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[硕士论文] 朱明明
病理学与病理生理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  B细胞淋巴瘤是来源于B细胞的实体肿瘤,分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。伯基特淋巴瘤(BL)在世界卫生组织(WHO)的淋巴瘤分类中被划分为具有高增殖指数的B细胞非霍奇金淋巴瘤,相关研究发现在90%的BL中存在免疫球蛋白基因位点的c-Myc重排,表明其恶性程度与c-Myc密切相关。近年来发现越来越多的超保守RNA(T-UCRs)在肿瘤的形成与发展机制中发挥重要作用。本课题组前期研究发现在不同c-Myc表达量的伯基特淋巴瘤模型中,部分T-UCRs有明显表达差异,本课题旨在进一步筛选与c-Myc相关的T-UCRs,并探讨uc.477+在B淋巴瘤细胞中的功能与机制。
  方法:
  1.在B细胞淋巴瘤细胞系及Myc-on淋巴瘤组织中,采用链特异性RT-PCR检测芯片中筛选出的12个T-UCRs,并与普通RT-PCR方法检测的结果进行比较。选取其中的uc.477+进行进一步研究。
  2.构建uc.477+的过表达质粒uc.477+-MSCV-PIG,将质粒转染至293T细胞并包装得到病毒,感染小鼠B淋巴瘤细胞株38B9细胞以及人B淋巴瘤细胞株Romas细胞株,经嘌呤霉素筛选,使uc.477+在细胞中过表达,并用流式细胞仪检测阳性表达率,建成稳定高表达uc.477+的B细胞淋巴瘤细胞株。
  3.通过细胞计数检测uc.477+过表达对B细胞淋巴瘤细胞的增殖的影响,并与感染空载体的细胞作比较;利用流式细胞计数检测uc.477+对B细胞淋巴瘤细胞的细胞周期和凋亡的影响;将过表达uc.477+及空载体pMSCV-PIG的38B9细胞经皮下注射至BALB/c小鼠,进行荷瘤,观察肿瘤的生长速度,两周后取瘤组织,测量体积与重量。
  4.检测uc.477+的宿主基因PLP1在正常小鼠B细胞、小鼠B淋巴瘤细胞(38B9,myc3)中以及在过表达uc.477+和空载体的38B9细胞中的表达情况,探讨uc.477+与其宿主基因之间可能的关系。检测uc.12+A的宿主基因SFPQ在B淋巴瘤细胞株中的表达情况,探讨uc.12+A与SFPQ之间的关系。
  结果:
  1.链特异性RT-PCR检测结果显示uc.477+、uc.12+A、uc.388+在小鼠B淋巴瘤细胞(38B9,myc3)以及Eu-myc小鼠的自发性B淋巴瘤中表达增高,其中uc.477+上调趋势显著,所以选取uc.477+作为进一步的研究对象。
  2.选取多个来自正义链和反义链上的T-UCRs用链特异性RT-PCR和普通RT-PCR检测表达并进行结果比对,以验证链特异性RT-PCR方法的可靠性。发现uc.31+、uc.142+A、uc.468+A在myc3细胞株中链特异性反转录组的表达下调;uc.388+与uc.12+A的链特异性RT-PCR组表达比非特异性RT-PCR组低,但在这两种检测方法中,uc.388+与uc.12+A在淋巴瘤细胞株(38B9)中表达上调的总趋势没有改变,说明链特异性RT-PCR可排除来自另一条链上的RNA干扰,检测结果更为精准。
  3.体外检测38B9细胞和Romas细胞过表达uc.477+后与MSCV对照组比较,发现细胞增殖加快,凋亡减少,细胞周期显示G0-G1期减少,G2-M期增高。体内检测38B9细胞过表达uc.477+后肿瘤组织与对照组相比,重量与体积明显增大。
  4.RT-PCR检测结果显示uc.477+的宿主基因PLP1在B淋巴瘤细胞株中的表达增高,PLP1在过表达uc.477+的38B9中表达增高。同时也发现uc.12+A的宿主基因SFPQ在B淋巴瘤细胞中表达增高,SFPQ在过表达uc.12+A的B淋巴瘤细胞株中高表达,uc.12+A与SFPQ在正常B细胞与B淋巴瘤细胞中表达呈显著正相关。流式检测发现在B淋巴瘤细胞株38B9细胞中过表达uc.12+A,细胞的增殖分裂速度加快。
  结论:
  uc.477+与uc.12+A在B淋巴瘤细胞中表达增高,具有促进B细胞淋巴瘤细胞生长的作用.
[硕士论文] 陈曦
内科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是近20年来在所有恶性肿瘤领域的诊断、治疗及预后等方面研究进展最迅速的一种血液疾病,其在血液学恶性肿瘤中的发病率仅次于淋巴瘤,且目前仍不可被治愈。而MM的治疗进展主要得益于诊断水平的提高,尤其是在血清、细胞、分子及基因等多层次方面均有长足进步。血清学诊断方面最显著的项目是血清游离轻链(Serum free light chains,sFLCs)检测,这种检测方法大大弥补了既往凭临床表现、骨髓浆细胞比例及免疫固定电泳(Immunofixation electrophor-esis,IFE)的不敏感、不定量、易漏诊等方面不足。本实验使用sFLCs联合IFE检测对多发性骨髓瘤患者进行筛选、预后判定以及疗效评估,以进一步评价血清游离轻链检测在多发性骨髓瘤患者临床管理中的价值。
  方法:
  选取2012年1月1日至2018年1月1日江苏省苏北人民医院血液科99名初治MM住院患者,并设置50名健康体检人群作为对照组,通过sFLCs联合IFE检测对MM患者进行筛选。随后对资料完整的87例MM患者进行随访,平均随访时长30.2个月,并将以上患者初诊时sFLCs检测结果结合R-ISS分期系统对MM患者进行预后判定。另通过sFLCs检测联合IFE对使用不同方案(包括CTD方案及PAD方案)治疗足四疗程的40例患者治疗前后进行疗效评估。
  结果:
  1.99例初诊MM患者及50例健康体检人群均同时采用sFLCs及IFE检测,随后通过SPSS22.0对上述不同检测方法的结果进行卡方检验,结果显示sFLCs检测和IFE具有一定的统计学差异。而sFLCs检测相对IFE更敏感,且将sFLCs及IFE检测联合起来比任何一种单一检测方法具有更高的灵敏度及特异度。
  2.将sFLCs联合R-ISS分期系统对87例于本院治疗资料完整的MM患者进行生存曲线分析,结果提示高血清游离轻链率及R-ISS分期越晚的MM患者,预后越不佳。
  3.此外,在对40名采用不同治疗方案(包括CTD方案及PAD方案)并且满四个疗程的MM患者进行疗效评估,采用Excel对其治疗前后的sFLCs检测结果进行配对样本t检验示p<0.01,说明治疗前后sFLCs的差异具有统计学意义,并且对不同治疗方案进行秩和检验发现PAD方案治疗的疗效明显优于CTD治疗方案。
  结论:
  sFLCs联合IFE检测能够筛选出MM患者,并对初诊MM患者的预后进行判定,优化治疗方案的选择,同时对治疗疗效进行检测。因此,sFLCs联合IFE检测在MM患者临床管理(包括早期诊断、预后判定以及疗效评估)中意义重大。
[硕士论文] 刘星
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。大部分临床化疗药对正常细胞和肿瘤细胞缺乏选择性,在杀伤肿瘤细胞的过程中会损伤人体的正常组织细胞,引起严重的毒副作用,并产生耐药性。水溶性多羟基富勒醇C60(OH)n和Gd@C82(OH)n(18≤n≤24)由于其独特的化学结构和物理性质受到广泛关注,在生物医学领域具有良好应用潜力。迄今为止国内外尚无文献报到富勒醇对白血病细胞系作用。本文拟从富勒醇对血清白蛋白相互作用和富勒醇对人源慢性髓系白血病K562细胞增殖和凋亡等方面展开研究工作。其具体内容如下:
  第一部分综述了富勒烯衍生物的性质及对各种肿瘤细胞的作用,阐明了富勒烯衍生物的潜在抗肿瘤活性和可能作用机制,以及富勒烯衍生物在光动力治疗和药物输送系统中的独特应用,进一步证明了富勒烯衍生物纳米颗粒在肿瘤治疗中具有潜在的应用前景。同时指出,目前富勒烯衍生物在临床或生物医学领域上所面临的挑战性问题。
  第二部分利用紫外-可见(UV-vis)光谱与荧光(FL)光谱法,采用Stern-Volmer方程,Lineweavei-Burk双倒数方程和双对数回归曲线模型,研究在不同温度下内嵌金属富勒醇Gd@C82(OH)n与血清白蛋白间结合作用的荧光行为,分别计算结合常数、结合位点和作用距离等,明确了富勒醇对血清白蛋白的荧光的猝灭作用机理为动态猝灭和静态猝灭协同作用的结果。低浓度下富勒醇与血清白蛋白以11结合形成基态复合物,且主要为静态猝灭,可能发生非辐射能量转移,推断出富勒醇与BSA之间主要为静电引力,而与HSA的作用力主要为范德华力和氢键。从三维荧光光谱与三维等高线剖面图研究发现富勒醇与血清白蛋白的反应引起蛋白质荧光猝灭和构象变化。同步荧光光谱表明,富勒醇BSA结合位点位于酪氨酸(Tyr)残基,而HSA分子的结合位点主要在色氨酸(Trp)残基上,两者均引起血清白蛋白构象的变化。进一步建立富勒醇血清白蛋白结合率的理论模型,预测药物与蛋白结合率随着浓度的变化而处于动态变化,且富勒醇与BSA结合率明显大于HSA,受温度影响较大。
  第三部分观察富勒醇C60(OH)n对慢性髓系白血病K562细胞的生物学特性的影响,如细胞增殖、周期以及凋亡等。初步结果显示:1)C60(OH)n干预K562细胞48h后,抑制增殖效果开始显现,且相对比较稳定,即C60(OH)n的浓度低于60μmol/L时对K562细胞有促进增殖的作用,高浓度(80~320μmol/L)时C60(OH)n明显抑制K562细胞的生长,生长抑制率最高可达40.7%,表现出剂量和时间的依赖性;2)C60(OH)n通过阻滞细胞于G2/M期,以及通过降低线粒体膜电位、并诱导细胞凋亡显著抑制K562细胞生长,细胞超微结构出现显著变化,可见核固缩、边聚和凋亡小体。
  第四部分探讨金属富勒醇Gd@C82(OH)n对慢性髓系白血病K562细胞的增殖、细胞周期、凋亡等生物学特性的影响。体外抗癌试验初步证实,金属富勒醇Gd@C82(OH)n亦具有一定的抑制人原髓细胞白血病癌细胞K562增殖活性与诱导肿瘤细胞凋亡的作用特性,且呈现出的量效关系。
Oncology 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:淋巴瘤的发病率逐年上升,目前,淋巴瘤已经是常见的恶性肿瘤之一。弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的淋巴瘤亚型。目前,化疗仍然是治疗DLBCL的主要方法,60%左右的DLBCL患者可以通过免疫化疗得到治愈。约40%的DLBCL的患者化疗失败。导致化疗失败的因素很多,临床上认为肿瘤细胞对化疗药物耐药是化疗失败的主要原因。耐药性的产生可能与肿瘤细胞膜或者细胞核表面某些蛋白过表达有关。近几年研究发现,MYC和BCL2蛋白过表达的DLBCL患者预后差,P53基因突变的慢性淋巴细胞白血病的患者化疗疗效差,那么,MYC蛋白、BCL-2蛋白和P53蛋白过表达是否与DLBCL化疗耐药相关目前尚无定论,所以进行了相关研究。
  目的:
  分析弥漫大B细胞淋巴瘤患者组织中MYC、BCL2和P53蛋白表达对初始化疗客观有效率的影响,探讨化疗耐药的可能机制。
  材料和方法:
  收集2014年6月至2017年6月期间,在大连医科大学附属第二医院确诊的137例DLBCL患者的临床资料,根据2008年世界卫生组织的分类,所有患者都经病理组织学诊断为DLBCL。原发中枢神经系统淋巴瘤、手术后无可观察的病灶、化疗不足4个周期、失访、组织标本不能满足本研究免疫组化要求的患者被排除在外。合格的病例仅剩48例。48例患者根据化疗疗效分为两组,一组为完全缓解(CR)组,由完全缓解(CR)和可能完全缓解(CRu)病例组成,另一组为未完全缓解组,由部分缓解(PR)、稳定(SD)和无效(PD)病例组成。所有组织标本均为化疗前的标本。应用免疫组织化学方法分析肿瘤标本中的MYC、BCL2和P53的蛋白表达。所有的免疫组化分析结果都没有任何临床的干预。根据现有文献中所述,将MYC、BCL2、p53蛋白阳性的截尾值分别设定为染色的肿瘤细胞的40%、50%、30%。分析MYC、BCL2和P53蛋白表达与化疗近期疗效的关系。数据分析使用统计软件SPSS22.0,以计算所有描述性统计。使用Fisher精确检验、卡方检验和Mann Whitney U检验评估临床特征和MYC、BCL2、P53蛋白的表达情况的相关性。P<0.05即被认为是有统计学意义。
  结果:
  本研究回顾分析了年龄、性别、LDH、分期、IPI评分、细胞来源(生发中心型,非生发中心型)、β-2微球蛋白和ESR对化疗近期疗效的影响,只有分期和ESR与化疗临床完全缓解(CR+CRu)率相关(P=0.02,P=0.05)。MYC过表达13例(27%)。BCL2过表达18例(38%),P53过表达17例(35%)。一线化疗后,只有MYC蛋白过表达与临床CR+CRu率相关(P=0.05),MYC蛋白过表达CR+CRu率低。BCL2或P53过表达与临床反应的关联无统计学差异(P=0.96,P=0.75)。与MYC+/P53+与MYC-/P53-的DLBCL患者CR+CRu率比较差异显著(p=0.03)。而MYC+/BCL2+的联合过度表达与MYC-/BCL2-相比较,一线化疗后的临床CR+CRu率之间没有显著性差异(p=0.22)。BCL2+/P53+与BCL2-/P53-的DLBC患者化疗疗效比较没有发现统计学差异(P=1.oo)。应用Mann-Whitney U test方法检测MYC、BCL2、P53蛋白表达率分别在40%、50%、30%截尾值以下时对DLBCL患者化疗CR+Cru率的影响,结果分别为p=0.93,p=0.99,p=0.37。提示MYC、BCL2、P53蛋白低表达对DLBCL患者化疗近期疗效无影响。
  结论:
  1.回顾性分析提示,分期晚及ESR高的DLBCL患者化疗近期疗效差。
  2.MYC蛋白过表达的DLBCL患者化疗近期疗效差,提示MYC蛋白过表达可能是化疗耐药的因素。
  3.MYC与P53蛋白联合过表达的DLBCL患者化疗近期疗效最差,提示MYC蛋白与P53蛋白在诱导化疗耐药方面可能有协同作用。
[硕士论文] 张榕
预防兽医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:牛白血病病毒(Bovine leukemia virus,BLV)属于反转录病毒科(Retroviridae),丁型反转录病毒属(Deltaretrovims)。该病毒会引起牛淋巴细胞持续性增生,进而导致牛地方流行性白血病的发生。BLV的感染和传播非常普遍,其在中国有较高的流行率。近期,美国学者的研究发现,人类乳腺上皮细胞中存在BLV DNA。随后的研究中发现,BLV DNA在乳腺癌患者的乳腺上皮组织中的阳性率为58.8%(67/114),显著高于普通人群中的阳性率(28.8%,30/104)。这一发现提示,BLV感染可能与人类乳腺癌发生有潜在的联系。本研究建立了检测BLV前病毒的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并基于我国上海、江苏、安徽等地乳腺癌患者的乳腺组织和全血样品,采用多种高灵敏度的方法检测BLV的核酸和抗体,进一步探讨BLV感染与人类乳腺癌发生的相关性。
  一、检测BLV前病毒的LAMP方法的建立
  牛地方流行性白血病有多种诊断方法,包括病理组织学检测、血液学检测、血清学方法以及分子生物学检测。LAMP方法是一种可以在等温条件下扩增核酸的新型技术,具有操作简便,检测成本低的优势。本研究根据GenBank中提供的BLV基因序列,基于其保守区域设计内引物、外引物以及环引物,并建立BLV的LAMP反应体系。在此基础上,通过探索外内引物比例、Mg2+浓度、Bst2.0DNA酶的添加量以及dNTPs浓度,优化LAMP反应参数条件。同时,通过在反应体系中加入钙黄绿素试剂,实现结果的可视化判定。本研究建立了一种能够在25μL反应体系中实现单拷贝病毒核酸检测的BLV LAMP方法,该方法灵敏度优于普通PCR检测方法,并有良好的特异性。
  二、BLV感染与人乳腺癌发生相关性的研究
  有研究发现在人的乳腺上皮组织中能够检测到BLV DNA,并推测BLV可能与人乳腺癌发生存在潜在的联系。乳腺癌的很多高危因素已被证实,但其发生的机理尚未清楚。BLV感染是否会引起乳腺癌的发生,这引起了众多研究者的关注。但截止到目前,并未证实BLV感染与乳腺癌发生存在关联性。
  根据我国BLV的分子流行病学调查,BLV在上海、江苏和安徽有较高的阳性率,所以本研究选择的乳腺癌患者的样品均来自上述三个地区,主要为乳腺组织样品和全血样品。91份乳腺癌患者的冰冻乳腺组织样品,其中66份来自上海健康所,25份来自江苏扬州苏北人民医院;160份乳腺癌患者的全血样品,其中140份由苏州大学第三附属医院提供,20份由安徽淮南朝阳医院提供。本研究采用100份正常人群全血样品作为对照组,该样品来自扬州市苏北医院2013年体检人群,体检人群均被确认为非乳腺癌患者。此外,本研究在安徽、北京、上海和江苏四个地区的奶牛场采集了150份奶牛全血样品。
  本研究为了精确检测人类体内是否存在BLV的核酸和抗体,采用了LAMP、PCR和ELISA多种高度灵敏、特异的检测方法。PCR方法包括:1)1种本实验室建立的FRET-qPCR方法;2)首次报道BLV和乳腺癌相关性的实验室建立的检测方法,包括1种普通PCR方法和5种巢式PCR方法。LAMP方法为本研究所建立的BLV LAMP检测方法。ELISA方法为针对gp51蛋白的商业化ELISA试剂盒。
  奶牛全血样品检测的结果显示,LAMP和FRET-qPCR两种方法检出阳性率为50.0%,检测结果高度吻合。其中,ELISA方法检出阳性率为48.7%,其中4份样品由于奶牛处于BLV感染早期,体内抗体含量未达到ELISA试剂盒检测限。该结果证实上述三种检测方法的可行性。随后,采用这三种方法分别检测人的乳腺组织样品和全血样品,均未在样品中检测出BLV核酸或特异性抗体。此外,本研究使用已报道BLV和乳腺癌相关性的实验室建立的检测方法检测乳腺组织样品的核酸,同样未检测到BLV的核酸。因此,本研究认为BLV感染与上述地区人类乳腺癌的发生不存在直接的关联性。
  综上所述,本研究建立一种快速、灵敏的BLV LAMP检测方法,并研究证实在安徽、江苏、上海等3个地区,BLV的感染与乳腺癌的发生无相关性。由于遗传背景和牛奶消费习惯等方面的差异,不同人群中BLV的感染与乳腺癌发生的相关性还需要进一步的研究。
[硕士论文] 苏锐
呼吸内科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨弥漫性肺淋巴管瘤病(diffuse pulmonary lymphangiomatosis,DPL)的临床特点,并复习文献,旨在提高对DPL的认识。
  方法:收集我院收治的1例弥漫性肺淋巴瘤病的临床表现、影像学特点、病理特征及其治疗,并结合文献复习进行探讨。
  结果:(1)患者为青年男性,发病年龄13岁,主要临床表现为咳嗽、咳痰、呼吸困难。胸部CT提示两肺弥漫性斑片状影,并胸腔、心包积液,纵隔肿块影。胸腔积液为血性乳糜性。心包病理为以海绵状淋巴管瘤形态为主,免疫组化结果D2-40部分(+),CD31部分(+),CD34部分(+),CD20灶状(+),CD3少数(+)。2012年4月经心包大部切除术、胸腔穿刺抽胸水、抗感染治疗后病情好转,但仍反复发作,发作时予抗感染及对症治疗后好转,2017年11月予口服泼尼松治疗,服用2个月后患者自行停用泼尼松,随访4月,未见复发。(2)文献复习结果:以“弥漫性肺淋巴管瘤病”为关键词通过中国知网和万方数据库检索1990年-2018年文献,共获得相关病例报道7篇,共报道有明确病理诊断10例,以“diffuse pulmonarylymphangiomatosis”为关键词通过PupMed进行检索,共获得外文相关病例报道32篇,共报道有明确病理诊断39例,国内外文献报道共49例病例。49例患者男∶女为1.5∶1,发病年龄8个月~55岁,平均年龄17.7岁,中位年龄13岁。临床表现无症状者6%(3/49),呼吸困难69%(34/49),咳嗽49%(24/49),咳痰24%(12/49),咯血20%(10/49),发热16%(8/49),活动耐力下降12%(6/49),胸闷10%(5/49),胸痛8%(4/49),其他腹痛、腰痛、心悸、下肢肿大都为个例。胸部影像学多表现为两肺小叶间隔增厚,散在分布条索影、网格影、斑片影,大部分病人有胸腔积液及纵隔低密度占位,侵犯心包时有心包积液。确诊方式外科手术活检55%(27/49),胸腔镜活检23%(11/49),纤支镜下肺组织活检(TBLB)16%(8/49),纵隔镜活检4%(2/49),尸检2%(1/49)。病理表现为病灶呈多造性分布,可见弥漫增生和扩张的淋巴管和血管,增生的淋巴管、内皮细胞无异型性,伴有不同程度的纤维化,部分可见含铁血黄素巨噬细胞。免疫组化染色D2-40阳性。治疗方法包括手术、放疗、饮食治疗、药物治疗等。49例患者中,11例未提及预后,剩余38例中,共死亡16例,占42%,病程1月至12年,平均病程35.8月。
  结论:1、弥漫性肺淋巴管瘤病在临床中罕见,多见于儿童,男性多于女性。其临床表现缺乏特异性。病灶具有一定的侵袭性,常侵犯肺、纵隔、胸膜、心包等,引起呼吸困难、呼吸衰竭而死亡。2、DPL胸部CT主要表现为两肺小叶间隔增厚,弥漫性条索影、网格影、斑片影,大部有胸腔积液及纵隔低密度占位,胸部CT增强后无明显强化可除外血管瘤。支气管镜和肺功能检查无特异性。3、确诊依赖病理。病理学上表现为淋巴管瘤,为弥漫增生和扩张的淋巴管,淋巴管内皮细胞增殖分化,无异型性,免疫组化染色D2-40阳性。4、病理多通过外科手术取得,TBLB、胸腔镜等也是常用方法。5、DPL尚无特异性治疗,DPL预后差,死亡率高,且发病年龄越早,预后越差。
[硕士论文] 马咏歌
药理学 黑龙江中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  以人类慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562为研究对象,探讨三氧化二砷(ATO)对K562细胞凋亡的影响,并探讨ATO对于Hedgehog(Hh)信号转导通路相关分子Gli1、Gli2、Smo和Ptch在mRNA和蛋白表达水平的影响,分析ATO影响Hh通路活性的可能机制,为将ATO应用于具有Hh通路异常激活的CML提供可靠的理论依据。
  方法:
  (1)使用不同浓度的ATO作用于K562细胞48小时,经AnnexinⅤ-FITC/PI染色后,采用流式细胞术检测ATO诱导K562细胞凋亡的效果。
  (2)采用免疫印迹(WB)技术检测ATO对Hh通路分子Gli1、Gli2、Ptch2蛋白水平表达的变化以及对CML致病关键分子P210/Bcr-Abl表达的影响。
  (3)采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测ATO对于Hh通路分子Gli1、Gli2、Smo和Ptch在mRNA水平表达的影响。
  结果:
  (1)经不同浓度ATO处理48小时后,各实验组K562细胞均出现了凋亡现象,且随着ATO的浓度的升高,凋亡效果越明显,呈剂量依赖性。
  (2)ATO对于Gli2和P210/Bcr-Abl蛋白表达具有显著的抑制作用,且抑制作用均呈剂量依赖性(P<0.05);ATO对于Ptch2蛋白表达具有一定的促进做用,但高剂量呈抑制作用(P>0.05);ATO对于Gli1蛋白表达无明显抑制作用。
  (3)ATO对于Gli1和Gli2mRNA表达水平均具有显著的抑制作用,且抑制作用均呈剂量依赖性(P<0.05);ATO可以上调Ptch的mRNA表达水平(P<0.05);无论任何浓度的ATO均未对Smo的mRNA表达水平产生影响(P>0.05)。
  结论:
  (1)ATO对K562细胞具有明显的诱导凋亡作用。
  (2)ATO可能是以Gli2蛋白为靶点抑制Hh通路活性,并通过降解P210/Bcr-Abl蛋白发挥作用。
  (3)ATO可能是通过抑制Gli1和Gli2的mRNA表达水平,上调Hh通路的抑制因子Ptch的mRNA表达水平,从而抑制Hh通路的异常激活。
[博士论文] 钟婧
医学影像学与核医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面展开论述:
  第一部分 扩散峰度成像对于淋巴瘤鉴别及分型诊断价值的研究
  目的:探讨磁共振扩散峰度成像(diffusion kurtosis imaging,DKI)对淋巴瘤鉴别以及病理分型诊断的临床应用价值,并与传统单指数模型参数进行对比。
  方法:前瞻性收集67例合并颈部淋巴结浸润的淋巴瘤病例(淋巴瘤组),50例颈部淋巴结转移病例(转移组)和35例健康志愿者(良性组)。所有受试者使用Philips3.0T磁共振行单指数模型扩散加权成像(DWI)及非高斯模型扩散峰度成像(DKI)扫描。DWI b值取值0和800s/mm2,DKIb值取值0、1000、2000s/mm2。将扫描后数据导入Philips后处理工作站,计算出三组淋巴结对应单指数模型参数ADC值及非高斯模型参数D值、K值。比较淋巴瘤受侵淋巴结与良性淋巴结、转移淋巴结,淋巴瘤各病理亚型组等参数值的差异。并绘制受试者工作特性曲线,评价各参数值对淋巴瘤的诊断效能。
  结果:良性组ADC值及D值(ADC值:1.029±0.107×10-3mm2/s,D值:1.370±0.183×10-3mm2/s)最高,转移组次之(ADC值:0.809±0.120×10-3mm2/s,D值:1.102±0.162×10-3mm2/s),淋巴瘤组最低(ADC值:0.735±0.228×10-3mm2/s,D值:1.033±0.468×10-3mm2/s),差异具有统计学意义。良性淋巴结组的K值(0.823±0.211)低于转移组(1.005±0.208)及淋巴瘤组(1.001±0.248),转移组及淋巴瘤组间的K值接近。而在病理分组对比中,HL组的ADC值及D值(ADC值:1.006±0.244×10-3mm2/s,D值:1.839±0.289×10-3mm2/s)明显高于NHL组(ADC值:0.699±0.201×10-3mm2/s,D值:0.923±0.371×10-3mm2/s),两组K值没有统计学差异,在NHL内,T细胞来源组与B细胞来源组的ADC值、D值及K值间均无明显统计学差异。各参数行ROC曲线分析发现ADC值总体诊断淋巴瘤效能略高于D值,当ADC值取最佳诊断阈值为0.685×10-3mm2/s,诊断淋巴瘤的敏感性和特异性分别为96.5%和47.8%。而ADC值及D值对NHL淋巴瘤的诊断效能优于总淋巴瘤,D值诊断效能高于ADC值,当D值取最佳诊断阈值为0.9395×10-3mm2/s,诊断NHL的敏感性和特异性分别为92.5%和64.4%。K值对淋巴瘤及NHL淋巴瘤均不具备诊断效能。
  结论:DWI和DKI模型参数均可用于鉴别诊断淋巴瘤,其中D值对NHL淋巴瘤的诊断价值较高。K值为淋巴结良恶性病变鉴别诊断提供补充信息。
  第二部分 DKI与淋巴瘤预后危险因素及侵袭性分级相关性研究
  目的:对DKI参数与淋巴瘤预后危险因素Ki67表达量及不同侵袭性分级间进行相关性研究,探讨DKI在淋巴瘤预后及侵袭性分级无创评估上的应用价值。
  方法:前瞻性入组67例淋巴瘤患者,行DWI及DKI扫描,参考2000年WHO淋巴瘤分类将淋巴瘤患者按照侵袭性程度分为惰性、侵袭性及高侵袭性三组,采用标准免疫组织化学染色S-P法测定病灶Ki67表达量。检验不同侵袭性分组间DKI参数差异以及Ki67表达量与DKI模型各参数之间相关性。
  结果:ADC值及D值随着淋巴瘤侵袭性升高而降低,K值和Ki67表达量升高,惰性组与侵袭性组、惰性组与高侵袭性组间,ADC值、D值、K值及Ki67表达量之间都存在显著差异,而侵袭性组与高侵袭性组之间,DKI参数值和Ki67的表达量均没有明显统计学差异。spearman相关分析表明ADC值和D值与Ki67值存在显著负相关(r=-0.340,P<0.01,r=-0.478,P<0.001),K值与Ki67表达量呈正相关(r=0.618,P<0.001)。
  结论:DWI及DKI模型参数定量参数与淋巴瘤侵袭性和预后危险因素存在显著相关性。DKI具有评估淋巴瘤侵袭性及预后的潜在能力。
  第三部分 淋巴瘤DKI参数与组织病理图像特征的相关性研究
  目的:对DKI模型参数值与计算机辅助聚类分析病理图像特征进行相关性探索,探索DKI参数值变化的相关细胞学机制。
  方法:前瞻性入组16例淋巴瘤患者。行DWI及DKI扫描并测量其参数值。对病灶活检标本行HE染色,对病理HE图像通过计算机辅助聚类分析计算出细胞计数、细胞核、胞浆、胞外间隙单独面积比及核浆、核与胞外间隙面积比等病理特征参数,另通过GLCM纹理特征分析计算出纹理参数同质性(Homogeneity),对淋巴结DWI和DKI参数值与上述病理特征参数进行相关性分析。
  结果:ADC值与细胞计数呈负相关(r=-0.847,P<0.001),与胞浆面积、胞核与胞外间隙面积比以及Homogeneity呈正相关(r=0.539,P<0.05;r=0.582,P<0.05;r=0.772,P<0.001)。D值与细胞计数值、胞外间隙面积呈负相关(r=-0.788,P<0.001;r=-0.515,P<0.05),胞核与胞外间隙面积比以及图像同质性呈正相关(r=0.535,P<0.05;r=0.763,P<0.01)。而K值则与细胞计数值呈正相关(r=0.711,P<0.01),与同质性呈负相关(r=-0.598,P<0.05)。
  结论:DWI和DKI参数值与病理特征参数存在显著相关,DKI模型参数值特别是K值能够作为评估肿瘤微组织结构复杂性和异质性的特征性指标。
[硕士论文] 陈燕
内科学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  研究IL-17A对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化作用的影响及其可能的机制。
  方法:
  以3例确诊为MM的患者为研究对象,取骨髓血并采用密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs),在低糖培养基(LG-DMEM)的培养下得到贴壁细胞,进行消化、分离、扩增得到纯度高的MSCs,并在显微镜下观察其生长、增殖情况。实验组用含IL-17A(终浓度10ng/ml),对照组分别用含TNF-α(终浓度50ng/ml)、TGF-β(终浓度10ng/ml)以及IFN-γ(终浓度10ng/ml)的LG-DMEM培养基培养MSCs,空白组为不加上述因子的LG-DMEM培养基。在上述不同细胞因子作用的第3天采用CCK-8试剂盒测定各细胞因子对MSCs的增殖速率影响情况(空白组增殖率计为100%);第14天时开始采用含有地塞米松(10-8mol/L)、维生素C(0.05g/L)和β-甘油磷酸钠(10-2mol/L)的LG-DMEM条件培养液诱导MSCs成骨分化。第28天时对MSCs进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色测量显色面积,钙结节(Von Kossa)染色计数钙结节形成的个数,评估MSCs成骨分化的能力;并提取各组的蛋白,采用蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)检测成骨分化相关通路蛋白Runx2、Wnt5a及TRAF4等表达情况;探讨IL-17A对MM患者MSCs的成骨分化影响及其可能的机制。
  结果:
  (1)BMMNCs中分离出贴壁细胞,经消化、扩增为形态,大小一致,长梭形的MSCs。(2)检测各细胞因子作用3天后MSCs增殖能力变化情况,CCK-8法测得IL-17A、TNF-α及TGF-β组参照于空白组增殖活力无明显变化,增殖率分别为96.6%±1.7%,93.9%±1.7%和94.1%±3.0%(P>0.05),而IFN-γ组增殖率相对空白组减低,为74.6%±7.2%(P<0.05),可见除IFN-γ对MSCs的增殖有抑制外,IL-17A、TNF-α及TGF-β对MM患者的MSCs增殖均无明显作用。(3)IL-17A作用后MSCs的ALP活性较空白组升高,测得IOD sum/Area sum值分别为0.322±0.054和0.192±0.031,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-α组和TGF-β组的IOD sum/Area sum值分别为0.369±0.048和0.277±0.041,也高于空白组(P<0.05),而IFN-γ组则低于空白对照,为0.113±0.031(P<0.05)。可见IL-17A能显著提高MSCs的ALP活性,促进成骨细胞分化,TNF-α和TGF-β的作用次之;而IFN-γ对MSCs成骨分化则起抑制作用。(4)第28天,Von-Kossa染色结果显示,IL-17A、TNF-α及TGF-β组的平均钙结节个数分别为17.7±1.5,16.8±1.6和15.0±1.5,高于空白组12.0±1.7(P<0.05);而IFN-γ组平均钙结节个数为7.3±1.5,低于空白组(P<0.05)。(5)Western blot检测MSCs表达的Runx2含量,显示IL-17A、TNF-α与TGF-β组Runx2表达量明显高于空白组(P<0.05),而IFN-γ组Runx2表达量与空白组相比无显著性差异(P>0.05);Wnt5a蛋白表达含量在IL-17A和TNF-α组较空白组显著减少(P<0.05),而TGF-β及IFN-γ组Wnt5a表达量与空白组无明显差异;检测相关通路上的TRAF4蛋白表达量,与空白组对比,IL-17A和TNF-α组显著升高,TGF-β组无显著差异,而IFN-γ组显著减低(P<0.05)。
  结论:
  (1)IL-17A及TNF-α能够有效促进MM患者MSCs的成骨分化,促进其ALP活性增加与钙结节的形成;
  (2)TGF-β对MM患者MSCs的成骨分化具有一定的促进作用,而IFN-γ对MSCs有抑制成骨的作用;
  (3)IL-17A和TNF-α促MM患者MSCs成骨分化作用可能与TRAF通路相关。
[硕士论文] 蒲伟民
耳鼻咽喉科学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究分析鼻腔NK/T细胞淋巴瘤(Clinical Analysis of Nasal NK/T-cell Lymphoma)的临床资料,回顾性分析其临床特点、诊疗与预后关系.
  方法:收集福建医科大学附属漳州市市医院2010年1月—2014年10月之间收治的40例具有完整记录的鼻腔NK/T细胞淋巴瘤患者临床资料,应用Cox比例风险回归模型及Kaplan-Meier探讨预后影响因素.
  结果:本组病患男性24例,女性16例,男女比例为3:2;中位年龄59岁(31~85岁).主要症状表现分别为鼻阻,流脓涕35例(87.5%),鼻出血及回缩性涕血6例(15%),面部肿胀、疼痛、面部糜烂坏死2例(5%),头晕1例(2%).病变范围主要为鼻腔,鼻腔邻近结构受侵比例为筛窦(50%)、上颌窦(35%)、蝶窦(25%)、鼻中隔(25%)、硬腭(25%)、鼻背皮肤(25%).接受临床治疗29例,放弃治疗11例.其中单纯化疗组8例,放疗加化疗组21例.通过Kaplan-Meier生存分析表明,病患1、2、及3年的累积生存率各为70%、67.5%及67.5%.经单因素分析对预后有意义为:年龄、β2-微球蛋白、LDH、白细胞总数、EBV抗体、临床分期及治疗;COX模型多因素回归分析独立预后因素为:年龄、白细胞总数及临床分期.
  结论:鼻腔NK/T细胞淋巴瘤临床表现较典型,年龄、白细胞总数及临床分期为影响预后的独立因素;治疗方案上联合放化疗优于单纯化疗.
[硕士论文] 戴丽霞
药理学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是一种淋巴祖母细胞恶性增殖的血液性疾病。ALL同时可见于儿童和成人,常见于2-5岁儿童。随着治疗仪器和手段的进步,目前儿科ALL治愈率高达90%,但成人治愈率仅为30%左右。对于难治性/复发性ALL,患者治愈率和5年生存率低,这仍然是国际治疗的难题。因此,新治疗策略的开发和肿瘤分子机制的研究显得尤为重要。
  硼替佐米(bortezomib)是一种合成的高选择性26S硼酸盐蛋白酶体抑制剂,2003年被美国FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤,并于2006年底批准治疗套细胞淋巴瘤。Bortezomib是目前研究最为广泛的一种蛋白酶体抑制剂,体外实验表明它对60种肿瘤细胞都有明显的抑制作用。且对多种血液疾病都有良好疗效,在ALL治疗上处于临床Ⅱ/期。
  B淋巴细胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2,Bcl-2)是最早研究与细胞凋亡相关的一类原癌基因。Bcl-2家族蛋白分为抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-xl,Bcl-w,Mcl-1和A1等)和促凋亡蛋白(Bak,Bax,Bok,Bik,Bim等)。Bcl-2家族蛋白主要定位于线粒体,并且通过线粒体途径调控细胞凋亡。由于大部分肿瘤细胞过表达Bcl-2等蛋白,研究员开发了一系列的Bcl-2家族蛋白抑制剂,其中包括obatoclax,AT-101,ABT-199等等。
  研究目的:
  自噬和泛素-蛋白酶体是细胞内蛋白降解的两大通路,前者主要负责降解长寿蛋白和损伤的细胞器,后者则负责短寿蛋白的降解。bortezomib是一种有效的26S硼酸盐蛋白酶体抑制剂,但同时可以诱导自噬引起药物耐受。单独使用bortezomib后,发现会造成一些抗凋亡蛋白的蓄积,如Mcl-1。因此,本课题中我们设计并探索了bortezomib联用Bcl-2抑制剂(obatoclax、AT-101、ABT-199)是否在急性淋巴白血病细胞上出现协同细胞毒性作用的实验方案。并对bortezomib联用obatoclax的协同细胞毒性机制进行初步的阐释和研究,希望能为临床研究中解决单药活性低、易耐药提供一个有价值的参考,也为临床上药物联合应用提供一个新的治疗方案。
  研究方法:
  1.MTT检测药物的细胞毒性作用
  2.Western blot检测bortezomib单独处理细胞后抗凋亡蛋白的变化情况
  3.MTT联合应用CompuSyn软件计算药物联用指数及联用前后浓度变化
  4.流式细胞术和Western Blot分别检测bortezomib联用obatoclax对白血病细胞凋亡的影响
  5.RT-PCR检测bortezomib联用obatoclax引起白血病细胞内质网应激反应相关基因的影响
  6.ER stress抑制剂TUDC对药物联用组细胞活性和凋亡的影响
  1)MTT检测TUDC对药物联用组细胞活性的影响。
  2)流式细胞仪检测TUDC对药物联用组细胞凋亡的影响。
  研究结论:
  1.Bortezomib、Obatoclax、AT-101和ABT-199单独使用可以显著性抑制白血病细胞Jurkat和Nalm-6细胞活力。
  2.Bortezomib单独处理细胞后造成抗凋亡蛋白Mcl-1显著蓄积。
  3.Bortezomib联用Obatoclax可以协同诱导白血病细胞的凋亡,但Bortezomib分别联用ABT-199、AT-101在MTT上并未发现协同作用。
  4.Bortezomib联用Obatoclax可以同时阻断自噬和泛素-蛋白酶体两大蛋白降解通路。
  5.Bortezomib联用Obatoclax引起内质网应激反应CHOP介导的细胞凋亡产生协同作用。
  6.内质网应激抑制剂(TUDC)可减少由内质网应激介导药物联用组(bortezomib+obatoclax)细胞的凋亡。
[博士论文] 付悦
内科学(血液病) 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  急性白血病根据受累细胞的不同,可分为急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)和急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML),病情凶险,预后不佳,因此深入解析其发生机制和诊疗靶点意义重大。基于组蛋白去+甲基化的表观遗传调控异常是白血病发生发展的重要原因,PHF8和KDM7A是携带JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶KDM7家族成员,然而,其与成人急性白血病发生发展的关系及相关机制尚不清楚。本研究目的在于:
  (一)解析组蛋白去甲基化酶PHF8介导成人ALL发生发展的功能与调控机制。
  (二)解析组蛋白去甲基化酶KDM7A介导成人AML的功能及其作为AML诊断和预后候选标志分子的潜在价值。
  方法与结果:
  (一)组蛋白去甲基化酶PHF8通过与MEK/ERK信号通路相互作用促进成人ALL的发生。
  1.PHF8在ALL中表达升高,并且与ALL的进展呈正相关:通过对GEO数据库中710例ALL骨髓样本和73例正常骨髓样本进行分析以及对17例ALL初诊骨髓样本和27例正常或缺铁性贫血骨髓样本进行检测,均发现PHF8在ALL患者中存在显著上调,说明PHF8可能参与ALL疾病的发生。对比初诊、完全缓解、复发的成人ALL患者以及对照组骨髓样本,证实PHF8的表达与ALL发生和进展呈正相关。对ALL初诊、完全缓解、复发不同时期患者PHF8蛋白水平的检测、对同一患者ALL不同疾病阶段PHF8表达水平的检测进一步验证了此结果。
  2.稳定干扰ALL细胞中的PHF8,可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,阻碍体内细胞生长:EdU和凋亡实验证明,慢病毒感染介导的PHF8稳定低表达抑制ALL细胞增殖、促进细胞凋亡。小鼠皮下成瘤模型证实PHF8稳定干扰细胞成瘤体积和重量较对照组明显降低。
  3.PHF8在体外和体内水平上调MEK1表达:MEK/ERK信号通路是肿瘤细胞增殖、凋亡的经典调控通路。稳定干扰PHF8的ALL细胞中存在MEK1mRNA和蛋白水平的下调,伴随MEK/ERK信号通路活性的降低。ChIP实验证实PHF8可以结合在MEK1的启动子区域,从而介导MEK1的表达上调。PHF8和MEK1表达的正性相关性在191例ALL标本中同样得到了验证。此外,ALL细胞PHF8稳定干扰的小鼠皮下成瘤样本中,干扰组MEK1的mRNA水平及蛋白水平较对照组明显降低,且二者表达呈正相关,在体内水平验证了PHF8对MEK1表达的正性调控。
  4.PD184352通过抑制MEK/ERK信号通路的活性下调PHF8的表达:PD184352是MEK/ERK信号通路的小分子抑制剂。免疫荧光结果显示,加入PD184352抑制MEK/ERK信号通路活性后,PHF8表达明显下调,证实PHF8与MEK/ERK信号通路存在正反馈调控。
  5.干扰PHF8可增强PD184352对于ALL细胞的杀伤作用:EdU及凋亡实验证明PD184352可以抑制ALL细胞增殖、促进细胞凋亡,基于PHF8与MEK/ERK信号通路的相互调控,PHF8干扰情况下PD184352对ALL细胞系增殖的抑制和凋亡的促进明显提高,说明PHF8干扰和MEK/ERK信号通路的抑制对于ALL细胞的杀伤具有明显协同作用。
  (二)组蛋白去甲基化酶KDM7A的低表达与AML患者的多种临床和生物学特征相关,有可能作为AML患者诊断及预后评估的潜在候选靶标分子。
  1.AML患者存在表观遗传学谱异常:为探究表观遗传学分子在AML发生中的作用,对GEO数据库中501例AML患者和73例正常骨髓样本的429个表观遗传学基因的表达进行了差异分析,发现AML患者存在表观遗传学基因表达的广泛异常。以“差异倍数大于1.2倍、校正后P<0.05”为界,共有111个表观遗传学基因在AML患者与对照样本中差异表达,其中71个基因表达上调,40个表达下调。显著上调基因有SMARCC1、KAT2A、ELMSAN1、DNMT3B、SMYD3等,显著下调的基因为KDM7A、KAT2B、CBX7、MYBL2、TADA2B等,其中KDM7A下调幅度最为明显,可进行更深入的研究。
  2.KDM7A的低表达可能参与AML的发生和进展:选择KDM7A作为进一步的研究对象,对比3组相互独立的AML与对照组的骨髓或外周血样本系列的KDM7A表达,发现KDM7A在AML患者中显著下调。同时对收集的正常骨髓样本、以及AML初诊、完全缓解和复发患者的骨髓样本检测,发现KDM7A的表达与AML发生和进展呈负相关。分别对比19例和11例患者AML初诊及复发期样本,结果显示KDM7A的低表达在AML复发期更为显著,可能参与AML的疾病进展。
  3.KDM7A的异常表达与多种AML临床及生物学特征相关:通过对数据库中KDM7A低表达组和高表达组不同临床及生物学特征进行分析,发现KDM7A的低表达与AML FAB分型、外周血及骨髓幼稚细胞比例相关,同时与许多已知的AML预测分子的表达具有相关性,如ERG、WT1、FLT3等。
  4.KDM7A低表达可能作为AML的不良预后的潜在候选靶标分子:通过对GEO等数据库进行分析,证明KDM7A低表达的AML患者具有更短的生存期和更差的预后,在染色体核型正常的AML患者和使用法尼基转移酶抑制剂治疗的难治复发AML患者中也得到了同样的结果。
  结论:
  (一)证实PHF8在ALL中表达升高,与ALL的发生和进展相关。PHF8的干扰在体外水平抑制ALL细胞增殖、促进细胞凋亡,在小鼠体内阻碍ALL细胞生长。PHF8通过与MEK1启动子区域的结合转录激活其表达,从而激活MEK/ERK信号通路。小分子抑制剂PD184352抑制MEK/ERK信号通路活性后PHF8表达明显下调,阐明了PHF8与MEK/ERK信号通路间存在正反馈调控机制,而PHF8的干扰也可以增强PD184352对于ALL细胞的杀伤作用。因此,本研究阐明了PHF8在ALL中的功能及分子机制,为ALL的靶向干预提供潜在候选靶标分子以及联合治疗策略的初步线索。
  (二)本研究证实AML患者存在表观遗传学表达谱的广泛异常,其中组蛋白去甲基化酶KDM7A下调最为明显。KDM7A的低表达与多种AML患者的临床和生物学特征相关,并提示AML患者预后不良。因此,本研究提示KDM7A可作为AML诊断、治疗、疾病进展监测及预后评估的表观遗传学潜在候选靶标分子。
[硕士论文] 杨亚玲
内科学(血液病) 山东大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一类髓系造血细胞恶性克隆增殖引起的高度异质性疾病,病情发展迅速,自然病程仅几个月。除了特殊类型的急性早幼粒细胞白血病外,大部分AML患者化疗缓解后易复发,长期生存率低,预后差,而AML的靶向药物种类也十分有限。因此,发现AML发生发展中新分子、挖掘新的治疗靶标十分重要。生物信息学方法是寻找白血病致病分子的重要筛选工具,本研究运用生物信息学对基因表达数据库GEO中急性髓系白血病数据深度挖掘,筛查AML发生发展与预后评估的候选分子,探究被发现候选分子ATF5在不同阶段AML患者中表达状况、与其它预后指标间的相关性、在AML细胞中发挥的生物学效应及其可能的机制,从而初步评估其作为AML候选靶向干预分子的价值。
  研究方法:
  1.GEO数据库中急性髓系白血病差异基因分析
  在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中选择同时包含急性髓系白血病组和对照组临床样本的基因表达数据,运用R语言在R Studio进行基因芯片质量的检验,合格后再应用R Studio进行差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的分析,选择差异较大的差异表达基因进行分析。在GEO数据库中选择同时有AML标本/细胞系组和对照组的基因芯片数据进行目的基因的表达验证。
  2.在不同分期AML患者临床标本中检测ATF5的表达水平
  分别提取正常对照者(IDA患者)、AML初诊患者、完全缓解者及难治复发患者骨髓标本单个核细胞,运用qRT-PCR、Westrn Blot及免疫荧光方法检测ATF5在疾病不同阶段的表达水平。
  3.AML细胞系诱导体外分化后检测ATF5表达水平
  分析GEO数据库中AML细胞系诱导分化相关芯片中ATF5表达水平;进一步应用Hemin、DMSO、PMA等体外诱导分化剂诱导AML细胞系U937和HL60向成熟红系、粒系、巨核系血细胞分化后,运用qRT-PCR和Westrn Blot方法分别在mRNA和蛋白水平检测ATF5表达变化。
  4.特异性siRNA沉默AML细胞系中ATF5表达后检测细胞增殖及凋亡
  AML细胞系中转染ATF5特异性siRNA沉默ATF5表达后,采用CCK8及Edu实验检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。
  5.分析ATF5表达水平与患者临床预后之间的关系
  对TCGA数据库数据进行整理,分析ATF5表达水平与患者年龄、性别、初诊时白细胞数量、FAB分型、细胞遗传学危险度分层及FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH2、RUNX1等基因突变之间的相关性。进而,在不同细胞遗传学危险度分级AML中分析ATF5表达水平,探索ATF5表达水平与细胞遗传学危险度分级间的关系。同时,在GEO数据库中选择基因表达信息与临床生存信息都较完整的AML患者基因芯片数据,将基因表达信息与患者临床信息进行匹配整理后,按照ATF5表达水平分为高表达组和低表达组进行患者总生存的Kaplan-Meier分析。
  6.ATF5表达相关差异基因的聚类分析
  为了探索AML中与ATF5表达变化有潜在关系的相关分子,对TCGA中AML数据集中基因表达文件进行整理,分别选取ATF5表达最高的25%和表达最低的25%的患者,运用R Studio进行两组间基因表达的差异分析。接着用GO、KEGG和GSEA进行差异基因富集分析和聚类分析,梳理ATF5表达差异所引起的生物学效应的可能机制。
  研究结果:
  1.AML基因芯片分析发现ATF5明显差异表达
  对GEO数据库中同时包含AML患者和正常对照者的基因表达谱数据进行基因表达差异分析,设定筛选条件为log2FC≥2、p值<0.01,选出95个差异表达基因,发现转录因子家族分子ATF5在AML患者中表达水平明显高表达。在较大样本量的基因芯片中对AML患者及正常对照者进行表达谱数据分析,发现转录因子家族多种分子在AML患者中均存在表达失调,其中人转录激活因子ATF3、ATF5及ATF6在成人急性髓系白血病中表达均高于对照组;在AML患者及细胞系基因芯片数据分析发现ATF5在AML标本及AML细胞系中均有高表达;进一步分析发现在不同细胞遗传学背景的AML患者中,ATF5表达差异较大,其中APL中表达水平较高。
  2.ATF5在急性髓系白血病患者标本中高表达,与疾病进程相关
  应用qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光(IF)在AML及正常对照者标本中检测ATF5在骨髓单个核细胞中的表达水平,结果显示:相较于对照组,ATF5在AML患者中表达水平明显较高,当疾病治疗达到完全缓解后,ATF5表达下降,疾病复发后,其表达水平再次升高。
  3.诱导AML细胞分化后ATF5表达降低
  在GEO数据库中选择AML细胞系诱导分化相关基因芯片,分析ATF5表达水平,发现诱导分化后ATF5表达明显降低;分别用PMA、Hemin和DMSO诱导AML细胞向巨核系、红系及粒系成熟血细胞分化后,qRT-PCR及Western Blot检测都ATF5表达水平明显降低。表明ATF5介导AML细胞的分化。
  4.ATF5表达沉然后AML细胞凋亡增加、增殖减低
  特异性siRNA转染AML细胞系沉默ATF5表达后,CCK-8及EDU实验发现细胞增殖速率减慢,流式细胞术发现细胞凋亡率增加。
  5.ATF5高表达与AML患者不良预后相关在TCGA数据库中分析AML患者ATF5表达水平与患者年龄、性别、初诊时白细胞数目、FAB分型、基因突变等临床信息间关系,发现ATF5在小于30岁患者中明显低表达,在M5型AML患者中高表达。TCGA数据集中根据细胞遗传学危险度不同分组进行ATF5表达水平分析,发现ATF5在中危组表达高于低危组。对GEO数据库中包含AML患者完整生存信息的基因芯片数据根据ATF5表达水平进行预后分析,发现ATF5高表达与患者不良预后相关。
  6.通路富集分析ATF5发挥作用的潜在下游基因
  对TCGA数据芯片中根据ATF5表达水平进行差异分析,设置log2FC≥1,p<0.05,共得到268个差异表达的基因,对这268个DEGs进行通路富集分析,富集到GO有18项,其中包括GO-BP的4项,GO-CC的7项,GO-MF的2项和KEGG的5项,同时用GSEA富集到有3项。结果发现氧化磷酸化、蛋白泛素化降解等生物学过程以及RUNX1T1等基因表达变化都可能参与ATF5介导的急性髓系白血病发生发展。
  研究结论:
  通过对GEO和TCGA数据库中急性髓系白血病基因芯片进行统计分析,发现人转录激活因子ATF5在AML中表达明显升高,ATF5高表达与AML患者临床不良预后有关系;在AML临床标本中检测到ATF5表达升高,与疾病进程相关,细胞系水平研究发现ATF5通过抑制AML细胞分化、凋亡,促进增殖来发挥促癌作用。上述研究提示,ATF5在AML中的异常高表达与疾病发生进展、不良预后相关,有可能成为AML致病和干预的潜在候选靶点。
[硕士论文] 任汝静
中药学 中国中医科学院 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过建立急性早幼粒细胞白血病动物模型,考察ATO联合ART对急性早幼粒细胞白血病的治疗作用。以人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4为研究对象,考察三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞生长抑制、周期分布、凋亡情况及相关蛋白的表达情况,以探讨其作用机制。
  方法:
  1.急性早幼粒细胞白血病动物模型的建立
  FVB小鼠,雄性,6-8周龄,检疫适应三天,分为两组,一组尾静脉注射携带PML-RARα及GFP基因的小鼠脾细胞造模,另一组作为正常对照组不作处理。观察小鼠一般生存情况;流式细胞仪检测外周血GFP比例;取主要组织做病理切片检查;取脾细胞提RNA做PCR分析目的基因表达情况。
  2.基于FVB小鼠模型考察三氧化二砷联合青蒿琥酯对APL的药效学情况
  建模:FVB小鼠尾静脉注射瘤细胞建模。分组:将建模后小鼠随机分为组,分别是正常对照组、模型组、ATO组、RA组、ART组、ATO+RA组、ATO+ART组、RA+ART组、ATO+RA+ART组。分批实验,主要考察小鼠生存时间、外周血GFP阳性率、骨髓细胞表面抗原CD34/CD117阳性率、主要脏器病理检查。
  3.三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞增殖的抑制作用
  MTT法检测不同剂量的三氧化二砷、青蒿琥酯及二者联用作用于NB4细胞后,对其增殖情况的影响并计算半数抑制浓度。
  4.三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞增殖周期及凋亡的影响
  以NB4细胞为研究对象,给予三氧化二砷、青蒿琥酯及二者联用刺激后,流式细胞仪检测细胞增殖周期分布及凋亡情况。
  5.三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞相关蛋白的影响
  以NB4细胞为研究对象,给予三氧化二砷、青蒿琥酯及二者联用刺激后,Western-Bolt分析NF-κB、VEGF、Survivin、MMP-9四种蛋白的表达。
  结果:
  1.急性早幼粒细胞白血病动物模型获得成功建立
  小鼠接种后15天外周血可检测到GFP,22天左右小鼠开始出现精神倦怠,活动减少,背部毛发乱杂竖起,进食减少,大便糖稀并开始出现死亡,死亡小鼠多口鼻流血,符合急性早幼粒细胞白血病临床出血症状,病理检查显示小鼠各重要脏器出现不同程度损伤,PCR检测到致病基因的表达。
  2.基于FVB小鼠模型考察三氧化二砷联合青蒿琥酯对APL的药效学情况
  小鼠给予三氧化二砷及青蒿琥酯治疗后,生存时间得到明显延长(P<0.05),外周血GFP明显下降(P<0.05),骨髓细胞分化较模型组明显改善(P<0.05),病理检查显示给药组主要脏器损伤明显改善。
  3.三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞增殖的抑制作用
  三氧化二砷、青蒿琥酯单用有明显抑制NB4细胞增殖的作用并呈浓度依赖性,联用后较各自单用效果更加明显(P<0.05)。
  4.三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞增殖周期及凋亡的影响
  三氧化二砷单用、青蒿琥酯单用均有明显阻滞NB4细胞增殖周期及诱导细胞凋亡的作用(P<0.05),二者合用较各自单用效果更加明显(P<0.05)。
  5.三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞相关蛋白的影响
  三氧化二砷联合青蒿琥酯对NB4细胞内NF-κB、VEGF、Survivin、MMP-9四种蛋白表达具有不同程度的下调作用。
  结论:
  1.FVB小鼠尾静脉注射携带基因的小鼠脾细胞可成功建立急性早幼粒细胞白血病模型,该模型为目前国内外研究急性早幼粒细胞白血病发生发展及治疗的常用模型。
  2.青蒿琥酯可增强三氧化二砷及维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的治疗作用,延缓疾病进程,有效延长生存时间,为临床新的用药方式提供了实验依据。
  3.青蒿琥酯单用有明显抑制NB4细胞增殖的作用并呈浓度依赖性,用三氧化二砷合用较各自单用效果更加明显。
  4.阻滞细胞增殖周期及诱导细胞凋亡是三氧化二砷单用和联合青蒿琥酯抑制NB4细胞增殖可能作用机制之一。
  5.抑制肿瘤增殖及转移相关蛋白的表达可能是三氧化二砷联合青蒿琥酯改善急性早幼粒细胞白血病的作用机制之一。
[博士论文] 周盼盼
儿科学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童时期最为常见的恶性肿瘤,其中又以B系(B-ALL)居多。随着诊疗水平的提高及治疗方案的改进,急淋患儿的缓解率和预后明显改善,但仍有20%-30%不能缓解而最终死亡,并且化疗副反应所引起的严重合并症也不容小觑,寻找新的治疗策略迫在眉睫。
  基因靶向治疗是当前恶性肿瘤治疗的研究热点,而自杀基因靶向疗法是其中最有前途的策略之一。然而由于缺乏将自杀基因传递至肿瘤组织的理想载体,使其发展受到阻碍,因此开发更有效的自杀基因系统及载体,提高靶向性具有重大意义。间充质干细胞(MSCs)具有肿瘤靶向迁移能力,且易被转导入各种基因片段,可作为肿瘤靶向治疗的理想载体。但是当前常规二维(2D)培养存在诸多缺点,可导致MSCs的趋化因子受体表达下降,削弱其迁移和归巢能力。而三维(3D)培养能更好地模拟体内微环境,改善细胞功能,因此研究MSCs的三维培养及其对细胞体内迁移能力的影响具有重大意义。
  此外,大量白血病细胞的生长必须依赖肿瘤微环境中新生血管的生成,其中VEGF(血管内皮生长因子)在血管新生和白血病细胞的抗凋亡进程中处于关键地位。因此寻找和应用有效抑制肿瘤微环境中VEGF水平和血管形成的策略具有重要意义。miRNAs可引起靶mRNA降解或者阻遏靶mRNA的翻译,有效抑制靶蛋白的表达,因此筛选出可有效抑制MSCs和白血病细胞VEGF产生和血管形成的miRNA分子十分重要。再联合自杀基因系统和MSCs3D培养技术,实现近距离杀伤和血管饥饿双重战术治疗B-ALL,达到良好的局部靶向治疗效果,同时降低系统用药的严重不良反应,以期为B-ALL的临床治疗提供新的策略和研究基础。
  目的:
  1.构建良好的脐带间充质干细胞(UCMSCs)三维培养体系,研究三维培养对细胞体内迁移和归巢能力的影响。
  2.构建高效低毒的以UCMSCs为载体的自杀基因系统。
  3.筛选出可有效抑制MSCs促血管形成能力的miRNA分子。
  4.构建高效低毒的自杀基因和miRNA双修饰的3D UCMSCs治疗B-ALL技术体系,抑制肿瘤生长增殖和血管形成,达到良好的靶向治疗效果。
  方法:
  1.脐带间充质干细胞的三维培养及迁移能力研究
  1.1脐带间充质干细胞的分离培养及流式鉴定:取新鲜健康新生儿脐带,采用组织块贴壁培养法分离培养人UCMSCs,显微镜下观察细胞形态,并行流式细胞术检测细胞表型CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和CD271的表达情况。
  1.2构建壳聚糖/β-甘油磷酸钠(β-GP)/胶原蛋白/MSCs-CM(间充质干细胞条件培养基)温敏水凝胶-UCMSCs三维培养体系:分别制备壳聚糖、β-GP和I型胶原蛋白溶液,收集脐带MSCs-CM,将它们以一定比例混合后制成温敏水凝胶并验证其温敏特性。显微镜观察联合CCK-8实验检测UCMSCs在水凝胶中的生长和增殖情况。
  1.3构建猪脱细胞真皮基质支架(porcine acellular dermal matrix scaffold,PADM)-UCMSCs三维培养体系:将UCMSCs以一定密度种于PADM上,DAPI染色观察细胞的植入及存活状况。
  2.YCD:UPRT(酵母菌来源的胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶)和miR195修饰的脐带间充质干细胞对急性B淋巴细胞白血病Nalm-6细胞体外作用研究
  2.1构建含有自杀基因YCD:UPRT的慢病毒载体:慢病毒载体采用以第三代载体系统为基础的四质粒体系构建而成。首先构建LV5-YCD:UPRT-GFP穿梭转移质粒,并行基因测序验证。然后将其和包装质粒共转染293T细胞,进行病毒的包装、收集和滴度测定。同法制备仅含有报告基因GFP(绿色荧光蛋白)的慢病毒载体作为阴性对照。
  2.2YCD:UPRT-GFP稳转脐带间充质干细胞的建立及验证:慢病毒载体转染UCMSCs,荧光显微镜下观察转染效率。嘌呤霉素筛选稳转细胞(YCD:UPRT-GFP-UCMSCs)并行流式细胞术验证。同法筛选稳转的阴性对照GFP-UCMSCs。普通PCR检测未转染的UCMSCs、GFP-UCMSCs和YCD:UPRT-GFP-UCMSCs细胞YCD:UPRT基因的表达情况。
  结果:
  1.脐带间充质干细胞的三维培养及迁移能力研究
  1.1脐带间充质干细胞的分离培养及流式鉴定:本实验分离培养的细胞具有UCMSCs的典型形态和细胞表型特点。
  1.2壳聚糖/β-GP/胶原蛋白/MSCs-CM温敏水凝胶-UCMSCs三维培养体系构建成功:上述制备的水凝胶具有温敏特性。显微镜下观察UCMSCs在水凝胶三维结构中几乎完全伸展,黏附、生长良好,CCK-8实验表明UCMSCs在水凝胶中培养1周内的具有良好的增殖活性。
  1.3PADM-UCMSCs三维培养体系构建成功:DAPI染色观察UCMSCs在PADM支架内植入和存活良好。
  1.4比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs表面免疫标志的表达情况:PADM支架中3D培养14天,UCMSCs的CD105阳性率持续降低(P<0.05),而CD34和CD271的阳性率在3D培养7天时较2D培养明显升高(P<0.05)。
  1.5比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs重要受体的表达:RT-RCR和Western blot结果示在PADM三维支架中培养3天,UCMSCs细胞TLR2、TLR3、TLR4、TLR6及CXCR4的mRNA和蛋白表达水平均较二维培养组细胞明显增高(P<0.05)。
  1.6比较二维及PADM-UCMSCs三维培养的UCMSCs体内迁移和归巢能力:结果显示在输注8h后,以肺组织为对照,3D组UCMSCs向小鼠心脏、肝脏、脾脏和BM中迁移数量显著大于2D组(P<0.05),但是AMD3100处理的3D细胞向肺以外其它各组织的迁移明显受到抑制,甚至低于2D组(P<0.05)。然而在移植后24h和48h,PCR检测结果示各组小鼠肺组织以外的其它各组织均未能检测到SRY基因。
  2.YCD:UPRT和miR195修饰的脐带间充质干细胞对急性B淋巴细胞白血病Nalm-6细胞体外作用研究
  2.1携带自杀基因YCD:UPRT及报告基因GFP的重组慢病毒构建成功:LV5-YCD:UPRT-GFP穿梭转移质粒行基因测序验证YCD:UPRT基因序列正确。携带自杀基因YCD:UPRT及阴性对照GFP的慢病毒载体其病毒滴度均为1×109TU/mL。
  2.2成功构建稳定表达YCD:UPRT-GFP的脐带间充质干细胞及验证:荧光显微镜观察示慢病毒转染UCMSCs成功。嘌呤霉素筛选后,流式细胞术验证GFP阳性的YCD:UPRT-GFP-UCMSCs的比例高达95%,表明高纯度的稳转细胞构建成功。同法获得作为阴性对照的GFP-UCMSCs。普通PCR结果示只有YCD:UPRT-GFP-UCMSCs可成功表达YCD:UPRT基因。
  2.3YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统具有高效的自杀效应:在本实验选用的浓度范围内,5-FC对UCMSCs本身无明显的细胞毒性,但是对YCD:UPRT-GFP-UCMSCs具有强大的直接杀伤作用,且这种杀伤作用具有时间和剂量依赖性。
  2.4YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统具有强大的旁观者效应:共培养结果示只有YCD:UPRT-GFP-UCMSCs+Nalm-6+5-FC组的UCMSCs及Nalm-6细胞形态出现异常,大小不一,最终大量死亡,Nalm-6细胞数目明显少于其他五组(P<0.05),且Nalm-6细胞的早期和晚期凋亡率均明显高于其它五组(P<0.05)。
  2.5具有抑制血管形成功能的miRNA的筛选及功能验证:RT-PCR示miR195对UCMSCs VEGFA基因的表达具有最强抑制作用,Western blot检测验证了miR195转染可有效抑制UCMSCs的VEGFA蛋白表达,HUVEC成血管实验检测其可有效抑制UCMSCs的促血管形成能力,并且Westernblot检测其可有效抑制与UCMSCs共培养的Nalm-6细胞的VEGFA蛋白表达。
  结论:
  1.本研究成功构建PADM-UCMSCs三维培养体系,发现三维培养可明显增强UCMSCs体内迁移和归巢能力,其中CXCR4发挥重要作用。
  2.本研究构建的YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统在体外可发挥强大的自杀效应和旁观者效应。
  3.miR195可有效抑制UCMSCs促血管形成能力。
  4.YCD:UPRT+miR195双修饰的3DUCMSCs+5-FC治疗B-ALL模型裸鼠,可有效抑制肿瘤生长增殖和血管形成,具有良好的靶向治疗效果。
[硕士论文] 聂莎莎
内科学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者血清中白介素-33(interleukin-33,IL-33)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)水平变化的临床意义,探讨其与MM疾病发生与发展所存在的内在联系,进而为疾病的靶向治疗提供理论依据和临床经验。
  方法:
  选取2014年10月-2017年5月期间在山东大学附属山东省立医院就诊的35例初诊MM患者(包括22名男性和13名女性;年龄范围为49-67岁,中位数为60岁)作为实验组,40名健康对照者(包括男性19名,女性21名;年龄45-70岁,中位数57岁)作为对照组。所有患者和健康对照者均采集10毫升外周静脉血。血液被离心后,血清被保存在-80℃下。在进行采样之前,它们均未通过免疫抑制治疗或进行输血治疗。所有MM患者均符合2015年美国国立综合癌症网络(NCCN)和国际骨髓瘤工作组(IMWG)的诊断标准。根据免疫球蛋白(Ig)分类包括:IgG19例,IgA11例,Kappa轻链3例,非分泌型2例。根据DS分期系统,MMⅠ期患者4例,Ⅱ期患者14例,Ⅲ期患者17例。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测35例MM患者和40例健康对照者血清中IL-33和IL-6的水平,并对其与疾病的发展阶段、严重程度的关系进行研究。
  结果:
  1.MM患者血清中IL-33的水平明显低于对照组(P<0.001),Ⅲ期MM患者血清中IL-33的水平明显低于Ⅰ期和Ⅱ期MM患者(P=0.003和P=0.48)。
  2.MM患者血清中IL-6的水平明显高于对照组(P<0.001),Ⅲ期患者血清中IL-6的水平明显高于Ⅰ期和Ⅱ期MM患者(P=0.007和P=0.004)。
  3.MM患者Ⅰ期与Ⅱ期之间IL-33水平无显著性差异,IL-6水平亦无显著性差异(P>0.05)。
  4.MM患者的血清中IL-6与IL-33呈显著负相关(P<0.001,相关系数=-0.740)。
  结论:
  我们的发现提示IL-33和IL-6异常表达促进了MM疾病的发生与发展,监测血清中IL-33和IL-6的水平有助于疾病的诊断,以及评估MM患者的疾病活动。
[硕士论文] 钟朝琴
内科学(血液病) 山东大学 2018(学位年度)
摘要:急性髓性白血病(AML)是一种以克隆性、异常分化的造血干血细胞在骨髓、外周血及其它组织增殖浸润为特点的血液系统恶性疾病。近年来关于急性髓性白血病的细胞遗传及分子异常得到广泛研究,治疗策略不断改进。然而,大多数患者仍出现难治、复发、耐药,长期预后不容乐观。免疫系统紊乱被发现与急性髓性白血病的发生发展相关,但具体机制仍不明朗。
  炎症小体是参与固有免疫的主要成分之一,到目前为止,研究最透彻、最清楚的是NLRP3炎症小体。NLRP3炎症小体是由NLRP3分子、ASC和pro-Caspase-1三者相互结合形成的多蛋白复合物。目前关于NLRP3炎症小体活化的具体机制仍处于不断探索研究中,普遍认为其活化包括两个步骤,第一步是启动,第二步是激活,NLRP3炎症小体的活化信号多种多样,其活化机制仍不完全清楚。Hornung等发现了一种新的炎症小体活化通路,和传统NLRP3炎症小体活化通路不同,脂多糖(LPS)不依赖两种信号通过TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8刺激人单核细胞NLRP3炎症小体活化。NLRP3炎症小体活化后促使caspase-1活化,随后切割IL-1β及IL-18前体,产生具有生物活性的IL-1β及IL-18并释放到细胞外。另外,IL-1β通过IL-1RI-MyD88-NF-κB诱导IL-1β前体合成,形成一个正反馈环。
  越来越多的证据证明炎症小体与炎症有关,而慢性炎症又与癌症的发生发展相关。作为NLRP3炎症小体的效应分子,IL-1β是一种多效细胞因子,参与细胞增殖、分化,在肿瘤的发生发展中起关键作用。最近的研究显示,血清中IL-1β和IL-18的高表达和癌症患者的不良预后密切相关。
  尽管大量临床及实验研究显示NLRP3炎症小体具有促癌活性,但其在癌症中的作用仍存在争议,NLRP3炎症小体对肿瘤发展的影响是有利的还是有害的引起了研究者的广泛关注。有研究认为NLRP3炎症小体的活化和IL-18通路诱导NK细胞的抗肿瘤活性并调节肠道菌群,从而在结肠炎相关的结直肠癌中发挥抑癌作用,然而,大量研究显示NLRP3-IL-1β-L-1R信号轴在胃癌、黑色素瘤、乳腺癌及纤维肉瘤的生长转移中发挥致癌作用。此外,炎症小体活化促进前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、肝癌以及皮肤癌的发生及转移,因此,一些针对炎症小体的小分子抑制剂、拮抗剂和单克隆抗体被研制出来控制肿瘤。
  我们的前期研究发现,NLRP3炎症小体通过IL-18在淋巴瘤中发挥促癌作用。另外,IL-1β(rs16944)和IL-18(rs1946518)的多态性可能导致AML的不良预后。然而,NLRP3炎症小体在AML发病及治疗中的作用仍不清楚。在本研究中,我们研究了NLRP3炎症小体在AML发生发展中的作用及可能的机制,发现NLRP3炎症小体通过Caspase-1/IL-1β通路在AML中发挥促癌作用并和耐药相关。
  研究目的:
  证实NLRP3炎症小体在AML患者骨髓中活化,通过贝叶斯网络找出和AML相关的关键分子;研究活化和抑制NLRP3炎症小体对初诊AML患者白血病细胞生物学行为的影响;研究NLRP3炎症小体在初诊AML患者白血病细胞对化疗药物耐药中的作用。
  研究方法:
  患者及标本
  收集84例初诊AML患者骨髓及16例正常对照骨髓,从EDTA抗凝骨髓收集上清冻存-80℃用于细胞因子检测。Ficoll密度梯度离心法无菌分离BMMCs,取2×106个细胞加TRIZOL冻存-80℃用于RNA提取,其余细胞作为初诊AML患者白血病细胞用于功能试验。
  1.检测初诊AML患者及正常对照骨髓中NLRP3炎症小体相关分子的mRNA表达及IL-1β浓度水平
  1.1 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR):选取63例初诊AML患者及16例健康对照BMMCs,用TRIZOL法提取RNA,利用RT-PCR检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、NF-κB及IL-1R在mRNA水平的表达。
  1.2 根据NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、NF-κB及IL-1R的mRNA表达数据分析贝叶斯网络模型。
  1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA):选取70例初诊AML患者及15例正常对照骨髓上清,采用ELISA检测细胞因子IL-1β水平。
  2.研究NLRP3炎症小体在初诊AML患者白血病细胞进一步活化的生物学效应
  2.1 使用含完全培养基(RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%青链双抗)于37℃、5%CO2环境培养初诊AML患者白血病细胞(1×106cells/ml),使用脂多糖(LPS,终浓度1μg/ml)刺激初诊AML患者白血病细胞,使其NLRP3炎症小体进一步活化。
  2.2 分别于24h、48h、72h,100ul/孔种板96孔板,每组设3个复孔,用CCK8法检测细胞增殖。
  2.3 另外,培养48h后,收集细胞培养上清用于ELISA实验,收集细胞进行凋亡检测以及RNA提取。
  3.NLRP3炎症小体活化的THP-1细胞与初诊AML患者白血病细胞共培养
  3.1 使用完全培养基培养THP-1细胞,培养环境37℃、5%CO2。
  3.2 LPS活化THP-1细胞:LPS刺激活化THP-1细胞,培养48h后,收集细胞培养上清用于ELISA实验,收集细胞用于RNA提取。
  3.3 LPS+ATP活化THP-1细胞:LPS刺激THP-1细胞(1×106cells/ml)6h后加ATP继续作用1h,然后生理盐水洗3遍,上室100ulTHP-1细胞(5×104cells/ml)与下室600ul初诊AML患者白血病细胞(1×106cells/ml)用Transwell小室共培养,Anti-IL-1β和anti-IL-18用于中和IL-1β和IL-18,培养48h后,收集下室细胞进行凋亡检测。另外,LPS+ATP活化的THP-1细胞培养48h后,收集细胞培养上清用于ELISA实验。
  4.IL-1β和IL-18处理初诊AML患者白血病细胞
  为研究NLRP3炎症小体效应分子在AML中的作用,IL-1β和IL-18加入AML患者白血病细胞,在培养24h、48h、72h、96h后,检测细胞增殖,并在培养48h后检测凋亡。
  5.Caspase-1抑制剂抑制NLRP3炎症小体活化
  在加入LPS刺激活化前,用Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK预处理初诊AML患者白血病细胞1h,以抑制Caspase-1活化。培养24h、48h、72h后检测细胞增殖。另外,培养48h后,离心收取细胞培养上清用于ELISA实验,收取细胞进行凋亡检测。
  6.NF-κB抑制剂抑制NLRP3炎症小体活化
  为抑制NF-κB通路活化NLRP3炎症小体,在LPS刺激活化前,用NF-κB抑制剂Bay11-7082预处理初诊AML患者白血病细胞1h。在培养24h、48h、72h后检测细胞增殖。另外,培养48h后,收取细胞培养上清用于ELISA实验,收取细胞进行凋亡检测。
  7.NLRP3炎症小体蛋白水平的活化与抑制
  LPS、LPS+ATP、LPS+ATP+Z-YVAD-FMK、LPS+ATP+Bay11-7082处理初诊AML患者白血病细胞.Z-YVAD-FMK和Bay11-7082预处理白血病细胞1h后加LPS刺激6h,再加ATP刺激1h。然后收取细胞提取蛋白,用western blot检测pNF-κB(磷酸化的NF-κB)、pro-Caspase-1(Caspase-1前体)、Caspase-1、pro-IL-1β(IL-1β前体)、IL-1β在蛋白水平的表达。
  8.研究NLRP3炎症小体对化疗药物抗肿瘤活性的影响
  为研究IL-1β、IL-18在化疗药物抗肿瘤活性中的作用,阿霉素(ADR)、柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-c)单独或与NLRP3炎症小体效应分子联合作用于初诊AML患者白血病细胞,另外我们研究了LPS活化NLRP3炎症小体对化疗药物抗肿瘤活性中的影响,并检测了细胞增殖与凋亡。
  实验结果:
  1.NLRP3炎症小体在初诊AML患者骨髓中活化
  1.1 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、NF-κB和IL-1R在初诊AML患者和正常对照骨髓的表达:RT-PCR结果显示,和正常对照相比,NLRP3、IL-1β、NF-κB和IL-1R的mRNA水平在初诊AML患者骨髓单个核细胞中显著升高,存在统计学差异。ASC、Caspase-1和IL-18的表达也有升高趋势,但未达到统计学意义。
  1.2 贝叶斯网络图提示AML中NLRP3炎症小体通过IL-1R、NF-κB发挥作用。
  1.3 ELISA结果显示,和正常对照比较,细胞因子IL-1β的浓度在初诊AML患者骨髓上清中明显增加。
  2.LPS进一步活化初诊AML患者白血病细胞NLRP3炎症小体后促进增殖并抑制凋亡
  2.1 LPS进一步活化初诊AML患者白血病细胞NLRP3炎症小体:LPS明显增加初诊AML患者白血病细胞Caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平,NLRP3和NF-κB的mRNA水平在LPS组也有上升,但未达到统计学差异。另外,ELISA结果显示,LPS明显增加初诊AML患者白血病细胞培养上清中IL-1β和IL-18的浓度。
  2.2 CCK8结果显示LPS促进增殖。凋亡结果显示,LPS使初诊AML患者白血病细胞凋亡率明显减少。以上结果说明,活化初诊AML患者白血病细胞NLRP3炎症小体促进增殖并抑制凋亡。
  3.活化的THP-1细胞抑制初诊AML患者白血病细胞凋亡
  3.1 RT-PCR结果显示,LPS明显上调THP-1细胞Caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平,NLRP3和NF-κB的mRNA水平也存在上升趋势,但未达到统计学差异。另外,ELISA结果显示,和对照组比较,LPS、LPS+ATP使THP-1细胞培养上清IL-1β和IL-18浓度明显升高。以上结果证实,LPS、LPS+ATP活化了THP-1细胞的NLRP3炎症小体。
  3.2 流式细胞术检测凋亡结果显示,NLRP3炎症小体活化的THP-1抑制初诊AML患者白血病细胞凋亡,且抑制凋亡的作用可被Anti-IL-1β抗体拮抗,但不能被Anti-IL-18抗体拮抗。
  4.IL-1β促进初诊AML患者白血病细胞增殖并抑制凋亡
  CCK8结果显示,IL-1β、IL-1β+IL-18明显促进白血病细胞的增殖,而单独的IL-18无明显作用。另外,流式细胞术结果显示,IL-1β、IL-1β+IL-18明显抑制白血病细胞的凋亡,而单独的IL-18无明显作用。以上结果证实NLRP3/IL-1β通路在AML中发挥促癌作用。
  5.Caspase-1抑制剂抑制NLRP3炎症小体活化后可抑制增殖促进凋亡
  ELISA结果显示,Caspase1抑制剂Z-YVAD-FMK使初诊AML患者白血病细胞培养上清中IL-1β和IL-18浓度明显下调。CCK8结果显示Z-YVAD-FMK抑制增殖,流式细胞术检测凋亡显示Z-YVAD-FMK促进凋亡。
  6.NF-κB抑制剂抑制NLRP3炎症小体活化后可抑制增殖促进凋亡
  NF-κB抑制剂Bay11-7082明显减少细胞因子IL-1β和IL-18的分泌,并能抑制增殖促进凋亡。
  7.NLRP3炎症小体在蛋白水平的活化与抑制
  Western blot显示,在LPS、LPS+ATP活化NLRP3炎症小体组,pNF-κB、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β在蛋白水平表达升高,说明LPS、LPS+ATP能活化NLRP3炎症小体。Z-YVAD-FMK和Bay11-7082使蛋白水平降低。
  8.NLRP3炎症小体增强初诊AML患者白血病细胞对阿霉素和柔红霉素的抵抗
  8.1 NLRP3炎症小体效应分子IL-1β、IL-18对化疗药物敏感性的影响:IL-1β明显增强阿霉素、柔红霉素的耐药,但对阿糖胞苷的杀伤作用无明显影响;另外IL-18对化疗药的杀伤作用无明显影响。
  8.2 NLRP3炎症小体活化增强初诊AML患者白血病细胞对阿霉素和柔红霉素的抵抗
  LPS活化NLRP3炎症小体后抑制ADR、DNR对初诊AML患者白血病细胞的杀伤作用,细胞增殖明显增加而细胞凋亡明显减少,但对Ara-c的杀伤作用无明显影响。
  实验结论:
  1.NLRP3炎症小体在初诊AML患者骨髓中活化并通过NF-κB和IL-1R在AML中发挥作用。
  2.LPS活化NLRP3炎症小体促进初诊AML患者白血病细胞增殖并抑制凋亡,NLRP3炎症小体活化的THP-1细胞抑制初诊AML患者白血病细胞凋亡,抑制NLRP3炎症小体活化后可明显抑制增殖并诱导凋亡。
  3.NLRP3炎症小体通过Caspase-1/IL-1β通路在AML中发挥促癌作用。
  4.NLRP3炎症小体增强初诊AML患者白血病细胞对阿霉素、柔红霉素的耐药。
  5.靶向调节NLRP3炎症小体可为AML提供新的治疗方向。
[硕士论文] 张艳芳
内科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨CD44基因在白血病K562细胞阿霉素耐药中的可能分子机制,阐明二者之间的相关性,探究逆转白血病耐药的靶基因。
  方法:
  1.琼脂糖凝胶电泳实验:检测含CD44质粒的大肠杆菌扩增后CD44质粒的表达情况,检测是否提取成功;
  2.电转染实验:将提取后的CD44载体质粒转入K562细胞中制备CD44高表达的K562细胞即K562/CD44细胞;
  3.用倒置荧光显微镜观察法、Western blot实验和实时荧光定量PCR实验分别检测K562细胞和K562/CD44细胞中CD44标记的绿色荧光蛋白、CD44蛋白和CD44的mRNA表达水平;
  4.实时荧光定量PCR实验:检测K562细胞及K562/CD44细胞中耐药基因P-gp的mRNA表达水平;
  5.WST-1细胞增殖实验:用1.0mg/L的阿霉素作用于K562细胞和K562/CD44细胞48h后,检测K562和K562/CD44细胞在相同浓度和相同作用时间下的增殖率;
  6.AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术:用1.0mg/L的阿霉素处理24h后,分别检测K562和K562/CD44细胞的细胞凋亡率;
  7.Western blot实验分别检测K562细胞和K562/CD44细胞中迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平。
  结果:
  1.琼脂糖凝胶电泳实验结果提示:提取的大肠杆菌质粒电泳后呈现出一条清新明亮的条带;
  2.倒置荧光显微镜观察结果显示:用电转染法将提取后的CD44质粒转入K562细胞制备的K562/CD44细胞中有绿色荧光蛋白高表达;
  3.实时荧光定量PCR实验结果显示:与K562细胞相比较,K562/CD44细胞中CD44和耐药基因P-gp的mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);
  4.WST-1细胞增殖实验检测结果:用1.0mg/L的阿霉素作用于K562细胞和K562/CD44细胞48h后,与K562细胞相比较,K562/CD44细胞的增值率明显升高(P<0.01);
  5.流式细胞术结果显示:与K562细胞相比较,K562/CD44细胞的凋亡率显著降低(P<0.01);
  6.Westem blot实验结果显示:相比于K562细胞,K562/CD44细胞中CD44、MMP-2、MMP-9、Bcl-2/Bax蛋白的表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01),而Bax蛋白的表达量显著下调(P<0.01)。
  结论:
  1.CD44过表达抵抗ADR对K562细胞增殖的抑制作用;
  2.CD44过表达可能通过调控耐药基因P-gp、迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9及凋亡蛋白Bcl-2/Bax参与K562细胞的耐药过程。
[硕士论文] 何显君
内科学(血液病) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:儿童急性B淋巴细胞白血病(BCP-ALL)目前已经成为可以治愈的血液肿瘤典范;与之形成对比的是,成人BCP-ALL整体预后仍然较差,长期生存仅为50%左右;克隆演化是白血病治疗耐药、疾病复发的重要原因。锌指蛋白家族成员IKZF1基因是正常B淋巴细胞分化、发育和成熟的重要调节因子;近年研究发现,IKZF1基因缺失在BCP-ALL发病机制中扮演重要角色,其编码的Ikaros蛋白是正常B淋巴细胞分化、发育和成熟的关键调控因子;IKZF1基因缺失是费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)和费城样急性淋巴细胞白血病(Ph-like ALL)中常见的典型分子遗传学特征,在BCP-ALL中具有独立预后意义;但IKZF1基因在BCP-ALL治疗前后,特别是疾病复发的克隆演化中的表达及意义,目前尚不完全清楚。
  目的:
  (1)检测分析IKZF1基因在初发和复发BCP-ALL中的突变比例及亚型分布;(2)分别分析IKZF1基因缺失在初发和复发BCP-ALL中的预后意义;(3)追踪分析患者初发和复发时配对标本中IKZF1基因缺失的变化,探索其在BCP-ALL复发克隆演化中的意义。
  方法:
  收集104例2011年9月至2017年8月南方医科大学南方医院血液科成年BCP-ALL患者初发DNA标本,采用GAP-PCR检测IKZF1基因外显子缺失,分析IKZF1基因在我国成人BCP-ALL中的缺失分布;回顾性分析IKZF1基因突变与BCP-ALL患者临床特征和预后的关系;筛选其中45组患者初诊-复发配对标本,分析IKZF1基因缺失的变化。
  结果:
  (1)在初发BCP-ALL患者中,IKZF1基因外显子缺失总体检出率为40.4%(42/104),初发Ph+ALL亚组检出率显著高于Ph-BCP-ALL亚组(57.6%vs17.8%,p<0.001);在复发患者中,IKZF1基因缺失率为51.1%(23/45),主要缺失亚型包括△4-7(n=17)、△2-7(n=3);复发Ph+ALL亚组,IKZF1基因缺失检出率65.2%(15/20),显著高于费城阴性亚组(65.2%vs34.8,p=0.004),主要缺失亚型为△4-7(n=5);
  (2)采用SPSS统计软件,根据初诊时IKZF1基因缺失亚组与非缺失亚组进行分析,两组无进展生存率(PFS)和总生存率(OS)均无显著性差异;Ph+ALL亚组和Ph-BCP-ALL亚组均无统计学差异。按复发时IKZF1突变状态,分为缺失亚组和非缺失亚组分析,伴有IKZF1基因缺失的Ph+ALL,1年OS(43.7%)显著低于不伴IKZF1基因缺失的Ph+ALL患者(88.9%),(p=0.047);
  (3)通过对45组初发和复发配对标本的IKZF1基因突变谱分析,结果显示24.4%(11/45)的患者IKZF1基因外显子缺失出现动态变化:在20例Ph+ALL亚组中,5例患者在复发时,原有IKZF1基因缺失克隆消失;在25例Ph-BCP-ALL亚组中,3例在复发阶段发生原有IKZF1基因缺失克隆消失,另3例在复发时出现新的IKZF1基因缺失克隆。
  结论:
  IKZF1基因缺失在成人BCP-ALL中检出率高,而且对Ph阳性/阴性、初发/复发BCP-ALL,均具有重要的预后分层意义,IKZF1基因缺失的动态变化是BCP-ALL复发克隆演化的重要分子遗传学特征之一。IKZF1基因缺失参与克隆演化的机制以及如何靶向IKZF1基因缺失,值得进一步深入研究。
[博士论文] ELHAM ALI IBRAHIM ELAMIN
CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS SPECIALTY HEMATOLOGY AND IMMUNOLOGY 山东大学 2018(学位年度)
摘要:急性淋巴细胞白血病是青少年中最常见的血液系统恶性肿瘤,成人也可发病。耐药是急性淋巴细胞白血病治疗失败的重要原因,临床上迫切需要开发新的治疗方法或靶向治疗药物。FKBP51是亲免素蛋白家族成员,在淋巴细胞生理性表达。FKBP51参与维持细胞生长、细胞恶变以及化疗耐药。
  目的:利用Jurkat细胞系,研究FKBP51蛋白对急性淋巴细胞白血病细胞生长和化疗药物敏感性的影响。探讨FKBP51作为急性淋巴细胞白血病发展/演化和对抗癌药物耐药的生物学标志的可能性。
  方法:用慢病毒载体包装FKBP51,感染Jurkat细胞,建立过表达FKBP51的Jurkat细胞系,用shRNA-FKBP51质粒转染Jurkat细胞,建立敲除FKBP51的Jurkat细胞系。western blot检测FKBP51蛋白表达水平,验证细胞建系成功。经CCK-8分析检测细胞增殖,Muse(R)细胞分析仪检测细胞周期分布,western blot研究丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)和核因子κB(NF-κB)信号通路。
  统计学处理:应用SPSS25.0和Graph Pad Prism6统计软件进行统计分析,实验数据用均数±标准差表示。不同实验组之间的差异用双尾T检验和单因素方差分析进行分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
  结果:与相应的阴性对照比较,CCK-8检测结果显示FKBP51过表达组细胞增殖能力增强,而FKBP51敲除组细胞增殖能力降低。细胞周期分析表明FKBP51过表达组G0/G1期细胞数目降低而G2/M和S-G2/M期细胞数目增多,FKBP51敲除组G0/G1期细胞数目增多而G2/M期细胞数目降低。Western blot分析结果表明FKBP51过表达组AKT磷酸化水平降低而FKBP51敲除组AKT磷酸化水平明显增强。同时,在静息状态下至TNFα刺激5分钟内,FKBP51过表达导致细胞浆及细胞核内NF-κB p65水平均明显升高,并在TNFα刺激15分钟时发生逆转,但是NF-κB p65,pIKKα,and IκB仍显著高于阴性对照。相应地,FKBP51敲除造成的NF-κB p65和pIKKα活性降低在TNFα刺激后5分钟内逐步升高。此外,FKBP51过表达导致Jurkat细胞对地塞米松处理的抵抗性增强,以时间和剂量依赖的方式促进细胞增殖。而FKBP51敲除使得Jurkat细胞对地塞米松处理更加敏感,抑制细胞增殖。我们的结果还显示高剂量的地塞米松(8,16,32μM)处理72小时后抑制细胞增殖。
  结论:FKBP51蛋白过表达促进细胞特别是T淋巴细胞增殖,从而促进急性淋巴细胞白血病的发展。其分子机制可能涉及AKT下游,提示FKBP51可能在NF-κB介导的抗凋亡通路中发挥重要作用。因此,将FKBP51蛋白作为急性淋巴细胞白血病发展进程及化疗耐药的生物学标志,将具有重要的临床意义。
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