显示淋巴结转移、病理高级别与较差的无疾病生存关联具有显著性;男性、淋巴结转移和病理高级别与较差的总生存关联具有显著性。多因素分析显示淋巴结分期和病理分级既是影响涎腺MEC患者无疾病生存,也是影响总生存的独立预后因素。接受了术后放疗的患者在长期无疾病生存上优于未放疗患者,但差异不具有显著性。术后的辅助化疗与总生存和无疾病生存均无关联。在63例腮腺来源的MEC患者中,以无疾病生存为临床终点,腮腺腺体全切除是独立于病理分级的重要预后因子。
  结论:1、接受以手术为主的综合规范治疗后,涎腺MEC患者的预后较好。2、淋巴结分期和病理分级是影响涎腺MEC患者无疾病生存和总生存的独立预后因素。对淋巴结转移、病理高级别患者应该采取较为积极的综合治疗方式。3、对腮腺MEC,腮腺腺体全切有助于提高肿瘤控制率。
[硕士论文] 陈红洁
口腔医学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:本研究旨在探寻涎腺腺样囊性癌中UBE3A,USP7及p53的表达情况和可能的作用及意义;同时探讨涎腺腺样囊性癌中UBE3A,USP7及p53蛋白之间表达的相关性,为泛素化在涎腺腺样囊性癌发生发展中的作用提供参考。
  方法:1.利用SP法、RT-PCR和Western blot检测UBE3A、USP7、p53在20例SACC中基因和蛋白层面的表达量,并以癌旁正常组织为阴性对照,分析其表达程度与SACC患者临床病理学资料是否具有一致性。2.利用RT-PCR和Western blot检测UBE3A、USP7和p53在SACC细胞株中基因和蛋白层面的表达量。
  结果:1.泛素连接酶UBE3A和去泛素化酶USP7在SACC组织中有表达,且在基因及蛋白层面表达量较对照组高(P<0.05),说明UPS在SACC癌组织中处于活跃状态;UBE3A、USP7与p53表达呈现出一定的负相关性,提示在SACC中UPS可能与p53交叉产生效应。
  2.通过多因素logistic回归分析检验证实UBE3A表达、USP7表达是SACC患者远处转移的独立危险因素(P<0.05)。
  3.与组织学研究结果相似,RT-PCR和Western blot检测到USP7和UBE3A在ACC-M(肺高转移细胞株)和ACC-2(肺低转移细胞株)中均有表达,但二者测定值在两株细胞株中无明显差异(P>0.05)。
  结论:1.UBE3A、USP7、p53在SACC组织及细胞株中均表达。
  2.UPS在肿瘤组织中处于活跃状态。
  3.UBE3A和USP7可能通过调节肿瘤细胞内关键的抑癌基因p53在SACC的表达,从而达到抗/促进肿瘤生长的目的。
  4.UPS在ACC高/低转移细胞株中的表达无差异,UPS可能通过另外的信号通路交叉作用于肿瘤的粘附及转移,由此需要后续实验验证UPS与该类肿瘤的粘附、转移之间的相关性。
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