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[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[博士论文] 程利鹏
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是世界第三大恶性肿瘤,也是导致癌症相关死亡的第四大原因。肿瘤复发及远处转移是CRC患者死亡的主要原因,而肝脏是其远处转移最常见的靶器官。大量研究证实,结直肠癌肝转移(Colorectal Liver Metastasis,CRLM)在伴有慢性肝病的患者中发病率较低。对于病理性肝病影响CRLM确切分子机制仍有争议。
  微小RNA(miRNA),作为一种内源性非编码RNA,在转录后水平调节人类近60%基因(尤其是癌基因)的表达。miRNA let-7超家族由12个成员组成,它作为一种肿瘤抑制因子,在多种恶性肿瘤中(包括CRC)发挥重要作用。前期研究已表明,IFN-γ刺激CRC细胞系HT29能下调let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p(let-7a簇)表达,增强其对Fas介导凋亡的敏感性。
  本文旨在进一步探讨肝炎微环境中IRF-1介导IFN-γ下调CRC细胞let-7a簇表达并降低其肝转移能力的相关分子机制。
  方法:
  采用4-6周雄性BALB/c小鼠,以40%四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)灌胃法构建慢性肝炎模型,经脾静脉注入鼠源性结直肠癌细胞系CT26.WT构建CRLM模型。活体成像和肝组织H&E染色确立成模时间。
  ELISA法检测炎症模型肝组织和血清中IFN-γ,TNF-α和IL-1β等炎症因子的表达水平。慢病毒稳转,构建IFN-γ受体1(IFNGR1)敲低细胞系(shRNA-IRFGR1-CT26),并在肝炎模型的基础上构建转移瘤模型,明确IFN-γ在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。IFN-γ刺激CRC细胞HT29和CT26.WT,体外模拟炎症微坏境,qRT-PCR、Western blot和IHC检测炎症状态下CRC细胞和小鼠肝组织中干扰素调节因子(IRF-1/IRF-2)及let-7a簇表达变化。检索UCSC网站,确立IRF-1/2与let-7a簇表达调控的相关性。Rescue实验、ChIP和双荧光素酶报告基因等实验,阐明IRF-1调控let-7a簇表达可能的相关机制。
  慢病毒构建let-7a-1-5p敲低(shRNA-let-7a-1-5p-CT26)和高表达(LV-let-7a-1-5p-CT26)细胞株,在正常和炎症小鼠模型基础上构建转移瘤模型,研究let-7a簇对结直肠癌肝转移的影响,同时探索其在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。
  用qRT-PCR、Western blot和IHC法检测CRC在体内外炎症微环境及let-7a-1-5p低表达情况下EMT相关marker(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表达情况,探索上皮-间质转化在炎症抵抗肿瘤转移过程中的作用。
  结果:
  1、肝炎微环境影响结直肠癌肝转移
  CCl4灌胃法和脾静脉注射法构建肝炎模型和CRLM模型。苏木精-伊红(H&E)染色后发现,当40%的CCl4灌胃(6ml/kg小鼠体重,每周2次)5周后肝炎模型构建成功。灌胃7周,肝硬化模型构建成功。CRLM造模6天后小鼠即可出现CRLM(1/6),而当建模12天后,超过80%(5/6)的小鼠肝脏出现了转移瘤。
  在肝炎的基础上构建CRLM模型。结果表明,炎症组肝转移率低于正常组(2/6vs.5/6),且活体成像总荧光强度、肝转移瘤最大直径和转移瘤个数等转移瘤负荷显著低于正常组(P值均小于0.05)。
  2、IFN-γ可能影响肝炎微环境中CRLM的发生过程
  ELISA法检测炎症小鼠血清及肝组织中IFN-γ,TNF-α和IL-1β的表达变化。结果发现,三者在炎症肝组织中表达无差异。而在炎症小鼠的血清中,表达均显著上调,尤其是IFN-γ,表达上调最为显著(倍数=6.55)。
  用shRNA-IRFGR1-CT26细胞在炎症模型基础上构建CRLM模型,IRFNG1敲低组肝转移率较高(8/10vs.3/10),转移瘤负荷也显著增高(P值均小于0.05)。
  3、肝脏炎症环境中let-7a簇与IRF-1表达呈负相关
  检索UCSC网站发现,let-7a簇转录起始位点上游存在多个IRF-1/2结合位点。qRT-PCR和Western blot检测发现,IFN-γ的刺激均能显著上调HT29和CT26.WT细胞IRF-1的表达,而IRF-2的表达无显著差异。IHC检测伴有肝炎的转移瘤肝组织进一步验证了上述结论。同时,研究还发现,IFN-γ刺激CRC细胞显著下调let-7a簇表达,但是,let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p表达下调无明显差异。
  4、IRF-1参与IFN-γ下调let-7a簇的表达
  Rescue实验结果显示,在HT29细胞中,干扰IRF-1的表达能显著削弱IFN-γ下调let-7a簇表达的趋势(P<0.01)。IFN-γ处理HT29,能同时显著下调let-7a-1-5p及其前体的表达水平(P<0.05),但二者下调趋势无差异(P>0.05)。
  染色质免疫共沉淀实验(ChIP)结果显示,引物4(chr9:96,931,077-96,931,229)扩增效率显著增高,提示该位点可能存在IRF-1的结合位点。本研究将879bp目的基因(包含chr9:96,931,077-96,931,229)构入报告质粒(let-7a-Report-WT)中,并在718-721(AATC)处构建缺失突变(let-7a-Report-MT)。双荧光素酶报告基因实验发现,IRF-1能结合在位点(718-721)上。
  5、结直肠癌细胞的let-7a-1-5p表达水平与其肝转移能力相关
  用shRNA-let-7a-1-5p-CT26和LV-let-7a-1-5p-CT26细胞株建立转移瘤模型。结果显示,与对照组相比,let-7a-1-5p敲低组CRLM发生率降低(1/6vs.4/6),荧光强度强度较弱(P=0.05),转移灶数目少(P<0.05),转移瘤最大直径较小(P=0.05)。而let-7a-1-5p高表达组CRLM发生率稍高(6/6vs.5/6),转移瘤负荷显著增高(P<0.05)。此外,在肝炎小鼠中,let-7a-1-5p敲低同样降低CRLM发生(1/10vs.5/10),且肿瘤负荷均显著低于高表达组(均P<0.05)。
  6、抑制let-7a簇的表达维持CRC细胞的间质表型
  在构建shRNA-let-7a-1-5p-HT29细胞系的过程中,HT29的细胞形态由上皮细胞型态转变成间质样细胞型态。我们用qRT-PCR和Western blot检测EMT相关marker后发现,IFN-γ刺激HT29后,E-cadherin表达显著增加,而N-cadherin和Vimentin的表达未见显著差异。敲低HT29细胞let-7a-1-5p表达也得到了相同的结论。再用IHC检测肝转移瘤组织中的N-cadherin,结果发现,肝脏炎症组和let-7a-1-5p低表达组的转移瘤组织中N-cadherin阳性率显著增加。
  结论:
  1.CCl4诱导的肝脏炎症微环境能降低结直肠癌肝转移的发生,IFN-γ在调控中起重要作用;
  2.IRF-1通过结合let-7a簇转录本上游区域,介导IFN-γ下调let-7a簇的表达,降低CRC细胞肝转移潜能;
  3.在炎症微环境中let-7a-1-5p低表达能减少CRLM的发生;
  4.Let-7a簇通过上调结直肠癌细胞的N-cadherin表达,促进了上皮-间质转化,从而降低了肿瘤细胞在肝脏中的定值能力。
[博士论文] 吴成
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:经导管动脉化疗栓塞术(TACE)是原发性肝癌的主要治疗方法之一,由于术中栓塞剂阻塞及化疗药物等作用,可造成肝脏局部缺血缺氧,致缺血区中性粒细胞、单核细胞、肝脏库弗氏细胞等大量聚集引起炎症反应,多种炎性因子大量生成分泌。炎性因子与肝癌的发生、发展密切相关。其中IL-8、TNF-α与肝癌的进展、血管生成和转移密切相关。TACE术后局部为缺氧环境,可上调缺氧诱导因子(HIF)-1α表达,进一步可通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)升高而促进肿瘤血管生长,进而促进肿瘤复发、转移,VEGF和HIF-1α是缺氧环境中调控血管生成的关键因子,VEGF的高表达可以促进肿瘤生长、增加转移机率。抑制VEGF表达水平是降低肝癌TACE术后复发转移率的重要手段,进而可阻止肿瘤新生血管的形成。在缺氧环境下,VEGF除受HIF-1α调控外,炎性因子亦可以促进VEGF表达。众多研究表明,中药医已经成为恶性肿瘤治疗策略中的重要组成部分,配合TACE术具有良性调节作用,不仅可减轻栓塞综合征,而且可以在降低肝癌复发、转移方面发挥作用。清热解毒法是中医治疗原发性肝癌的主要治疗方法之一,清热解毒中药在肝癌发展的不同阶段均有一定疗效。熊胆粉作为清热解毒类中药,具有抗炎、抗肿瘤的作用。现研究发现,熊胆粉在减少炎性因子分泌、调节肿瘤微环境、抑制肝星状细胞活化、促进T细胞增殖、诱导肝肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖及血管生成等方面均有作用。熊胆粉是否可能下调TACE术后缺氧环境炎性因子分泌,是否可以下调VEGF表达,是否可以抑制缺氧条件下的血管生成,目前尚无相关报道。
  目的:
  探讨熊胆粉对原发性肝癌TACE术后炎性因子及栓塞综合征的影响,并进一步探讨熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞炎性因子及血管生成的影响,为熊胆粉配合TACE术进一步提高TACE术的疗效提供实验依据。
  方法:
  1、熊胆粉对原发性肝癌患者TACE术后血清炎性因子及栓塞综合征的影响
  将符合纳入标准的107例原发性肝癌患者随机分为熊胆粉组(服用熊胆粉胶囊)及对照组(服用安慰剂),均于TACE术前1天开始用药,疗程6天,分别于术前、术后第3天及术后第5天检测并记录患者血清炎性因子、肝功水平及记录临床症状情况。
  2、熊胆粉对CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响
  体外采用CoCl2造成人肝癌细胞SMMC-7721缺氧模型,MTT检测不同浓度熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞增殖的影响,然后用对SMMC-7721肝癌细胞无明显毒性的低、中、高浓度的熊胆粉干预,RT-PCR方法检测缺氧条件下熊胆粉对肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGF表达,同时用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清中IL-8水平、Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,探讨熊胆粉在缺氧条件下对IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响。
  3、熊胆粉对IL-8诱导的血管生成的影响
  在体外实验中,我们用铺基质胶方法将100ng/mL IL-8与内皮细胞注入高浓度的基质胶内,并加入不同浓度的熊胆粉培养,在荧光显微镜下观察血管结节数量、血管长度及面积并拍照,图片采用Image J软件进行处理并统计其血管生成情况。
  在体内实验中,将裸鼠分3组,分别为空白组(裸鼠皮下接种基质胶与内皮细胞)、IL-8组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞与IL-8混合液)、IL-8+熊胆粉组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞、IL-8与0.4mg/mL熊胆粉混合液),将混有IL-8、EA.hy926细胞、熊胆粉的基质胶按分组设计方案接种于裸鼠体内。10天后,将裸鼠皮下基质胶团块剥离,一部分置于EP管中,加入Lysis细胞裂解液并在组织研磨机中研磨,通过BCA法检测蛋白浓度,将所有样品调整至相同蛋白浓度后,将所获得的组织悬液通过贝博血红蛋白检测试剂盒进行血红蛋白浓度的检测;另一部分用于HE染色观察血管生成情况,免疫组化检测CD31、VEGF表达以评估血管生成情况。
  结果:
  1、临床研究发现,原发性肝癌患者TACE术后炎性因子IL-6、CRP、IL-8表达明显上调(P<0.05),术后第5天时熊胆粉组IL-8、TNF-α水平明显低于对照组(P<0.01,P<0.05),提示熊胆粉可以抑制TACE术后炎性因子IL-8、TNF-α表达水平;
  2、原发性肝癌患者TACE术后肝功TBIL、DBIL、ALT、AST水平升高,熊胆粉组AST/ALT比值、AST水平显著低于对照组(P<0.01,P<0.05);熊胆粉组患者的发热持续时间明显短于对照组(P<0.05),提示熊胆粉可以改善TACE术后肝功能损伤,减轻发热症状,减轻栓塞综合征。
  3、RT-PCR方法检测肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,结果发现,CoCl2能显著诱导SMMC-7721细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),而熊胆粉能够明显抑制CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA的表达。进一步采用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清液中IL-8水平,结果与mRNA结果一致。Western blot法检测肝癌细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达,结果也显示熊胆粉可抑制HIF-1α、VEGF蛋白表达,以上均提示熊胆粉具有抑制缺氧条件下IL-8、HIF-1α、VEGF表达的作用。
  4、熊胆粉体外对IL-8诱导的血管生成的影响,结果显示:混有IL-8及内皮细胞的基质胶内血管结节数量、血管长度及面积方面均明显高于空白对照组(P<0.05),提示IL-8能刺激血管的生成;加入不同浓度的熊胆粉干预后,血管结节数量、血管长度及面积三个指标均较IL-8组下降,其中0.2、0.4mg/mL两组与IL-8组差异显著(P<0.05),提示熊胆粉能有效抑制IL-8促血管生成的效应,并且呈一定的剂量依赖性。
  5、熊胆粉对体内血管生成的影响的实验中,HE染色观察发现基质胶团块血管生成在IL-8刺激下明显增加,而熊胆粉能有效抑制该效应;免疫组化检测体内基质胶内CD31、VEGF表达的结果发现,IL-8组CD31、VEGF表达明显高于对照组,而熊胆粉+IL-8组则CD31、VEGF表达均较IL-8组明显减少,检测体内基质胶内血红蛋白浓度发现,在IL-8诱导下,IL-8组基质胶内血管较空白对照组丰富,血红蛋白浓度明显高于空白对照组,差异显著(P<0.05),而熊胆粉+IL-8组则血管不明显,血红蛋白浓度明显低于IL-8组,差异有统计学意义(P<0.05),以上均提示熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成。
  结论:
  1、熊胆粉可以抑制TACE术后IL-8、TNF-α表达水平;降低术后AST水平,减轻TACE术后栓塞综合征;
  2、熊胆粉能够抑制缺氧诱导的肝癌细胞VEGF、IL-8水平升高;
  3、熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成;
  4、熊胆粉可能能够抑制原发性肝癌TACE术后缺氧诱导的血管生成,其机制可能与抑制HIF-1α/IL-8/VEGF相关。
[博士论文] 王碧波
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分 肝细胞调控肝血窦内皮细胞促进肝再生机制研究
  目的:
  肝脏在遭受到外力损伤,化学毒物暴露,或者病毒感染时,具有显著的再生能力,来维持肝脏的结构和功能。肝再生是一个由不同种类的细胞共同参与的持续的自然过程。小鼠肝部分切除模型(Partial Hepatectomy, PHx)是用来研究肝再生最经典的模型。在这个模型中,70%的肝脏被手术切除,剩下的肝脏增殖,大约术后1周,达到原来的肝脏体积,之后再生过程停止。肝再生是如何被触发的,在再生过程中肝脏的结构和功能是如何保持的,哪些信号负责关闭生长反应是肝脏再生的三个主要问题。肝脏结构主要由肝实质细胞、肝血窦内皮细胞(Liver sinusoidalendothelial cell,LSEC)、肝内胆管上皮细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)、Kupffer细胞和细胞外基质组成。肝细胞增殖在前,非实质细胞再生随后。正常组织结构恢复过程中,星状细胞在部分肝切除术后约4天产生细胞外基质,重建肝细胞与其他细胞之间的连接。肝内血管系统主要由动脉、静脉和LSEC构成。肝再生后期,势必需要建立丰富的血管系统来维持新生肝细胞的存活,肝内血管再生离不开肝脏内特殊的毛细内皮系统。LSECs约占肝脏内细胞的15-20%,形成肝窦壁,参与了不同的生理和病理过程。肝细胞和LSECs的平衡对于肝再生稳态的维持尤为重要,它有助于新生肝细胞的存活和肝脏功能保护。LSEC对肝细胞的增殖与终止是至关重要的,但启动LSEC的再生过程仍不清楚。
  方案:
  1.检测PHx后肝细胞与LSEC增殖的时相,探讨导致两者时相差的原因;
  2.论证CRISPR-Cas9联合AAV技术用于肝再生研究的可行性;
  3.基于CRISPR-Cas9联合AAV技术构建特异性抑制肝细胞增殖的肝再生模型,观察LSEC再生情况;
  4.筛查并验证肝细胞调控LSEC再生的关键因子,明确调控机理;
  5.探讨肝细胞对内皮前体细胞分化形成LSEC的影响。
  结果:
  1.发现肝再生中,肝细胞增殖高峰早于LSEC增殖高峰的可能原因;
  2.首次论证了CRISPR-Cas9技术用于肝再生研究的可行性。
  3.基于CRISPR-Cas9技术构建了肝细胞特异性敲除OSMR(OSMR△Hep)和Met(Met△Hep)的肝再生模型,发现抑制肝细胞增殖后,LSEC以及肝脏内的血管再生滞缓,提示肝细胞启动了LSEC再生过程;
  4.肝切除术后分离肝脏中的肝细胞、HSC、Kupffer和LSEC,分别进行了多因子筛查检测,对比分析显示肝细胞中促进内皮细胞生长的细胞因子VEGFA表达水平显著上调,而抑制内皮细胞生长的细胞因子PEDF表达水平显著下调;进一步结合OSMRAHep以及Met△Hep模型,提示了肝细胞可能通过上调VEGFA以及下调PEDF来促进LSEC再生。
  5.体内注射VEGFA中和抗体以及PEDF因子,可以显著滞缓LSEC再生;
  6.肝细胞特异性敲除VEGFA(VEGFA△Hep)的小鼠肝切除术后,LSEC增殖滞后;而它在LSEC、Kupffer以及HSC内的敲除不影响肝体比恢复速率以及LSEC再生;肝细胞过表达PEDF(PEDFHep)小鼠肝切除术后LSEC增殖滞后;以上实验证实了肝细胞可通过上调VEGFA以及下调PEDF来促进LSEC再生;
  7.结合内皮前体细胞分析显示,肝再生过程中,肝细胞可通过上调VEGFA及下调PEDF,促进骨髓中CD133阳性的内皮前体细胞动员、定植入肝,分化形成LSEC过程。
  结论:
  我们的研究发现了肝再生过程中肝细胞可启动LSEC再生,深入探讨了肝细胞调控LSEC再生的方式,揭示了肝细胞影响骨髓CD133阳性内皮前体细胞分化形成LSEC的机理。肝再生早期伴随着肝细胞的快速增殖,肝细胞通过上调VEGFA同时下调PEDF(PHx后第2-3天),促进LSEC的快速增殖;同时还促进骨髓中CD133阳性的内皮前体细胞,进入血液中(PHx后第2-3天),定植肝内(PHx后第2-4天),分化形成LSEC(PHx后第4-7天)。LSEC的部分再生过程依赖于骨髓内皮前体细胞定植分化,本研究结果解释了为什么VEGFA和PEDF在肝细胞内变化高峰(PHx后第2-3天)与内皮细胞增殖高峰(PHx后第4-5天)存在2-3天的时间差。
  第二部分 靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂在肝癌防治中的不同作用
  目的:
  肝脏具有的独特快速再生能力,可避免在急/慢性损伤或肝细胞死亡后对肝脏正常功能的影响。然而,在慢性损伤的情况下,驱动肝脏再生的分子机制是导致肝细胞癌变的主要危险因素,这也解释了肝细胞癌的发生通常伴有慢性肝病的基础,如肝硬化和慢性肝炎。伴随着肝脏的损伤存在着持续的肝脏再生,其中,细胞积累活性氧簇与抗氧化调控失衡是导致致癌突变引发肝癌的主要原因之一。长久以来,人们普遍认为抗氧化剂能够中和活性氧(ROS)来减少氧化应激产生的损伤,因此认为抗氧化剂具有一定的预防和辅助治疗肿瘤的作用。然而越来越多的随机对照实验以及基础研究表明结果与此相反,即抗氧化剂对肿瘤不但没有防治作用,甚至某些特殊情况下还会增加肿瘤罹患的风险;这进一步说明了抗氧化剂在肿瘤预防中的双重作用,而且抗氧化剂对不同种类的肿瘤作用也不同。此外,循证医学提示抗氧化剂的种类也是会影响肿瘤预防的效果。总体而言,为了合理地使用抗氧化剂,需要区分肿瘤类型以及抗氧化剂的种类。然而,使用不同种类的抗氧化剂对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生的结局仍然未知。本文综合国内外有关抗氧化剂在肿瘤预防和治疗中的应用和进展,研究了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向型抗氧化剂在肝癌防治中的作用,分析了这两类抗氧化剂促进或抑制肿瘤的具体机制,并提出抗氧化剂的类型是影响其用于肝癌防治不同效应的重要因素,从而为抗氧化剂在肝癌防治中的合理应用提供了理论依据。
  方案:
  1.建立DEN和DEN联合CCl4诱导的两种肝癌模型,给予靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向型抗氧化剂,研究两类抗氧化剂对HCC形成的影响;
  2.检测给予不同种类抗氧化剂后,肝细胞内总ROS和线粒体内ROS的变化情况,以明确这两类抗氧化剂的作用部位;
  3.转录本测序分析抗氧化剂处理后肝脏样本基因转录水平的变化;
  4.根据芯片数据探讨抗氧化剂对肝细胞DNA损伤的影响和作用机制。
  5.检测给予不同种类抗氧化剂后,DNA损伤,损伤反应相关蛋白以及修复相关蛋白在两组之间的变化情况,明确调控机理;
  6.探讨改变ATM/ATR活性对不同类型抗氧化剂防治HCC形成过程的影响。
  结果:
  1.靶向线粒体型抗氧化剂(SS-31、Mito-Q)促进HCC的形成,非靶向线粒体型抗氧化剂(NAC、Trolox)抑制HCC的形成;
  2.非靶向线粒体型抗氧化剂降低了细胞内总的ROS;相比而言,靶向线粒体型抗氧化剂除降低细胞内总的ROS外,还特异性降低了线粒体内的ROS;
  3.转录本测序数据提示靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂对肝细胞内氧化还原状态的影响不同,多条信号通路分析提示它们对DNA损伤反应的影响不同;
  4.体内外实验证实靶向线粒体型抗氧化剂促进了肝细胞中DNA损伤,非靶向线粒体型抗氧化剂则抑制了该损伤;
  5.升高SS-31降低线粒体内ROS,可以抑制SS-31所导致的DNA损伤;
  6.靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂对肝细胞内DNA损伤反应以及DNA修复相关蛋白影响不同;
  7.靶向线粒体型抗氧化剂抑制ATM/ATR及其下游信号通路,促进ATM在线粒体内富集,并减少核内ATM分布;而非靶向线粒体型抗氧化剂进一步活化该通路,促进ATM核内富集,减少线粒体内ATM分布;
  8.改变ATM/ATR活性可逆转不同类型抗氧化剂对HCC的防治效果。
  结论:
  本研究发现了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向线粒体型抗氧化剂对化学诱发肝癌的不同防治效果;揭示了非靶向线粒体型抗氧化剂NAC和Trolox可促进原代肝细胞中DEN损伤的DNA修复过程,减缓了HCC形成;而靶向线粒体型抗氧化剂SS-31和Mito-Q则抑制了DNA修复,促进了HCC;阐述了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向线粒体型抗氧化剂在HCC防治中的不同作用与线粒体内ROS和非线粒体内ROS在HCC形成中的不同作用有关,线粒体内外ROS的失衡可能诱导了DNA损伤进而促进了HCC形成。
[博士论文] 塔娜
病理学与病理生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  胰腺癌是一种较为常见的高度恶性的消化系统肿瘤,其五年生存率不足5%,中位生存期小于6个月。胰腺癌最常见的组织学类型为胰腺导管腺癌(PDAC),约占所有胰腺癌病例的85%-90%。患者死亡率高、预后差的主要原因是该疾病早期缺乏特异性临床症状和诊断及预后相关的分子标志物,大部分患者在诊断时肿瘤已发生转移,从而失去了手术机会,而且该肿瘤对放、化疗反应性差,极易复发转移。近年来,随着医学的发展,人类大多数恶性肿瘤患者的生存期有了显著增加,但胰腺癌患者的生存期并无明显改善,因此胰腺癌早期诊断及治疗成为亟待解决的问题。研究显示,胰腺上皮内瘤变(PanIN),尤其是高级别上皮内瘤变(PanIN-3),是胰腺导管腺癌最常见的非侵袭性癌前病变。早期诊断和手术切除可将胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6%提高到Ⅰ期的50%左右。若能找到胰腺癌特异性的分子标志物并在癌前病变阶段对该疾病进行诊断或有针对性的对胰腺癌高危人群进行筛查,胰腺癌患者的生存状况将会得到大大改善。此外,胰腺癌的发生发展涉及多种癌基因、抑癌基因以及表观遗传学等改变,探索胰腺癌的发病机制,将为胰腺癌诊断治疗提供新的思路。
  MicroRNA(miRNA)是一组内源性的非编码的单链小RNA分子,长度为19-24个核苷酸,主要通过与其靶标mRNA的3'UTR区域互补结合,导致mRNA的降解或翻译的抑制,在转录后水平调节30%的蛋白质编码基因的表达而发挥作用。一个miRNA可能对应多个靶点,同时,多个miRNA也可能作用于同一个靶点。miRNA的异常表达与多种肿瘤发生发展的重要过程息息相关,例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。目前研究表明,miR-21,miR-155,miR-196a和miR-210在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用,或可作为胰腺癌潜在的分子标记物。然而多种研究中特异性miRNAs的一致性较差,应用中其敏感性和特异性仍有待提高。因此,本研究主要致力于发现更有优势的胰腺癌尤其是PanIN-3特异性的miRNAs并探索其作用机制,为胰腺癌的诊断、治疗和预后判断提供新的切入点。
  目的:
  筛查PanIN-3及胰腺癌组织中异常表达的miRNAs,并在胰腺癌组织和外周血浆中进行验证,研究其对胰腺癌生物学特性的影响,并分析其相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性,再通过生物信息学方法寻找并鉴定其下游作用的靶基因,进一步探寻其作用机制。
  方法:
  1.利用miRNA芯片技术筛查PanIN-3及胰腺癌组织中较胰腺正常导管及低级别上皮内瘤变组织中显著差异表达的miRNAs。
  2.利用原位杂交和实时荧光定量PCR技术,在胰腺癌患者石蜡包埋组织和外周血浆中进一步验证上述miRNAs的表达情况,获得可能作为诊断标志物的候选miRNAs,并分析其诊断效能。
  3.结合胰腺癌患者临床病理资料,分析候选miR-1290的相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性。
  4.通过细胞学实验:观察miR-1290对胰腺癌细胞株生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性的影响。
  5.通过动物实验:研究miR-1290对胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生物学特性的影响。
  6.利用生物信息学(MiRDB,Targetscan,MiRanda)分析技术,预测miR-1290可能的下游靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统分析其与miR-1290的关系,并进一步验证其对胰腺癌生物学行为的影响。
  7.利用实时荧光定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学技术,分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌旁正常组织中的表达情况,探讨其临床意义。
  结果:
  1.miRNA芯片结果显示:与正常胰腺导管上皮和低级别上皮内瘤变相比,PanIN-3和胰腺癌中表达明显上调或者下调(超过5倍)的miRNAs有30余种,结合文献,筛选出其中的19条作为候选miRNAs。其中上调的主要有miR-31-5p,miR-29a-5p,miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,miR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p,miR-29a-3p,miR-34a-3p,miR-155;下调的主要有miR-105-3p,miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。
  2.原位杂交结果显示:以“PanIN-3和癌组织中表达明显高于正常导管上皮和低级别上皮内瘤变(PanIN-1和PanIN-2)”作为判定标准,筛选出高表达的miRNAs共计6条,包括miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p以及miR-155。
  3.血浆实时荧光定量PCR验证结果显示:胰腺癌患者外周血浆中,miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表达均明显增高,差异具有统计学意义。绘制ROC曲线比较其诊断效能,miR-31-5p和miR-1290具有相对较好的诊断效能,AUC分别为0.848和0.829。
  4.组织实时荧光定量PCR验证结果显示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺导管腺癌组织中高表达,癌旁正常组织低表达,与外周血浆结果相一致,提示miR-31及miR-1290可能是参与高级别上皮内瘤变向胰腺癌转变这一过程的早期分子,具有成为胰腺癌早期诊断分子标志物的潜能。结合患者的临床病理资料进一步发现miR-1290高表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移密切相关(p<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。提示miR-1290可能参与肿瘤的侵袭转移。
  5.miR-1290对胰腺癌细胞株生物学特性的影响:(1)检测五株胰腺癌细胞株中miR-1290的表达量,发现其在AsPC-1中表达最低,在PANC-1中表达最高,选取这两株细胞分别进行过表达和抑制实验。(2)验证转染效果:转染miR-1290Agomir的细胞系中,miR-1290被成功过表达,转染miR-1290Antagomir的细胞系中,miR-1290被成功抑制。(3)平板克隆实验结果显示,过表达miR-1290可显著促进细胞增殖和集落形成(p<0.05)。(4)细胞增殖活性实验结果显示,miR-1290过表达,细胞增殖速度加快,24小时活细胞数量明显高于对照组(p<0.05);miR-1290抑制后,细胞增殖速度减慢,24小时活细胞数量明显少于对照组(p<0.05)。(5)细胞迁移及侵袭实验结果显示,过表达miR-1290可促进胰腺癌细胞迁移和侵袭(p<0.05);抑制miR-1290,细胞迁移和侵袭能力显著下降(p<0.05)。与细胞划痕实验趋势一致。(6)凋亡实验结果显示,过表达或抑制miR-1290对细胞凋亡无明显影响(p>0.05)。
  6.裸鼠皮下荷瘤实验结果显示:过表达miR-1290可增加胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积更大(p<0.05);抑制miR-1290可减弱胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积减小(p<0.05)。
  7.生物信息学结果显示,IKKα可能为miR-1290的靶基因之一。
  9.IKKα对胰腺癌细胞功能学实验结果显示:(1)抑制IKKα在胰腺癌细胞系中的表达,可促进其增殖、迁移和侵袭;(2)过表达IKKα,可逆转miR-1290对胰腺癌细胞系促增殖、迁移和侵袭的作用;(3)改变胰腺癌细胞系中miR-1290及IKKα的表达量,NF-κB信号通路相关的蛋白IKBα、P65和P50表达无明显变化。
  结论:
  1.通过miRNA芯片、原位杂交以及组织和血浆中差异性表达miRNAs的筛查,6条miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表达升高。
  2.胰腺癌组织中差异性表达的miRNAs与胰腺癌患者血浆中差异性表达的miRNAs具有一致性,提示血浆中miRNAs有望成为胰腺癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。
  3.miR-1290在胰腺癌组织及胰腺癌患者外周血浆中表达均显著升高,且其表达水平与胰腺癌患者肿瘤分化程度及淋巴结转移相关,提示miR-1290可能成为胰腺癌诊断及预后判断的分子标志物。
  4.miR-1290可通过促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及成瘤能力,参与胰腺癌生物学行为的调控,其在胰腺癌发生发展中可能起着癌基因的作用。
  5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一,其可直接被miR-1290抑制(结合位点为3'端843-849处),促进胰腺癌的增殖、迁移和侵袭,提示miR-1290及其靶基因IKKα可能成为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。
  6.IKKα作为miR-1290靶基因之一参与胰腺癌发生发展,可能通过非NF-κB依赖的信号通路发挥作用。
[硕士论文] 陈泉
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分:不同强度的有氧运动对DEN诱导的小鼠肝癌形成的影响
  目的:以有氧运动作为干预方式,设定12米/分钟和18米/分钟的速度对DEN诱导小鼠进行干预,观察小鼠一般状态,检测肝肾功能等相关指标以及肝癌成瘤率和小鼠死亡率,明确有氧运动对于DEN诱导小鼠的死亡率及肝癌成瘤率的影响,为有氧运动抑制肝癌形成提供实验依据。
  方法:通过DEN灌胃诱导小鼠肝癌模型,并对各组小鼠实施不同强度的运动干预,观察小鼠肝功能、肾功能、死亡率、肝癌发生率的不同变化。
  结果:1.相较于空白组,DEN组ALT、AST均升高,差异具有统计学意义(ALT:40.40±5.63VS110.70±7.08;AST:140.90±21.89VS677.00±77.47;P<0.01);相较于DEN组,DEN+中速组、DEN+高速组小鼠ALT、AST显著降低,且差异具有统计学意义(ALT:110.70±7.08VS64.11±7.27;110.70±7.08VS61.13±6.62;AST:677.00±77.47VS208.50±43.45;677.00±77.47VS198.9±45.69;P<0.01)。2.相较于空白组,DEN组的BUN、UA显著增高,差异均有统计学意义(BUN:3.055±0.798VS9.875±1.089;UA:114.40±29.54VS317.30±43.26;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠UA均降低,且差异具有统计学意义(317.30±43.26VS192.0±38.59;317.30±43.26VS199.9±40.39;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠BUN无明显差异(P>0.05)。3.空白组、DEN组、DEN+中速组、DEN+高速组小鼠,死亡率均无统计学差异。4.与空白组相比,DEN组小鼠肝癌发生率显著增高,差异具有统计学差异(0%VS94.73%;P<0.05);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠肝癌发生率显著降低,且差异具有统计学意义(94.73%VS66.67%;94.73%VS56.25%;P<0.05)。
  结论:有氧运动对于DEN诱导肝癌小鼠的一般状态有明显改善作用,有氧运动能够降低DEN诱导小鼠的肝癌发生率。
  第二部分:有氧运动对DEN诱导的模型小鼠铁代谢的影响
  目的:通过观察各组小鼠铁代谢相关指标的差别,证明有氧运动、铁代谢及肝癌形成三者之间的相关性,以观察有氧运动是否是通过影响铁代谢从而抑制DEN诱导的模型小鼠肝癌的发生。
  方法:在第一部分实验基础上,分别检测各组小鼠血清、肌肉组织和肝脏组织中铁、Ferritin和Hepcidin,并观察肌细胞膜上TfR1、TfR2和FPN1的表达差异,以证实有氧运动是否是通过促进铁代谢从而抑制DEN模型小鼠肝癌的发生。
  结果:1、与空白组相比,DEN组小鼠血清Fe含量明显升高差异有统计学意义(23.71±9.895VS54.86±5.383;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠血清Fe含量显著降低,且差异具有统计学意义(54.86±5.383VS29.31±9.997)。与空白组相比,DEN组小鼠血清Ferritin含量明显升高,差异具有统计学意义(1944±439.6VS3799±685.5;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠血清Ferritin含量显著降低,且差异有统计学意义(3799±685.5VS2318±555.4;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠血清Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(239.2±16.90VS318.1±28.80;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组血清Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(318.1±28.80VS512.7±26.35;P<0.01)。2、与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织铁含量明显降低,差异有统计学意义(3.117±0.325VS2.876±0.232;P<0.05);与DEN组比DEN+中速组小鼠肌肉组织铁含量显著提高,且差异有统计学意义(2.876±0.232VS4.199±0.313;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织Ferritin含量显著增高(13.32±0.909VS17.34±1.416;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组肌肉组织Ferritin含量显著降低,差异有统计学意义(17.34±1.416VS11.01±1.330;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织Hepcidin含量无显著改变;与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肌肉组织Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(48.83±3.409VS81.67±7.090;P<0.01)。3、与空白组相比,DEN组小鼠肝脏组织Fe含量显著升高,且差异具有统计学意义(5.007±0.738VS8.118±0.865;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肝脏组织Fe显著降低,差异有统计学意义(8.118±0.865VS4.997±0.589;P<0.01)。与空白组相比DEN组小鼠肝脏组织Ferritin含量显著增高(28.79±4.093VS41.89±3.069;P<0.01);与DEN组相比DEN+中速组肝脏组织Ferritin含量显著降低,差异有统计学意义(41.89±3.069VS26.71±4.567;P<0.01);与空白组相比,DEN组肝脏组织Hepcidin含量无明显差异;与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肝脏组织Hepcidin含量显著增高,差异有统计学意义(4.492±0.776VS10.290±0.867;P<0.01)。
  结论:有氧运动通过增加运动过程中肌肉组织对铁的摄入,升高体内Hepcidin的水平,降低血清Fe和体内Ferritin的水平,这可能与运动抑制小鼠肝癌的发生存在相关性。
[硕士论文] 韦荣强
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1、归纳En-bloc胰十二指肠切除术的手术策略和具体操作步骤,指导临床实践;
  2、探究En-bloc胰十二指肠切除术的可行性、安全性以及疗效。
  方法:
  1、结合胰十二指肠切除术主刀医师的指导、手术录像资料及相关文献回顾,对En-bloc手术策略和具体操作步骤进行归纳。
  2、回顾性分析2013年1月~2016年6月海军军医大学附属长海医院和长征医院胰腺外科邵成浩团队收治的139例行胰十二指肠切除并且术后病理证实为胰腺导管腺癌的病人的临床资料,其中2013年1月至2014年6月共70例病例行传统胰十二指肠切除术(Traditional Pancreatoduodenectomy,TPD),2014年7月至2016年6月共69例病例行En-bloc胰十二指肠切除术(En-bloc Pancreatoduodenectomy,En-PD),分别设为TPD组和En-PD组。观察指标包括:1)手术时间、术中出血量、肿瘤最大直径、切缘状态、TNM分期等;2)术后主要并发症发生率(胰瘘、术后出血、乳糜漏、腹腔感染、胃排空延迟等)、围手术期死亡率、术后平均住院时间、局部复发转移率、中位生存时间、总生存时间等。
  3、本研究拟对En-PD切除病例资料进行回顾性分析,观察临床疗效与预后,并与传统胰十二指肠切除术(TPD)病例资料相比较,探讨En-bloc手术策略的安全性、可行性及临床应用价值。
  结果:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除,其手术时间、术中出血量均高于TPD组(P值分别为0.017,0.016);En-PD组和TPD组术后平均住院时间、术后并发症发生率及死亡率差异无统计学意义(P值分别为0.592,0.810,1.000)。
  2、En-PD组和TPD组中,可能切除病例数分别是16例(23.2%)和14例(20.0%),均行联合PV/SMV整块切除重建术,差异无统计学意义(P=0.648)。两组术后R0切除率分别是91.3%和94.3%,淋巴结阳性率分别是44.9%和41.4%,差异均无统计学意义(P=0.532,P=0.677);但En-PD组平均淋巴结切除数目(13.58±11.19枚)多于TPD组(5.79±3.12枚),统计学差异明显(P<0.001)。
  3、En-PD组和TPD组术后局部复发转移率分别为29.0%、45.7%,有统计学差异(P=0.042)。En-PD组术后中位生存期为19.8个月,1年生存率和2年生存率分别为75.5%和21.7%;而TPD组术后中位生存期为20.9个月,1年生存率和2年生存率分别为72.9%和24.3%。两组生存期差异无统计学意义(P=0.061)。
  结论:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除术在临床实践中安全、可行,但是建议在经验丰富的胰腺外科中心开展,尤其是对可能切除胰腺癌需行联合血管整块切除重建的病例。
  2、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术术后局部复发转移率低。
  3、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术具有更高的淋巴结切除数目,有利于对转移淋巴结的清扫。
  4、En-bloc切除策略胰十二指肠切除术后总体短期疗效满意。
[硕士论文] 蒋亚波
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  信号转导与转录激活因子5(Signal Transducer and Activator Of Transcription5,STAT5)在人体内有着广泛的生理病理功能。STAT5能被多种细胞因子(cytokines)如催乳激素(prolactin,Prl)、红细胞生长素(erythropoietin)、生长激素(growth hormone,GH)和上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等激活并能反馈的调控多种细胞因子。在肝脏中,有研究发现GH-STAT5信号通路在控制脂代谢途径上发挥着重要的作用:肝脏特异性敲除STAT5后,增加了CD36和PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)的表达,导致实验小鼠出现明显的脂肪肝、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗和肝脏再生能力受损。此外STAT5在肝脏的缺失,还会引起TGF-β和STAT3的表达增加,加速了肝脏的纤维化和肿瘤的形成。另外,肝特异性的敲除STAT5A后,调控了NOX4(reactive oxygen species(ROS)-generating enzyme NOX4)的表达,导致凋亡蛋白PUMA和BIM的表达下降,从而促进了肝癌细胞增殖。
  STAT5包含了STAT5A和STAT5B两个亚型,二个亚型均由人类17号染色体上衔接的连锁基因所编码,并在DNA结构上有95%的相似性,但是由于蛋白结构上的反式激活区域存在着一定的差异,STAT5A和STAT5B在生理病理过程中都有着特异的生物学功能。本课题旨在探究STAT5A亚型在肝癌进展中的作用,尤其是对肝癌糖代谢的影响。同时,希望能从抑制糖代谢的角度寻找新的潜在的治疗靶点。
  研究方法:
  首先,利用病人组织芯片,分析并明确STATSA在肝癌病人肿瘤组织中的表达情况。Kaplan-Meier方法分析STAT5A的表达与预后的关系以及进行多因素的生存分析。在生物学功能方面,首先构建STAT5A过表达的稳转Huh7肝癌细胞系,利用CCK8、流式分析及裸鼠皮下荷瘤实验探索STAT5A对于肝癌细胞增殖和细胞周期的影响。然后,利用Kit检测STAT5A的表达对于细胞葡萄糖消耗,乳酸代谢的影响。更进一步凭借GC-MS技术,具体的分析糖酵解和TCA循环上各代谢产物的变化。在机制方面,利用q-PCR技术和Wectern blot技术分析验证STAT5A可能的作用通路以及作用的糖代谢靶点。
  研究结果:
  (一)STAT5A的表达与患者预后的关系
  1.根据148例病人的组织芯片结果分析发现,与配对癌旁组织相比,STAT5A在肝癌肿瘤组织中的表达明显降低。用Kaplan-Meier生存分析方法分析发现,肿瘤中STAT5A低表达组OS较高表达组明显降低。多因素生存分析也有类似的结果:STAT5A的表达与是否有包膜、AFP的表达和肿瘤大小可以作为影响RFS和OS的独立风险因素。
  (二)STAT5A在体内外对肝癌细胞增殖能力、细胞周期的影响
  1.检测STAT5A在常用肝癌细胞系中的表达,挑选Huh7构建了稳转的过表达细胞系,而敲除STAT5A的细胞系则用相对应的siRNA,并用WB对STAT5A的表达进行验证。
  2.CCK8增殖实验发现,过表达STAT5A后肝癌细胞的增殖明显被抑制,而敲除STATSA之后细胞的增殖能力明显增强。裸鼠皮下荷瘤实验也证实了STAT5A能抑制肝癌细胞的增殖。流式技术分析还发现,STAT5A过表达可以抑制肝癌细胞的周期进展,使肝癌细胞更多的停滞在G0/G1期,减少了细胞的有丝分裂。
  3.关于糖代谢方面,首先利用相关kit检测培养基葡萄糖和乳酸,发现STAT5A过表达可以明显的减少肝癌细胞葡萄糖的消耗和乳酸的产生。进一步的针对具体代谢产物的分析提示,STAT5A过表达可以降低糖酵解和TCA循环上的主要产物。
  (三)STAT5A机制探究
  1.在通路方面,发现STAT5A可以明显的调控AKT的磷酸化,而反过来抑制AKT之后STAT5A的磷酸化也会增加。配对病人的组织芯片结果也证实,STAT5A的表达与p-AKT的表达呈负性相关。
  2.利用knock-down和过表达的细胞进行qPCR检测发现STAT5A在转录水平能影响多种基因的表达,在病人组织的RNA水平上也有类似的结果。进一步的WB实验发现,STAT5A会明显的影响HK2的蛋白水平的表达。加入AKT抑制剂之后能逆转HK1的蛋白表达证实,AKT通路在STAT5A-HK2的调控过程中有着重要的作用。
  3.发现了miRNA-23a可以负调控STAT5A的表达。
  4.此外,还证实了,STAT5A对另一个重要的转录因子HNF4α有着明显的正调控,并且,HNF4α可以直接作用于PI3K。
  研究结论:
  本课题首先明确了STAT5A在肝癌患者肿瘤组织中低表达,并且低表达组预后较差。接着在细胞学以及动物水平上验证了STAT5A能明显抑制细胞的增殖和细胞周期的进展,发挥着重要的抑癌作用。关于糖代谢方面,发现STAT5A的过表达可以明显的抑制糖酵解过程和TCA循环,从能量的角度抑制肿瘤的进展。在机制方面,验证了STAT5A与p-AKT的关系,并且确定了下游糖代谢的关键基因HK2。此外,还发现了可以调控STAT5A的miRNA-23a以及STATSA-HNF4α-PI3K-AKT信号通路,但具体的机制尚不清楚,仍需进一步研究。
[硕士论文] 罗旭
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝炎-肝硬化-肝癌被认为是肝癌发生过程中“三部曲”。临床大量资料显示,大多数肝癌患者有肝纤维化或肝硬化背景,且伴肝硬化背景的肝癌患者中位生存期下降,肝窦内压力增加及肝硬化促进肝癌进展。研究发现肝脏硬度可作为肝癌发生的独立危险因素,患者肝纤维化程度越重,肝癌肝内转移率也越高,说明肝纤维化与肝癌细胞增殖及侵袭转移间也存在非常重要的关系。门脉高压时,肝窦内压力大幅增加,肝窦显著扩张,肝细胞受到了肝窦压力和肝窦扩张后的张应变力等生物力学因素直接或间接的作用。但是,肝纤维化所致张应变力的变化对肝癌细胞的影响及其相关机制,如牵涉到的MicroRNAs(miRNAs)等未见报道。众所周知,miRNA是一种长21~23核苷酸的非编码RNA分子,在调控细胞增殖、分化和凋亡中起着重要的作用。一些研究发现miRNAs同时与张应变力和肝癌均有关系。所以本研究运用流式细胞术及cck-8,Brdu等方法测定张应变力对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响。使用Agilent单色标记芯片实验筛选差异表达MicroRNAs,再使用RT-PCR证实。并运用GO和Pathway分析基因。为肝癌力学微环境是如何影响肝癌细胞的行为提供有用的信息。
  方法:
  一、肝癌细胞最适张应变力加载条件的确定
  周期性张应变加载细胞主要有三个参数:张应变幅度、张应变频率和张应变时间。通过固定其中两个参数,变化另一个参数以观察此参数下的张应变对肝癌HepG2细胞的影响(除此三个参数外其余实验条件均相同)。
  (一)细胞牵拉力加载方法
  采用Flexcell FX4000T张应变力加载装置进行张应变力加载。方法是将体外培养的人肝癌细胞系HepG2细胞用不含PBS的DMEM培养基同步化24h后接种在鼠尾胶原包被后的Flexcell六孔板上,细胞贴壁后把六孔板置于培养箱内的BioFlex Culture Plate底座上,首先开启真空泵和桥接器,然后在相连电脑上启动Flexercell Strain中央控制器,根据需要设定张应变力参数进行张应变力加载。
  (二)最适张应变力加载条件的确定
  把实验分为三组:1.张应变时间组:固定频率1Hz、张应变幅度15%,设立张应变时间分别为2h、6h、12h、24h、48h共5个实验组,另设不加载张应变组为对照组。2张应变频率组:固定张应变幅度15%、时间24h,设立张应变频率分别为0.5Hz、1Hz共2个实验组,另设不加载张应变组为对照组。3.张应变幅度组:固定张应变时间24h、张应变频率1Hz,设立张应变幅度分别为5%、15%共2个实验组,另设不加载张应变组为对照组。张应变力加载结束后,以标准程序用流式细胞仪检测,评价不同张应变力加载条件对细胞增殖的影响,确定最适张应变条件。
  二、张应变力加载对肝癌细胞增殖活性的影响
  将同步化24h的HepG2细胞同样在Flexcell FX4000T张应变力装置进行张应变力加载,另设无张应变力加载组为对照组。使用BrdU法和CCK-8法验证上步确定的肝癌细胞最适张应变力加载条件对HepG2细胞增殖能力的影响。
  三、肝癌细胞张应变力加载后差异表达MicroRNAs的筛选
  (一)差异miRNAs的筛选
  采用上海欧易生物医学科技有限公司的Agilent Human miRNA芯片。样品总RNA使用Trizol法提取后,参照其公司芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。采用Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件进行quantile标准化和后续处理。利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>=2.0且P值<=0.05。
  (二)筛选出的差异miRNAs的验证
  采用Trizol法提取实验各组HepG2细胞的总RNA,紫外检测仪分别在260nm和280nm波长下检测RNA的浓度及纯度。用逆转录试剂盒(Thermo Fisher)合成cDNA,以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增。实验同步以U6作为内参照。mRNA表达量的分析采用比较Ct数据法(2-△△Ct)进行。验证筛选出的差异miRNAs是否准确。
  四、张应变力调节肝癌细胞增殖功能的生物信息学分析
  利用3个数据库(Targetscan,microRNAorg,PITA)共同对差异miRNA进行靶基因预测,接着对预测出的靶基因进行GO分析和KEGG富集分析,以判定差异miRNA主要影响的生物学功能或者通路。最后,对差异miRNA进行非监督层次聚类,利用热图的形式展示差异miRNA在不同样本间的表达模式。探索其影响肝癌细胞功能的可能生物学过程。
  结果:
  一、肝癌细胞最适张应变力加载条件的确定
  摸索出使用Ⅰ型鼠尾胶原包被BioFlex六孔板使HepG2细胞稳定贴壁生长的方法,选定张应变幅度15%、频率1Hz、时间24h为后续实验条件。
  二、张应变力加载对肝癌细胞增殖活性的影响
  BrdU法与CCK-8法结果均显示与control组相比,张应变幅度15%、频率1Hz、24h的张应变力加载促进了细胞增殖和代谢活力,结果具有统计学意义(P<0.0001)。
  三、肝癌细胞张应变力加载后差异表达MicroRNAs的筛选
  (一)差异miRNAs的筛选
  使用张应变力加载条件:幅度15%,频率1Hz加载HepG2细胞24h后,使用miRNA芯片实验筛选差异表达miRNAs,共检出2557个miRNA,其中7个差异较大(表达差异>2倍,且P<0.05)miRNA,分别是hsa-miR-296-5p、hsa-miR-6752-5p、hsa-miR-6794-5p、hsa-miR-6889-5p、hsa-miR-7845-5p(上调),hsa-miR-4428、hsa-miR-503-5p(下调)。
  (二)筛选出的差异miRNAs的验证
  使用RT-PCR实验验证筛选出的7个差异表达miRNA,结果显示qRT-PCR检测到的7种miRNAs变化趋势与miRNA芯片结果一致。
  四、张应变力调节肝癌细胞功能的生物信息学分析
  利用生物信息学对7种差异miRNAs的潜在靶基因进行了搜索,数据库miRNAorg、PITA和TargetScan分别预测了2306、1277和16205个靶基因,取3个数据库的交集,共224个目标基因,其中SMAD7和SP1值得关注。为了解这些目标基因的生物学特性,GO分析结果显示目标基因的生物学功能集中在:细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物,微管细胞骨架,蛋白激酶,RNA聚合酶Ⅱ活性,DNA模板转录的正调控,骨骼肌组织发展的正调控,血管形成等一系列生物学功能上。KEGG Pathway分析发现52个显著的通路,包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、内分泌抵抗等疾病相关通路和TGF-β,MAPK,PI3K-Akt,FoxO,Ras等信号通路。
  结论:
  一、使用Ⅰ型鼠尾胶原包被BioFlex六孔板可以使HepG2细胞稳定贴壁生长,张应变力加载能促进人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖,特别是在牵拉幅度为15%,牵拉频率为1Hz,牵拉时间为24小时的牵拉条件下促进效果最显著。
  二、使用最适条件加载后的HepG2细胞miRNAs表达产生明显变化,筛选出7个差异较大的miRNA和224个目标基因,其中SMAD7和SP1值得后续进行探索相关功能和机制。
  三、GO和KEGG分析显示目标基因的生物学功能集中在与多种癌症相关的功能上,也包括TGF-β、MAPK、PI3K-Akt等与各种癌症关系密切的信号通路上。待验证的可能机制为张应变力相应的hsa-miR-503-5p调节SMAD7基因与TGF-β信号通路。
[博士论文] 鲍蕾蕾
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,基因组测序技术的快速发展,加深了人们对肿瘤异质性的认识,含有大量肿瘤临床样本多组学数据库的TCGA及Oncomine分析平台为肿瘤个体差异的基因分型、治疗与生存期的整合研究提供了大样本数据库,受到国内外学者的广泛关注,并越来越多地运用到肿瘤的个体化精准治疗的研究中来。
  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一,现已成为中国第二世界第三位的癌症死亡原因。中国为肝癌高发病率国家,手术切除被认为是可能治愈初诊HCC患者的疗法,但只有约10%~20%的患者肿瘤可切除,且手术病人面临肿瘤复发的可能,最近的统计发现2000年至2014年间中国肝癌患者5年生存率仅为14.1%。
  近年来针对肝癌靶向治疗药物的研发逐渐成为热点,但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突变参与了肝细胞癌的发生发展,而其精确的分子机制尚不完全清楚,导致靶向制剂对肿瘤患者个体的治疗效果差异大,药物靶向性较低。目前,作为首个美国FDA批准上市,用于晚期HCC靶向治疗的多激酶抑制剂索拉菲尼,其有效率也仅为25%。
  1995年Lever在The Lancet杂志发表一项大型开创性回顾研究,发现服用血管紧张素酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEIs)和血管紧张素受体抑制剂(angotensin recepter blockers,ARBs)的病人比未服用该类药物的病人患乳腺癌和肺癌的风险更低。随后另一部分的学者进行相关研究却未得到类似结果。这个不同的研究结果引起众多学者的关注,在这些研究中除了入选患者种族、人群及服药周期等不同因素外,由于受到基因测序技术的限制,大部分的患者未做个体基因表达谱测定,导致患者个体基因差异未做考虑。在后续的研究中发现,在肾素血管紧张素系统中一个关键受体AT1R(type-1angiotensinⅡ)其编码的基因AGTR1在多个肿瘤中发生异质性表达,并且高表达该基因会引起多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良预后,但是AGTR1基因在肝细胞癌中的表达及对肝癌的影响却少有报道。对TCGA数据库中全部3个肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据的AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用的基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。
  第一部分 AGTR1差异表达对肝细胞癌发展的影响
  选用Oncomine数据库中全部3个肝细胞癌的临床347例RNA芯片数据,发现AGTR1基因在这3个数据集中均位于过表达基因前5%,并在部分肝细胞癌患者中出现高表达。同时在TCGA数据库中对全部374例的肝细胞癌临床样本进行差异分析,发现AGTR1表达前80位和后80位的样本AGTR1的相对表达具有显著差异,进一步结合数据库中肝细胞癌样本预后数据,采用Kaplan-Meier生存分析,发现低表达组患者的生存期较高表达组显著延长。以上结果说明,AGTR1在部分肝细胞癌患者中呈高表达,且这种高表达与患者的生存期相关,由此初步推断AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用。为了证明AGTR1基因在肝细胞癌发生、发展及转移中的作用,筛选低表达AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404细胞,对它们进行过表达AGTR1的改造,同时选择高表达AGTR1的MHCC-97H细胞进行干扰表达的改造,体内外研究AGTR1对肝细胞癌的作用。结果发现AGTR1在体外实验中具有促进肿瘤细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移的作用,而在体内试验中能加速裸鼠皮下成瘤试验的肿瘤形成及生长。此外,采用含有luciferine片段的载体构建sh-AGTR1和sh-nc,稳筛低表达AGTR1的MHCC-97H细胞,采用小动物活体成像系统,在体观察不同AGTR1表达量的MHCC-97H细胞在脾脏肝转移模型中的转移情况,发现抑制AGTR1可以降低MHCC-97H肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。
  第二部分 AGTR1差异表达影响肝细胞癌生长的作用机制研究
  为了探讨AGTR1促进HCC细胞生长、转移作用机制,采用Westen Blot方法检测过表达和干扰表达AGTR1对HCC细胞信号通路的影响,发现过表达HCC细胞中的AGTR1可以促进JAK2、STAT3、ERK的磷酸化,抑制AGTR1则可以降低相应分子的磷酸化。且JAK2特异性抑制剂AG490可以抑制AGTR1介导的HCC细胞的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力。此外,先用TCGA数据库中374例肝细胞癌患者的mRNA芯片数据,对VEGF与AGTR1进行相关性分析,发现随着AGTR1的表达量的上升,VEGF与AGTR1表达相关性也随之上升。对低表达AGTR1的SMMC-7721,BEL-7404细胞过表达AGTR1,两个细胞内VEGF的表达也随着AGTR1的表达上升而上升。对高表达AGTR1的MHCC-97H细胞干扰表达AGTR1,VEGF的表达也随之下降,且因AGTR1的高表达或过表达引起的VEGFA的上调表达可以被AG490抑制。由此可以推断,AGTR1的高表达可能会促进细胞内JKA2的磷酸化,进而激活细胞质内STAT3、ERK等分子的磷酸化,这些磷酸化的分子可进入细胞核,启动VEGF等分子的转录、翻译、合成,促进细胞分泌VEGF等细胞因子,大量新分泌的VEGF与细胞表面的受体结合可能会进一步激活细胞内STAT3、MAPK等信号通路,促进肿瘤内新生血管的生成及细胞的增殖、迁移等生物学过程。
  第三部分 AGTR1抑制剂对HCC细胞体内外抗肿瘤作用效果研究
  本部分研究中选择临床应用时间最长、应用病例最多的洛沙坦作为靶向AGTR1的抑制剂考察其作用效果。在体外实验中,发现当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高表达的MHCC-97H细胞和AGTR1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,但对AGTR1低表达的SMMC-7721细胞和AGTR1干扰表达的MHCC-97H细胞则无上述作用。体内实验中,选用高表达AGTR1的MHCC-97H细胞,在裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药,相比空白对照组,20mg·Kg-1~80mg·Kg-1给药剂量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。免疫组化分析发现随着给药剂量的增加,瘤内AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表达水平显著下降,血清VEGFA量也随着洛沙坦的给药剂量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在体内外水平对AGTR1高表达HCC细胞生长及肿瘤血管形成的抑制作用。
  综上所述,本课题通过TCGA数据库中全部肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据,对AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用,在此基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。对6种不同的肝细胞癌细胞系(HepG2、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、MHCC97H、HLF)与正常肝细胞系(QSG-7701)进行AGTR1的mRNA及蛋白的表达检测,证实相比正常肝细胞系(QSG-7701),肝细胞癌细胞系MHCC97H、HLF中AGTR1mRNA和蛋白水平均有显著的上调表达,而在BEL-7404、SMMC-7721中AGTR1mRNA和蛋白水平的表达显著低于正常肝细胞的表达水平。通过验证临床肝癌样本中AGTR1的表达情况,显示33例肝细胞癌样本中有20例临床样本AGTR1呈上调表达或高表达。进一步通过体内外实验,发现过表达AGTR1后可促进HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,加速裸鼠皮下肿瘤形成及生长;而抑制AGTR1的表达可降低HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,并降低HCC肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。通过对AGTR1相关通路的分析,揭示AGTR1高/过表达HCC细胞主要通过JAK2/STAT3通路介导其生长、增殖、迁移及侵袭过程,同时验证了AGTR1靶向抑制剂的作用。在药效实验中,探讨以AGTR1靶向抑制剂洛沙坦对HCC细胞的作用效果,结果发现在体外试验中,当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高/过表达HCC细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。在体内实验的裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药(20mg·Kg-1~80mg·Kg-1),洛沙坦能显著抑制AGTR1高表达HCC细胞裸鼠皮下肿瘤的生长,降低肿瘤组织中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表达。由此证明了洛沙坦在体内外水平具有抑制AGTR1高表达HCC细胞生长的作用。研究结果明确了AGTR1在肝癌发生发展中的作用,探讨了AGTR1促进肝细胞癌细胞异常生长的可能机制,为AGTR1高表达肝细胞癌靶向治疗药物的发现及应用提供了实验数据。
[硕士论文] 伍睿
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  胆囊癌(Gallbladder Carcinoma,GBC)和胆管癌(Cholangiocarcinoma)同属胆道系统恶性肿瘤,其中胆管癌根据原发肿瘤起源于胆管树上皮位置的不同,分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝外胆管癌(Extrahepatic Cholangiocarcinoma,EHC),肝外胆管癌又可再细分为肝门部胆管癌(Hilar Cholangiocarcinoma,HCCA)和远端胆管癌(Distal Cholangiocarcinoma,DCCA)。胆道肿瘤恶性程度高,转移侵袭性强,易复发,预后差。迄今为止,手术根治切除仍然是获得较好预后的唯一方法。通常术前依靠肿瘤标志物结合影像学检查结果对手术可行性进行评估并制定手术方案,但由于胆道肿瘤位置特殊周围结构复杂、易于侵犯周围肝脏和大血管,局部扩散和淋巴结转移等情况在术前评估中往往不易被发现,最终影响手术过程和效果。
  循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从肿瘤原发灶脱落至外周血中的肿瘤细胞,因为在肿瘤转移过程中发挥重要作用,近年来在越来越多的肿瘤相关领域被广泛研究。现已逐步证实循环肿瘤细胞与肿瘤的临床分期和预后状况紧密相关。循环肿瘤微癌栓(Circulating Tumor Microemboli,CTM)是指外周血中发现的由2个或更多循环肿瘤细胞聚集在一起组成的细胞团。其相比与单个循环肿瘤细胞,具有更强的侵袭和转移潜力。目前对于不同类型的肿瘤,循环肿瘤细胞及循环肿瘤微癌栓相关研究已逐步展开,但在胆道肿瘤研究中,其在临床应用中的价值尚不明确
  本研究旨在通过检测胆囊癌及胆管癌患者术前循环肿瘤细胞计数水平及循环肿瘤微癌栓阳性率,结合各肿瘤术后临床病理分期情况,评估其作为诊断指标的诊断效能,并探索其与传统肿瘤标志物在疾病诊断评估方面的优势。
  研究方法:
  1、根据预先设计的纳入标准,选取拟行手术治疗的胆囊癌、胆管癌患者共105例,于术前1日采集静脉血通过使用带孔滤膜法系统鉴定循环肿瘤细胞和循环肿瘤微癌栓,根据排除标准,最终76例行手术治疗患者被纳入研究;
  2、术后采集研究患者的临床基本信息、CEA、CA19-9水平及病理相关资料,并根据最新美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版胆道肿瘤分期标准对每个患者进行TNM分期;
  3、进行统计分析,评价CTCs计数水平、CEA水平、CA19-9水平在不同胆道肿瘤中对不同TNM分期的诊断效能,并分析CTM发现阳性率在不同胆道肿瘤的不同TNM分期中的差异性。
  研究结果:
  1、在胆囊癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分胆囊癌和良性病的诊断敏感性为95.45%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.964(P=0.0001)。当截断值选择>5个/5ml时,CTCs计数显示可以区分肿瘤T分期T1+2和T3+4的诊断敏感性为66.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001)。当截断值选择>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为85%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9(P=0.0001);
  2、在肝内胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝内胆管癌和良性病的诊断敏感性为76.47%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.916(P=0.001)。当截断值>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期T1和T2+3+4期的诊断敏感性为78.57%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.905(P=0.0001)。当截断值>5个/5ml时,CTCs计数显示区分肿瘤M0和M1期的诊断敏感性为100%,特异性为71.43%,ROC曲线下面积为0.893(P=0.0024);当截断值>5个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为58.33%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.808(P=0.0045);
  3、在肝门部胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝门部胆管癌和良性病的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.896(P=0.001)。但CTCs计数对肝门部胆管癌TNM各分期之间诊断效能较差(P>0.05);
  4、远端胆管癌组,选取CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分远端胆管癌和良性病的诊断敏感性为91.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9333(P=0.0001)。当截断值>4个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期中T2和T3期的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001);
  5、CTM在胆囊癌、肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌各组的阳性率分别为0%、16%、12%、16%。各组内CTM阳性率在T分期、N分期、M分期及TNM分期中未见明显差异(P>0.05)。
  研究结论:
  1、术前CTCs计数作为诊断指标在区分胆道肿瘤良恶性疾病时,普遍具有较好的诊断价值,可作为传统肿瘤标志物的辅助参考依据;
  2、术前CTM在胆道肿瘤中阳性率普遍很低,且与TNM分期间无明显相关性。
[硕士论文] 唐渊
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:胃癌是中国最常见的消化道恶性肿瘤,中国新发生的胃癌,其中90%以上患者是进展期胃癌。目前胃癌主要治疗方式是手术加上化疗,部分进展期的胃癌通常不能直接进行手术,需要进行术前的新辅助化疗。目前临床胃癌新辅助化疗,存在化疗耐药问题。课题组前期研究发现,胃癌新辅助化疗能够诱导肿瘤细胞衰老。衰老的细胞会分泌大量的炎性因子,趋化因子,蛋白酶体等,这种表型是细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),能够通过多种方式,导致化疗耐药。进一步研究发现胃癌新辅助化疗标本耐药的患者存在SASP相关因子升高。课题组前期对胃癌新辅助化疗组织标本进行回顾性研究发现:胃癌新辅助化疗的效果与tristetraprolin(TTP)的表达有着密切相关,TTP高表达的患者胃癌新辅助化疗敏感性好,TTP低表达的患者新辅助化疗敏感性差。TTP作为一个RNA结合蛋白,能够与大量细胞因子mRNA的3'UTR区的AU富集区(AU-rich element,ARE)结合,进而降解目标因子的mRNA,也是一个重要的抑炎和抑癌蛋白。TTP调控的靶因子的mRNA与SASP相关分泌因子的mRNA有大量重叠。由此推测:TTP可能通过调控胃癌新辅助化疗引起的SASP,进而增加胃癌新辅助化疗敏感性。TTP其有可能成为候选的胃癌新辅助化疗敏感性的生物标志物。本研究拟在此研究基础上,通过在体外胃癌细胞衰老模型下,研究TTP通过调控SASP相关因子表达,提高新辅助化疗敏感性具体作用及其分子调控机制。为进一步探讨如何通过TTP改善胃癌新辅助化疗敏感性,以及胃癌患者治疗个体化治疗方案,也为TTP作为胃癌新辅助化疗有效的生物标志物提供基础理论支持,具有重要的临床意义。
  方法:第一部分:根据课题前期相关实验结果,选取胃癌BGC-823细胞系。分别在0、25nM、35nM、45nM浓度下紫杉醇诱导处理BGC-823细胞24h、48h、72h。衰老相关的β-gal半乳糖苷酶染色,分析构建稳定体外的胃癌细胞衰老模型。
  第二部分:基于胃癌BGC-823细胞系构建TTP过表达和TTP干扰细胞株,嘌呤霉素筛选稳定表达和稳定干扰的细胞株。实验分为三组:TTP过表达组,TTP干扰组,空白对照组。在紫杉醇35nM浓度下,诱导胃癌BGC-823细胞72h,分别通过qPCR和ELISA检测SASP部分相关因子的mRNA水平和蛋白分泌水平。
  第三部分,在体外紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞衰老模型上,通过Western blot方法检测p65在TTP过表达,TTP干扰的细胞核内外表达水平变化。进一步通过细胞免疫荧光,确定核内外p65表达水平,使用Image pro plus软件进行核内外p65荧光强度半定量分析。
  结果:第一部分:成功构建胃癌BGC-823细胞衰老模型构建:在35nM浓度下,紫杉醇诱导BGC-823细胞72h,β-gal染色,染色阳性,说明成功构建体外的胃癌细胞BGC-823衰老模型,其中胃癌BGC-823细胞衰老染色在紫杉醇诱导72h细胞衰老的比例达到60%以上
  第二部分:构建胃癌BGC-823细胞的TTP过表达和TTP干扰的细胞株,通过RT-qPCR验证TTP过表达和TTP干扰细胞株构建成功。通过嘌呤霉素在2μg/ml浓度作用下,筛选得到TTP稳定过表达和TTP稳定干扰的胃癌BGC-823细胞株。在35nM浓度紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞72h,通过qPCR和ELISA分别检测SASP部分相关因子的mRNA和蛋白变化。结果显示:TTP过表达时,能够下调SASP部分相关因子的表达,TTP干扰时,上调SASP部分相关因子表达,相比空白对照组差异具有统计学意义。
  第三部分:为了进一步研究TTP对SASP调控分子机制,在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型上,Western blot结果显示p65核内外的表达,TTP过表达组相比空白对照组显著减少,TTP干扰组核内p65相比空白对照也是显著增多。为了进一步验证TTP过表达和TTP干扰是否对p65入核影响,细胞免疫荧光,TTP过表达,TTP干扰组,空白对照组在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞72h条件下,细胞免疫荧光分析结果显示:在TTP过表达,核内的p65的荧光相比空白对照组和TTP干扰组有差异具有统计学意义。
  结论:成功构建紫杉醇体外诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型,在胃癌细胞衰老模型上,发现TTP能够调控胃癌BGC-823细胞的衰老相关分泌表型。TTP通过ARE结合途径直接降解SASP相关因子表达,还可以通过减少p65入核,抑制NF-κB信号通路激活,进而调控胃癌细胞衰老相关分泌表型。这也揭示:TTP可能通过调控SASP相关因子的表达,增加胃癌新辅助化疗敏感性。
[博士论文] 徐庆国
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乙型肝炎病毒感染(HBV)是全球范围内的主要公共健康问题之一,尤其是包括中国在内的发展中国家。虽然目前针对HBV的抗病毒治疗可以抑制HBV的复制,但仍不能彻底清除HBV。部分慢性乙型肝炎(CHB)患者发展成为进行性肝纤维化,并逐步导致了肝硬化,甚至是原发性肝细胞癌(简称肝癌)的发生。在中国,由于HBV感染的广泛性和抗病毒治疗的不规范性使得肝硬化和肝癌的发生比例较高。慢性HBV感染所导致的肝硬化和肝癌严重威胁着中国人民的生命健康,是中国十三五规划中需要着重解决的重大课题。
  HBVX基因(HBx)作为HBV四个开放阅读框之一,可以编码出分子量为17KD的HBx蛋白。大量的研究证实HBx蛋白在肝硬化和肝癌的发生发展过程中发挥了至关重要的作用,是尤为重要的病毒蛋白。由于HBV复制过程中不准确的逆转录和缺乏校对能力,HBx DNA存在多种变异。在前期研究中,通过测序技术在大队列的肝癌癌组织和癌旁组织中对HBx的基因型进行了调查,发现了一型携带多个位点共同变异的基因型,即HBx-EHBH2(HBx-E2)。预后分析表明携带HBx-E2的患者预后较好。此外,还初步研究了HBx-E2在肝癌细胞中的生物学功能。
  然而,HBx-E2在判断肝癌患者预后中的作用和在临床转化中的意义还需多中心的队列进行验证,而且HBx-E2在肝癌发生和发展中所发挥的功能,以及具体的分子机制仍需进一步探索。同时,HBx-E2与临床病理指标的相关性分析表明HBx-E2与肝硬化的缺失相关。所以,HBx-E2在肝硬化进程中是否也发挥了与其他基因型不同的作用,也需进一步研究。针对上述的科学问题,开展了本研究。
  第一部分HBx基因EHBH2基因型影响肝癌进程的分子机制
  研究目的:明确HBx-E2基因型在术前预测肝癌患者预后中的作用。确定HBx-E2在肝癌发生发展中的生物学功能及相关分子机制。
  研究方法:在不同地区的肝癌患者队列中检测HBx基因型,并对HBx-E2进行预后分析和临床病理指标相关性分析。构建多株表达多个HBx基因型的肝癌细胞系和肝细胞系,通过细胞计数试剂盒8(CCK8)、克隆形成、流式细胞术等实验明确HBx-E2对细胞增殖的影响。利用体外合成重组HBx蛋白和蛋白芯片筛选HBx-E2与野生型HBx蛋白结合蛋白的差异,并通过免疫共沉淀和激光共聚焦技术探索分子机制。
  研究结果:在不同地区的肝癌患者组织队列(n=171)的癌和癌旁中以及在血清队列(n=168)中,HBx-E2均与患者较好的预后相关。临床病理指标相关性分析表明HBx-E2与肝硬化缺失、肿瘤直径较小相关。按照HBx基因型分类和巴塞罗那肝癌临床(BCLC)分期在组织队列和血清队列分层进行预后分析,结果表明HBx-E2可以作为术前预测BCLC B期患者预后的分子标记物。体内外实验证明相对于其他基因型,HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力。蛋白芯片和免疫共沉淀等实验发现HBx-E2失去与JAK1结合的能力,而且不能激活STAT3和STAT5。JAK1的抑制剂Upadacitinib可以抑制除HBx-E2外其他基因型的增殖能力。
  研究结论:HBx-E2可以作为分子标记物术前预测BCLC B期患者预后。HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力,不能激活JAK1/STATs通路。JAK1是HBV相关肝癌中某些HBx基因型患者的潜在治疗靶点。
[博士论文] 孙筱
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝癌是常见的恶性肿瘤之一,其中来源于肝细胞的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最为常见。肝癌一般是由慢性肝病引起的肝细胞损伤,如慢性肝炎导致的肝组织纤维化、肝硬化,最后导致肝细胞癌。传统的治疗手段有手术、介入、放疗、化疗以及生物免疫治疗等。寻找有效的治疗药物,并对肝病的发病机理和药物的作用机制进行研究,是非常受重视的研究方向之一。
  苦参碱(Matrine)是从豆科属植物苦参的干燥根中分离出来的生物碱,具有广泛的药理学活性,如抗菌消炎、镇痛、免疫调节、抗心律失常、抗肝纤维化、抗肿瘤活性,在临床上可以治疗肝纤维化,慢性乙肝等疾病。苦参碱抗肿瘤活性的机制是多方面的,如抑制肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制肿瘤组织内部微血管的生成,诱导肿瘤细胞分化等,并且具有免疫调节以及降低化疗、放疗带来的毒性等作用。
  M-19是近年来重点研究的一个新型硫代苦参碱衍生物,其药理活性广泛,尤其对多种肿瘤细胞具有较强的抑制活性,其活性远强于苦参碱,但是M-19有与苦参碱一样的缺点,水溶性好,它的稳定性还不如苦参碱,很容易分解。在前期研究的基础之上,以苦参碱和苦参碱衍生物M-19为先导化合物,以槐果碱为起始原料,保留基本药效基团,向结构中引入药物设计中常见的有效结构片段,合成了多个系列的新化合物,并从中筛选到了编号为WM622的高活性、低毒性的新型苦参碱衍生物。
  对化合物WM622进行了深入的药理研究,发现其对HCC-LM3和Hep3B细胞有很好的活性。在体外的细胞实验中,WM622对肝癌细胞的增殖有着显著的抑制作用,能够抑制肿瘤细胞迁移,促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞在G0/G1期。通过计算机辅助的药物设计的手段,对WM622与靶点蛋白的作用进行了计算机模拟对接,推测其与EGFR和PTEN蛋白结合的匹配性较好,并通过实验证实了其对EGFR-AKT/PI3K通路具有抑制作用。在荷瘤小鼠体内,WM622对肿瘤的生长有明显的抑制作用。从而为抗肝癌药物的研究提供了新的机理和研究基础。
  方法:
  1、苦参碱衍生物的合成以及抗肿瘤活性筛选。以苦参碱和苦参碱衍生物M-19为先导化合物,合成了三类新型苦参碱衍生物,并用MTT法测定了0.1mg/mL浓度下各个化合物对不同肝癌细胞系的抑制率,筛选出对肝癌细胞有抑制作用的化合物。检测并计算这一批化合物对肝癌细胞的IC50,筛选出抗肿瘤活性高的化合物和敏感细胞系。
  2、WM622体外抑制肝癌细胞以及肝癌干细胞作用的研究。为了检测WM622对肝癌细胞以及肝癌干细胞的抑制作用,从以下几个方面进行了研究:(1)通过MTT比色法和平板克隆形成实验,检测WM622对肝癌细胞增殖的作用;(2)通过细胞划痕愈合实验和Transwe11小室实验,检测WM622对肝癌细胞迁移的作用;(3)通过Hoechst33258染色以及PI、AV/FITC双染的方法,使用流式细胞术检测WM622处理过的肿瘤细胞中凋亡细胞所占的比例,评价WM622对肝癌细胞凋亡的作用;(4)通过PI染色以及流式细胞术检测WM622处理过的肿瘤细胞中各个周期细胞所占的比例,分析WM622对肝癌细胞周期的影响;(5)通过磁珠分选的方法,获得CD133+细胞系,通过成球实验验证其干性,检测WM622对CD133+和CD133-细胞成球和细胞增殖的影响。
  3、WM622抑制肝癌细胞分子机制的研究。先通过计算机辅助药物设计的方法,寻找WM622可能作用的靶点蛋白和信号通路。然后用Western Blot的方法对结果进行验证,研究WM622在抗癌过程中的具体机制。
  4、WM622体内抗肝癌作用效果的研究。先将HCC-LM3细胞悬液皮下注射于四周龄的BALB/c裸鼠背部,建立BALB/c裸鼠成瘤模型。设置高浓度药物组(34mg/kg)、低浓度药物组(17mg/kg)、5-Fu组(20mg/kg)及空白对照组(PBS),隔一天进行腹腔注射给药。给药10次后采取小鼠肿瘤组织,绘制肿瘤增长曲线和小鼠体重变化曲线。组织切片HE染色的方法观察肿瘤组织结构。通过免疫组织化学染色,以及Western Blot的方法,检测肿瘤组织中相关通路关键蛋白的表达量变化。
  结果:
  1、苦参碱衍生物的合成以及抗肿瘤活性筛选。合成了三类苦参碱衍生物,MTT法检测了各个化合物在0.1mg/mL的浓度下对6种肝癌细胞系的抑制率。分别计算这批化合物对4种肝癌细胞的IC50,从中筛选出了抗肿瘤活性最好的化合物WM622以及敏感细胞系HCC-LM3和Hep3B。
  2、WM622体外抑制肝癌细胞以及肝癌干细胞作用的研究。这部分的研究中,得到以下结论:(1)WM622对肝癌细胞系HCC-LM3和Hep3B的抑制率随着浓度和时间的增加而升高,对正常肝细胞系的毒性低于对肝癌细胞系的毒性,随着WM622浓度的增加,HCC-LM3和Hep3B的平板克隆形成率显著下降;(2)随着WM622浓度的增加,HCC-LM3和Hep3B的划痕实验愈合面积显著减少,Transwell细胞数显著减少;(3)经Hoechst33258染色后,荧光显微镜下观察到凋亡细胞的亮白色呈分散的碎颗粒状或棒状细胞核,随着WM622浓度的增加,凋亡细胞的数目逐渐增多;(4)PI和AV-FITC染色后,流式细胞仪检测到的凋亡细胞所占的比例增多,G1期细胞所占的比例增加,提示WM622能够将细胞周期阻滞在G0/G1期;(5)通过磁珠分选的方法,将肝癌细胞系分为CD133÷细胞和CD133-细胞,CD133+细胞的成球率显著高于CD133-细胞。WM622能够浓度依赖地抑制CD133+细胞的成球和增殖能力。
  3、WM622抑制肝癌细胞分子机制的研究。通过计算机辅助药物设计的方法,推测出了WM622与EGFR、PTEN结合的匹配性较好,并用Western Blot的方法进一步验证了WM622能够抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
  4、WM622体内抗肝癌作用效果的研究。得出,随着WM622给药时间的延长,可以看到肿瘤体积增长幅度越来越小。光镜下观察肿瘤组织的HE染色切片,可见细胞核质比大,胞核深染,组织结构散乱等肿瘤组织的一般形态学特征。通过免疫组织化学和Western Blot的方法,验证了WM622能够抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
  结论:
  在体外,WM622能够剂量和时间依赖地抑制肝癌细胞系HCC-LM3和Hep3B的增殖、迁移,促进肿瘤细胞的凋亡,将肿瘤细胞的周期阻滞在G0/G1期。能够抑制肿瘤干细胞的增殖。在体内,WM622能够剂量依赖地抑制肿瘤的生长。WM622作用的机制是抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
[硕士论文] 李高峰
外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本文目的是研究肝脏肿瘤细胞调控氧化应激的机制及肿瘤干细胞在抗氧化应激过程中的作用,探寻参与调节肿瘤干性特征与抗氧化应激过程的相交叉的分子靶点,并人为干预后,进一步对比肝脏肿瘤细胞抗氧化应激能力及干性特征的变化。从而从肿瘤干细胞具有较强抗氧化应激能力的生物学特性角度为肿瘤的临床治疗、基础研究及新药研发提供新的策略与思路。
  方法:
  1.对比肝细胞癌(HCC)细胞系Huh7与SMMC-7721对外源性ROS(H2O2)抵抗能力及两组细胞系中参与ROS调控的相关分子表达差异,探究肝癌细胞对ROS抵抗的初步机制;2.进一步分离Huh7细胞中抗ROS的亚群,并与普通Huh7细胞比较抗ROS能力及调控ROS代谢的相关分子表达的差异,筛选出调节通路中的关键分子(β-catenin);3.使用β-catenin阻滞剂XAV939阻断Wnt/β-catenin信号通路,观察Huh7细胞抗ROS能力的变化;4.通过慢病毒干扰Huh7细胞系内ROS产生基因Nox1,人为减少细胞内ROS的产生,来比较Nox1基因干扰组与GFP(绿色荧光)对照组细胞抗ROS能力、干性特征及相关分子表达的变化,进而探究ROS调控能力与肿瘤干性特征之间的关系。
  结果:
  1.经H2O2作用后,相对于SMMC-7721细胞,Huh7细胞凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低,同时相对高表达干性分子CD133、bmi-1,DNA修复基因Rad51、ROS清除酶基因SOD2。2.肝癌细胞Huh7内存在具有较强抗ROS能力的亚群(Huh7-ROS),该亚群细胞相对于普通的Huh7细胞高表达bmi-1、CD133、Bcl-2、SOD1,并且在经H2O2作用后,凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低。3.相对于未用XAV939处理的Huh7细胞,经XAV939处理的Huh7-XAV939组细胞在H2O2作用后,细胞凋亡坏死数目更多,活性更低,细胞内ROS水平更高,而在不使用H2O2情况下即H2O2浓度为0umol/ml时,Huh7细胞的凋亡和坏死及细胞活性都没有差异。4.干扰Huh7细胞内ROS产生基因Nox1的实验组细胞(Huh7-siNox1),相对于普通的对照组绿色荧光细胞(Huh7-GFP),不但在H2O2作用后细胞活性更高,而且还有更强体内致瘤能力、集落形成能力。
  结论:
  1.肝癌细胞拥有较强的抗ROS的能力有赖于肿瘤干性分子、DNA修复基因及清除酶基因的共同作用。2.肝癌细胞内存在抗ROS的亚群细胞,这一亚群也同时高表达肿瘤干性分子、ROS清除酶基因、DNA修复基因以及肿瘤干细胞信号通路分子β-catenin基因。3.β-catenin基因调控肿瘤细胞的自我更新等干性细胞学特性,在肿瘤细胞抗ROS过程中同样发挥作用。XAV939作为β-catenin基因的特异性阻滞剂,可以在不会诱导细胞凋亡和坏死的浓度水平抑制肝脏肿瘤细胞调控ROS抵抗的能力,进而可增加化疗药杀伤肿瘤细胞的效应,其有可能成为化疗“增敏剂”,进而在化疗过程中起到辅助作用。4.通过干扰Nox1基因降低内源性ROS的产生可以增强Huh7细胞抗ROS的能力并激活肿瘤细胞的干性特征,Nox1分子表达的高低及肿瘤细胞中ROS的水平可能作为为患者预后评判的标准和相关治疗的分子靶点来研究。
[硕士论文] 毛子明
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  中国是肝癌大国,且肝癌在人群中的发病率逐年上升。目前,以手术为主的综合治疗是肝癌治疗采用的主要方案。然而此类肿瘤早期诊断难度较大,中晚期患者多已难以进行根治性手术。传统的放化疗不良反应大,病人的预后通常不佳。因此,筛选肝癌分子靶标并据此研发分子靶向药物越来越受到人们的重视,成为抗肿瘤研究的热点之一。
  PPP2R5A是细胞内重要磷酸酶PP2A(Protein phosphatase2A)的调节亚基,负责特异性调节PP2A的磷酸酶功能、底物特异性以及细胞内定位。研究发现,PPP2R5A参与对P53、Bcl2、cyclin/CDK、MAPK、JAK/STAT、c-Myc以及β-catenin等相关通路的调节,且PPP2R5A的异常常伴随各类腺癌、上皮癌、心肌病以及心衰的发生。通过数据库查询发现,在欧美人群中,PPP2R5A表达与肝癌预后相关,高表达PPP2R5A的肝癌患者预后较好。本课题前期的研究发现,在中国肝癌病人中,肝癌组织内PPP2R5A的表达水平普遍偏低,且该趋势在合并乙肝病毒感染的肝癌病人中较为明显。这些结果提示,在肝癌发生发展过程中PPP2R5A可能作为一个抑癌因素存在。
  本课题以PPP2R5A为研究对象,探究其在肝癌中的表达以及其对肝癌发生发展的影响,阐明PPP2R5A作用的相关机制,为利用PPP2R5A作为靶点,进行肝癌的预防、治疗及改善患者预后打下基础。
  方法:
  1.检测肝癌细胞及肝癌组织中PPP2R5A的表达:选择正常肝细胞系L02、WRL-68、Chang liver;肝癌细胞系QGY-7701、Hep3B、PLC/PRF/5、SMMC-7721、HepG2、HepG2.215、Huh-7、HCC-LM3进行培养,分别提取细胞总蛋白以及细胞总核糖核酸(RNA),以蛋白质免疫印迹实验(Western blot)和实时定量聚合酶链反应实验(qRT-PCR),检测细胞中PPP2R5A的基因转录和蛋白表达,并通过免疫组化实验,检测肝癌组织以及癌旁肝组织内PPP2R5A的表达水平。
  2.检测PPP2R5A的表达对肝癌生物学特性的影响:选择QGY-7701、Hep3B细胞,构建PPP2R5A敲减/过表达肝癌细胞系及其转染空载质粒的对照组细胞系,采用流式细胞术、CCK8、Transwell、划痕以及平板克隆实验,检测PPP2R5A表达对肝癌细胞增殖、迁移侵袭、周期、克隆形成等细胞生物学特性的影响;通过免疫组化实验,比较不同肝癌病人癌组织之间PPP2R5A的表达差异,探究PPP2R5A表达对肝癌患者预后的影响。
  3.探究PPP2R5A对肝癌发生发展发挥作用的相关机制:培养敲减/过表达PPP2R5A的Hep3B和QGY-细胞系及其各自对照组细胞系,提取细胞总蛋白,通过Western blot实验方法检测PPP2R5A及其下游相关蛋白分子p-ERK、p-Raf、p-AKT、c-Myc、β-catenin的表达水平,分析PPP2R5A表达对相关信号通路的影响;通过免疫组化实验,检测肝癌中PPP2R5A的表达与年龄、性别、甲胎蛋白(AFP)、乙肝病毒(HBV)感染、病理分级、TNM分期的关系。
  结果:
  1.正常肝细胞系、肝癌细胞系以及肝癌组织中PPP2R5A的表达
  1.1.通过qRT-PCR检测正常肝细胞系WRL-68、肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Huh-7以及QGY-7701、Hep3B细胞中PPP2R5A的转录水平,结果显示,与正常肝细胞系WRL-68相比,PPP2R5A在Huh-7、Hep3B以及QGY-7701细胞中转录水平较高,而在HepG2以及SMMC-7721细胞中转录水平较低。
  1.2.Western blot实验分别检测正常肝细胞系、乙肝病毒整合阴性的肝癌细胞系以及乙肝病毒整合阳性的肝癌细胞系中PPP2R5A的表达。结果显示,PPP2R5A在正常肝细胞系L-02、chang liver、WRL-68以及乙肝病毒整合阴性的肝癌细胞系如Huh-7、HCC-LM3细胞中表达较高,而在乙肝病毒整合阳性的肝癌细胞系如Hep3B、QGY-7701、PLC/PRF/5以及乙肝病毒整合阴性的肝癌细胞系SMMC-7721中低表达。同时,虽然在Hep3B和QGY-7701细胞中PPP2R5A蛋白低表达,但是qRT-PCR显示Hep3B和QGY-7701细胞中PPP2R5A转录水平较高,这提示PPP2R5A可能在翻译水平受到抑制或是在细胞内降解增加。
  1.3.免疫组化实验显示,肝癌组织中PPP2R5A的表达较低,癌旁组织中PPP2R5A的表达则较高,且该趋势在合并乙肝病毒感染的患者体内更为明显。
  2.PPP2R5A表达对肝癌细胞生物学特性的影响及其相关机制
  2.1成功构建PPP2R5A敲减/过表达的Hep3B和QGY-7701细胞系及感染空载质粒的对照组细胞,检测敲减/过表达PPP2R5A后肝癌细胞的生物学特性的改变:
  2.1.1CCK8实验发现过表达PPP2R5A导致肝癌细胞增殖能力下降,而敲减PPP2R5A则导致肝癌细胞增殖能力增强;
  2.1.2平板克隆实验显示过表达PPP2R5A导致肝癌细胞克隆形成能力下降,而敲减PPP2R5A则导致肝癌细胞克隆形成能力增强;
  2.1.3流式细胞术实验结果表明,过表达PPP2R5A导致G0/G1期肝癌细胞数增加,G2/M期或S期细胞数减少;而敲减PPP2R5A则造成G0/G1期肝癌细胞数减少,G2/M期或S期细胞数增加。结合CCK8实验结果,提示PPP2R5A蛋白对肿瘤增殖起抑制作用;
  2.1.4划痕以及transwell实验提示,过表达PPP2R5A可以引起肝癌细胞迁移侵袭抑制,而敲减PPP2R5A则引起肝癌细胞迁移侵袭增强。
  以上实验结果提示PPP2R5A在肝癌的发生发展中起抑制作用。
  2.2Western blot实验检测敲减/过表达PPP2R5A后肝癌细胞内相关蛋白表达的改变。结果显示,过表达PPP2R5A的肝癌细胞内p-ERK、p-Raf、c-Myc、Bcl2、p-AKT以及β-catenin表达水平下降,而敲减PPP2R5A的肝癌细胞内p-ERK、p-Raf、c-Myc、Bcl2、p-AKT以及β-catenin表达增加。实验结果提示PPP2R5A参与抑制MAPK通路、p-AKT通路、WNT通路的活性以及并抑制Bcl2蛋白、c-Myc蛋白的表达。
  2.3免疫组化实验显示,与癌旁肝组织相比,肝癌组织中PPP2R5A的表达较低,且该现象在合并乙肝病毒感染的患者体内更为明显,这提示PPP2R5A在肝癌组织中的低表达很可能促进了肝癌的发生发展且乙肝病毒感染可以降低PPP2R5A的表达水平。免疫组化还显示,PPP2R5A表达高的肝癌患者无瘤生存时间较长,这提示PPP2R5A抑制肝癌的术后复发。
  2.4为了探究HBV感染与肝癌细胞内PPP2R5A表达水平之间的关系,Western blot实验进一步对比HBV阳性的HepG2.215细胞与其亲代HepG2细胞的蛋白表达差别。结果显示,HepG2.215细胞内PPP2R5A的表达水平低于HBV感染阴性的亲代HepG2细胞。
  结论:
  本课题旨在研究PPP2R5A表达水平对肝癌的作用及其相关机制。实验结果表明,乙肝病毒感染可以影响肝癌细胞中PPP2R5A的表达,而这可能促进了肝癌的发生发展。PPP2R5A可以抑制肝癌细胞的增殖侵袭能力,这可能与PPP2R5A降低了肝癌细胞中肿瘤相关蛋白p-ERK、p-Raf、p-AKT、c-Myc、Bcl2以及β-catenin的表达水平有关。通过对肝癌患者癌组织中PPP2R5A的表达水平以及患者预后的分析,发现PPP2R5A高表达的患者术后无瘤生存时间较长。总之,PPP2R5A能抑制肝癌细胞增殖和迁移侵袭能力,使其有望成为肝癌靶向治疗以及改善预后的新靶标。
[硕士论文] 张宪文
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着医学的发展,诊断肿瘤方法除原有的影像学、肿瘤标志物等,更有了新的基因检测技术。基于血液标本的循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是研究的热点,而作为血检“明星”的ctDNA越来越引起研究者重视。ctDNA是指肿瘤细胞脱落或凋亡后释放进入循环系统的DNA,是一种特征性的肿瘤生物标记物。通过ctDNA检测,能够检出血液中的肿瘤踪迹。相比于其他传统的肿瘤标记物,ctDNA具有半衰期短、假阳性率低、实时反映肿瘤本身等特点。但是ctDNA本身含量少,提取检测难度大。随着定量检测技术发展,DNA检测灵敏度逐渐提升,人们在多种肿瘤类型患者中的研究发现与证明了ctDNA在肿瘤诊断和治疗中的价值。尽管如此,目前对ctDNA在结直肠癌患者外周和门静脉血中分布情况及其在追踪微小残留病中的价值仍不清楚。考虑到胃肠肿瘤存在共性的门静脉回流系统,故本研究通过搜集结直肠癌、胃癌患者术中外周血及门静脉血,通过Accu-Act技术行61个基因pannel的深度二代测序,比较分析ctDNA在含量、基因的突变图谱、片段长度及丰度上的区别。此外,在动物体内注射携带突变位点K-ras基因的片段,考察ctDNA在动物体内的代谢动力学情况。最后,建立结直肠癌患者随访时间点,结合肿瘤复发、转移和死亡数据,考察ctDNA在追踪结直肠癌患者血液微小残留病中的价值。研究结果发现,相比较外周静脉血,门静脉血中的ctDNA(含有突变位点的cfDNA)在含量、肿瘤突变图谱以及片段长度无明显差异(P>0.05)。但是,体细胞突变的最小等位基因频率(MAF)在门静脉血中更高(P<0.05)。此外,与全长的cfDNA相比,ctDNA的平均长度更短(P<0.05)。更进一步,计算外周静脉血中的ctDNA半衰期为30秒-45分钟不等,进一步探索携带突变位点的K-ras基因片段在动物体内的代谢情况,发现ctDNA在动物体内的平均半衰期约为2.22分钟,这与临床结直肠癌患者静脉血中ctDNA估算的代谢时间不同。结直肠癌患者中术后检测到ctDNA能较好地预测2年内肿瘤复发,ctDNA在可切除的结直肠癌患者术后微小残留病评估中能起到至关重要的作用,是NCCN指南很好的补充。
  第一部分:ctDNA在胃肠癌患者外周和门静脉血中的对比研究
  目的:考虑到胃肠肿瘤存在共同的门静脉回流系统,且同时可将胃癌和结直肠癌作对比,故搜集结直肠癌、胃癌患者术中外周血及门静脉血,比较分析ctDNA在含量、基因的突变图谱、片段长度及丰度上的区别,并进一步考察片段ctDNA在动物体内的代谢动力学情况。
  方法:由于胃癌、结直肠癌存在共同的门静脉回流系统,搜集外周静脉血和门静脉血,通过Accu-Act技术行64个基因pannel的NGS二代测序,比较分析两者之间ctDNA在含量、体细胞突变率、长度、MAF的不同,并估算其代谢的半衰期。在动物体内注射携带突变位点K-ras基因的片段,将浓度为51.27ng/uL的CL-187酶切产物,予以生理盐水稀释后于狗下肢左侧股静脉注入,在右侧股静脉分别于1分钟、2.5分钟、5分钟、10分钟、30分钟取血3-5ml,予以血浆分离、Trans磁珠抽提ctDNA、ddPCR,计算出各个时间点ctDNA突变频率,从而计算其半衰期。
  结果:外周静脉血和门静脉血来源的ctDNA(含有突变位点的cfDNA)比较,两者在含量上没有差异(P=0.566)。检测外周血和门静脉血来源的ctDNA的突变图谱无差异。ctDNA的突变率(血中的突变数目/肿瘤组织中的突变数目)在外周静脉血和门静脉血中分别为42%和47%,两者比较无统计学差异(P=0.35)。检测到6例患者(C4,C8,C9,C10,C11和S5)肿瘤匹配的静脉血ctDNA片段长度与在相同染色体区域不含突变的cfDNA相比,明显短,差异具有统计学意义(P<0.001)。比较肿瘤匹配的外周静脉血和门静脉中ctDNA的MAF,用二元线性回归模型分析,门静脉血中的MAF明显高于外周静脉血(P=0.000679)。评估cfDNA的降解率依赖于肿瘤MAF的突变估算,而因为肿瘤的异质性、拷贝数目的变化和非整倍性,MAF很难完整获得。然而,通过多个基因组位点可以预估最大和最小降解率,进而计算指数式衰减。在5例结直肠癌和1例胃癌患者中通过估算9个基因组位置来分析降解率,每个基因组的位置有6个或者更多的UC读本,我们的结果显示,患者血中的cfDNA半衰期为30秒-45分钟不等,平均为1.98分钟。动物实验狗1各个时间点突变频率分别为3/986、1.4/1274、1.4/1254、0/610、0/1166;狗2各个时间点突变频率分别为11.2/430、4.8/466、2.6/352、1.4/502、0/848;狗3各个时间点突变频率分别为24/800、9.8/538、1.6/588、0/658、0/928。通过R软件编程计算每只狗体内ctDNA的半衰期,分别为2.479011分钟、2.794444分钟、1.38862分钟,平均为2.220692分钟。
  结论:ctDNA在外周血与门静脉血中的含量、肿瘤突变谱、片段大小无明显差异,但门静脉血中ctDNA基因突变频率比外周血高,经过计算,ctDNA在人体血液中代谢半衰期平均为1.98分钟,而在动物体内半衰期平均为2.2分钟。外周静脉血ctDNA有很好的循环系统代表性,且半衰期短,能实时监测肿瘤。
  第二部分:ctDNA在追踪结直肠癌患者微小残留病中的价值
  目的:建立结直肠癌患者随访时间点,结合肿瘤复发、转移和死亡数据,考察ctDNA在追踪结直肠癌患血液微小残留病中的价值。
  方法:前期搜集517例结直肠癌患者的术前血/术后血/临床肿瘤标本,排除不匹配标本,排除随访<12月,排除Ⅳ期肿瘤,最后纳入85例具备完整术前血、术后血和临床肿瘤标本病例,同时留取具有完整匹配临床标本的22例Ⅳ期转移性结直肠癌患者做对照研究。选取的85例患者均行R0根治性手术,术后规律随访。
  结果:通过Accu-Act技术行NGS二代测序,研究结果发现,在结直肠癌肿瘤组织、术前外周静脉血和术后静脉血中检测到的高频突变前五位基因为:TP53、KRAS、APC、BRAF和PIK3CA,与WES肿瘤gDNA(The Cancer Genome Atlas Network,Nature2012)报道的在多种肿瘤中的检测到的高度突变的基因类似。进一步,选取TP53、KRAS、APC和BRAF,发现来自结直肠癌组织的gDNA、血浆中的ctDNA突变图谱与全外显子测序(TCGA)的基因突变频率相似。因此捕获的Panel也是合理的,能cover约90%的结直肠癌患者(1-2突变)。病人群体与已报道的人群没有明显差异,ctDNA检测是精准的,与组织DNA检测结果符合。这说明采取Accu-Act技术行NGS二代测序的可行性及准确性。一共纳入85例结直肠癌患者,其中男性52例(61.2%),女性33例(38.8%),平均年龄62.87岁。左半结肠癌占28.23%,右半结肠占29.41%,直肠癌占42.36%。85例患者中仅有8例(9.4%)术后血检测到ctDNA,其中4例患者出现了复发或转移;77例患者术后血未检测到ctDNA,仅6例患者出现复发或转移。为了比较ctDNA含量、MAF在不同分期的结直肠癌患者中的分布规律,及术前ctDNA对术后ctDNA的检出预测情况,纳入Ⅳ期结直肠癌患者信息联合分析,不管是术前的ctDNA还是术后ctDNA的检出都与结直肠癌分期无关(P>0.05),术前cfDNA含量的高低,不会影响到术后ctDNA检出与否(P>0.05)。因此ctDNA含量和cfDNA总量没有太大关系,而是与微转移相关。术前的ctDNA的MAF与分期成正相关(P<0.05),而术前ctDNA的MAF也不能简单预测术后的ctDNA检出(P>0.05)。无论是术前的cfDNA还是术后cfDNA含量都不能预测2年内肿瘤复发的情况,术前ctDNA和肿瘤组织中的MAF均不能预测2年内肿瘤复发的情况,但术后ctDNA中的MAF可预测2年内肿瘤复发的情况(HR:1.33;P=0.0256)。发现,术前CEA、术后CEA、肿瘤大小,淋巴结检出和癌栓等因子,都不能有效的预测肿瘤2年内是否复发。只有术后ctDNA检出与否能有效预测2年内肿瘤复发。进一步行亚组分析,发现对于术后没有使用辅助化疗的结直肠癌Ⅱ期患者,术后无ctDNA检出的病人有明显生存优势,可见ctDNA是很好的MRD预后评估的生物标记物。结直肠癌Ⅲ期术后ctDNA阴性的患者,辅助化疗对无进展生存期没有明显影响,这可能与Ⅲ期ctDNA阴性未化疗的病人总数太少、随访时间短有一定的关系,因此结论的可靠性有待进一步证实。最后,使用TP53、KRAS、APC和BRAF4基因的小Panel,验证其检测MRD的可能性,证实小Panel的术后ctDNA检测也能很好的预测复发风险。
  结论:结直肠癌患者中术后检测到ctDNA能有效预测2年内肿瘤复发,ctDNA在可切除的结直肠癌患者术后微小残留病评估中能起到至关重要的作用,是NCCN指南好的补充。
[硕士论文] 沈皓
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:中国HCC的发病例数和死亡例数占全球的50%以上,但各个地区的HCC发病率差异明显。本研究旨在比较中国大陆肝癌高发地区(High HCC prevalence regions)和肝癌低发地区(Low HCC prevalence regions)的肝癌病人在肝切术后的远期预后情况,找出不同地区之间影响预后的危险因素的差异。
  研究方法:回顾性分析了1996-2010年间在东方肝胆外科医院进行肝癌切除术并获得组织病理学证实的肝癌病人临床病例资料。参照《2012年中国癌症登记年报》,将病人按照出生地分为高发地区组和低发地区组。计量资料的比较采用Mann-Whitney非参数U-检验,计数资料的比较采用卡方检验,生存资料的分析采用Kaplan-Meier法、对数秩检验和Cox风险回归分析。使用R3.4.1和SPSS18.0统计软件对统计结果进行分析。
  研究结果:本研究随访日期截止至2013年6月30日,中位随访时间为24.1个月。研究共纳入4919例病人,其中3370例来自肝癌高发地区,1549例来自肝癌低发地区。在全部病人中,高发地区组的5年肿瘤复发率明显高于低发地区组(82.9%比69.2%;p<0.001),而其5年生存率则低于低发地区组(48.8%比53.7%;p<0.001)。多因素分析发现,来自高发地区在肿瘤复发和总体生存中都是独立危险因素(TTR[HR]:1.18;OS[HR]:1.24)。
  按地区不同对病人进行亚组分析后发现,来自高发地区的病人HBsAg、HBeAg和HBcAb阳性率更高并且HBV-DNA>2000IU/mL,AFP>20ng/ml,微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)阳性及肿瘤低分化(Edmondson-Steiner分级:Ⅲ-Ⅳ级)的比例也更高。两地区病人共同的预后独立危险因素为AFP水平>20ng/mL,肿瘤直径>5cm以及MVI阳性。低发地区组的预后独立危险因素是年龄≤50岁,男性和输血,而高发地区组的独立危险因素为HBeAg阳性,HBV-DNA>2000IU/mL,TBIL>17.1umol/L,非解剖性肝切除以及肿瘤低分化。
  全部病人中,符合米兰标准的病人共2497例(高发地区组1739例,低发地区组758例);符合BCLC0期标准的病人共370例(高发地区组264例,低发地区组106例)。多因素分析发现,来自高发地区在以上两个分期中依旧是肿瘤复发和总体生存的独立危险因素(米兰标准:TTR:1.27;OS:1.37;BCLC0期:TTR:1.94;OS:2.50)。
  对全部病人、符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中HBeAg阳性病人分别进行亚组分析后发现,高发地区组的1、3、5年复发率均高于低发地区组(全部病人:p=0.030;米兰标准:p=0.004;BCLC0期:p=0.048),符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中高发地区组的1、3、5年生存率低于低发地区组(米兰标准:p=0.043;BCLC0期:p=0.046)。但在全部病人中,两者的1、3、5年生存率并没有明显差异(p=0.182)。
  研究结论:本研究首次发现了中国大陆肝癌高发地区和肝癌低发地区病人术后远期预后存在明显差异,来自高发地区的病人预后更差。来自高发地区在多个肿瘤分期中都是预后的独立危险因素。高发地区的病人HBV感染率更高且环境毒素暴露机会更多可能是导致这种现象的原因。
[硕士论文] 孙力祺
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目前EUS-FNA判断PCNs风险和诊断A-PCNs主要依赖液基细胞学和囊液癌胚抗原(Carcmo-embryonic antigen,CEA)的检测。尽管液基细胞学检查诊断A-PCNs的特异性可达到90%以上,但敏感性仅为48%。囊液CEA可以有效的鉴别粘液和非粘液性PCNs。对于CEA鉴别A-PCNs和非A-PCNs,尽管目前有了很多文献的报道,但仍然缺乏高质量的前瞻性研究数据的支持,广泛认可的标准仍未建立。鉴于两种方法对于诊断A-PCNs均不能令人满意,两种方法联合诊断A-PCNs可以作为临床应用的一个方向,但其准确率目前尚没有文献报道。
  由于胰腺手术的创伤较大,并发症发生率较高,寻找创伤小疗效确切的替代治疗方法成为了热点。目前以EUS-FNA为操作基础的瘤内注射治疗最为安全有效,而最常用的消融剂为无水乙醇。超声内镜引导下无水乙醇灌注术(Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation,EUS-EA)是在EUS-FNA穿刺成功后通过穿刺针孔道注入无水乙醇对PCNs囊壁进行灌洗消融使囊壁细胞壁中的蛋白质变性从而抑制肿瘤细胞生长。目前国外多篇文献已经对EUS-EA治疗PCNs进行了报道,相对于手术治疗,EUS-EA创伤小,恢复快,安全性已经得到了肯定,但有效性仍有一定的争议,故目前仍未在临床大规模开展应用,指南亦未进行推荐。目前进行EUS-EA往往要求先进行EUS-FNA囊液分析对PCN进行风险评估后再决定是否需要行EUS-EA治疗,需要进行两次穿刺,增加了并发症发生的可能。根据AGA指南高危的PCN具有特征性的影像学表现,而EUS可以清晰的显示这些高危因素。因此不通过囊液分析,仅通过EUS判断高危因素,对于具有高危因素的PCNs将EUS-FNA和EUS-EA两者结合,一次内镜操作就将诊断和治疗同时进行其可行性尚没有得到论证,目前也没有文献报道。
  本研究目的为回顾性分析判断AGA指南在诊断MNs中的准确性,进一步探究囊液CEA和液基细胞学及两者联合在诊断A-PCNs中的应用价值,并初步探究EUS-EA的可行性、有效性和安全性以及EUS-FNA联合EUS-EA的可行性。本研究分为3部分:
  第一部分:AGA指南在诊断MNs中的应用
  目的:评价AGA指南和替代方案在诊断MNs中的准确性。
  方法:从2004年6月到2017年6月,124名在第二军医大学附属长海医院行EUS-FNA诊断以及囊液CEA分析的患者纳入本研究。对于每位患者,其临床基本特征,超声内镜特征(囊腔位置、囊腔大小、囊内有无实性成分、胰管直径的大小、有无分隔以及囊腔数量)以及囊液CEA水平均进行了回顾性分析。以囊液CEA水平大于192ng/ml作为判断MNs的标准[1]。统计学方法为:单因素分析、多因素分析、受试者特征曲线分析(Receiver operator characteristic curve,ROC curve)。
  结果:124名患者中44例经囊液CEA分析诊断为MNs,80例为非MNs。在MNs和非MNs间,囊腔的大小存在统计学差异(P=0.032)。通过多因素分析提示囊腔大于1.5cm(优势比值OR=0.134,95%置信区间0.014-0.948)诊断为MNs的可能性较大。选择囊腔直径>1.5cm作为高危因素,选择多囊样的形态学表现作为良性因素,并以此确定替代诊断方案。AGA指南诊断MNs的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值以及准确率分别为:20.5%,73.8%,30%,62.8%和54.8%,替代诊断方案的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值以及准确性分别为43.2%,61.3%,38%,66.2%和54.8%。44例MNs患者中,AGA指南方案漏诊了35例,而替代方案漏诊了25例,漏诊率分别为79.5%和56.8%。ROC曲线分析显示两者方案的诊断效能没有统计学差异,但两种方案间的漏诊率有统计学差异(P=0.022)。
  结论:AGA指南在诊断MNs方面需要一定的改进,尽管替代方案和AGA指南方案的诊断效能没有统计学差异,但是替代方案可以降低MNs的漏诊率。
  第二部分:超声内镜引导下细针穿刺术及囊液分析在胰腺囊性肿瘤诊断中的价值
  目的:探索胰腺囊性肿瘤囊液CEA浓度及液基细胞学检测在诊断进展期囊腺瘤中的价值,并分析两者联合是否可以提高诊断的准确性。
  方法:回顾性分析从2006年1月到2017年6月间在第二军医大学附属长海医院行EUS-FNA和囊液分析,其后转入外科行手术治疗并获得病理诊断的胰腺囊性肿瘤患者。共有78例患者进入研究,对于每一个患者其临床基本资料、超声内镜图像特征,囊液分析结果以及病理结果都进行了回顾性分析。敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率用于分析液基细胞学检测和CEA界值对于诊断进展期PCN的价值。T检验用于比较良性PCN和A-PCN间囊液CEA浓度有无不同,受试者特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)用于确定预测A-PCN的囊液CEA浓度的最佳界值。
  结果:78例患者有32例经手术后病理确诊为A-PCNs。其中液基细胞学在60例患者中进行了检测(27例在A-PCNs患者中),囊液CEA浓度在33例患者中进行了检测(7例在A-PCNs患者中)。液基细胞学的诊断准确率在两组间有统计学差异(P=0.002),液基细胞学诊断A-PCNs的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为:48.1%,90.9%,81.3%,68.2%和55.1%。囊液CEA浓度在两组间有差异(P=0.049)。根据ROC曲线结果,囊液CEA>418.9ng/ml可以帮助预测A-PCNs,ROC曲线线下面积为0.863,采用该界值诊断A-PCN的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为:85.7%,73.1%,46.2%,95%和75.8%。囊液CEA浓度联合液基细胞学诊断A-PCNs的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率为100%,73.1%,56.3%,100%和80%。
  结论:囊液液基细胞学检测和CEA浓度平对于诊断A-PCN有一定的帮助。两者联合可提高诊断A-PCNs的敏感性和准确性。
  第三部分:超声内镜引导下无水乙醇消融术在治疗胰腺囊性肿瘤中的疗效和安全性的初步评价
  目的:评价临床应用超声内镜引导下无水乙醇消融术治疗胰腺囊性肿瘤(EUS-EA)的可行性、安全性及有效性,以及EUS-FNA联合EUS-EA的可行性分析。
  方法:回顾性分析2013年7月至2017年8月在第二军医大学长海医院接受EUS-EA的11例胰腺囊性肿瘤患者的临床资料,包括基本信息、EUS图像特征、术后并发症情况、随访情况等。根据术后随访的影像学资料进行疗效评估,疗效分为完全缓解(瘤体消失)、部分缓解(瘤体直径缩小30%以上)、病变稳定(瘤体无缩小),病变进展(瘤体增大20%以上)。
  根据2015年AGA指南所推荐的高危因素来确定PCNs是否为高危囊腺瘤,有2个以上高危因素则判断为高危囊腺瘤。根据术后囊液分析回顾性分析高危囊腺瘤是否为粘液性,如为粘液性则认为直接行EUS-EA是有意义的,并进一步评估利用高危因素选择联合EUS-FNA和EUS-EA患者的准确性。
  结果:11名患者瘤体最大直径的中位数为2.80±1.49cm,根据囊液分析结果,6例浆液性囊腺瘤,4例粘液性囊腺瘤,1例未定型囊腺瘤。11名患者共行13次EUS-EA,手术成功率100%,术后无有临床意义的并发症出现。中位随访时间为4.0月(3-12个月)。总的疗效为5例完全缓解(45.5%),5例(45.5%)部分缓解,1例(9.0%)稳定,无进展病例。经过EUS扫查,共3例患者具有2个以上的高危影像学因素,通过囊液分析诊断均为MCNs。因此,通过高危因素判断选择直接行EUS-FNA联合EUS-EA患者的准确率的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为75%,62.5%,50%,83.3%和72.7%。
  结论:EUS引导下无水酒精消融术治疗胰腺囊性肿瘤手术成功率高、并发症少、总体疗效较好,具有两个以上危险因素的PCN为MCN的可能性较大,故通过高危因素判断来选择EUS-FNA联合EUS-EA的患者是可行的,但需要进一步大样本量、长期随访的临床对照研究进行证实。
  依据上述研究本课题可以得出以下结论:
  1、在AGA指南的基础上进行一些补充和改进可以有效的降低MNs的漏诊率。
  2、超声内镜引导下细针穿刺及囊液分析可以更准确的帮助的内镜医师判断胰腺囊性肿瘤的良恶性,为下一步的临床诊治策略的选择提供良好的依据。
  3、寻找超声内镜引导下无水乙醇消融术的标准操作流程是下一步的研究方向,大样本量多中心长时间随访的前瞻性研究是EUS-EA在临床广泛应用所必要的,EUS-FNA联合EUS-EA为临床更优化的诊治策略提供了一种思路。
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