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[硕士论文] 刘浩
外科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究在前期工作的基础上,以miR-15a/16-1敲除鼠为主要研究对象,探讨CD19+Tim-1+B细胞的生物学功能以及对肝癌生长的影响。以期明确miR-15a/16-1在肝癌中的作用并揭示其机制,为阐明肝癌的发病机制及临床治疗提供实验基础。
  方法:
  1.检测miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞频率变化及其作用
  1.1 检测miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中B细胞频率变化及其分泌的细胞因子IL-10的变化
  分别制备8-12周龄和15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠和WT小鼠脾脏单细胞悬液,流式细胞术检测脾脏中B220+CD19+细胞亚群频率。用磁珠分选出CD19+细胞后经LPS刺激0h、24h、48h后收集培养上清,ELISA法检测上清中IL-10的浓度。流式细胞术检测15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+细胞内IL-10的表达。
  1.2 检测不同周龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中CD19+Tim-1+、CD19+FcγRⅡbhi及CD19+CD5+CD1dhi细胞频率
  取8-12周龄和15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏制备成单细胞悬液,流式细胞术分别检测脾脏CD19+Tim-1+,CD19+FcγRⅡbhi及CD19+CD5+CD1dhi细胞亚群频率,再用胞内染色法检测CD19+Tim-1+细胞内IL-10的表达。
  1.3 检测荷瘤后的8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞亚群频率
  8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠经H22小鼠肝癌细胞荷瘤,3周后检测脾脏中调节性B细胞亚群频率,并用胞内染色检测其分泌IL-10情况。
  1.4 检测CD19+Tim-1+细胞对CD4+T细胞的作用
  将CD19+Tim-1+细胞和CD4+T细胞以1∶1的比例进行混合培养,72小时后,流式细胞术检测CD4+T细胞CD69的表达和IFN-γ分泌情况;在CD4+T细胞和CD19+Tim-1+细胞共培养体系中加入IL-10的中和性抗体观察CD4+T细胞表面CD69的表达和IFN-γ分泌情况。
  2.CD19+Tim-1+B细胞对肝癌生长的影响
  2.1 检测肝癌病人外周血调节性B细胞的频率
  人体内调节性B细胞主要为CD19+C24hiCD38hi细胞,收集临床肝癌病人治疗前的外周血,用Perco11梯度离心分离外周血淋巴细胞,用流式细胞仪检测CD19+C24hiCD38hi调节性B细胞频率。
  2.2 观察CD19+Tim-1+细胞对移植瘤小鼠肿瘤生长的影响
  分选15-18月龄的miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中CD19+Tim-1+细胞和CD19+Tim-1-细胞,分别过继输入H22移植瘤小鼠(5×105细胞/200μl/只)。每3天过继输入一次,共三次。观察移植瘤小鼠的肿瘤生长情况,记录下肿瘤生长曲线。三周后处死小鼠,剥离肿瘤组织并记录肿瘤体积。
  3.探讨CD19+Tim-1+B细胞发挥负向作用的机制
  3.1 STAT3信号通路的检测
  制备15-18月龄的野生型和miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏单细胞悬液,分选CD19+Tim-1+细胞,提取总蛋白后Western Blot法检测胞内STAT3,pSTAT3Tyr705和pSTAT3ser727的表达。
  3.2 STAT3抑制剂对CD19+Tim-1+细胞中IL-10分泌的影响
  分选15-18月龄的野生型和miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞,加入STAT3抑制剂共培养8小时后,流式细胞仪检测CD19+Tim-1+细胞内IL-10的表达。
  3.3 miR-16过表达对STAT3表达的影响
  使用生物信息分析软件查找miR-16与STAT3之间的关系;分选15-18月龄的野生型和miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞,pro-miR-16慢病毒感染后,Western Blot法检测CD19+Tim-1+细胞中STAT3的表达。
  研究结果:
  1.15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞频率增高
  1.1 15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中B细胞频率增高且高分泌IL-10
  与同龄野生型小鼠相比,15-18月龄的miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中B220+CD19+细胞亚群频率显著增高,且该细胞高分泌IL-10,而8-12周龄小鼠的B220+CD19+细胞频率无明显差异。15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠的CD19+细胞经LPS刺激48h后培养上清中IL-10含量显著增高。以上结果说明15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中分泌IL-10的调节性B细胞增多,而在8-12周龄的miR-15a/16-1-/-小鼠无变化。
  1.2 15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中CD19+Tim-1+细胞频率增高
  进一步分析15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞亚型,显示15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中的CD19+Tim-1+细胞频率较野生型小鼠显著增高,且高分泌IL-10,而CD19+FcγRⅡbhi及CD19+CD5+CD1dhi细胞亚群频率无明显差异。此结果说明miR-15a/16-1缺失可以诱导15-18月龄小鼠体内CD19+Tim-1+细胞的产生。
  1.3 8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠荷瘤后脾脏中CD19+Tim-1+细胞频率增高
  8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠皮下种植H22癌细胞3周后,脾脏中CD19+Tim-1+细胞频率较同龄野生荷瘤鼠显著增高,此结果说明小鼠肝癌可以引起8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠中CD19+Tim-1+细胞增多。
  1.4 CD19+Tim-1+细胞抑制CD4+T细胞的活性
  CD4+T细胞与CD19+Tim-1+B细胞共培养72小时后,CD4+T细胞CD69表达量和IFN-γ分泌量显著下调,说明CD19+Tim-1+B细胞抑制CD4+T细胞的活性。但该抑制效应可被IL-10中和性抗体逆转,提示CD19+Tim-1+细胞可能通过分泌IL-10发挥抑制效应。
  2.CD19+Tim-1+细胞可促进小鼠肝癌的生长
  2.1 肝癌病人外周血中调节性B细胞频率增高
  肝癌患者治疗前外周血中调节性B细胞频率较正常人显著增高,提示调节性B细胞可能参与肝癌的发生与发展。
  2.2 过继输入CD19+Tim-1+细胞可以促进肿瘤生长
  过继输入CD19+Tim-1+细胞的荷瘤小鼠肿瘤生长速度及体积均显著大于CD19+Tim-1-细胞过继输入组小鼠,说明CD19+Tim-1+细胞可以促进肝癌的生长。
  3.miR-15a/16-1可以通过STAT3通路发挥负向调节作用
  3.1 miR-15a/16-1-/-小鼠CD19+Tim-1+细胞中STAT3表达增高
  我们用Western Blot法在蛋白水平研究miR-15a/16-1的调控信号通路,结果发现miR-15a/16-1-/-小鼠CD19+Tim-1+细胞中STAT3,pSTAT3Tyr705,pSTAT3scr727的表达较野生鼠显著上调。
  3.2 STAT3抑制剂下调miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞IL-10的分泌
  MiR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞经STAT3抑制剂处理后,其胞内IL-10分泌量显著下降。进一步印证STAT3信号通路的表达变化可影响CD19+Tim-1+细胞IL-10的分泌。
  3.3 miR-16慢病毒过表达后STAT3的表达下降
  生物信息软件显示miR-16直接绑定于STAT3的3'端非编码区,CD19+Tim-1+细胞中miR-16过表达后检测STAT3的表达,发现实验组的STAT3表达较对照组明显下调,此结果说明进一步CD19+Tim-1+细胞可能通过STAT3通路发挥促进肿瘤生长的作用。
  结论:
  1)肝癌患者外周血中调节性B细胞频率增高;
  2)CD19+Tim-1+细胞可以促进肝癌的生长;
  3)miR-15a/16-1可通过STAT3信号通路抑制CD19+Tim-1+细胞分泌IL-10,从而发挥肿瘤抑制作用。
[硕士论文] 谈思源
外科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:肿瘤在生长及转移过程中伴随着大量新生血管的生成及糖代谢增加。血管新生需要血管生长促进因子及血管抑制因子共同作用,血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)是最重要的血管生长促进因子,它主要通过刺激内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)的增殖和迁移促进新生血管的形成,而血管生长抑制因子则有新近发现的血管生长抑制因子(Vasohibin,VASH),包括VASH1及VASH2。糖代谢增加则与葡萄糖转运蛋白表达上调关系密切,目前已发现的葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,Glut)有8种不同功能的亚型,其中跨膜转运能力最强的为Glut-1,在恶性肿瘤组织中,肿瘤细胞中Glut-1基因的表达增多,导致细胞外葡萄糖向细胞内转运增多,从而增强细胞增殖,促进肿瘤生长。本文旨在通过qRT-PCR和免疫组织化学SP染色法分别检测结直肠癌组织及其癌旁正常组织中VASH1、VEGF、Glut-1的mRNA和蛋白的表达,并结合临床病理资料分析其与结直肠癌发生、发展、侵袭和转移的关系。
  方法:选取扬州大学临床医学院(江苏省苏北人民医院)胃肠外科2014年3月~2015年3月行手术治疗的64例结直肠癌组织和癌旁正常组织标本(距离癌组织边缘5cm以上)。所有患者术前均未接受过化疗、放疗及生物治疗,所有标本均由术后病理确诊并有相应的临床病例资料。所有大体标本均在术中切下后半小时内切取,并均分成两份,一份迅速置入液氮后转-80℃冰箱冻存;另一份浸入福尔马林溶液固定后放入4℃冰箱保存。应用免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)染色法检测VASH1、VEGF、Glut-1蛋白在组织中的表达情况;应用Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)检测VASH1、VEGF、Glut-1mRNA的表达情况及其与临床病例特征的关系。
  结果:VASH1、VEGF、Glut-1在癌组织中的表达均高于癌旁正常组织,三者在癌组织中的表达与浸润范围、淋巴结转移、有无远处转移、病理分期相关,其表达随浸润范围的增加、淋巴结转移的增多逐渐上调(均P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分型、有无血管侵犯无相关性。VASH1表达与VEGF、Glut-1互呈正相关(r=0.9058,p<0.001;r=0.9251,p<0.001;r=0.9468,p<0.001)。生存分析提示N分期、TNM分期、及VASH1、VEGF、Glut-1是否阳性表达是影响生存率的危险因素,具有统计学意义(P<0.05);而性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、T分期、M分期与生存率的影响无统计学意义。进一步将危险因素纳入Cox回归分析中,TNM分期、VEGF阳性表达是影响生存预后的独立的危险因素(P<0.05)
  结论:结直肠癌组织中VASH1、VEGF、Glut-1的mRNA和蛋白表达水平高于癌旁正常组织;VASH1表达与肿瘤的分化程度、TNM分期、T分期、淋巴结转移、远处转移相关;VEGF表达与肿瘤的分化程度、TNM分期、T分期、淋巴结转移、远处转移相关;Glut-1表达与TNM分期、T分期、淋巴结转移、远处转移相关;VASH1、VEGF、Glut-1在结直肠癌组织中的表达水平互呈正相关;VASH1、VEGF、Glut-1是否阳性表达是影响生存率的危险因素,TNM分期、VEGF阳性表达是影响生存预后的独立的危险因素。
[硕士论文] 易敏
营养与食品卫生学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄芪是中国传统的中草药,又是食药两用物品,所含黄芪皂苷具有抑制肿瘤生长、转移、血管生成与调节肿瘤免疫等功能。结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一,其治疗除了常规的外科切除、放疗和化疗手段以外,分子靶向药也是一种有效的治疗方式。PLKs,Polo样激酶(polo-like kinases),是一种高保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。哺乳动物PLKs存在2个结构域,N末端蛋白激酶结构域和C末端polo-box结构域,polo-box结构域与底物结合和调节激酶活性有关。PLK2是细胞分裂的有效调节剂,参与细胞周期中心体的成熟、有丝分裂的进入与染色体的分离等过程。
  本文首先探讨黄芪皂苷对结直肠癌细胞的作用效果:经CCK8细胞活性实验、克隆形成实验,显示黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ对结直肠癌细胞的增殖无影响(p>0.05);经transwell迁移实验、细胞划痕实验观察黄芪皂苷对4种结直肠癌细胞系迁移能力的影响,表明黄芪皂苷Ⅱ对结直肠癌细胞DLD1、HCT116、HT29的迁移能力均有抑制作用(p<0.05),对HCT15细胞的迁移能力无影响(p>0.05);异黄芪皂苷Ⅱ仅对HCT116细胞的迁移具有抑制作用(p<0.01),对其他肠癌细胞的迁移能力无影响(p>0.05)。分析表明,相同条件下黄芪皂苷干预各类肠癌细胞会出现不同反应,表明细胞间具有异质性。
  进一步就黄芪皂苷对结直肠癌细胞可能发挥的作用机制进行探讨:经Western Blot实验、qRT-PCR实验表明,黄芪皂苷能够下调表达PLK2,进一步在DLD1细胞系上构建敲降PLK2的慢病毒稳定细胞株DLD1-shPLK2,经细胞增殖实验和细胞迁移实验结果表明,沉默PLK2的表达对DLD1的增殖无影响(p>0.05),而对细胞的迁移能力有影响(p<0.05);验证实验结果与黄芪皂苷处理肠癌细胞的结果相一致。由此推测,黄芪皂苷通过下调PLK2的表达抑制了肠癌细胞的转移,从而为该物质治疗与应用提供了依据。
[硕士论文] 林先勇
肿瘤学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过给予晚期结直肠癌患者重组人血管内皮抑制素注射液(恩度,Endostar)微量泵持续给药联合窗口期化疗,探究其治疗的疗效,并观察其近期疗效、影响药物疗效的因素和不良反应,为抗血管靶向药物临床治疗晚期结直肠癌优化给药方案提供依据。
  方法:
  1、收集自2015年7月至2017年10月就诊于我院肿瘤科的晚期结直肠癌患者60例,分为3组:A组20例(静脉持续泵入恩度联合窗口期化疗)、B组20例(静脉滴注恩度联合窗口期化疗)、C组20例(仅单纯化疗)。如化疗为两周方案,每四周为一个疗程;如化疗为三周方案,每三周为一个疗程,在第二、四个疗程后评价疗效,记录不良反应。
  2、通过患者住院治疗、出院后电话随访及门诊复查病情进行随访。随访时间从患者入组第1天开始计算到2017年10月31日。患者开始接受治疗作为研究的起点,最后一次治疗、随访、复查作为研究的终点。
  3、记录A、B、C三组患者治疗后的疗效指标(CR、PR、SD、PD)、无疾病进展生存期(PFS)、客观缓解率(ORR)、疾病控制率(DCR)、生活质量(QOL)及毒性反应。通过统计随访患者的PFS,分析恩度静脉持续泵入窗口期化疗对晚期结直肠癌患者预后的影响。
  4、采用SPSS19.0软件进行数据分析及统计量描述等进行结果分析。
  结果:
  三组患者均完成至少4疗程,两个疗程后评价疗效A、B、C三组ORR分别为50.0%、40.0%、35.0%,DCR分别是90.0%、75.0%、65.0%;四个疗程后评价疗效,A、B、C三组ORR分别为45.0%、35.0%、30.0%,DCR分别是90.0%、70.0%、60.0%。A组和B组相比不良反应无明显差异(P>0.05);B组和C组相比不良反应也无明显差异(P>0.05)。A、B、C组中位无疾病进展期(mPFS)分别为4.9个月、3.2个月、2.1个月,结果显示A组和B组患者的中位无疾病进展期(mPFS)均明显长于单纯化疗C组,A组患者中位无疾病进展期(mPFS)也比B组患者延长。
  结论:
  恩度持续静脉泵入联合窗口期化疗治疗晚期结直肠癌的方案有明显的疗效,结果显示:1、持续静脉泵入给药优于传统的静脉滴注给药,其可更好的发挥恩度的抗血管生成作用。2、持续静脉泵入恩度可以延长mPFS相比于静脉滴注恩度。3、恩度联合化疗较单纯化疗治疗晚期结直肠癌可显著提高治疗的有效性,且安全性高,有较好的临床意义,这种治疗方案在临床上值得推广。
[硕士论文] 王丽
肿瘤学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:背景及目的:结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率和死亡率均位于消化系统恶性肿瘤的前列。结直肠癌按照病理组织分型又可分为息肉样型、狭窄型和溃疡型等。结直肠癌临床治疗复发率很高,死亡率也很高,而且在临床治疗中经常会出现对化疗的耐药性以及对放疗的不敏感,导致结直肠癌的临床治疗效果不佳,预后较差。目前,我国的结直肠癌五年生存率仍只维持在60%左右。即使进行了根治性手术切除的患者,复发转移率仍达到20%-50%。因此,结直肠癌一直是消化内科、普外科以及肿瘤科最难办的问题之一。至今,结直肠癌的具体发病机制尚未十分清晰。肿瘤流行病学调查发现,高脂肪饮食习惯可能是增加结直肠癌发病的重要危险因素之一。此外,除外界环境因素外,内在遗传基因在结直肠癌的发病及进展中也产生着一定的影响。
  错配修复是机体一种自我修复过程,主要通过DNA错配修复(mismatch repair,MMR)基因修复DNA复制期间发生的碱基错配序列。目前,已发现有6个错配修复基因,包括MSH2、MLH1、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2。MMR缺陷可导致DNA复制后自我修复功能丧失,产生微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)。2个或者2个以上位点发生微卫星不稳定现象称为高频微卫星不稳定(microsatellite high instability,MSI-H);仅一个位点发生微卫星不稳定现象称为低频微卫星不稳定(microsatellite low instability,MSI-L);没有位点发生微卫星不稳定现象则称为微卫星稳定(microsatellite stability,MSS)。研究发现,微卫星不稳定性对于结直肠癌的化疗敏感性以及预后有着重要影响。但这些研究大多集中在Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者中,微卫星不稳定性对于晚期结直肠癌患者的化疗敏感性以及预后影响的研究相对较少。为此,本研究采用免疫组织化学方法,检测晚期结直肠癌患者微卫星不稳定性状态,分析其对晚期结直肠癌患者的化疗敏感性以及预后的影响。
  方法:选取2009年12月至2016年12月期间在扬州大学附属医院收治的结直肠癌患者181例。所有病例经组织病理学、B超、CT、MRI等检查,确诊为Ⅳ期结直肠癌患者,且均接受FOLFOX方案或XELOX方案的一线化疗方案化疗。收集所有病例原发肿瘤组织,采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织MLH1、PMS2、MSH2、MSH6四种蛋白的表达情况,并分析其与患者化疗敏感性及预后的关系。
  结果:本研究共纳入181例晚期结直肠患者,其中男性96例,女性85例;小于60岁的患者有76例,大于等于60岁的有105例;癌细胞分化程度低者68例,中高度分化者113例;病变部位在右半(包括升结肠、横结肠、肝曲)共计86例;左半(包括直肠、乙状结肠、降结肠、脾曲)共计95例;结直肠癌单发转移患者11例,多发转移患者170例。除了病变部位外,其他临床特征在MSI组和MSS组中的分布均无统计学差异(P均>0.05)。181例晚期结直肠癌患者肿瘤组织中,18例免疫组化检测结果为dMMR,即MSI组,占9.9%;163例免疫组化检测结果为pMMR,即MSS组,占90.1%。采用多因素COX回归分析方法对随访资料进行分析,MSI组和MSS组患者中总体生存时间分布无统计学差异(P=0.21)。所有晚期结直肠癌患者均行一线FOLFOX或XELOX方案化疗,经随访资料分析,MSI组中,部分缓解2例,稳定10例,进展6例,化疗总有效率为11.1%,疾病控制率为66.7%;MSS组中,部分缓解14例,稳定54例,进展95例,化疗总有效率为8.6%,疾病控制率为41.7%,两组总有效率无统计学意义(x2=0.13,P=0.72),但MSI组疾病控制率显著高于MSS组(x2=4.09,P=0.04)。此外,本研究中无一例患者出现完全缓解。
  结论:微卫星不稳定状态与晚期结直肠癌患者的总生存时间无关,与疾病控制率呈正相关。因此,在治疗结直肠癌患者过程中有必要进行微卫星检测。
[博士论文] 金凤
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本课题共分为四部分研究内容。
  第一部分:南蛇藤提取物通过DJ-1抑制人食管鳞癌细胞迁移、侵袭及肿瘤干样细胞增殖目的:观察COE对人食管鳞癌细胞的侵袭、迁移能力、EMT进程及干细胞转录因子mRNA水平的影响;构建食管鳞癌干细胞模型,筛选COE作用于人食管鳞癌肿瘤干细胞模型的蛋白靶点。
  方法:体外培养人食管鳞癌细胞ECA-109及TE-8细胞,不同浓度(10,20,40,80,160,320μg/mL)的COE对作用于细胞24h、48h、72h后,MTT法检测COE对细胞生长增殖的影响。普通显微镜观察COE对细胞形态的影响。Transwell小室实验、western blot及RT-qPCR分别检测分别检测COE对两株细胞侵袭、迁移能力及细胞中蛋白水平与mRNA表达的影响。通过无血清培养基(serum-free medium,SFM)悬浮培养富集人食管鳞癌干样细胞,并以CD90、CD133及SOX2、Nanog、OCT4的mRNA表达变化及细胞在裸鼠体内成瘤能力来鉴定其干性。
  结果:不同浓度的COE作用ECA-109及TE-8细胞24h、48h、72h后,细胞的生长呈现不同程度的抑制,并呈一定的浓度及时间依赖性(P<0.05);其24h IC50分别为139.17±13.95μg/mL,153.74±10.72μg/mL。20、40、80μg/mL浓度的COE及阳性对照药5-Fu作用ECA-109及TE-8细胞24h后,随着COE浓度的增加,细胞形态呈凋亡状改变。且COE能抑制ECA-109及TE-8细胞迁移及侵袭能力,并呈浓度依赖(P<0.05)。随着COE浓度的升高,E-cadherin表达而逐渐上调,而N-cadherin表达逐渐下调,提示COE可以抑制EMT的发生。RT-qPCR结果提示COE可以降低干细胞转录因子SOX2、Nanog及OCT4的mRNA水平,呈浓度依赖(P<0.05)。成功富集人食管鳞癌干样细胞(ECA-109-S),且富集后第14天细胞内CD90及CD133表达及SOX2、Nanog及OCT4的mRNA水平较正常血清培养中的细胞高(P<0.05)。
  结论:COE可以抑制人食管鳞癌ECA-109及TE-8细胞增殖、侵袭、EMT及ECA-109干样细胞增殖,其作用的蛋白靶点为可能是α-tubulin、SLP-2、Prohibitin、DJ-1、HSP27等靶点蛋白单独或共同参与的结果。
  第二部分:DJ-1通过Wnt/β-catenin信号通路促进人食管鳞癌细胞增殖及转移
  目的:该部分主要探讨DJ-1在人食管鳞癌细胞增殖及转移中的作用,并对其潜在机制进行了探讨。
  方法:通过免疫组织化学检测DJ-1,Vimentin和E-cadherin在84例人食管鳞癌标本中的表达水平,分析各蛋白的表达与临床病例基线资料是否有统计学意义及这三个蛋白之间的相关性。利用TGF-β1建立EMT模型,分析DJ-1的表达水平。利用慢病毒载体构建DJ-1过表达及低表达细胞模型,并用Wnt/β-catenin抑制剂XAV939干预过表达DJ-1的细胞,通过Edu增殖实验、克隆实验、transwell小室实验及western blot分别检测细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力和细胞中各蛋白水平。
  结果:在84例食管鳞癌标本中,DJ-1的表达与淋巴结转移和远处转移密切相关,而Vimentin和E-cadherin与肿瘤细胞分化、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05)。且DJ-1的表达水平与Vimentin表达呈正相关,r=0.739,P<0.001,而与E-cadherin表达呈负相关,r=-0.770,P<0.001。在TGF-β1诱导的ECA-109细胞EMT模型中,DJ-1表达水平较ECA-109细胞明显增高(P<0.01)。成功构建过表达DJ-1的重组细胞株ECA-109-LV-DJ-1,沉默表达DJ-1的细胞株ECA-109-LV-siRNA-DJ-1及其各自的阴性病毒对照组细胞。ECA-109-LV-DJ-1细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力均强于对照组细胞(P<0.05)。在ECA-109-LV-DJ-1细胞中,E-cadherin表达降低,而N-cadherin和Vimentin表达增加;Wnt/β-catenin信号通路中LRP6、p-LRP6、β-catenin表达水平增高,Axin1表达水平降低(P<0.05)。
  结论:DJ-1通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进人食管鳞癌ECA-109细胞增殖、黏附、迁移、侵袭和EMT进程。
  第三部分:DJ-1通过促进线粒体生成及呼吸维持人食管鳞癌细胞干细胞特性
  目的:该部分主要探讨DJ-1在维持人食管鳞癌细胞干细胞特性中的作用,并对其潜在机制进行了探讨。
  方法:通过免疫组织化学检测DJ-1、SOX2和Nanog在84例人食管鳞癌标本中的表达水平,并分析其相关性。利用无血清培养建立肿瘤干细胞模型、慢病毒载体构建DJ-1过表达及低表达细胞模型。细胞成球实验、流式细胞分析、RT-qPCR分别用于检测细胞成球能力、细胞表面标记CD90、CD133的表达及干细胞转录因子SOX2、Nanog及OCT4的变化。Mito-Tracker Red染色用于分析线粒体质量,荧光观察及流式分析用于线粒体膜电位的测定,透射电镜用于观察各组细胞内的线粒体数目及结构,ATP检测试剂盒用于检测细胞内总ATP产量,流式细胞分析用于检测DCFH-DA标记的细胞内总ROS含量,western blot用于检测细胞中各蛋白水平。
  结果:在84例人ESCC组织标本中,SOX2的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移密切相关,而Nanog的表达与肿瘤细胞的分化、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关。且DJ-1的表达与干细胞转录因子Nanog (r=0.685,P<0.001)和SOX2(r=0.620,P<0.001)的表达正相关。过表达DJ-1后,细胞具有更强的成球能力及体内成瘤能力,及更高水平的CD90、CD133标记及Nanog、OCT4、SOX2 mRNA表达(P<0.05)。而DJ-1表达减弱后,以上能力均减弱。无血清培养后的细胞具有更强的线粒体质量、数量,更高表达的PGC-1αmRNA、ATP产量、线粒体膜电位(P<0.05),而细胞内总ROS含量并无明显变化。此外,线粒体质量、P GC-1αmRNA、ATP产量在过表达DJ-1细胞中增加而在低表达细胞中明显减弱(P<0.05)。过表达DJ-1细胞中线粒体数目增多(P<0.05),低表达DJ-1细胞中线粒体数量没有明显变化,但是线粒体形态出现明显破坏,表现为线粒体的肿胀,嵴排列紊乱并消失。且削减DJ-1表达的细胞中总ROS含量明显增多。同时DJ-1过表达可以增加线粒体相关蛋白PGC-1α、VDAC、Cyt-C的表达,而削减DJ-1表达后,PGC-1α、VDAC、Cyt-C表达明显降低(P<0.05)。
  结论:DJ-1通过促进线粒体生成及呼吸维持人食管鳞癌细胞干细胞特性。
  第四部分:南蛇藤提取物通过DJ-1介导的线粒体生成调控人食管鳞癌干样细胞侵袭转移
  目的:观察COE对人食管鳞癌干样细胞干性能力及侵袭转移的影响,并探索其可能的作用机制。
  方法:细胞分为野生细胞对照组,干样细胞阴性对照组及干样细胞加各浓度药物组。Transwell小室实验分别检测不同浓度COE对细胞侵袭、迁移能力的变化。Western blot及RT-qPCR分别用于检测各组细胞中蛋白及mRNA水平的变化。透射电镜用于观察各组细胞内的线粒体数目及形态结构,Mito-Tracker Red染色用于分析线粒体质量,流式分析用于线粒体膜电位的测定。构建裸鼠腹腔转移瘤模型,将注射ECA-109-S细胞的裸鼠随机分为对照组(含1% DMSO的生理盐水溶液),COE低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40mg/kg)剂量组,替吉奥(10 mg/kg)组,各组裸鼠均灌胃给药,观察各组裸鼠的腹膜种植转移的情况。
  结果:食管鳞癌干样细胞的迁移及侵袭能力明显强于野生细胞,而COE可以抑制食管鳞癌干样细胞的迁移及侵袭能力,并呈浓度依赖,并上调细胞中E-cadherin的表达,下调N-cadherin及Vimentin的表达(P<0.05)。透射电镜结果显示80 μg/mL COE可以减少干样细胞中线粒体的数量(P<0.05),并使线粒体结构发生改变,表现为线粒体肿胀,内膜消失,嵴排列紊乱。Mito-Tracker Red染色结果显示80 μg/mL COE可明显降低线粒体质量(P<0.05)。COE可以降低ECA-109-S细胞中的线粒体膜电位,并减少DJ-1及线粒体相关蛋白PGC-1α、HSP60、VDAC等的表达,呈浓度依赖(P<0.05)。体内实验显示,COE各剂量组中裸鼠的活动及生长状态均明显好于对照组。COE各剂量组中,肿瘤在大网膜、肠系膜、肝脏的转移发生率明显小于对照组(P<0.05)。免疫组化结果表明COE可明显上调移植瘤组织中E-cadherin的表达,下调DJ-1、Nanog及PGC-1α蛋白的表达。
  结论:COE可抑制人食管鳞癌干样细胞侵袭及转移,其作用机制可能与COE调控DJ-1介导的线粒体生成有关。
[硕士论文] 周怀成
临床医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨术前2小时口服10%葡萄糖溶液对胃癌手术患者术前主观舒适度的影响,术后胰岛素抵抗、术后快速康复的影响。从而为胃癌手术患者术前禁食、禁饮方案的选择提供参考依据。
  方法:
  选取2017年06月至2018年03月在扬州市苏北人民医院胃肠外科进行胃癌根治术的60例患者为观察对象,随机分为治疗组(糖水组)、对照组(禁饮组)各30例,治疗组于术前2小时给予10%葡萄糖溶液500ml口服(15min内进食完毕);对照组术前12小时禁食,8小时禁饮。两组患者的围手术期管理均按照本科室常规的快速康复外科流程进行管理,并由同一组外科医师完成手术。分别在术前3小时和术前30分钟测定两组患者的主观舒适度,主要包括了口渴感、饥饿感。记录患者手术时间、术中出血量、首次排气时间、术后住院时间;记录患者术后并发症。在手术当天术前3小时、术后第1日和术后第3日清晨分别抽取患者外周静脉血,测定血糖浓度、血清胰岛素浓度,并用稳态模式评估法计箅胰岛素抵抗指数。
  结果:
  治疗组有1例患者未按要求口服葡萄糖溶液,将此1例患者剔出研究,其余共有59例入组对象完成实验,其中治疗组29例,对照组30例。研究过程中,无术中死亡病例,无因并发症死亡患者,所有患者均康复出院。
  1、治疗组29例,其中男性患者21例,女性患者8例,患者年龄64.07±6.81岁,BMI21.98±2.60kg/m2。对照组30例,其中男性患者21例,女性患者9例,患者年龄63.83±7.99岁,BMI21.92±2.59kg/m2。两组患者在性别、年龄、BMI指标等方面均无差异(P>0.05);
  2、治疗组患者术中出血量75.52±35.92ml、手术时间172.59±53.91分钟、其中行胃癌全胃切除术的患者14例,行胃次全切除术+淋巴结清扫的患者有15例。对照组患者术中出血量87.33±23.92ml、手术时间172.59±53.91分钟、其中行胃癌全胃切除术的患者16例,行胃次全切除术+淋巴结清扫的患者有14例。两组患者在手术时间、出血量、手术方式等两组数据上无统计学意义,(P>0.05);
  3、治疗组与对照组患者术前3小时饥饿感评分分别为3.21±0.89、2.75±1.01,口渴感评分分别为4.78±0.98、4.77±0.93,两组数据无统计学意义(P>0.05);两组患者术前30分钟饥饿感评分分别为1.63±0.37、3.14±0.92,口渴感评分分别为1.67±0.48、5.14±0.91,两组数据有统计学意义(P<0.01);
  4、治疗组与对照组患者术后首次排气分别为3.79±0.73d、3.73±0.58d,术后住院时间分别为10.69±1.23d、10.43±1.19d,两组数值无显著统计学差异(P>0.05);
  5、治疗组与对照组患者术前3小时血糖,术后第1天血糖,术后第3天血糖进行分析,均无统计学意义(P>0.05)。两组患者术前3小时的胰岛素浓度6.78±3.10mU/L、6.50±1.83mU/L,无统计学意义(P>0.05)。术后第1天胰岛素浓度分别为6.37±2.37mU/L、12.54±4.22mU/L,术后第3天胰岛素浓度分别5.56±1.86mU/L、10.03±2.56mU/L,均有统计学意义(P<0.01)。两组患者术前3小时的胰岛素抵抗指数分别为1.83±0.95、1.81±0.56,无统计学意义(P>0.05)。术后第1天胰岛素浓度分别为1.95±0.83、3.68±1.50,术后第3天胰岛素浓度分别1.58±0.60、2.84±0.96,均有统计学意义(P<0.01)。
  结论:
  1、术前2h口服10%葡萄糖水可减轻患者麻醉前的口渴感与饥饿感,提高患者的舒适度;
  2、术前2h口服10%葡萄糖水明显减轻胃癌患者术后胰岛素抵抗程度。
[硕士论文] 叶敬霆
胸心外科 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  分析老年食管癌患者(≥70岁),特别是年龄在80岁以上的老年患者的临床特征及预后,探讨人口老龄化时代下老年食管癌患者的治疗策略。
  方法:
  对美国国家监测、流行病学和最终结果数据库中的老年食管癌患者(≥70岁)的临床信息进行回顾性分析。我们将搜集的2004至2012年间的15,612名食管癌患者分为三个年龄组(<70岁组、70~79岁组和≥80岁组)。对不同年龄组患者的人口学特征和分期分布情况进行比较,用统计学方法分析食管癌的独立预后因素,多角度比较接受不同治疗方案(未经治疗、仅放射治疗、仅手术治疗和手术联合放疗)后患者长期预后的差异。此外,我们对患有局部食管癌(TNMⅠ、Ⅱ和Ⅲ期)的患者进行了相同的研究,并纳入讨论。
  结果:
  在15,612名符合研究要求的患者中,1,857例≥80岁(即非常高龄患者),占总数的11.9%;70~79岁的患者3,596例,占总数的23.0%;<70岁的患者10,159例,占总数的65.1%。三组患者的分期及组织学分布皆具有可比性(P<0.001)。老年患者(≥70岁)的5年癌症特异性生存率较低,更为甚者的是非常高龄患者(≥80岁组、70~79岁组和<70岁组分别为5.4%、14.6%和20.1%,P<0.001)。在不同性别、种族、婚姻状况、组织学分级和TNM分期分析下皆呈此趋势。老年食管癌患者(≥70岁)接受局部治疗(放射治疗和手术治疗)的可能性低于较年轻患者(≥80岁组、70~79岁组和<70岁组分别为26.9%、28.4%和40.4%,P<0.001)。年龄、种族、婚姻状况、组织学类型、组织学分级和TNM分期是食管癌患者独立和显著的预后因素。总体而言,随着年龄的增长,食管癌患者的预后越来越差。70~79岁组和≥80岁组患者的总生存率低于<70岁组(≥80岁组、70~79岁组和<70岁组分别为5.4%、14.6%和20.1%,P<0.001)。但积极的治疗,尤其是手术治疗可以显著改善老年食管癌患者(≥70岁)的预后,即使对于年龄在80岁及以上的患者,接受手术治疗后的5年癌症特异性生存率也具有明显优势。仅针对局部食管癌患者的分析可以得到相似的结果。
  结论:
  老年患者(≥70岁)占食管癌患者总数的34.9%(≥80岁患者占11.9%)。相比于较年轻的患者(<70岁),老年食管癌患者(≥70岁),尤其是非常高龄患者(≥80岁)不太可能接受手术治疗或放射治疗。与年龄较小的患者(<70岁)相比他们的预后更差,而其中部分原因归于身体状况和社会心理因素。本研究结果显示,充分考虑患者总体身体状况后,对老年食管癌患者(甚至是非常高龄患者)采取积极的治疗,特别是手术治疗是合理且必要的。
[硕士论文] 翟达
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:观察并探讨鸦胆子油乳注射液+TP化疗同步适形调强放疗(Intensity-Modulated Radiation Therapy,IMRT)联合方案治疗食管癌的疗效与安全性,为中西医结合治疗肿瘤在临床的推广应用提供可参考依据。
  方法:将符合标准的60例食管癌患者随机分为治疗组及对照组,每组各30例,两组均采用相同方案同步放化疗治疗,即TP化疗同步IMRT。治疗组于同步放化疗全过程联合运用鸦胆子油乳注射液30ml静脉滴注治疗,每日1次。对照组则单用同步放化疗治疗。TP化疗21天为1个周期,连用2个周期。IMRT:GTV60-64Gy/28-30次,CTV54Gy/28次,PTV54Gy/28次,IMRT从TP化疗第一天开始,每周5次,共6-7周完成。于治疗过程中及治疗前后观察并评价两组患者的近期疗效、中医症状、放化疗毒副反应、体力、体重及生命质量的情况及变化。
  结果:(1)近期疗效方面,治疗组及对照组的有效率分别为60%及53.33%,治疗组的有效率高于对照组,但差异无明显统计学意义(P>0.05)。(2)中医症状方面,治疗组在吞咽困难、胸痛或背痛、神疲乏力及中医症状总积分值方面的改善率明显高于对照组(P<0.05);在吞咽疼痛、异物感及声音嘶哑症状方面两组无明显统计学差异(P>0.05)。(3)放化疗毒副反应方面,治疗组较对照组明显降低骨髓抑制、胃肠道反应及放射性反应的发生率(P<0.05);在周围神经毒性、脱发及口腔黏膜反应方面两组无明显统计学差异(P>0.05)。(4)生存质量评价由Karnofsky(KPS)体力评分、体重及欧洲癌症治疗研究组织生命质量核心量表(The European Organization for Reasearch and Treatment of Cancer Quality of Life Questionnare-Core30,EORTC QLQ-C30)评分三方面综合评估:两组治疗前后KPS体力评分的稳定率分别为86.67%及73.33%,治疗组优于对照组(P<0.05)。两组治疗前后体重变化的稳定率分别为56.67%及40.00%,治疗组优于对照组(P<0.05)。EORTC QLQ-C30量表治疗前后评分对比,两组在身体功能、角色功能、情绪功能、社会功能及物理症状维度方面,治疗后评分均较治疗前明显改善(P<0.05),认知功能及健康经济相关维度无明显统计学差异(P>0.05);两组间治疗后评分对比,在角色功能、情绪功能及物理症状维度,治疗组较对照组在治疗后评分上有明显改善(P<0.05),在身体功能、认知功能、社会功能及健康经济相关维度两组无明显统计学差异(P>0.05)。
  结论:在TP化疗同步IMRT治疗食管癌的过程中联合运用鸦胆子油乳注射液,可改善患者的中医症状,减轻放化疗治疗的毒副反应,提高患者的生存质量。
[硕士论文] 仲婕
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:表观遗传学是研究DNA序列没有发生改变的情况下表型或基因表达的遗传变化,已成为生命科学中普遍关注的前沿领域,而中药复方及其有效成分对表观遗传的作用正日益受到重视。中药可以作用于表观遗传的多个环节,以调控基因转录及其表达,但时至今日,中医证的表观遗传学特征的研究非常薄弱。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)脾虚证的表观遗传学特征的研究尚未见报道。鉴于此,本课题就CRC脾虚证的流行病学特征、CRC脾虚证患者粪便中GATA4基因甲基化水平进行了初步研究分析,以期为从分子生物学的角度揭示证的现代机制提供参考。
  本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 结直肠癌脾虚证流行病学研究
  目的:探讨结直肠癌脾虚证的流行病学特征。
  方法:收集2016年3月至2017年5月诊断为CRC脾虚证的患者110例,以IBS-D脾虚证患者58例作为对照组,且符合相关中医辨证标准,自愿填写流行病学调查表且能保证所被调查内容真实性。
  结果:CRC脾虚证患者110例,IBS-D脾虚证患者58例,CRC脾虚证患者平均年龄(63.4±11.8)岁,高于IBS-D脾虚证患者平均年龄(44.2±14.4岁),且两组之间年龄构成方面有显著差异(P<0.05);CRC脾虚证与IBS-D脾虚证在性别方面均为男性多于女性,但两组之间的性别构成差异无统计学差异(P>0.05);CRC脾虚证患者与IBS-D脾虚证患者在吸烟情况上无统计学差异(P>0.05),但两组在饮酒情况上有统计学差异(P<0.05)。CRC脾虚证患者中气虚体质最多,IBS-D脾虚证患者中阳虚体质最多,但两组在中医体质上无统计学差异(P>0.05)。CRC脾虚证患者中脾虚+湿热证人数最多,IBS-D脾虚证患者中脾虚+肝郁证人数最多。CRC脾虚证及其兼证在不同性别中分布差异无统计学意义(P>0.05);IBS-D脾虚证及其兼证在不同性别中分布差异无统计学意义(P>0.05)。
  结论:CRC脾虚证患者易兼夹湿热证,IBS-D脾虚证患者易兼夹肝郁证。
  第二部分 结直肠癌脾虚证与GATA4基因甲基化相关性研究
  目的:对CRC脾虚证与GATA4基因甲基化相关性进行探讨。
  方法:收集CRC脾虚证患者60例、IBS-D患者20例、正常健康对照组10例粪便标本,从中提取粪便DNA,采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测粪便中GATA4基因甲基化情况。
  结果:在60例CRC脾虚证患者粪便标本中,共有48例检测出GATA4甲基化阳性,阳性率为80.0%;在20例IBS-D脾虚证患者粪便标本中,共有3例粪便标本检测出GATA4甲基化阳性,阳性率为15.0%;在10例对照组粪便标本中,共有1例粪便标本检测出GATA4甲基化阳性,阳性率为10.0%。CRC脾虚证患者粪便标本中GATA4甲基化阳性率明显高于IBS-D脾虚证患者及对照组。CRC脾虚证患者与对照组粪便中GATA4甲基化阳性情况有统计学差异(P<0.05),IBS-D脾虚证患者与对照组粪便中GATA4甲基化阳性情况无统计学差异(P>0.05)。
  结论:1.GATA4基因甲基化可能是结直肠癌脾虚证的分子生物学特征之一。2.结直肠癌脾虚证GATA4甲基化水平可能高于结直肠癌非脾虚证GATA4甲基化水平。
[硕士论文] 杨婷
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:中草药南蛇藤,卫矛科南蛇藤属,药性辛温,有小毒,具有祛风、活血、解毒、消肿等功能。课题组前期研究发现,南蛇藤提取物(CelastrusOrb iculatus extracts,COE)具有较强的抗肿瘤活性,能抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,但其分子机制还未完全明确。
  原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),消化道最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势,致死率在所有癌症中居第三位。目前采取以手术切除为主的综合治疗模式,但是愈后不佳。
  哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)参与多种生理与病理过程,是细胞内许多重要信号转导通路的关键枢纽,其功能失调与肿瘤的发生发展紧密相关。
  为了研究南蛇藤提取物是否靶向mTOR发挥抗肿瘤活性,本文构建了过表达mTOR基因的人肝癌HepG2细胞株(记作HepG2/mTOR+细胞),加入不同浓度的南蛇藤提取物干预后,探讨COE对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响及机制。结果显示,与对照组相比,在一定浓度范围内,COE呈浓度依赖性地减少mTOR的表达,抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,促进人肝癌HepG2细胞凋亡,其分子机制可能与南蛇藤提取物抑制mTOR相关信号转导通路有关。本研究内容共分四部分。
  第一部分 人肝癌HepG2/mTOR+细胞株的构建
  目的:构建过表达mTOR蛋白的人肝癌HepG2细胞株。
  方法:体外培养人肝癌HepG2细胞株至对数期,利用分子生物学技术,将GV238-mTOR重组质粒转染至人肝癌HepG2细胞中,同时设阴性对照组和野生细胞对照组。24 h后,倒置显微镜下观察细胞形态。收集细胞总蛋白,Western blot法检测人肝癌HepG2细胞中mTOR蛋白的表达量。
  结果:转染24 h后,倒置显微镜下观察,野生型细胞贴壁生长,呈梭形,细胞轮廓清晰,细胞壁光滑无突起,折光性良好,核质均匀。与之相比,大部分HepG2/mTOR+细胞形态无显著变化,少量细胞变圆。Western blot结果显示,与对照组相比,HepG2/mTOR+细胞中mTOR蛋白的表达水平显著增加。
  结论:成功构建了人肝癌HepG2/mTOR+细胞株。
  第二部分 南蛇藤提取物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞的影响
  目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2/mTOR+细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。
  方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,加入不同浓度的COE(20,40,80,160,320mg/L),以野生型细胞为阴性对照,2 mg/L DDP为阳性对照。MTT法检测各组药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞增殖能力的影响;倒置显微镜及透射电镜观察形态学改变;流式细胞术检测药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡的影响;细胞划痕法检测药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞爬行能力的影响;Transwell实验研究细胞侵袭迁移的变化。
  结果:与野生型细胞相比,HepG2/mTOR+细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显增强。与未加药组相比,在一定浓度范围内,COE能抑制人肝癌HepG2/mTOR+细胞的增殖、侵袭及迁移,促进其凋亡,并呈明显的浓度依赖性。
  结论:mTOR的表达水平与肿瘤细胞的恶性行为相关。COE能降低mTOR的表达水平,抑制人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭及迁移,并促进肿瘤细胞凋亡。
  第三部分 南蛇藤提取物促进人肝癌HepG2/mTOR+凋亡的分子机制
  目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2/mTOR细胞mTOR信号通路及凋亡相关蛋白表达水平的影响,初步探讨其分子机制。
  方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,为了避免细胞毒性作用的干扰,根据IC50的结果,加入不同浓度COE(20,40,80 mg/L),同时设立野生细胞对照组和阳性药物对照组(2 mg/L DDP)。作用24 h后,Western blot法检测各组目的蛋白的表达水平。
  结果:COE抑制人肝癌HepG2/mTOR+细胞中mTOR蛋白的表达,呈浓度依赖性。COE能降低凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-2L12的表达,同时增加Bax、Caspase-3的表达量,呈浓度依赖性。随着药物浓度的增加,COE降低mTOR信号转导通路相关蛋白的表达量,尤其是明显降低4E-BP1、p-4E-BP1、P70和p-P70蛋白的表达水平。
  结论:COE促进人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡,其作用机制可能与mTOR信号转导通路及Bcl-2凋亡蛋白家族有关。
  第四部分 南蛇藤提取物与雷帕霉素联合应用的疗效比较
  目的:比较南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)与mTOR的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)联合应用对人肝癌HepG2/mTOR+细胞的影响。
  方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,分为COE组(80 mg/L)、RAPA组(100nmol/L)、COE+RAPA组,同时设立野生型细胞对照组和阴性药物对照组。24 h后,倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变;流式细胞术检测各组药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡的影响;Western blot法检测各组目的蛋白的表达水平。
  结果:与未加药阴性对照组相比,COE或RAPA均能抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。与单独使用COE或RAPA的治疗组相比,COE和RAPA的联合治疗显示出一定的协同效应。
  结论:COE与雷帕霉素联用可进一步促进肿瘤细胞凋亡。
[硕士论文] 朱晓舟
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第三位,近年来,结肠癌的发病率与病死率在中国呈上升的趋势,达到或超过了西方发达国家的平均水平,其发病年龄在40岁以上,高发年龄普遍在50~60岁,比西方国家平均提早10岁。目前结肠癌临床治疗主要以手术为主,同时有目的的结合放疗和化疗。结肠癌5年生存率为74%,根治手术率为85%。但是对于有些失去手术机会,又不能耐受化疗毒副作用的患者,迫切需要寻找或开发出新型的抗肿瘤药物。蜂毒是蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的透明毒液,民间利用蜂毒治疗类风湿性关节炎已有悠久的历史。蜂毒素是从蜂毒中提取的一种小蛋白分子,约占蜂毒干重的50%,具有很强的生物活性。随着现代分子生物科学技术的发展,基因工程蜂毒素技术已经很成熟,并通过体内外实验,验证其具有生物学活性。蜂毒素具有抗肿瘤作用,能抑制消化道肿瘤的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。国内外关于蜂毒素抑制肿瘤细胞增殖、转移,诱导凋亡的研究尚未完全阐明,课题组前期研究发现蜂毒素能通过线粒体通路抑制胃癌细胞转移,诱导胃癌细胞的凋亡,本研究拟通过细胞、分子、动物水平探究基因工程蜂毒素给药的最佳药物浓度及治疗效果,旨在探讨蜂毒素体内外抑制结肠癌的机制。
  研究内容分为三部分:
  第一部分 天然蜂毒素抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的实验研究
  目的:通过不同浓度的蜂毒素抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,探讨蜂毒素对小鼠结肠癌CT-26细胞的迁移和凋亡的影响及其分子机制。
  方法:MTT法检测不同浓度蜂毒素(1、2、4、8和16μg/mL)分别作用小鼠结肠癌CT-26细胞不同时间(1、2、4、8h)后细胞增殖情况;Transwell小室实验检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用小鼠结肠癌CT-26细胞1h后迁移能力的情况;流式细胞术检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用CT-26细胞1h后诱导细胞凋亡情况;Western Blot检测蜂毒素(1、2μg/mL)作用1h后小鼠结肠癌CT-26细胞线粒体通路中Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白水平。
  结果:MTT结果显示蜂毒素能够有效抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,随着浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐增高,趋近100%,当蜂毒素浓度分别为1和2μg/mL作用1h,抑制率分别达到24.83%、58.16%,与对照组相比差异显著(P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,经1和2μg/mL蜂毒素处理细胞1h后,CT-26细胞穿膜数分别为192个和53个,较对照组207个明显减少,并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,经1和2μg/mL的蜂毒素处理后1h,CT-26细胞凋亡率分别为8.5%、11.3%,较对照组凋亡率5.3%明显升高并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。Western Blot结果显示,经1和2μg/mL蜂毒素处理小鼠结肠癌CT-26细胞1h后,细胞上清中,Caspase-9相对表达量分别为1.07和0.46,较对照组2.25明显降低,呈一定的浓度依赖性(P<0.01),Caspase-3相对表达量分别为3.72和2.33,较对照组11.03明显降低,呈一定的浓度依赖性(P<0.01),PARP相对表达量分别为1.23、1.10,较对照组1.80明显降低,并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。
  结论:当蜂毒素浓度分别为1、2μg/mL,作用小鼠结肠癌CT-26细胞1h后,就能明显抑制细胞的增殖、迁移、并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Caspase-9,Caspase-3和PARP蛋白水平直接相关。
  第二部分 携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌体外抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的实验研究
  目的:通过不同浓度的各组菌抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,探讨携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌(Mel菌)对小鼠结肠癌CT-26细胞的迁移和凋亡的影响及其分子机制。
  方法:MTT法检测不同浓度的Mel菌及减毒沙门氏菌(X4550菌)、携带荧光基因的减毒沙门氏菌(GFP菌)(15、20、25、30、35、40、45和50CFU/细胞)分别作用小鼠结肠癌CT-26细胞24、48h后细胞增殖影响;Transwell小室实验检测Me1菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用小鼠结肠癌CT-26细胞24h后迁移能力的情况;流式细胞技术检测Mel菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用CT-26细胞24h后诱导细胞凋亡的情况;Western Blot检测经Mel菌25CFU/细胞、对照组X4550菌45CFU/细胞和对照组GFP菌30CFU/细胞作用24h后的小鼠结肠癌CT-26细胞线粒体通路中Caspase-9,Caspase-3和PARP的蛋白水平。
  结果:MTT结果显示各组菌均能够有效抑制小鼠结肠癌CT-26细胞的生长,随着浓度的增大和作用时间的延长,抑制率逐渐增高,趋近100%,当Mel菌浓度为25CFU/细胞时,抑制率为50.26%,当X4550菌浓度为45CFU/细胞时,抑制率为50.12%,,当GFP菌浓度为30CFU/细胞时,抑制率为50.02%,作用时间均为24h,与对照组相比差异显著(P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理24h后的CT-26细胞穿膜数为41.8个,较对照组161.8个明显减少并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理24h后的小鼠结肠癌CT-26细胞凋亡率为13.98%,较对照组5.73%明显提高并呈一定的浓度依赖性(P<0.01)。Western Blot结果显示,经25CFU/细胞Mel菌处理小鼠结肠癌CT-26细胞24h后,细胞上清中,Caspase-9,Caspase-3和PARP的相对表达量分别为0.43、0.37、0.44,较对照组1.91、1.3、2.2明显降低,呈一定的浓度依赖性(P值均<0.01)。
  结论:携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌(Mel菌)具有天然蜂毒素的活性,当其浓度为25CFU/细胞,作用小鼠结肠癌CT-26细胞24h后,就能明显抑制细胞的增殖、迁移、并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Caspase-9,Caspase-3和PARP蛋白水平直接相关。
  第三部分 携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌治疗小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型的实验研究
  目的:观察携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌治疗小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型的效果。
  方法:60只BALB/c小鼠购回后适应性饲养1周,除正常组外,所有小鼠以右侧腋窝皮下注射小鼠结肠癌CT-26细胞悬液浓度为3×106/0.1ml/鼠的方法诱导制作小鼠结肠癌CT-26细胞移植瘤小鼠模型。细胞悬液注射后,每天检查小鼠右侧腋下,有肿大质硬的肿块,确定造模成功。按随机数字法将其分为模型组,对照组X4550菌组,对照组GFP菌组,Me1菌组,阳性药物人参皂苷对照组(Rg3)。成瘤后每3天细菌组(X4550菌组、GFP菌组、Mel菌组)分别给小鼠灌胃,1×106CFU/0.2ml/鼠;Rg3组每日灌胃Rg3,剂量是0.1mg/kg/0.2ml/鼠;正常组及模型组均灌胃,0.2ml/鼠生理盐水,每3天灌胃后测量小鼠体质量、测量肿瘤长和宽、记录小鼠一般情况。给药4周后,于末次给药12h后摘眼球取血法收集血样,ELISA法检测相关因子(IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ);RT-PCR检测小鼠肿瘤组织中VEGF、KDR和p53mRNA的表达。
  结果:肉眼观察可见,除正常组外,其他各组小鼠均成功荷瘤,通过小鼠肿瘤测量计算体积比较后发现,给药组小鼠的肿瘤体积均得到缓解,其中Mel菌组小鼠肿瘤体积增长程度慢于其他组(P<0.01);ELISA检测小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ等细胞因子发现,Mel菌组小鼠各项免疫学指标改变优于其他组(P<0.01);各治疗组与模型组相比较,VEGF、KDR mRNA基因的相对表达量下调(P<0.01),p53mRNA基因相对表达量上调,差异具有统计学意义(P<0.01)。
  结论:携带蜂毒素基因的减毒沙门氏菌具有天然蜂毒素的活性,能有效缓解荷瘤小鼠肿瘤的生长,通过调控IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、IFN-γ等细胞因子的表达及抑制VEGF/KDR通路中关键信号分子的激活和激活抑癌基因p53的表达来达到抑制肿瘤生长。
[硕士论文] 施越
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。全球发病率第三,死亡率第二。神经激肽受体包括NK1R、NK2R和NK3R,参与了体内多种生理和病理过程。SR140333是一种高选择性和高特异性的NK1R拮抗剂,我们课题组前期研究发现利用SR140333靶向阻断NK1R能时间和剂量依赖地抑制结肠癌细胞的增殖,并阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导结肠癌细胞发生凋亡,但目前尚未见更深入的分子机制研究报道。
  在本论文中,我们采用shRNA技术敲降表达NK1R蛋白,发现结肠癌细胞HCT116的增殖被明显抑制,这与用SR140333靶向阻断NK1R的结果相一致。50例结肠癌患者癌组织和癌旁组织的免疫组化结果显示,癌组织中NK1R显著高表达,且其高表达导致结肠癌患者五年生存率显著降低(P=0.004);免疫印迹检测结果显示与痔疮患者相比,结肠癌细胞系中NK1R也呈显著高表达。SR140333靶向阻断NK1R后c-Myc蛋白的表达显著下调,且过表达c-Myc能显著提高SR140333靶向阻断NK1R后的结肠癌细胞的活力,抵抗细胞周期阻滞和细胞凋亡,提示c-Myc蛋白是SR140333靶向阻断NK1R后抑制结肠癌细胞增殖诱导其凋亡的重要下游蛋白。靶向阻断NK1R也能引起pERK1/2显著下调表达,而与细胞增殖相关的pAKT的表达却发生了显著上调,且只有MEK抑制剂U0126与SR140333联用才能协同地显著抑制HCT116细胞的增殖。U0126单独处理HCT116细胞使pERK1/2与c-Myc均发生了时间依赖的下调表达,且c-Myc下调表达时间明显滞后于pERK1/2,进一步证明了在结肠癌细胞HCT116中pERK1/2直接调控了c-Myc的表达。另外,结肠癌细胞HCT116中蛋白酶体抑制剂MG132能阻断SR140333引起的c-Myc的快速降解。细胞质和线粒体钙流检测结果显示,SR140333靶向阻断NK1R后,细胞质Ca2+浓度呈剂量依赖地显著增加,线粒体Ca2+浓度也适当增加了,而NK1R内源性激动剂SP仅引起了微弱的胞质钙流:胞质Ca2+螯合剂BAPTA和内质网钙库释放阻断剂2-APB均能明显挽救SR140333引起的细胞凋亡,但是线粒体钙通道阻断剂DIDS对SR140333引起的HCT116细胞活力抑制无明显影响,表明SR140333靶向阻断NK1R引起从内质网释放到细胞质的Ca2+浓度快速增加,显著抑制了结肠癌细胞的活力。本研究未检测到SR140333引起细胞质和线粒体ROS的增加。此外,细胞质Ca2+螯合剂BAPTA能显著阻止SR140333引起的pERK1/2和c-Myc蛋白的下调表达,提示SR140333靶向阻断NK1R后,通过胞质Ca2+-pERK1/2-c-Myc信号轴调控了结肠癌细胞的增殖。HCT116荷瘤裸鼠模型的研究结果显示,SR140333显著抑制了荷瘤小鼠肿瘤生长且无明显毒副作用;H&E染色结果和TUNEL染色结果显示在荷瘤小鼠体内SR140333显著抑制了HCT116细胞的增殖并诱导了凋亡;免疫印迹结果发现SR140333在体内也能调控细胞周期和凋亡相关蛋白表达,同时也抑制了pERK1/2和c-Myc的表达,表明在体内外SR140333靶向阻断NK1R后均是通过胞质Ca2+-pERK1/2-c-Myc信号轴抑制了结肠癌细胞的增殖,并诱导了结肠癌细胞发生凋亡。
  Annexin蛋白超家族是一群由Ca2+调节的磷脂依赖的膜结合蛋白,参与一系列重要的生理病理过程以及肿瘤的发生发展等。Annexin A1对不同肿瘤类型具有不同的作用效果,既可以作为肿瘤抑制因子又可以作为肿瘤促进因子。但目前尚未见Annexin A1在结肠癌上的功能研究。50例结肠癌患者的癌组织和癌旁组织的免疫组化结果显示,癌组织AnnexinA1蛋白显著高表达,且高表达患者生存期显著缩短(P=0.005)。对结肠癌细胞HCT116和SW620两种细胞系,我们分别进行了Annexin A1蛋白的敲降表达和过表达,研究结果表明Annexin A1蛋白对结肠癌细胞的增殖有促进作用。流式细胞术结果显示,Annexin A1敲降表达后,结肠癌细胞被阻滞在G0/G1期,而Annexin A1过表达使得结肠癌细胞周期中S期细胞显著增加;但本实验条件下Annexin A1并不明显影响细胞的凋亡和迁移。在荷瘤裸鼠模型中,与Annnexin A1蛋白敲降表达组相比,空载对照组成瘤率高且瘤体增长快,而敲降组肿瘤成瘤率低且易消退,说明在动物水平上,Annexin A1敲降表达会抑制结肠癌细胞的生长。进一步的MTT实验结果显示NK1R拮抗剂SR140333处理Annexin A1敲降和过表达的结肠癌细胞,Annexin A1敲降表达使得结肠癌细胞对SR140333更为敏感。
  综上所述,本论文研究结果显示NK1R蛋白和Annexin A1蛋白在结肠癌患者中均呈现显著高表达,且与结肠癌患者预后呈显著负相关。靶向阻断NK1R在体内外水平均通过胞质Ca2+-pERK1/2-c-Myc信号轴抑制了结肠癌细胞的增殖,并诱导了结肠癌细胞发生凋亡。Annexin A1蛋白在体内外水平均能促进结肠癌细胞增殖,初步机制研究发现AnnexinA1蛋白通过调控细胞周期来促进结肠癌细胞增殖,但不影响结肠癌细胞的凋亡和迁移;且AnnnexinA1蛋白敲降表达的结肠癌细胞对NK1R拮抗剂SR140333更为敏感。
  这些研究结果为开发NK1R和Annexin A1成为结肠癌单独或联合治疗新靶点提供了基础理论数据的支持,为临床结肠癌患者的诊断与治疗带来新的希望和突破。
[硕士论文] 李嘉思
病理学与病理生理学(肿瘤病理) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  为明确前列腺素E2受体EP2(Prostaglandin E Receptor2,EP2受体)与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展的关系,本课题利用慢病毒载体构建干扰EP2受体表达的稳定HCC细胞系,通过体外细胞功能学实验验证EP2受体对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,并应用二代测序技术筛查并验证EP2受体在HCC中调控的下游信号通路。
  研究方法:
  1、设计并构建针对EP2受体的shRNA质粒表达载体,将重组的质粒与另外两种载体p Helper1.0,p Helper2.0共转染293T细胞,包装生产慢病毒。
  2、培养肝癌细胞(SK-Hep-1、SMMC-7721、MHCC97-H、HepG2、Huh7),通过Western Blot技术检测EP2受体表达情况,选出EP2受体高表达的细胞株进行后续实验。
  3、慢病毒载体构建干扰EP2受体表达的稳定HCC细胞系,通过Western Blot及qPCR方法检测其干扰效率,并采用CCK8、细胞划痕、Transwell实验等细胞功能学实验检测EP2受体对HCC增殖、迁移及侵袭能力的影响。
  4、分别对EP2受体干扰的MHCC97-H细胞及其对照组进行RNA数字表达谱(RNA-Seq)测序以及生物信息学分析,筛查EP2受体调控HCC的相关靶点与分子信号通路,并进行qPCR和Western Blot验证。
  研究结果:
  1、通过DNA测序鉴定,结果显示携带靶向沉默EP2受体基因shRNA片段的质粒构建正确,包装并生产慢病毒载体LV-shEP2。
  2、Western Blot结果显示:5种细胞株均表达EP2受体,MHCC97-H及HepG2细胞较其他三株表达更高,选择MHCC97-H及HepG2细胞进行后续实验。
  3、Western Blot及qPCR结果显示:与空白对照组和LV-ctrl组相比,感染LV-shEP2的MHCC97-H及HepG2中EP2mRNA和蛋白的表达量明显下降。
  4、CCK8实验中,细胞生长96h时,相比空白对照组和LV-ctrl组,感染LV-shEP2的MHCC97-H及HepG2细胞的OD值明显降低(P<0.01)。
  5、细胞划痕实验中,感染LV-shEP2后的MHCC97-H及HepG2细胞向中央迁移的能力减弱;Transwell实验中,感染LV-shEP2的MHCC97-H及HepG2细胞穿膜的细胞数明显少于空白对照组和LV-ctrl组,差异具有统计学意义(P<0.01)。
  6、RNA-Seq及qPCR验证结果显示:干扰MHCC97-H的EP2受体后,Wnt通路中的Wnt6、其相关受体FZD6、其下游的靶基因CCND2表达下调,通过KEGG分析得到Wnt通路。
  7、Western Blot结果显示:干扰MHCC97-H及HepG2细胞的EP2受体,总的β-catenin蛋白的表达无明显变化,磷酸化的β-catenin表达明显升高。
  研究结论:
  1、成功构建重组慢病毒表达载体LV-shEP2,具有较高的感染效率,能够稳定抑制EP2受体的表达。
  2、EP2受体可增强HCC细胞的迁移、侵袭和转移能力。
  3、EP2受体可能通过Wnt信号通路促进HCC的发生发展。
[硕士论文] 张香西
病理学与病理生理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,占肝癌的90%,有数据表明:HCC由于其发病率逐年增加且预后差现位居世界恶性肿瘤致死病因的第2位。
  GPC-3是过度生长综合症(Simpson Golabi BehmelSyndrome,SGBS)患者中普遍存在的功能突变基因,是蛋白聚糖家族成员之一。GPC-3基因编码的GPC-3蛋白可通过共受体(co-receptor)与相关配基如生长因子、细胞黏附分子等共同作用,来参与细胞生物学行为的调节。有学者认为在细胞生长的各个过程包括细胞的繁殖、黏附、分化、迁移等过程中均存在GPC-3的直接或间接调控。研究发现HCC患者体内的GPC-3表达水平跟健康人及良性肝疾病患者相比显著升高,正常成人及良性肝疾病患者组织和血清中的GPC-3表达水平极低甚至检测不到,这表明GPC-3与HCC关系密切,可能在其发生发展中起促进作用。
  GPC-3是HCC临床鉴别诊断中有用的特异性标志物,又是HCC预防和免疫治疗的新靶点,尽管目前有多篇文章探讨其分子机制,它的结构已基本研究清楚,但是其功能尚未完全阐明。基于以上研究背景,本课题通过Crispr/cas9技术对GPC-3进行敲除并构建了GPC-3过表达载体,沉默和上调HCC细胞中GPC-3基因的表达,进而研究GPC-3对于肝癌的生长、侵袭等生物学行为的影响,为进一步阐明GPC-3在HCC中的作用机制,指导HCC的临床治疗奠定基础。
  方法:
  1、通过Western-blot和Q-PCR检测多株HCC细胞中GPC-3蛋白/基因的表达水平,选择GPC-3高表达和低表达的HCC细胞株;
  2、按照Genebank(NCBI)中GPC-3基因序列设计引物,PCR扩增、纯化以获取GPC-3目的片段,经基因重组及双酶切来构建GPC-3过表达载体;
  3、运用Crispr/cas9技术设计三条靶向GPC-3基因的gRNA,插入Crispr/cas9敲除载体后导入高表达GPC-3的细胞株,筛选出一条编辑效率最高的gRNA;
  4、将上述GPC-3过表达载体及GPC-3敲除载体用第三代慢病毒包装系统分别进行慢病毒载体包装,浓缩细胞上清液后获得相应的病毒液;
  5、用上述含有GPC-3过表达载体的慢病毒液感染低表达GPC-3的HCC细胞,用含有GPC-3敲除载体的慢病毒液感染高表达GPC-3的HCC细胞,通过嘌呤霉素(puro)持续药筛获得GPC-3过表达稳定细胞株以及不表达GPC-3的单克隆细胞株,用Western-blot和Q-PCR技术检测细胞中GPC-3的表达情况;
  6、通过CCK-8、划痕实验、Transwell及流式细胞仪分别检测细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡情况,观察GPC-3过表达/敲除后细胞的生物学行为的改变趋势;
  7、观察敲除GPC-3后Huh-7细胞的裸鼠皮下移植瘤模型的生长情况,判断GPC-3敲除细胞株的体内成瘤能力。
  结果:
  1、多株HCC细胞中GPC-3基因表达水平从高到低的顺序为:HepG2>Hep3B>Huh-7>LM3>MHCC97H>MHCC97L,SK-hep-1几乎不表达GPC-3;
  2、Western-blot检测HCC细胞的GPC-3蛋白表达水平,HepG2、Hep3B、Huh-7三株细胞高表达GPC-3,LM3、MHCC97H、MHCC97L、SK-hep-1四株细胞未检测到明显GPC-3条带;
  3、成功构建GPC-3过表达慢病毒载体,获得三个GPC-3完全敲除的病毒载体;
  4、选择MHCC97L、SK-hep-1两株细胞用于过表达GPC-3,Huh-7细胞用于敲除GPC-3,获得GPC-3过表达的稳转细胞株及敲除的单克隆细胞株。通过Western-blot和Q-PCR证实各株细胞成功过表达/敲除GPC-3;
  5、过表达GPC-3后,SK-hep-1细胞的增殖能力被抑制,而MHCC97L细胞的增殖能力不受影响,敲除GPC-3后,Huh-7细胞的增殖能力明显降低;
  6、过表达GPC-3后,与对照组相比,MHCC97L、SK-hep-1细胞的迁移/侵袭能力均增强,而敲除GPC-3的Huh-7细胞的迁移及侵袭能力明显低于对照组;
  7、过表达/敲除GPC-3后,MHCC97L、SK-hep-1、Huh-7三株细胞的凋亡情况与对照组相比均没有明显差异;
  8、裸鼠成瘤实验发现敲除GPC-3组Huh-7细胞在裸鼠体内成瘤能力低于对照组。
  结论:
  成功构建GPC-3过表达/敲除载体,并获得稳定过表达/敲除GPC-3的HCC细胞株。通过体内外实验发现GPC-3能促进HCC细胞的迁移、侵袭,但对HCC细胞体外增殖的影响因细胞系的不同而不同,GPC-3与肝癌细胞的凋亡无密切相关。以上结果提示通过抑制HCC患者体内GPC-3的表达可作为治疗HCC的有效手段。
[硕士论文] 刘莉
病理学与病理生理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptors,CARs)是源自编码单链可变片段(scFv)的转基因的嵌合免疫球蛋白T细胞受体(TCR)分子,与T细胞的免疫受体酪氨酸活化基序相结合,能特异识别和结合肿瘤相关抗原的抗体,诱导细胞构象变化,导致转录因子表达和细胞因子释放,从而诱导T淋巴细胞产生针对肿瘤细胞的细胞毒活性。近年来,研究者们通过对CARs胞内信号区改造,旨在提高嵌合抗原分子传递信号的强度和持续时间,CAR-T已经历了从第一代到第五代的变迁,成为了肿瘤免疫治疗的新热点。
  肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界上最常见的癌症之一,尽管HCC现阶段的临床治疗水平有了极大提高,但死亡率并无明显改善,5年以上生存率低至25%~39%左右。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员之一,据报道该蛋白在原发性肝细胞癌中表达率高达80%,但在正常肝组织、肝硬化组织或癌旁组织中不表达。由于GPC3对肝细胞癌的诊断具有特异性强和敏感性高的优势,GPC3有望成为诊断和治疗肝癌的新靶点。
  本课题组前期研究将GPC3-CAR导入T淋巴细胞,已构建第二代和第三代的GPC3-CAR,成功转染T淋巴细胞,并进行体外杀伤实验,取得阶段性成果。本课题组在前期研究的基础上,进一步设计动物体内实验,旨在验证GPC3-CAR对肝癌靶向治疗的有效性,筛选靶向性好、杀伤性强、安全性佳的GPC3-CAR,为GPC3-CAR过继T细胞疗法治疗肝癌的临床应用奠定基础。
  方法:
  1、肝癌细胞株的培养
  本课题组在前期研究上已筛选出肝癌细胞GPC3高表达HepG2和GPC3不表达的Sk-Hep-1肝癌细胞株。选取状态良好的HepG2和Sk-Hep-1肝癌细胞株用10%完全培养基(即胎牛血清:MEM培养基=1:9)进行培养及大量扩增。
  2、小鼠肝癌荷瘤模型的构建
  选择6~8周的44只NOD/SCID小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司,合格证号2013001828737),肝癌细胞株培养到一定数量后,吸取处于细胞对数生长期的肝癌细胞混悬液,稀释为5×106/0.2ml,摇匀注入小鼠右大腿皮下,建立HepG2和Sk-Hep-l皮下瘤肝癌荷瘤小鼠模型。
  3、GPC3-CAR基因修饰的T细胞的制备
  抽取健康人外周血,T细胞分选磁珠分选T淋巴细胞,用细胞因子(300U/mL)优化培养T淋巴细胞。用第二代GPC3-CAR(GBBz)、第二代GPC3-CAR(G28BBz)及空载体Mock分别感染T淋巴细胞,制成Mock-T及GBBz-T、G28BBz-T,体外培养约28天达到一定数量后进行后续的治疗。
  4、GPC3-CAR对肝癌荷瘤小鼠的体内过继免疫治疗
  当肿瘤体积长到100~200mm3时,分别将HepG2和Sk-Hep-l小鼠荷瘤模型,随机分为4组(n=5):无菌盐水组,Mock-T组,GBBz-T和G28BBz-T,每只小鼠尾静脉注射8×106个T细胞,进行肝癌荷瘤小鼠体内过继免疫治疗。
  5、观察肝癌荷瘤小鼠的生存情况及肿瘤的生长情况
  观察荷瘤小鼠精神,饮食,排便以及体重等一般生存情况,活体肿瘤生长情况及荷瘤小鼠生存情况,选择荷瘤小鼠CAR-T过继免疫疗法的时机,观察治疗前后以下指标的变化:①小鼠精神、饮食、排便以及体重等一般情况;②观察瘤体大小;③处死小鼠,取出瘤体以及肝脏,脾脏,心脏,肺,肾,脑等器官,观察重要器官的损伤以及炎症细胞浸润情况,评估GPC3-CAR T细胞对肝癌治疗的安全性。④瘤体石蜡切片进行CD3免疫组化染色观察CAR-T细胞在瘤体的迁移情况;⑤TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡情况。⑥取小鼠外周血,ELISA检测血清中细胞因子INF-γ和IL-2的分泌情况。
  结果:
  1、成功构建GPC3高表达HCC细胞HepG2和GPC3不表达的Sk-Hep-l的NOD/SCID小鼠肝癌荷瘤模型。注射肝癌细胞混悬液后约7d-10d后成瘤,HepG2成瘤率约为75%~90%,Sk-Hep-1成瘤率接近100%。
  2、经过第二代及第三代GPC3-CAR T治疗后,小鼠一般情况良好,体重呈波动性改变,荷瘤小鼠的肝脏,脾脏,心脏,肺,肾,脑等器官与对照组相比,各脏器组织镜下结构清晰完整,未见明显中性粒细胞及淋巴细胞浸润,无细胞坏死,无充血水肿及组织纤维化。
  3、高表达GPC3的HepG2组,经过第二代及第三代GPC3-CAR T治疗后,肿瘤体积与对照组相比有明显的缩小,重量减轻(**P<0.01),GBBz组与G28BBz组无明显差异(P>0.05),不表达GPC3的Sk-Hep-1组,各T细胞组之间肿瘤体积和重量均无明显差异(P>0.05)。
  4、CD3免疫组化观察肿瘤组织中T细胞的浸润,光镜发现,HepG2荷瘤小鼠的G28BBz组和GBBz组有较多量阳性细胞,5个高倍视野下阳性细胞数分别为170.8±8.7和132.8±12.8,高于Mock组10.2±4.3(**P<0.01)。
  5、TUNEL检测肿瘤细胞的凋亡情况,荧光显微镜下计数5个高倍视野下阳性细胞所占的百分比。HepG2荷瘤小鼠中,与对照组相比,GBBz组和G28BBz组凋亡细胞多(*P<0.05);GBBz组vs G28BBz组之间无明显差异(P=0.05254)。Sk-Hep-1组可见少量凋亡细胞,各T细胞组之间均无明显差异(P>0.05)。
  6、ELISA检测荷瘤小鼠血清中细胞因子INF-γ和IL-2的分泌情况。细胞因子IL-2和INF-γ在小鼠体内分泌水平极低,在HepG2组中,经GBBz和G28BBz修饰的T淋巴细胞过继治疗后均分泌较高水平的细胞因子(*P<0.05)。Sk-Hep-1组分泌IL-2及INF-γ的能力低,各组间无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  成功构建GPC3高表达和GPC3不表达的NOD/SCID小鼠肝癌荷瘤模型;经第二代和第三代GPC3-CAR修饰的T淋巴细胞过继免疫治疗后,对GPC3高表达的肝癌荷瘤小鼠有明显杀伤,对重要器官无明显的损伤,未见体内细胞因子风暴。提示第二代和第三代GPC3CAR-T细胞过继免疫疗法可作为肝癌的有效治疗手段。
[硕士论文] 程海丽
病理学与病理生理学(肿瘤病理) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  构建mPGES-1-RNAi慢病毒(前列腺素E2合成酶-1-RNAi)并感染肝癌细胞,观察干扰mPGES-1基因对肝癌细胞SMMC7721和HepG2体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。采用miRNAs芯片方法检测肝癌细胞HepG2mPGES-1基因被干扰后miRNAs差异表达情况,并加以验证以及相关分析,以期发现mPGES-1介导miRNAs信号通路在肝细胞癌恶性进展中的作用及可能的分子机制。
  研究方法:
  (1)构建mPGES-1-RNAi慢病毒并分别感染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,同时设置空载体组(NC组)和未感染组(Control组)。采用Western blot、PCR等方法检测干扰mPGES-1基因前后肝癌细胞SMMC7721和HepG2中mPGES-1mRNA及蛋白的表达水平。运用CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测干扰mPGES-1基因对肝癌细胞SMMC7721和HepG2增殖、迁移和侵袭能力的影响。
  (2)用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测干扰肝癌细胞株SMMC7721和HepG2mPGES-1前后前列腺素E2(PGE2)的含量。
  (3)采用miRNAs芯片筛选干扰肝癌细胞株HepG2mPGES-1基因后显著差异表达miRNAs,同时用qPCR加以验证,对差异表达最显著的miR-146a-5p用TargetScan、PITA、microRNAorg数据库进行靶基因预测。三个数据库取交集后的共同靶基因进行后续的GO和KEGG Pathway分析。
  (4)用免疫组织化学方法检测mPGES-1、cyclinD1和EGFR在肝癌组织和癌旁肝组织的表达情况,并分析它们之间的相关性。
  研究结果:
  (1)成功构建mPGES-1-RNAi慢病毒并感染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,SMMC7721的病毒感染率约为80%,HepG2的病毒感染率约为90%。
  (2)与未感染组(Control组)、空载体组(NC组)相比,肝癌细胞SMMC7721和HepG2中mPGES-1基因干扰组(LV-2组)mPGES-1mRNA和蛋白表达明显下调,且差异有统计学意义(P<0.05)。
  (3)与未感染组(Control组)、空载体组(NC组)相比,肝癌细胞SMMC7721和HepG2中mPGES-1基因干扰组(LV-2组)PGE2含量明显下调,且差异有统计学意义(P<0.05)。
  (4)CCK8实验及Transwell侵袭实验结果显示:在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中,mPGES-1基因干扰组(LV-2组)与未感染组(Control组)和空载体组(NC组)相比,细胞增殖、侵袭能力明显减弱,且差异有统计学意义(P<0.05)。
  (5)细胞划痕实验结果显示:在肝癌细胞SMMC7721中,相对未感染组(Control组)与空载体组(NC组),mPGES-1基因干扰组(LV-2组)细胞迁移能力明显减弱,且差异有统计学意义(P<0.05);在肝癌细胞株HepG2中,相对未感染组(Control组)与空载体组(NC组),mPGES-1基因干扰组(LV-2组)细胞迁移能力有所下调,但差异统计无学意义(P>0.05)。
  (6)miRNAs芯片筛选显著差异表达miRNAs与qPCR验证结果相对比:miR-146a-5p、miR-6889-5p、miR-3150b-3p、miR-4470表达上调;miR-20a-3p、miR-23a-5p、miR-629-5p、miR-7-1-3p、miR-6820-3p表达下调,以上结果与miRNA芯片结果相一致,其中上调miRNAs中miR-146a-5p改变最明显,上调倍数为4.12,下调miRNAs中miR-7-1-3p改变最明显,下调倍数为3.70。但miR-5191、miR-2276-3p、miR-892b表达上调,miR-521表达下调,这4个miRNAs的表达情况与芯片结果不一致。
  (7)差异表达最显著miR-146a-5p的靶基因预测及对靶基因的GO分析和KEGG分析结果显示:miR-146a-5p的候选靶基因有120个,有cyclinD1、EGFR等;且miR-146a-5p的靶基因主要调控基因转录、细胞转移、小GTPase介导的信号转导、脱磷酸作用、T细胞激活等生物学行为,主要富集在:肿瘤相关信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、ErbB信号通路等。
  (8)免疫组织化学染色结果显示:mPGES-1在肝癌组织中高表达率高于癌旁肝组织(77.78%vs.53.70%),差异有统计学意义(P<0.05);cyclinD1在肝癌组织中高表达率高于癌旁肝组织(12.96%vs.1.85%),差异有统计学意义(P<0.05);EGFR在癌旁肝组织中的高表达率高于肝癌组织(38.89%vs.72.22%),差异有统计学意义(P<0.05)。对mPGES-1、cyclinD1、EGFR三者的相关性进行分析,结果显示:mPGES-1与cyclinD1呈正相关、与EGRF呈负相关,同时cyclinD1与EGFR呈负相关,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。
  研究结论:
  (1)成功构建mPGES-1-RNAi慢病毒载体,高效感染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,可稳定、显著的降低mPGES-1基因的表达。
  (2)干扰mPGES-1基因可以减弱肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
  (3)干扰肝癌细胞HepG2mPGES-1基因前后miRNAs的表达谱发生改变,mPGES-1可能通过miR-146a-5p靶向cyclin D1和EGFR影响肝细胞癌的恶性进展。
[硕士论文] 甘川
中西医结合临床 广西中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:应用Cochrane系统的方法来评价三维适形放疗(3DCRT)联合中药与单独应用三维适形放疗的方案在原发性肝癌治疗中的疗效及安全性。
  方法:计算机检索Cochrane Library,PubMed,Embase,万方,VIP(China Science and Technology Journal Database),CNKI(National Knowledge Infrastructure),CBM(Chinesejournalfull—textdatabase)数据库,检索有关原发性肝癌治疗中应用三维适形放疗联合中药与单独应用三维适形放疗方案的临床随机对照试验的文献,纳入的文献发表时间限定为2000年01月01日至2018年01月01日,对两种治疗方式的疗效及毒副作用方面进行Meta分析。
  结果:共纳入32篇随机对照试验(randomized controlled trial,RCT)文献,包含2238例患者;Meta分析结果显示,三维适形放疗联合中药的治疗方案在客观有效率[OR=2.50,95%CI(2.02,3.10),P<0.00001]、疾病控制率[RR=1.11,95%CI(1.04,1.19),P=0.001]、胃肠道反应发生率[OR=0.47,95%CI(0.36,0.62,P<0.00001]、白细胞下降发生率[OR=0.45,95%CI(0.34,0.61),P<0.00001]、血小板下降发生率[OR=0.64,95%CI(0.42,0.98),P=0.04]、骨髓抑制发生率[OR=0.60,95%CI(0.39,0.93),P=0.02]、恶心呕吐发生率[OR=0.34,95%CI(0.16,0.76),P=0.008]、KPS评分提高率[OR=3.88,95%CI(2.47,6.10),P<0.00001]、KPS评分情况[MD=10.73,95%CI(7.64,13.81),P<0.00001]、TBIL评分情况[MD=-7.66,95%CI(-13.29,-2.03),P=0.008]、CD4+情况[MD=6.60,95%CI(2.61,10.59),P=0.001]、CD4+/CD8+情况[MD=0.34,95%CI(0.11,0.57),P=0.003]、半年生存率[OR=1.67,95%CI(1.10,2.55),P=0.02]、1年生存率[OR=1.91,95%CI(1.43,2.56),P<0.0001]、2年生存率[OR=1.88,95%CI(1.30,2.72),P=0.0009]、ALT情况[MD=-34.36,95%CI(-49.91,-18.81),P<0.0001]方面较单纯三维适形放疗方案具有明显优势,而在免疫指标CD8+情况[MD=0.26,95%CI(-6.97,10.18),P=0.96]方面,两种治疗方案的差异无统计学意义。
  结论:与单纯三维适形放疗方案相比,三维适形放疗联合中药的治疗方案可明显改善客观有效率、疾病控制率、KPS评分提高率、KPS评分情况、TBIL情况、免疫指标CD4+情况、免疫指标CD4+/CD8+情况、肝功能指标ALT情况、半年生存率、1年生存率、2年生存率,减轻胃肠道反应发生率、白细胞下降发生率、血小板下降发生率、骨髓抑制发生率、恶心呕吐发生率,但在免疫指标CD8+方面无改善。
[硕士论文] 武晓君
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球癌症死亡的第二大原因,威胁着人类的生命[1,2]。HCC发病率逐年升高,由于其遗传异质性、多种病因和并发慢性肝病使得HCC患者的诊断和治疗面临一定的困难[3]。长链非编码RNA(Long-chain non-coding RNA,lncRNA)是非编码RNA的一种,长度超过200个bp,很少或没有蛋白质编码能力[4]。近几年的研究显示,很多lncRNA与癌症相关,而lncRNA小核仁RNA宿主基因5(Smallnucleolar RNA host gene5,SNHG5)已发现在胃癌、结直肠癌、食管癌等癌症中存在表达异常,但在肝癌中目前还没有报道。
  为探究SNHG5在肝癌中是否也有一定的作用,首先通过实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测了SNHG5在正常肝脏细胞HL7702和肝癌细胞系HepG2、MHCC97L、MHCC97H、QGY-7701、SK-Hep1中的表达,结果显示SNHG5在上述几种肝癌细胞系中都表达上调。随后通过siRNA干扰技术将HepG2中的SNHG5沉默,结果发现沉默后HepG2的增殖、迁移、细胞周期和克隆形成均被明显抑制,而凋亡显著增加。此外,查找文献发现富含丝氨酸精子发生相关蛋白2(Spermatogenesis-associated serine-rich protein2,SPATS2)和PITRM1(Pitrilysin metallopeptidase1)可能是SNHG5的相关靶基因。因此进一步通过qRT-PCR与Western blot对靶基因进行检测。结果表明,当抑制或过表达SNHG5时,SPATS2和PITRM1的mRNA和蛋白表达水平会随之下调或上调。此后通过双荧光素酶报告基因实验对SPATS2进行检测,结果显示SPATS2与SNHG5存在互补结合位点。最后通过转染siSPATS2或siPITRM1,将HepG2中的SPATS2或PITRM1沉默,进一步探究它们对HepG2生物学功能的影响。结果表明,在HepG2中沉默SPATS2或PITRM1后能显著抑制HepG2的增殖、迁移、周期和克隆形成,同时显著促进凋亡,与在HepG2中沉默SNHG5的效果类似。
[硕士论文] 徐佳佳
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:胃癌作为一种起源于胃黏膜上皮的常见消化道恶性肿瘤,已对人类的健康产生了严重的威胁。近年来,尽管许多国家胃癌的发病率和死亡率都有所下降,但由于其病因极其复杂,目前胃癌尚未得到有效治疗。手术切除是目前胃癌治疗的主流手段,但术后易出现复发与转移。因此,寻找新型有效的抗胃癌药物对于胃癌的治疗显得十分重要。柯里拉京(corilagin)是单宁家族的独特成分,存在于多种药用植物中,是叶下珠属植物的主要活性单体,具有广泛的生物学活性如抗炎、保肝、抗病毒、抗肿瘤等。近年来,柯里拉京在抗肿瘤方面的作用越来越受到人们的关注。已有文献报道,其对肝癌、卵巢癌以及成胶质瘤细胞具有明显的抑制作用。然而,柯里拉京对胃癌的生物学效应及其机制尚不清楚。
  本课题以人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823为研究对象,主要探讨柯里拉京诱导人胃癌细胞程序性死亡的作用机制。首先,我们采用MTT法和Edu染色实验分别检测人胃癌SGC-7901和BGC-823细胞经不同浓度柯里拉京作用24h后细胞的存活率。结果表明,柯里拉京能显著抑制人胃癌细胞SGC-7901和BGC-823的增殖,并且抑制作用呈现出显著的剂量依赖效应。同时用MTT法测定柯里拉京对人正常胃黏膜上皮细胞GES-1增殖的影响,结果说明,在一定剂量范围内,柯里拉京不会抑制正常胃黏膜上皮细胞GES-1的生长,表现出对肿瘤细胞的特异性。其次,通过Hochest33342染色实验、Annexin V-FITC/PI双染实验,Western blot实验检测经不同浓度柯里拉京处理24h后,相关凋亡指标的变化。结果表明,柯里拉京可诱导胃癌细胞SGC-7901和BGC-823发生caspase依赖的凋亡。接着,通过吖啶橙(AO)染色实验、MTT实验和蛋白免疫印迹分析实验,我们发现柯里拉京可诱导胃癌SGC-7901和BGC-823细胞发生自噬,且抑制自噬可提高柯里拉京对胃癌细胞的增殖抑制作用。因此认为自噬对胃癌细胞起到保护作用。此外,采用流式细胞术分析与MTT实验相结合的方法,研究证实柯里拉京能以剂量依赖的方式显著地诱导细胞内ROS的累积,并且ROS在细胞内的积聚会显著地抑制胃癌细胞的存活。最后,采用RT-PCR和Western blot等实验,证实柯里拉京不能诱导胃癌细胞SGC-7901和BGC-823发生程序性细胞坏死。
  综上所述,本研究结果表明,柯里拉京可诱导胃癌细胞SGC-7901和BGC-823发生凋亡和自噬以及ROS的大量积聚,但不会诱导胃癌细胞发生程序性坏死。本实验结果可为今后将柯里拉京开发成为临床新型抗胃癌药物提供一定的科学依据。
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