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[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[硕士论文] 韦荣强
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1、归纳En-bloc胰十二指肠切除术的手术策略和具体操作步骤,指导临床实践;
  2、探究En-bloc胰十二指肠切除术的可行性、安全性以及疗效。
  方法:
  1、结合胰十二指肠切除术主刀医师的指导、手术录像资料及相关文献回顾,对En-bloc手术策略和具体操作步骤进行归纳。
  2、回顾性分析2013年1月~2016年6月海军军医大学附属长海医院和长征医院胰腺外科邵成浩团队收治的139例行胰十二指肠切除并且术后病理证实为胰腺导管腺癌的病人的临床资料,其中2013年1月至2014年6月共70例病例行传统胰十二指肠切除术(Traditional Pancreatoduodenectomy,TPD),2014年7月至2016年6月共69例病例行En-bloc胰十二指肠切除术(En-bloc Pancreatoduodenectomy,En-PD),分别设为TPD组和En-PD组。观察指标包括:1)手术时间、术中出血量、肿瘤最大直径、切缘状态、TNM分期等;2)术后主要并发症发生率(胰瘘、术后出血、乳糜漏、腹腔感染、胃排空延迟等)、围手术期死亡率、术后平均住院时间、局部复发转移率、中位生存时间、总生存时间等。
  3、本研究拟对En-PD切除病例资料进行回顾性分析,观察临床疗效与预后,并与传统胰十二指肠切除术(TPD)病例资料相比较,探讨En-bloc手术策略的安全性、可行性及临床应用价值。
  结果:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除,其手术时间、术中出血量均高于TPD组(P值分别为0.017,0.016);En-PD组和TPD组术后平均住院时间、术后并发症发生率及死亡率差异无统计学意义(P值分别为0.592,0.810,1.000)。
  2、En-PD组和TPD组中,可能切除病例数分别是16例(23.2%)和14例(20.0%),均行联合PV/SMV整块切除重建术,差异无统计学意义(P=0.648)。两组术后R0切除率分别是91.3%和94.3%,淋巴结阳性率分别是44.9%和41.4%,差异均无统计学意义(P=0.532,P=0.677);但En-PD组平均淋巴结切除数目(13.58±11.19枚)多于TPD组(5.79±3.12枚),统计学差异明显(P<0.001)。
  3、En-PD组和TPD组术后局部复发转移率分别为29.0%、45.7%,有统计学差异(P=0.042)。En-PD组术后中位生存期为19.8个月,1年生存率和2年生存率分别为75.5%和21.7%;而TPD组术后中位生存期为20.9个月,1年生存率和2年生存率分别为72.9%和24.3%。两组生存期差异无统计学意义(P=0.061)。
  结论:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除术在临床实践中安全、可行,但是建议在经验丰富的胰腺外科中心开展,尤其是对可能切除胰腺癌需行联合血管整块切除重建的病例。
  2、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术术后局部复发转移率低。
  3、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术具有更高的淋巴结切除数目,有利于对转移淋巴结的清扫。
  4、En-bloc切除策略胰十二指肠切除术后总体短期疗效满意。
[博士论文] 黄海
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肿瘤内异质性是促进肿瘤进化、疾病进展,以及导致治疗失败和患者不良预后的重要原因。肿瘤干细胞样细胞,作为肿瘤细胞群体遗传构成的一个亚群,是肿瘤异质性的重要来源。在不同肿瘤中发现,肿瘤干细胞样细胞具备自我更新能力、化疗药耐药、扩增成为肿瘤细胞并具有转移潜能等特性,是肿瘤进展和耐药的重要因素。因此,揭示肿瘤干细胞样细胞内在的分子机制,有助于发现针对进展期肿瘤的新疗法,为临床实践提供理论基础。
  前列腺癌,是世界范围内威胁男性健康的最主要原因之一,且具有高度异质性。雄激素剥夺治疗作为目前广泛应用的一线疗法,尽管对于进展期或是复发性前列腺癌有短时间的缓解效果,但是,最终由于不可逆的耐药,而导致不良预后。
  越来越多的证据提示,雄激素剥夺治疗在诱导耐药的过程中,对前列腺癌细胞进行重编程,导致一部分前列腺癌细胞发展出肿瘤干细胞样细胞特性。并且,在复杂的肿瘤微环境中,多种成分发挥与前列腺癌细胞相互塑造、相互促进的作用,因此,揭示前列腺癌干细胞样细胞与肿瘤微环境细胞相互作用的分子机制,并联合阻断相关通路,将有助于提高雄激素剥夺治疗的有效性。
  内容及结果:
  (一)OV6作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标
  为了了解OV6在前列腺癌组织中的表达情况和患者预后相关性,我们分别在正常前列腺组织、局限性前列腺癌组织、局部性进展前列腺癌组织、激素抵抗性前列腺癌、神经内分泌分化前列腺癌组织中,同时在同一前列腺癌组织内部、不同Gleason评分区域、晚期前列腺癌雄激素剥夺治疗前后组织、原位前列腺癌雄激素剥夺治疗的动物模型、前列腺癌细胞转移的动物模型中,利用免疫组化检测OV6的表达水平,结果发现,OV6与前列腺癌的恶性程度呈正相关,并且在同一肿瘤组织内部高Gleason评分区域相对高表达,并且在前列腺癌雄激素剥夺治疗后组织和转移组织中相对高表达,说明OV6可作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标。
  (二)OV6阳性前列腺癌细胞通过启动自噬维持肿瘤干细胞样细胞特征
  为了了解OV6阳性前列腺癌细胞是否具有肿瘤干细胞样细胞特征以及发挥维持干细胞特性的分子机制。我们通过定量PCR检测OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞基因表达;通过梯度稀释体外成球实验和体内成瘤实验检测OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力;通过增殖和凋亡实验检测OV6阳性前列腺癌细胞对于化疗和雄激素剥夺治疗药物的药物抗性,从而评估OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞特性。并通过RNA全转录组测序和一系列分子生物实验如Co-IP、Duolink、ChIP等,探索OV6阳性前列腺癌细胞维持干细胞特性的分子机制,发现,OV6阳性前列腺癌细胞可以通过启动自噬过表达ATG7,维持细胞质内β-catenin的稳定性,并促进后者入核启动OCT4的转录激活,从而维持干细胞特性。
  (三)OV6阳性前列腺癌干细胞样细胞通过和单核细胞相互塑造发挥促进雄激素剥夺治疗耐药的作用。
  我们在上部分研究中发现,单独抑制OV6阳性前列腺癌细胞内部相关通路并不能有效提高原位前列腺癌异种移植模型中雄激素剥夺药物恩杂鲁胺的治疗效果,提示肿瘤微环境细胞可能参与耐药过程。我们通过OV6阳性前列腺癌细胞与单核细胞共培养,抗体芯片和ELISA检测细胞上清中细胞因子的表达变化,发现IL6是OV6阳性前列腺癌细胞和单核细胞相互作用的关键分子。两者的相互作用,一方面,增强OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力,另一方面,招募并促进单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合抑制ATG7和IL6R可以有效提高前列腺癌细胞在原位前列腺癌异种移植瘤模型中对于恩杂鲁胺治疗的有效性。
  结论:
  在本项研究中,我们发现OV6阳性前列腺癌细胞具有干细胞特性,并且可以招募和促进肿瘤微环境中的单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合靶向OV6阳性前列腺癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间的网络信号传导可以有效改善原位前列腺癌模型中前列腺癌细胞对于雄激素剥夺治疗的抗性,这为改善前列腺癌雄激素剥夺药物的耐药性和提高疗效,最终改善患者预后提供临床前研究的理论基础。
[硕士论文] 程小龙
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:
  肺癌是当前全球范围内发病率及肿瘤相关病死率均最高的恶性肿瘤。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是最常见的内分泌疾病,其中绝大部分为2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)。流行病学资料显示T2DM是多种肿瘤发病及预后的危险因素。但目前关于T2DM与肺癌预后关系的研究相对较少,且结论相互矛盾。本文旨在通过对52例在我院接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ肺癌合并T2DM患者与63例同期在我院接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ肺癌不合并T2DM患者进行回顾性预后分析,探讨合并T2DM对接受一线含铂类双药联合方案化疗的晚期肺癌患者预后的影响。
  方法:
  通过检索第二军医大学附属长海医院病案管理系统,收集2011年1月至2015年12月期间在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ期肺癌合并T2DM患者为DM组,同时以1∶1的比例收集同期在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ期肺癌不合并T2DM患者为对照组,记录患者肺癌确诊时的年龄、性别、有无吸烟史、是否合并其他慢性疾病、肺癌病理类型等一般临床特征。并通过住院记录、门诊记录、电话咨询或邮件及信件联系,随访患者的无进展生存期(progression free survival,PFS)及总体生存期(overall survival,OS)。应用卡方检验及T检验比较两组患者之间一般临床特征的差异。应用单因素生存曲线比较法(Kaplan-Meier法)比较两组患者之间PFS与OS是否存在差异。行多因素生存分析(Cox回归分析),评估T2DM、年龄、性别、吸烟史、其他慢性合并症、病理类型等相关因素对晚期肺癌化疗患者PFS与OS的影响。
  结果:
  共收集到5年时间内在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗Ⅳ期肺癌合并T2DM患者88例,同时收集同期在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗Ⅳ期肺癌不合并T2DM患者88例。按照纳入标准,最终共115例患者纳入研究,其中DM组52例,对照组63例。一般临床特征比较结果显示DM组患者年龄大于对照组,平均年龄为64±7岁vs61±8岁(t=2.669,P=0.009);DM组男性、有吸烟史、有其他慢性疾病史的患者比例高于对照组,分为38/52vs32/63(X2=5.939,P=0.015)、25/52vs18/63(X2=4.630P=0.031)、30/52vs21/63(X2=6.849P=0.009)。病理类型分为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两大类,两组患者之间病理类无显著差异,SCLC/NSCLC为5/47vs3/60(X2=1.037P=0.422)。单因素生存曲线分析显示对照组与DM组患者PFS为13月(95%CI9-17月)vs8月(95%CI6-9月),(P=0.135),对照组患者PFS有长于DM组的趋势,但差异无统计学意义。而对照组患者OS显著长于DM组为36月(95%CI28-43月)vs18月(95%CI15-22月),(P<0.001)。多因素生存分析显示T2DM对患者PFS的影响为(HR=0.719,95%CI:0.451-0.145;P=0.165),对OS的影响为(HR=0.539;95%CI:0.334-0.870;P=0.011),合并T2DM以外其他慢性疾病对患者PFS与OS的影响分别为(HR=1.179;95%CI.:0.736-1.890;P=0.493)与(HR=1.756;95%CI:1.080-2.856;P=0.023)。
  结论:
  接受一线含铂类双药联合方案化疗的晚期肺癌合并T2DM患者总生存期显著短于不合并T2DM者,T2DM是此类患者长期生存独立且显著的危险因素,而T2DM对晚期接受化疗肺癌患者疾病进展期无显著影响。此外,合并T2DM以外其他慢性疾病也是晚期肺癌化疗患者长期生存独立且显著的危险因素。这说明晚期肺癌患者的治疗,是需要以病人为中心,以患者整体健康的维护与促进为目标的长期综合性健康管理。
[博士论文] 王碧波
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分 肝细胞调控肝血窦内皮细胞促进肝再生机制研究
  目的:
  肝脏在遭受到外力损伤,化学毒物暴露,或者病毒感染时,具有显著的再生能力,来维持肝脏的结构和功能。肝再生是一个由不同种类的细胞共同参与的持续的自然过程。小鼠肝部分切除模型(Partial Hepatectomy, PHx)是用来研究肝再生最经典的模型。在这个模型中,70%的肝脏被手术切除,剩下的肝脏增殖,大约术后1周,达到原来的肝脏体积,之后再生过程停止。肝再生是如何被触发的,在再生过程中肝脏的结构和功能是如何保持的,哪些信号负责关闭生长反应是肝脏再生的三个主要问题。肝脏结构主要由肝实质细胞、肝血窦内皮细胞(Liver sinusoidalendothelial cell,LSEC)、肝内胆管上皮细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)、Kupffer细胞和细胞外基质组成。肝细胞增殖在前,非实质细胞再生随后。正常组织结构恢复过程中,星状细胞在部分肝切除术后约4天产生细胞外基质,重建肝细胞与其他细胞之间的连接。肝内血管系统主要由动脉、静脉和LSEC构成。肝再生后期,势必需要建立丰富的血管系统来维持新生肝细胞的存活,肝内血管再生离不开肝脏内特殊的毛细内皮系统。LSECs约占肝脏内细胞的15-20%,形成肝窦壁,参与了不同的生理和病理过程。肝细胞和LSECs的平衡对于肝再生稳态的维持尤为重要,它有助于新生肝细胞的存活和肝脏功能保护。LSEC对肝细胞的增殖与终止是至关重要的,但启动LSEC的再生过程仍不清楚。
  方案:
  1.检测PHx后肝细胞与LSEC增殖的时相,探讨导致两者时相差的原因;
  2.论证CRISPR-Cas9联合AAV技术用于肝再生研究的可行性;
  3.基于CRISPR-Cas9联合AAV技术构建特异性抑制肝细胞增殖的肝再生模型,观察LSEC再生情况;
  4.筛查并验证肝细胞调控LSEC再生的关键因子,明确调控机理;
  5.探讨肝细胞对内皮前体细胞分化形成LSEC的影响。
  结果:
  1.发现肝再生中,肝细胞增殖高峰早于LSEC增殖高峰的可能原因;
  2.首次论证了CRISPR-Cas9技术用于肝再生研究的可行性。
  3.基于CRISPR-Cas9技术构建了肝细胞特异性敲除OSMR(OSMR△Hep)和Met(Met△Hep)的肝再生模型,发现抑制肝细胞增殖后,LSEC以及肝脏内的血管再生滞缓,提示肝细胞启动了LSEC再生过程;
  4.肝切除术后分离肝脏中的肝细胞、HSC、Kupffer和LSEC,分别进行了多因子筛查检测,对比分析显示肝细胞中促进内皮细胞生长的细胞因子VEGFA表达水平显著上调,而抑制内皮细胞生长的细胞因子PEDF表达水平显著下调;进一步结合OSMRAHep以及Met△Hep模型,提示了肝细胞可能通过上调VEGFA以及下调PEDF来促进LSEC再生。
  5.体内注射VEGFA中和抗体以及PEDF因子,可以显著滞缓LSEC再生;
  6.肝细胞特异性敲除VEGFA(VEGFA△Hep)的小鼠肝切除术后,LSEC增殖滞后;而它在LSEC、Kupffer以及HSC内的敲除不影响肝体比恢复速率以及LSEC再生;肝细胞过表达PEDF(PEDFHep)小鼠肝切除术后LSEC增殖滞后;以上实验证实了肝细胞可通过上调VEGFA以及下调PEDF来促进LSEC再生;
  7.结合内皮前体细胞分析显示,肝再生过程中,肝细胞可通过上调VEGFA及下调PEDF,促进骨髓中CD133阳性的内皮前体细胞动员、定植入肝,分化形成LSEC过程。
  结论:
  我们的研究发现了肝再生过程中肝细胞可启动LSEC再生,深入探讨了肝细胞调控LSEC再生的方式,揭示了肝细胞影响骨髓CD133阳性内皮前体细胞分化形成LSEC的机理。肝再生早期伴随着肝细胞的快速增殖,肝细胞通过上调VEGFA同时下调PEDF(PHx后第2-3天),促进LSEC的快速增殖;同时还促进骨髓中CD133阳性的内皮前体细胞,进入血液中(PHx后第2-3天),定植肝内(PHx后第2-4天),分化形成LSEC(PHx后第4-7天)。LSEC的部分再生过程依赖于骨髓内皮前体细胞定植分化,本研究结果解释了为什么VEGFA和PEDF在肝细胞内变化高峰(PHx后第2-3天)与内皮细胞增殖高峰(PHx后第4-5天)存在2-3天的时间差。
  第二部分 靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂在肝癌防治中的不同作用
  目的:
  肝脏具有的独特快速再生能力,可避免在急/慢性损伤或肝细胞死亡后对肝脏正常功能的影响。然而,在慢性损伤的情况下,驱动肝脏再生的分子机制是导致肝细胞癌变的主要危险因素,这也解释了肝细胞癌的发生通常伴有慢性肝病的基础,如肝硬化和慢性肝炎。伴随着肝脏的损伤存在着持续的肝脏再生,其中,细胞积累活性氧簇与抗氧化调控失衡是导致致癌突变引发肝癌的主要原因之一。长久以来,人们普遍认为抗氧化剂能够中和活性氧(ROS)来减少氧化应激产生的损伤,因此认为抗氧化剂具有一定的预防和辅助治疗肿瘤的作用。然而越来越多的随机对照实验以及基础研究表明结果与此相反,即抗氧化剂对肿瘤不但没有防治作用,甚至某些特殊情况下还会增加肿瘤罹患的风险;这进一步说明了抗氧化剂在肿瘤预防中的双重作用,而且抗氧化剂对不同种类的肿瘤作用也不同。此外,循证医学提示抗氧化剂的种类也是会影响肿瘤预防的效果。总体而言,为了合理地使用抗氧化剂,需要区分肿瘤类型以及抗氧化剂的种类。然而,使用不同种类的抗氧化剂对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生的结局仍然未知。本文综合国内外有关抗氧化剂在肿瘤预防和治疗中的应用和进展,研究了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向型抗氧化剂在肝癌防治中的作用,分析了这两类抗氧化剂促进或抑制肿瘤的具体机制,并提出抗氧化剂的类型是影响其用于肝癌防治不同效应的重要因素,从而为抗氧化剂在肝癌防治中的合理应用提供了理论依据。
  方案:
  1.建立DEN和DEN联合CCl4诱导的两种肝癌模型,给予靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向型抗氧化剂,研究两类抗氧化剂对HCC形成的影响;
  2.检测给予不同种类抗氧化剂后,肝细胞内总ROS和线粒体内ROS的变化情况,以明确这两类抗氧化剂的作用部位;
  3.转录本测序分析抗氧化剂处理后肝脏样本基因转录水平的变化;
  4.根据芯片数据探讨抗氧化剂对肝细胞DNA损伤的影响和作用机制。
  5.检测给予不同种类抗氧化剂后,DNA损伤,损伤反应相关蛋白以及修复相关蛋白在两组之间的变化情况,明确调控机理;
  6.探讨改变ATM/ATR活性对不同类型抗氧化剂防治HCC形成过程的影响。
  结果:
  1.靶向线粒体型抗氧化剂(SS-31、Mito-Q)促进HCC的形成,非靶向线粒体型抗氧化剂(NAC、Trolox)抑制HCC的形成;
  2.非靶向线粒体型抗氧化剂降低了细胞内总的ROS;相比而言,靶向线粒体型抗氧化剂除降低细胞内总的ROS外,还特异性降低了线粒体内的ROS;
  3.转录本测序数据提示靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂对肝细胞内氧化还原状态的影响不同,多条信号通路分析提示它们对DNA损伤反应的影响不同;
  4.体内外实验证实靶向线粒体型抗氧化剂促进了肝细胞中DNA损伤,非靶向线粒体型抗氧化剂则抑制了该损伤;
  5.升高SS-31降低线粒体内ROS,可以抑制SS-31所导致的DNA损伤;
  6.靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂对肝细胞内DNA损伤反应以及DNA修复相关蛋白影响不同;
  7.靶向线粒体型抗氧化剂抑制ATM/ATR及其下游信号通路,促进ATM在线粒体内富集,并减少核内ATM分布;而非靶向线粒体型抗氧化剂进一步活化该通路,促进ATM核内富集,减少线粒体内ATM分布;
  8.改变ATM/ATR活性可逆转不同类型抗氧化剂对HCC的防治效果。
  结论:
  本研究发现了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向线粒体型抗氧化剂对化学诱发肝癌的不同防治效果;揭示了非靶向线粒体型抗氧化剂NAC和Trolox可促进原代肝细胞中DEN损伤的DNA修复过程,减缓了HCC形成;而靶向线粒体型抗氧化剂SS-31和Mito-Q则抑制了DNA修复,促进了HCC;阐述了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向线粒体型抗氧化剂在HCC防治中的不同作用与线粒体内ROS和非线粒体内ROS在HCC形成中的不同作用有关,线粒体内外ROS的失衡可能诱导了DNA损伤进而促进了HCC形成。
[硕士论文] 吴震中
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 超声引导下微波热消融治疗cN0期甲状腺乳头状癌的临床随访评估
  目的:探讨超声引导下cN0期甲状腺乳头状癌微波热消融治疗的临床疗效。
  方法:收集2011年10月至2017年5月于上海长征医院超声科和上海国际医学中心接受微波消融治疗的cN0期甲状腺乳头状癌患者222例并对其随访,统计分析其结节吸收情况、并发症发生率以及复发率。
  结果:原消融灶均呈不同程度缩小,平均缩小率约87.34%,共56例消融灶完全吸收。除2例单侧腺体消融损毁后出现亚临床甲减,其余患者消融术后甲状腺功能指标正常。术后无严重并发症出现,随访共发现1例出现淋巴结转移灶,1例出现腺体内其他部位新生癌灶,予以了二次消融,后续随访未再出现复发。
  结论:微波热消融治疗cN0期甲状腺乳头状癌临床效果较好,可能是未来治疗甲状腺乳头状癌的重要手段。
  第二部分 cN1期甲状腺乳头状癌微波热消融治疗的临床疗效及其复发危险因素的研究
  目的:探讨cN1期甲状腺乳头状癌微波热消融治疗的临床疗效及其复发危险因素。
  方法:回顾性分析2013年7月至2017年4月于上海长征医院超声科和上海国际医学中心接受微波消融治疗的cN1期甲状腺乳头状癌患者共50例,其中临床淋巴结转移cN1a期32例、cN1b期18例。探讨cN1期甲状腺乳头状癌微波消融术后的临床疗效以及性别、年龄、原发肿瘤大小、肿瘤病灶数等与复发的关系。影响复发的单因素差异性比较采用log rank检验,并运用COX回归模型进行多因素分析。
  结果:随访过程中共发现9例出现淋巴结转移灶,3例出现腺体内其他部位新生癌灶,未见有远处转移的病例,总体复发率为24%。单因素分析显示了性别、肿瘤病灶数、淋巴结转移分期是甲状腺乳头状癌微波消融术后复发的危险因素。多因素分析显示肿瘤病灶数和淋巴结分期是甲状腺乳头状癌消融术后复发的危险因素。
  结论:微波热消融治疗cN1期甲状腺乳头状癌具有一定的临床效果,具有可重复性好的优点,但仅行一次消融复发率较高,重复消融并不增加并发症的发生率。
[博士论文] 塔娜
病理学与病理生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  胰腺癌是一种较为常见的高度恶性的消化系统肿瘤,其五年生存率不足5%,中位生存期小于6个月。胰腺癌最常见的组织学类型为胰腺导管腺癌(PDAC),约占所有胰腺癌病例的85%-90%。患者死亡率高、预后差的主要原因是该疾病早期缺乏特异性临床症状和诊断及预后相关的分子标志物,大部分患者在诊断时肿瘤已发生转移,从而失去了手术机会,而且该肿瘤对放、化疗反应性差,极易复发转移。近年来,随着医学的发展,人类大多数恶性肿瘤患者的生存期有了显著增加,但胰腺癌患者的生存期并无明显改善,因此胰腺癌早期诊断及治疗成为亟待解决的问题。研究显示,胰腺上皮内瘤变(PanIN),尤其是高级别上皮内瘤变(PanIN-3),是胰腺导管腺癌最常见的非侵袭性癌前病变。早期诊断和手术切除可将胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6%提高到Ⅰ期的50%左右。若能找到胰腺癌特异性的分子标志物并在癌前病变阶段对该疾病进行诊断或有针对性的对胰腺癌高危人群进行筛查,胰腺癌患者的生存状况将会得到大大改善。此外,胰腺癌的发生发展涉及多种癌基因、抑癌基因以及表观遗传学等改变,探索胰腺癌的发病机制,将为胰腺癌诊断治疗提供新的思路。
  MicroRNA(miRNA)是一组内源性的非编码的单链小RNA分子,长度为19-24个核苷酸,主要通过与其靶标mRNA的3'UTR区域互补结合,导致mRNA的降解或翻译的抑制,在转录后水平调节30%的蛋白质编码基因的表达而发挥作用。一个miRNA可能对应多个靶点,同时,多个miRNA也可能作用于同一个靶点。miRNA的异常表达与多种肿瘤发生发展的重要过程息息相关,例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。目前研究表明,miR-21,miR-155,miR-196a和miR-210在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用,或可作为胰腺癌潜在的分子标记物。然而多种研究中特异性miRNAs的一致性较差,应用中其敏感性和特异性仍有待提高。因此,本研究主要致力于发现更有优势的胰腺癌尤其是PanIN-3特异性的miRNAs并探索其作用机制,为胰腺癌的诊断、治疗和预后判断提供新的切入点。
  目的:
  筛查PanIN-3及胰腺癌组织中异常表达的miRNAs,并在胰腺癌组织和外周血浆中进行验证,研究其对胰腺癌生物学特性的影响,并分析其相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性,再通过生物信息学方法寻找并鉴定其下游作用的靶基因,进一步探寻其作用机制。
  方法:
  1.利用miRNA芯片技术筛查PanIN-3及胰腺癌组织中较胰腺正常导管及低级别上皮内瘤变组织中显著差异表达的miRNAs。
  2.利用原位杂交和实时荧光定量PCR技术,在胰腺癌患者石蜡包埋组织和外周血浆中进一步验证上述miRNAs的表达情况,获得可能作为诊断标志物的候选miRNAs,并分析其诊断效能。
  3.结合胰腺癌患者临床病理资料,分析候选miR-1290的相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性。
  4.通过细胞学实验:观察miR-1290对胰腺癌细胞株生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性的影响。
  5.通过动物实验:研究miR-1290对胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生物学特性的影响。
  6.利用生物信息学(MiRDB,Targetscan,MiRanda)分析技术,预测miR-1290可能的下游靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统分析其与miR-1290的关系,并进一步验证其对胰腺癌生物学行为的影响。
  7.利用实时荧光定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学技术,分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌旁正常组织中的表达情况,探讨其临床意义。
  结果:
  1.miRNA芯片结果显示:与正常胰腺导管上皮和低级别上皮内瘤变相比,PanIN-3和胰腺癌中表达明显上调或者下调(超过5倍)的miRNAs有30余种,结合文献,筛选出其中的19条作为候选miRNAs。其中上调的主要有miR-31-5p,miR-29a-5p,miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,miR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p,miR-29a-3p,miR-34a-3p,miR-155;下调的主要有miR-105-3p,miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。
  2.原位杂交结果显示:以“PanIN-3和癌组织中表达明显高于正常导管上皮和低级别上皮内瘤变(PanIN-1和PanIN-2)”作为判定标准,筛选出高表达的miRNAs共计6条,包括miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p以及miR-155。
  3.血浆实时荧光定量PCR验证结果显示:胰腺癌患者外周血浆中,miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表达均明显增高,差异具有统计学意义。绘制ROC曲线比较其诊断效能,miR-31-5p和miR-1290具有相对较好的诊断效能,AUC分别为0.848和0.829。
  4.组织实时荧光定量PCR验证结果显示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺导管腺癌组织中高表达,癌旁正常组织低表达,与外周血浆结果相一致,提示miR-31及miR-1290可能是参与高级别上皮内瘤变向胰腺癌转变这一过程的早期分子,具有成为胰腺癌早期诊断分子标志物的潜能。结合患者的临床病理资料进一步发现miR-1290高表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移密切相关(p<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。提示miR-1290可能参与肿瘤的侵袭转移。
  5.miR-1290对胰腺癌细胞株生物学特性的影响:(1)检测五株胰腺癌细胞株中miR-1290的表达量,发现其在AsPC-1中表达最低,在PANC-1中表达最高,选取这两株细胞分别进行过表达和抑制实验。(2)验证转染效果:转染miR-1290Agomir的细胞系中,miR-1290被成功过表达,转染miR-1290Antagomir的细胞系中,miR-1290被成功抑制。(3)平板克隆实验结果显示,过表达miR-1290可显著促进细胞增殖和集落形成(p<0.05)。(4)细胞增殖活性实验结果显示,miR-1290过表达,细胞增殖速度加快,24小时活细胞数量明显高于对照组(p<0.05);miR-1290抑制后,细胞增殖速度减慢,24小时活细胞数量明显少于对照组(p<0.05)。(5)细胞迁移及侵袭实验结果显示,过表达miR-1290可促进胰腺癌细胞迁移和侵袭(p<0.05);抑制miR-1290,细胞迁移和侵袭能力显著下降(p<0.05)。与细胞划痕实验趋势一致。(6)凋亡实验结果显示,过表达或抑制miR-1290对细胞凋亡无明显影响(p>0.05)。
  6.裸鼠皮下荷瘤实验结果显示:过表达miR-1290可增加胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积更大(p<0.05);抑制miR-1290可减弱胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积减小(p<0.05)。
  7.生物信息学结果显示,IKKα可能为miR-1290的靶基因之一。
  9.IKKα对胰腺癌细胞功能学实验结果显示:(1)抑制IKKα在胰腺癌细胞系中的表达,可促进其增殖、迁移和侵袭;(2)过表达IKKα,可逆转miR-1290对胰腺癌细胞系促增殖、迁移和侵袭的作用;(3)改变胰腺癌细胞系中miR-1290及IKKα的表达量,NF-κB信号通路相关的蛋白IKBα、P65和P50表达无明显变化。
  结论:
  1.通过miRNA芯片、原位杂交以及组织和血浆中差异性表达miRNAs的筛查,6条miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表达升高。
  2.胰腺癌组织中差异性表达的miRNAs与胰腺癌患者血浆中差异性表达的miRNAs具有一致性,提示血浆中miRNAs有望成为胰腺癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。
  3.miR-1290在胰腺癌组织及胰腺癌患者外周血浆中表达均显著升高,且其表达水平与胰腺癌患者肿瘤分化程度及淋巴结转移相关,提示miR-1290可能成为胰腺癌诊断及预后判断的分子标志物。
  4.miR-1290可通过促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及成瘤能力,参与胰腺癌生物学行为的调控,其在胰腺癌发生发展中可能起着癌基因的作用。
  5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一,其可直接被miR-1290抑制(结合位点为3'端843-849处),促进胰腺癌的增殖、迁移和侵袭,提示miR-1290及其靶基因IKKα可能成为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。
  6.IKKα作为miR-1290靶基因之一参与胰腺癌发生发展,可能通过非NF-κB依赖的信号通路发挥作用。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
[硕士论文] 许洋
放射医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  原花青素是目前已知的抗氧化能力最强的天然提取物,远高于日常使用的维生素C及维生素E。其具有来源广泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的优势。此外,原花青素的生物体内的半数致死剂量超过5000mg/kg,远远大于治疗剂量。原花青素对肺组织相关炎症及疾病具有较好的治疗作用:原花青素可以有效减轻角夹胶诱导的肺组织急性炎症反应,减轻小鼠哮喘模型的急性气道炎症反应,抑制肺水肿的形成,且对博来霉素诱导的肺炎具有很好的治疗作用。本实验室前期研究成果发现,原花青素可以显著减轻辐照后早期放射性肺炎的炎症渗出和晚期放射性肺纤维化的发生,降低辐射所导致的肺组织上皮间质转化程度,减轻炎症因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改变程度。另外,与其他抗氧化剂不同的是,原花青素是一种缓释抗氧化剂,他可以在血液和组织中存留7-10天,发挥持续的抗氧化作用,这对于病情进行性进展的放射性肺损伤的防治具有独到的优势。此外,原花青素还具有抗肿瘤作用。过去的十年体外细胞实验和动物实验均已经证明原花青素对皮肤癌,乳腺癌,前列腺癌,头颈部肿瘤和肺癌等肿瘤细胞增殖具有明确抑制作用。研究者还在体外实验中证实原花青素对正常细胞的生长和活力没有明显影响,而只对肿瘤细胞表现出杀伤作用。综合以上的特点,推测,原花青素有希望在肺癌放疗过程中,防护放射野内正常的肺组织的同时,对肺癌细胞又起到抑制增殖的作用。本课题将重点研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用及其分子机制。
  研究目的:
  (一)小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。
  通过原位肺内注射法建立原位肺癌模型。特点:以左肺上叶作为肺癌细胞的生长环境,通过基质胶固定细胞位置。
  (二)原花青素在肺癌放疗中的双向作用。
  1、原花青素在细胞作用中的研究。
  (1)通过CCK8检测原花青素在小鼠正常肺上皮细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的毒性;
  (2)通过流式检测及克隆形成率实验检测原花青素对肺正常细胞的辐射防护作用及对肺肿瘤细胞的辐射增敏作用。
  2、原花青素在肺癌模型中的作用。
  (1)原花青素能够抑制小鼠肿瘤的生长及转移
  ①原花青素抑制小鼠皮下肿瘤的生长;
  ②原花青素抑制小鼠肿瘤的转移。
  (2)原花青素影响荷瘤小鼠局照后的生存状况;
  (3)原花青素对荷瘤小鼠局照后肿瘤大小及肺叶重量的影响;
  (4)原花青素减少荷瘤小鼠局照后正常肺组织的炎性渗出;
  (5)原花青素能够减少小鼠肺正常组织照射后的凋亡,而促进照射后肿瘤组织的凋亡,同时抑制其增值;
  (6)原花青素能够调节Th1/Th2相关细胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的机制研究。
  1、原花青素可以明显降低辐照后A549及BEAS-2B细胞中活性氧的产生;
  2、原花青素对肺正常细胞及肿瘤细胞内的p-ERK、p-JNK及p-P38表达情况的影响具有差异;
  3、原花青素可以激活肺正常细胞及肿瘤细胞Sirt6蛋白的表达;
  4、研究肺正常细胞及肿瘤细胞过表达Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表达情况;
  5、通过抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况,判断Sirt6蛋白在原花青素中的作用。
  研究方法:
  (一)建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。
  1、用胰岛素注射器将肿瘤细胞与基质胶的混悬液注射入小鼠左上肺叶,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;
  2、使用本实验室设计的固定小鼠模具,采取铅块遮挡的方式建立肺部局照放射模型;
  3、照射方式:采用25Gy60Coγ射线单次照射,剂量率为1Gy/min。
  (二)研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用
  1、选取小鼠肺上皮细胞MLE-12、肺癌细胞LLC及人正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺腺癌细胞A549进行试验;
  (1)细胞分组:对照组、原花青素处理组、照射组、照射组加原花青素处理组,每种细胞分组相同,照射剂量为8Gy;
  (2)细胞照射及原花青素处理后对正常细胞及肿瘤细胞增殖能力的影响:流式细胞仪检测及克隆形成率;
  2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基础上检测原花青素的双向作用
  (1)小鼠分为:假手术对照组、假手术肺部照射组、肺部荷瘤对照组、肺部荷瘤原花青素处理组、肺部荷瘤照射组及肺部荷瘤原花青素加照射组,共6组,每组选用雄性8周C57BL/6小鼠3只;
  (2)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠的生存影响:检测荷瘤小鼠生存期及体重;
  (3)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠肿瘤的影响:检测肿瘤大小,H&E染色及小鼠左上肺叶重量;
  (4)免疫荧光检测正常肺组织及肿瘤组织的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;
  (5)检测原花青素对小鼠免疫细胞因子的影响:用ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-6和IFN-γ。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的分子机制
  1、检测原花青素对照射后细胞内活性氧的清除:ROS检测试剂盒;
  2、检测原花青素对照射后细胞内相关蛋白变化的影响:Western blot;
  3、检测原花青素对照射后原位荷瘤小鼠正常肺组织及肿瘤组织蛋白的影响:Western blot;
  4、通过改变细胞内Sirt6的表达检测p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达:Sirt6过表达质粒的转染、Western blot;
  5、通过选取抑制剂S1805、SP600125及SB203580分别抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况:Western blot。
  研究结果:
  (一)成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型
  1、成功建立小鼠左上肺叶原位肺癌荷瘤模型,肿瘤生长符合实验要求;
  2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。
  (二)原花青素在肺正常细胞及肿瘤细胞放疗中的双向作用
  1、对小鼠肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少小鼠肺上皮细胞MLE-12照射后的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对小鼠肺上皮细胞MLE-12具有辐射防护作用,对小鼠肺癌细胞LLC具有辐射增敏作用;
  2、对人肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少人正常肺上皮细胞BEAS-2B凋亡且促进人肺腺癌细胞A549的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞具有辐射防护作用,且能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,具有辐射增敏作用;
  (三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放疗中的双向作用研究
  1、通过观察并记录原位肺癌荷瘤小鼠的生存情况,发现:原花青素处理加照射组相比于照射组,其存活时间更长;
  2、通过对小鼠肺内肿瘤的测量,发现:原花青素处理加照射抑制小鼠左上肺叶内肿瘤的生长,相比较于单纯照射组,效果更加明显;
  3、通过荧光免疫分别标记增殖相关蛋白Ki67及凋亡相关蛋白p53,发现:在小鼠正常肺组织内,原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显降低;在肿瘤组织内,单纯处理组的Ki67的表达量相比于对照组明显降低,而原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显升高;
  4、通过ELISA检测荷瘤小鼠血清细胞因子的表达量,发现:原花青素加照射组相比于单纯照射组,能够明显抑制IL-6、提高IFN-γ的表达,促进对肿瘤的抑制,降低炎性损伤。
  (四)原花青素在肺癌放疗中的可能作用机制
  1、原花青素能够显著清除人肺癌细胞A549及正常肺上皮细胞BEAS-2B照射后所产生的自由基;
  2、在人肺癌细胞A549中,原花青素明显提高照射后p-JNK蛋白的表达;在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可以明显抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而这与其能够清除活性氧自由基有关。
  3、在人肺癌细胞A549中,原花青素通过增加Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用
  研究结论:
  在细胞层面上发现,原花青素对小鼠肺癌细胞LLC及人肺癌细胞A549具有辐射增敏作用,对小鼠肺正常细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B具有辐射防护作用。在人肺癌细胞A549中,原花青素可以通过提高Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用。在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可能通过清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎症作用。通过建立小鼠原位肺癌的放疗模型,发现原花青素能提高小鼠的生存期,可以改变血清细胞因子的表达,能够减少小鼠肺正常组织的辐射损伤,同时对肿瘤具有放疗增敏的作用。
[硕士论文] 蒋亚波
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  信号转导与转录激活因子5(Signal Transducer and Activator Of Transcription5,STAT5)在人体内有着广泛的生理病理功能。STAT5能被多种细胞因子(cytokines)如催乳激素(prolactin,Prl)、红细胞生长素(erythropoietin)、生长激素(growth hormone,GH)和上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等激活并能反馈的调控多种细胞因子。在肝脏中,有研究发现GH-STAT5信号通路在控制脂代谢途径上发挥着重要的作用:肝脏特异性敲除STAT5后,增加了CD36和PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)的表达,导致实验小鼠出现明显的脂肪肝、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗和肝脏再生能力受损。此外STAT5在肝脏的缺失,还会引起TGF-β和STAT3的表达增加,加速了肝脏的纤维化和肿瘤的形成。另外,肝特异性的敲除STAT5A后,调控了NOX4(reactive oxygen species(ROS)-generating enzyme NOX4)的表达,导致凋亡蛋白PUMA和BIM的表达下降,从而促进了肝癌细胞增殖。
  STAT5包含了STAT5A和STAT5B两个亚型,二个亚型均由人类17号染色体上衔接的连锁基因所编码,并在DNA结构上有95%的相似性,但是由于蛋白结构上的反式激活区域存在着一定的差异,STAT5A和STAT5B在生理病理过程中都有着特异的生物学功能。本课题旨在探究STAT5A亚型在肝癌进展中的作用,尤其是对肝癌糖代谢的影响。同时,希望能从抑制糖代谢的角度寻找新的潜在的治疗靶点。
  研究方法:
  首先,利用病人组织芯片,分析并明确STATSA在肝癌病人肿瘤组织中的表达情况。Kaplan-Meier方法分析STAT5A的表达与预后的关系以及进行多因素的生存分析。在生物学功能方面,首先构建STAT5A过表达的稳转Huh7肝癌细胞系,利用CCK8、流式分析及裸鼠皮下荷瘤实验探索STAT5A对于肝癌细胞增殖和细胞周期的影响。然后,利用Kit检测STAT5A的表达对于细胞葡萄糖消耗,乳酸代谢的影响。更进一步凭借GC-MS技术,具体的分析糖酵解和TCA循环上各代谢产物的变化。在机制方面,利用q-PCR技术和Wectern blot技术分析验证STAT5A可能的作用通路以及作用的糖代谢靶点。
  研究结果:
  (一)STAT5A的表达与患者预后的关系
  1.根据148例病人的组织芯片结果分析发现,与配对癌旁组织相比,STAT5A在肝癌肿瘤组织中的表达明显降低。用Kaplan-Meier生存分析方法分析发现,肿瘤中STAT5A低表达组OS较高表达组明显降低。多因素生存分析也有类似的结果:STAT5A的表达与是否有包膜、AFP的表达和肿瘤大小可以作为影响RFS和OS的独立风险因素。
  (二)STAT5A在体内外对肝癌细胞增殖能力、细胞周期的影响
  1.检测STAT5A在常用肝癌细胞系中的表达,挑选Huh7构建了稳转的过表达细胞系,而敲除STAT5A的细胞系则用相对应的siRNA,并用WB对STAT5A的表达进行验证。
  2.CCK8增殖实验发现,过表达STAT5A后肝癌细胞的增殖明显被抑制,而敲除STATSA之后细胞的增殖能力明显增强。裸鼠皮下荷瘤实验也证实了STAT5A能抑制肝癌细胞的增殖。流式技术分析还发现,STAT5A过表达可以抑制肝癌细胞的周期进展,使肝癌细胞更多的停滞在G0/G1期,减少了细胞的有丝分裂。
  3.关于糖代谢方面,首先利用相关kit检测培养基葡萄糖和乳酸,发现STAT5A过表达可以明显的减少肝癌细胞葡萄糖的消耗和乳酸的产生。进一步的针对具体代谢产物的分析提示,STAT5A过表达可以降低糖酵解和TCA循环上的主要产物。
  (三)STAT5A机制探究
  1.在通路方面,发现STAT5A可以明显的调控AKT的磷酸化,而反过来抑制AKT之后STAT5A的磷酸化也会增加。配对病人的组织芯片结果也证实,STAT5A的表达与p-AKT的表达呈负性相关。
  2.利用knock-down和过表达的细胞进行qPCR检测发现STAT5A在转录水平能影响多种基因的表达,在病人组织的RNA水平上也有类似的结果。进一步的WB实验发现,STAT5A会明显的影响HK2的蛋白水平的表达。加入AKT抑制剂之后能逆转HK1的蛋白表达证实,AKT通路在STAT5A-HK2的调控过程中有着重要的作用。
  3.发现了miRNA-23a可以负调控STAT5A的表达。
  4.此外,还证实了,STAT5A对另一个重要的转录因子HNF4α有着明显的正调控,并且,HNF4α可以直接作用于PI3K。
  研究结论:
  本课题首先明确了STAT5A在肝癌患者肿瘤组织中低表达,并且低表达组预后较差。接着在细胞学以及动物水平上验证了STAT5A能明显抑制细胞的增殖和细胞周期的进展,发挥着重要的抑癌作用。关于糖代谢方面,发现STAT5A的过表达可以明显的抑制糖酵解过程和TCA循环,从能量的角度抑制肿瘤的进展。在机制方面,验证了STAT5A与p-AKT的关系,并且确定了下游糖代谢的关键基因HK2。此外,还发现了可以调控STAT5A的miRNA-23a以及STATSA-HNF4α-PI3K-AKT信号通路,但具体的机制尚不清楚,仍需进一步研究。
[博士论文] 鲍蕾蕾
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,基因组测序技术的快速发展,加深了人们对肿瘤异质性的认识,含有大量肿瘤临床样本多组学数据库的TCGA及Oncomine分析平台为肿瘤个体差异的基因分型、治疗与生存期的整合研究提供了大样本数据库,受到国内外学者的广泛关注,并越来越多地运用到肿瘤的个体化精准治疗的研究中来。
  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一,现已成为中国第二世界第三位的癌症死亡原因。中国为肝癌高发病率国家,手术切除被认为是可能治愈初诊HCC患者的疗法,但只有约10%~20%的患者肿瘤可切除,且手术病人面临肿瘤复发的可能,最近的统计发现2000年至2014年间中国肝癌患者5年生存率仅为14.1%。
  近年来针对肝癌靶向治疗药物的研发逐渐成为热点,但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突变参与了肝细胞癌的发生发展,而其精确的分子机制尚不完全清楚,导致靶向制剂对肿瘤患者个体的治疗效果差异大,药物靶向性较低。目前,作为首个美国FDA批准上市,用于晚期HCC靶向治疗的多激酶抑制剂索拉菲尼,其有效率也仅为25%。
  1995年Lever在The Lancet杂志发表一项大型开创性回顾研究,发现服用血管紧张素酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEIs)和血管紧张素受体抑制剂(angotensin recepter blockers,ARBs)的病人比未服用该类药物的病人患乳腺癌和肺癌的风险更低。随后另一部分的学者进行相关研究却未得到类似结果。这个不同的研究结果引起众多学者的关注,在这些研究中除了入选患者种族、人群及服药周期等不同因素外,由于受到基因测序技术的限制,大部分的患者未做个体基因表达谱测定,导致患者个体基因差异未做考虑。在后续的研究中发现,在肾素血管紧张素系统中一个关键受体AT1R(type-1angiotensinⅡ)其编码的基因AGTR1在多个肿瘤中发生异质性表达,并且高表达该基因会引起多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良预后,但是AGTR1基因在肝细胞癌中的表达及对肝癌的影响却少有报道。对TCGA数据库中全部3个肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据的AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用的基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。
  第一部分 AGTR1差异表达对肝细胞癌发展的影响
  选用Oncomine数据库中全部3个肝细胞癌的临床347例RNA芯片数据,发现AGTR1基因在这3个数据集中均位于过表达基因前5%,并在部分肝细胞癌患者中出现高表达。同时在TCGA数据库中对全部374例的肝细胞癌临床样本进行差异分析,发现AGTR1表达前80位和后80位的样本AGTR1的相对表达具有显著差异,进一步结合数据库中肝细胞癌样本预后数据,采用Kaplan-Meier生存分析,发现低表达组患者的生存期较高表达组显著延长。以上结果说明,AGTR1在部分肝细胞癌患者中呈高表达,且这种高表达与患者的生存期相关,由此初步推断AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用。为了证明AGTR1基因在肝细胞癌发生、发展及转移中的作用,筛选低表达AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404细胞,对它们进行过表达AGTR1的改造,同时选择高表达AGTR1的MHCC-97H细胞进行干扰表达的改造,体内外研究AGTR1对肝细胞癌的作用。结果发现AGTR1在体外实验中具有促进肿瘤细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移的作用,而在体内试验中能加速裸鼠皮下成瘤试验的肿瘤形成及生长。此外,采用含有luciferine片段的载体构建sh-AGTR1和sh-nc,稳筛低表达AGTR1的MHCC-97H细胞,采用小动物活体成像系统,在体观察不同AGTR1表达量的MHCC-97H细胞在脾脏肝转移模型中的转移情况,发现抑制AGTR1可以降低MHCC-97H肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。
  第二部分 AGTR1差异表达影响肝细胞癌生长的作用机制研究
  为了探讨AGTR1促进HCC细胞生长、转移作用机制,采用Westen Blot方法检测过表达和干扰表达AGTR1对HCC细胞信号通路的影响,发现过表达HCC细胞中的AGTR1可以促进JAK2、STAT3、ERK的磷酸化,抑制AGTR1则可以降低相应分子的磷酸化。且JAK2特异性抑制剂AG490可以抑制AGTR1介导的HCC细胞的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力。此外,先用TCGA数据库中374例肝细胞癌患者的mRNA芯片数据,对VEGF与AGTR1进行相关性分析,发现随着AGTR1的表达量的上升,VEGF与AGTR1表达相关性也随之上升。对低表达AGTR1的SMMC-7721,BEL-7404细胞过表达AGTR1,两个细胞内VEGF的表达也随着AGTR1的表达上升而上升。对高表达AGTR1的MHCC-97H细胞干扰表达AGTR1,VEGF的表达也随之下降,且因AGTR1的高表达或过表达引起的VEGFA的上调表达可以被AG490抑制。由此可以推断,AGTR1的高表达可能会促进细胞内JKA2的磷酸化,进而激活细胞质内STAT3、ERK等分子的磷酸化,这些磷酸化的分子可进入细胞核,启动VEGF等分子的转录、翻译、合成,促进细胞分泌VEGF等细胞因子,大量新分泌的VEGF与细胞表面的受体结合可能会进一步激活细胞内STAT3、MAPK等信号通路,促进肿瘤内新生血管的生成及细胞的增殖、迁移等生物学过程。
  第三部分 AGTR1抑制剂对HCC细胞体内外抗肿瘤作用效果研究
  本部分研究中选择临床应用时间最长、应用病例最多的洛沙坦作为靶向AGTR1的抑制剂考察其作用效果。在体外实验中,发现当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高表达的MHCC-97H细胞和AGTR1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,但对AGTR1低表达的SMMC-7721细胞和AGTR1干扰表达的MHCC-97H细胞则无上述作用。体内实验中,选用高表达AGTR1的MHCC-97H细胞,在裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药,相比空白对照组,20mg·Kg-1~80mg·Kg-1给药剂量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。免疫组化分析发现随着给药剂量的增加,瘤内AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表达水平显著下降,血清VEGFA量也随着洛沙坦的给药剂量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在体内外水平对AGTR1高表达HCC细胞生长及肿瘤血管形成的抑制作用。
  综上所述,本课题通过TCGA数据库中全部肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据,对AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用,在此基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。对6种不同的肝细胞癌细胞系(HepG2、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、MHCC97H、HLF)与正常肝细胞系(QSG-7701)进行AGTR1的mRNA及蛋白的表达检测,证实相比正常肝细胞系(QSG-7701),肝细胞癌细胞系MHCC97H、HLF中AGTR1mRNA和蛋白水平均有显著的上调表达,而在BEL-7404、SMMC-7721中AGTR1mRNA和蛋白水平的表达显著低于正常肝细胞的表达水平。通过验证临床肝癌样本中AGTR1的表达情况,显示33例肝细胞癌样本中有20例临床样本AGTR1呈上调表达或高表达。进一步通过体内外实验,发现过表达AGTR1后可促进HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,加速裸鼠皮下肿瘤形成及生长;而抑制AGTR1的表达可降低HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,并降低HCC肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。通过对AGTR1相关通路的分析,揭示AGTR1高/过表达HCC细胞主要通过JAK2/STAT3通路介导其生长、增殖、迁移及侵袭过程,同时验证了AGTR1靶向抑制剂的作用。在药效实验中,探讨以AGTR1靶向抑制剂洛沙坦对HCC细胞的作用效果,结果发现在体外试验中,当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高/过表达HCC细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。在体内实验的裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药(20mg·Kg-1~80mg·Kg-1),洛沙坦能显著抑制AGTR1高表达HCC细胞裸鼠皮下肿瘤的生长,降低肿瘤组织中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表达。由此证明了洛沙坦在体内外水平具有抑制AGTR1高表达HCC细胞生长的作用。研究结果明确了AGTR1在肝癌发生发展中的作用,探讨了AGTR1促进肝细胞癌细胞异常生长的可能机制,为AGTR1高表达肝细胞癌靶向治疗药物的发现及应用提供了实验数据。
[硕士论文] 刘永刚
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)属于起源于间充质的一种恶性骨肿瘤,是儿童与青少年罹患原发性恶性骨肿瘤疾病谱中最常见的。骨肉瘤患者的年龄分布呈现双峰状态,分别为青春期人群与老年人群。青春期高峰集中在大约15岁。0~24岁组的骨肉瘤发病率为4.4/百万。第二个峰值集中在75岁左右,主要由与佩吉特病或其他骨性病变相关的继发性骨肉瘤组成。男性与女性的发病率之比为1.22∶1。转移仍然是骨肉瘤最重要的致命性并发症,约有80%的骨肉瘤患者在确诊时发现已存在转移性或微小转移性病灶。由于治疗原则和化学疗法的进展,患者的5年生存率从不到30%提高到70%以上。尽管有了上述进展,但骨肉瘤发生发展的生物学机制研究仍任重而道远,如何从根源上治愈骨肉瘤是当今医学界面临的难题之一。
  整合素连接激酶相关磷酸酶(integrin-linked kinase-associated phosphatase,ILKAP)是一种丝氨酸/苏氨酸(S/T)磷酸化酶,与细胞的生存和凋亡有关。ILKAP同时也是一种具有调控肿瘤发生发展功能的抑癌基因表达产物。ILKAP广泛表达于人体组织中,主要在肾脏、骨骼肌、肝脏等脏器中表达水平较高。介导细胞凋亡是ILKAP的主要生理功能。ILKAP与肿瘤细胞的发生、发展息息相关。
  低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是肿瘤微环境与肿瘤病因学研究中的重点。作为一种转录因子,HIF-1有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等一系列作用。HIF-1的含量一旦失调,细胞将具备多种恶性能力并演变成肿瘤。早期研究认为,细胞在正常微环境下,HIF-1主要受羟化酶的调节而进入泛素降解途径,而仅当细胞处于低氧条件时HIF-1不能被降解,进而发挥功能。近年来随着对HIF-1调节方式的深入研究,人们发现羟化反应并不是HIF-1转录活性调节的唯一途径,磷酸化调节也是调控HIF-1的一种重要方式,尤其是在非低氧条件下。
  研究目的:
  证实低氧可导致细胞发生凋亡;研究低氧条件下ILKAP通过与HIF-1α相互作用,对骨肉瘤细胞凋亡产生的相关影响。
  研究方法:
  1、细胞低氧模型的构建与监测:使用Billups Rothenberg公司生产的二氧化碳培养箱将骨肉瘤细胞进行培养。连续从0h至96h将气罐中充入了混合的O2(1%)与N2(94%)和CO2(5%)。调节二氧化碳培养箱的温度(37℃)、湿度(95%)。每24h更换细胞培养液。通过YSI模型55溶氧测定仪来监测培养箱内溶氧量,从而监测低氧环境。
  2、骨肉瘤细胞活力测定:台盼蓝染色试验测定细胞存活率。将单细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合混匀。每0.1mL单细胞悬液中加入一滴台盼蓝染液,室温下染色3~5min,记录活细胞和死细胞数。将处理过的骨肿瘤细胞材料在高倍镜下观察。分别计数1000个细胞内的活细胞和死细胞数,统计未染色细胞,用公式计算细胞存活率。
  3、骨肉瘤细胞凋亡检测:本实验采用激光共聚焦显微镜技术通过观察骨肉瘤细胞内DAPI与TUNEL的共定位,判断骨肉瘤细胞是否经历凋亡。
  4、检测HIF-1α、细胞凋亡标记物:采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)—底物化学发光ECL法。
  5、研究ILKAP在导细胞凋亡过程中的作用:采用ILKAP shRNA腺病毒转染与Ad-ILKAP过表达的研究方法。
  6、研究HIF-1α、ILKAP、p53之间的相互作用:对细胞进行了72h低氧处理,而后进行免疫共沉淀实验。
  研究结果:
  1、细胞活力随着时间延长而下降,细胞凋亡增加(P<0.05)。HIF-1α随低氧处理时间延长逐步被诱导,磷酸化HIF-1α逐渐减少。通过400U ILKAP处理HIF-1α,PBS作为阴性对照,400Uλ磷酸酶作为阳性对照,发现ILKAP和λ磷酸酶对于HIF-1α的作用相似,可使去磷酸化HIF-1α逐渐增多。
  2、低氧条件下细胞存活由ILKAP shRNA维持。低氧条件下细胞凋亡与ILKAP有关。相同低氧时间下,ILKAP shRNA组的细胞凋亡数明显少于对照组(P<0.05)。Western blot条带显示HIF-1α在ILKAP shRNA组与对照组比较,大部分没有转为去磷酸化形式。
  3、通过免疫共沉淀实验发现,磷酸化形式的HIF-1α优先与抗ILKAP抗体免疫沉淀,去磷酸化形式的HIF-1α优先与p53抗体免疫共沉淀,ILKAP与p53之间没有相互作用。
  4、相比于对照组,Ad-ILKAP组的细胞存活率显著减少,呈时间依赖性(P<0.05)。细胞凋亡标记物和TUNEL法在Ad-ILKAP组相比于对照组,反映出显著增加的细胞凋亡现象。常氧条件无法诱导HIF-1α表达,但在Ad-ILKAP组可检测。
  研究结论:
  1、细胞凋亡数量会随着低氧处理时间延长而显著增加。ILKAP可以起到类似于λ磷酸酶的去磷酸化作用。HIF-1α磷酸化状态在持续的低氧诱导细胞凋亡过程中发生改变,ILKAP可使HIF-1α从磷酸化状态转为去磷酸化状态。
  2、长时间低氧诱导情况下,下调细胞内ILKAP表达,则细胞凋亡减少。由此可见,ILKAP在长时间低氧诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用。
  3、ILKAP结合磷酸化形式的HIF-1α使其去磷酸化,然后与去磷酸化形式的HIF-1α分离,去磷酸化的HIF-1α则与p53结合。ILKAP不与p53直接作用。
  4、常氧无法诱导HIF-1α表达。在常氧情况下,上调细胞内ILKAP表达可诱导细胞凋亡,并且使HIF-1α去磷酸化。
  综上所述,ILKAP直接使HIF-1α去磷酸化,并且对后续p53依赖的细胞凋亡发挥重要作用。考虑到其与p53及p53本身的复杂作用,现阶段的实验结果为进一步研究不同HIF-1α类型在多种疾病中的作用基因奠定了基础。
[硕士论文] 伍睿
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  胆囊癌(Gallbladder Carcinoma,GBC)和胆管癌(Cholangiocarcinoma)同属胆道系统恶性肿瘤,其中胆管癌根据原发肿瘤起源于胆管树上皮位置的不同,分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝外胆管癌(Extrahepatic Cholangiocarcinoma,EHC),肝外胆管癌又可再细分为肝门部胆管癌(Hilar Cholangiocarcinoma,HCCA)和远端胆管癌(Distal Cholangiocarcinoma,DCCA)。胆道肿瘤恶性程度高,转移侵袭性强,易复发,预后差。迄今为止,手术根治切除仍然是获得较好预后的唯一方法。通常术前依靠肿瘤标志物结合影像学检查结果对手术可行性进行评估并制定手术方案,但由于胆道肿瘤位置特殊周围结构复杂、易于侵犯周围肝脏和大血管,局部扩散和淋巴结转移等情况在术前评估中往往不易被发现,最终影响手术过程和效果。
  循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从肿瘤原发灶脱落至外周血中的肿瘤细胞,因为在肿瘤转移过程中发挥重要作用,近年来在越来越多的肿瘤相关领域被广泛研究。现已逐步证实循环肿瘤细胞与肿瘤的临床分期和预后状况紧密相关。循环肿瘤微癌栓(Circulating Tumor Microemboli,CTM)是指外周血中发现的由2个或更多循环肿瘤细胞聚集在一起组成的细胞团。其相比与单个循环肿瘤细胞,具有更强的侵袭和转移潜力。目前对于不同类型的肿瘤,循环肿瘤细胞及循环肿瘤微癌栓相关研究已逐步展开,但在胆道肿瘤研究中,其在临床应用中的价值尚不明确
  本研究旨在通过检测胆囊癌及胆管癌患者术前循环肿瘤细胞计数水平及循环肿瘤微癌栓阳性率,结合各肿瘤术后临床病理分期情况,评估其作为诊断指标的诊断效能,并探索其与传统肿瘤标志物在疾病诊断评估方面的优势。
  研究方法:
  1、根据预先设计的纳入标准,选取拟行手术治疗的胆囊癌、胆管癌患者共105例,于术前1日采集静脉血通过使用带孔滤膜法系统鉴定循环肿瘤细胞和循环肿瘤微癌栓,根据排除标准,最终76例行手术治疗患者被纳入研究;
  2、术后采集研究患者的临床基本信息、CEA、CA19-9水平及病理相关资料,并根据最新美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版胆道肿瘤分期标准对每个患者进行TNM分期;
  3、进行统计分析,评价CTCs计数水平、CEA水平、CA19-9水平在不同胆道肿瘤中对不同TNM分期的诊断效能,并分析CTM发现阳性率在不同胆道肿瘤的不同TNM分期中的差异性。
  研究结果:
  1、在胆囊癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分胆囊癌和良性病的诊断敏感性为95.45%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.964(P=0.0001)。当截断值选择>5个/5ml时,CTCs计数显示可以区分肿瘤T分期T1+2和T3+4的诊断敏感性为66.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001)。当截断值选择>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为85%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9(P=0.0001);
  2、在肝内胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝内胆管癌和良性病的诊断敏感性为76.47%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.916(P=0.001)。当截断值>3个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期T1和T2+3+4期的诊断敏感性为78.57%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.905(P=0.0001)。当截断值>5个/5ml时,CTCs计数显示区分肿瘤M0和M1期的诊断敏感性为100%,特异性为71.43%,ROC曲线下面积为0.893(P=0.0024);当截断值>5个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的诊断敏感性为58.33%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.808(P=0.0045);
  3、在肝门部胆管癌组,选取术前CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分肝门部胆管癌和良性病的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.896(P=0.001)。但CTCs计数对肝门部胆管癌TNM各分期之间诊断效能较差(P>0.05);
  4、远端胆管癌组,选取CTCs计数>2个/5ml为截断值时,其对区分远端胆管癌和良性病的诊断敏感性为91.67%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.9333(P=0.0001)。当截断值>4个/5ml时,CTCs计数区分肿瘤T分期中T2和T3期的诊断敏感性为80%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.875(P=0.0001);
  5、CTM在胆囊癌、肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌各组的阳性率分别为0%、16%、12%、16%。各组内CTM阳性率在T分期、N分期、M分期及TNM分期中未见明显差异(P>0.05)。
  研究结论:
  1、术前CTCs计数作为诊断指标在区分胆道肿瘤良恶性疾病时,普遍具有较好的诊断价值,可作为传统肿瘤标志物的辅助参考依据;
  2、术前CTM在胆道肿瘤中阳性率普遍很低,且与TNM分期间无明显相关性。
[硕士论文] 王宇璐
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  探讨在中国汉族人群中,GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性的关系。并根据年龄、性别、吸烟情况、肿瘤家族史和病理类型进行分层分析,观察在各亚层中GSTP1基因rs1695位点多态性与肺癌易感性之间的关联。
  研究方法:
  采用病例对照研究方法,选取上海及江苏泰州地区汉族人群中经病理诊断为肺癌患者974例和健康体检者1005例入组本研究。采集研究对象的外周静脉血标本,然后采用血液基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA,采用SNPscanTM方法对GSTP1基因rs1695位点进行基因分型。基因分型质量控制按照质量控制(QC)流程进行,包括大于95%的成功检出率、重复检出基因型、内部阳性对照样本检测以及Hardy—Weinberg遗传平衡检验。
  采用Student t检验及x2检验比较病例组与对照组在年龄、性别、吸烟状态、肿瘤家族史方面的差异,以及两组GSTP1基因rs1695位点A、G等位基因频率及AA、GA、GG基因型频率分布差异。用非条件logistic回归分析等位基因模型、基因型模型、显性基因模型和隐性基因模型与肺癌风险的关联,并对研究对象的年龄、性别、吸烟状况和肿瘤家族史进行校正,结果以比值比(odds ratios,ORs)及其95%的置信区间(confidence intervals,CIs)表示。采用SPSS19.0统计学软件进行所有统计分析,所有的p值都是双侧检验,p<0.05为具有统计学意义。
  研究结果:
  1.本研究包括974例肺癌患者及1005例健康体检者,两组性别、年龄比较差异无统计学意义(p=0.101,p=0.944)。肺癌组中吸烟者及有肿瘤家族史者均多于对照组,差异均有统计学意义(p<0.001)。
  2.本研究中基因分型检出率为99.9%。GSTP1基因rs1695A/G位点基因型频率符合Hardy—Weinberg遗传平衡(p>0.05)。
  3.肺癌组与对照组中A、G等位基因频率差异无统计学意义(x2=3.785,p=0.053),G等位基因携带者罹患肺癌的风险降低(OR=0.811,95%CI0.684-0.961,p=0.016)。两组间各基因型的分布频率差异无统计学意义(x2=4.072,p=0.131)。GG基因型使肺癌风险降低(OR=0.591,95%CI0.347-0.988,p=0.048),GA基因型与肺癌风险无明显关联(OR=0.838,95%CI0.683-1.028,p=0.091)。
  4.分层分析显示,G等位基因携带者罹患肺癌的风险在男性(OR=0.784,95%CI0.639-0.962,p=0.020)、有吸烟史的人群(OR=0.732,95%CI0.591-0.906,p=0.004)、无肿瘤家族史的人群(OR=0.782,95%CI0.643-0.950,p=0.014)以及肺腺癌患者(OR=0.798,95%CI0.641-0.990,p=0.042)中有所下降。在女性、无吸烟史的人群、有肿瘤家族史的人群以及肺鳞癌患者和小细胞肺癌患者中,是否携带G等位基因与肺癌发生风险之间无明显关联(p>0.05)。
  研究结论:
  GSTP基因rs1695位点多态性与肺癌发病风险相关联,有望成为肺癌风险预测的靶点。
[博士论文] 马重
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:膀胱癌是世界范围内发病率和致死率都很高的一种恶性疾病,是我国泌尿系统中发病率第一的肿瘤。根据膀胱癌细胞侵袭下层组织的深度,可以分为非肌层浸润和肌层浸润性。这两种类型的膀胱癌生物学表型不同、预后不同,临床对应的治疗方法也不同。非肌层浸润性膀胱癌,约占所有膀胱肿瘤的75%,若能早期诊断和治疗,预后较好,但是容易复发。非肌层浸润性膀胱癌,治疗上以经尿道膀胱肿瘤切除术为标准,术后可辅助丝裂霉素等化疗药物或卡介苗膀胱灌注来预防复发和进展。肌层浸润性膀胱癌,对局部组织侵袭严重,转移风险高,预后不良。膀胱癌一旦确诊浸润肌层,在尚未转移时,应当采用更积极的根治性全膀胱癌切除+尿流改道术治疗;根据术中切缘情况,以及术后局部复发、远处转移情况,进行放疗或全身化疗。膀胱癌侵袭深度和临床预后的异质性,反映了膀胱癌细胞在基因、蛋白质水平的差异。研究不同类型膀胱癌的基因差异,探讨高恶性程度膀胱癌的进展机制,是实现膀胱癌早期诊断、精准治疗的前提。
  现有的膀胱癌诊断技术以尿脱落细胞检查和膀胱镜检查为主。尿脱落细胞检查是一项无创性诊断技术,特异性高,但总体敏感性低,诊断低级别膀胱癌的敏感性不到20%。膀胱镜检查是将膀胱内窥镜经过尿道插入被检者膀胱,通过医生肉眼观察,发现形态可疑的新生物后,用活检钳夹取组织样本,进行病理学检查。膀胱镜检查是一项有创性操作,镜检过程会造成尿道、膀胱粘膜的破损,引起出血;检查后尿路感染风险很高。不仅如此,膀胱镜检会造成被检者疼痛和心理不适,患者依从性不够高。鉴于现有膀胱癌诊断技术的不足,发现基于尿液的无创性诊断标志物,具有较高的临床应用价值。新一代测序技术的发展、生物信息学平台的完善,为寻找膀胱癌诊断和分子分型的标志物提供了丰富的资源。也为了解膀胱癌发生、进展机制,提供了强大的工具和线索。
  研究目的:
  为了解国人膀胱癌测序结果,寻找潜在的膀胱癌诊断标志物,探索膀胱癌进展中的分子机制,课题组收集了一系列不同恶性程度的膀胱癌组织样本和患者尿液样本,利用高通量测序技术、体外及活体的细胞分子实验技术,对膀胱癌诊断标志物和分子机制进行研究。
  研究方法:
  1.利用转录组测序技术和生物信息学分析,对膀胱癌组织样本和自身配对的正常尿路上皮样本进行测序和分析,发现差异化表达基因,筛选具有潜在膀胱癌诊断价值、可能调控膀胱癌进展的关键分子。
  2.扩大样本量,抽取组织RNA,通过定量PCR方法,对发现的差异化表达基因Endocan进行验证。
  3.检索生物信息学平台Oncomine,分析Endocan在其他膀胱癌研究中的结果。
  4.构建尿液中Endocan蛋白的检测体系。收集膀胱癌患者和对照人群的尿液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Endocan浓度,用尿肌酐浓度对检测结果进行标化、分析。
  5.制作含有不同恶性程度膀胱癌及正常尿路上皮的组织芯片。用免疫组织化学技术研究Endocan在组织芯片中的表达量。
  6.在膀胱癌细胞中用siRNA干扰Endocan表达,研究Endocan对增殖、迁移、侵袭等膀胱癌生物学表型的影响。
  7.利用慢病毒建立稳转的Endocan敲减膀胱癌细胞系,在裸鼠实验中,探索Endocan在膀胱癌发生、进展中的作用。
  8.通过流式细胞术,研究Endocan对膀胱癌细胞周期、凋亡的影响。
  9.用蛋白免疫印迹(Western-Blotting)研究Endocan与膀胱癌细胞自噬的关系,分析可能的分子机制。
  研究结果:
  1.在10对膀胱癌组织与自身配对的正常粘膜组织的转录组测序中,发现Endocan在膀胱癌组织中显著过表达。
  2.在扩大的组织样本中验证,Endocan在膀胱癌中的表达显著高于正常尿路上皮样本,并且Endocan表达量与膀胱癌恶性程度有关。
  3.在Oncomine数据库中,证实其他研究中Endocan在膀胱癌中也呈现过表达。
  4.在92例膀胱癌患者中检测经肌酐标化的Endocan含量为6.08±0.75,而37例对照人群的尿液中经肌酐标化的Endocan含量为0.75±0.18,差异显著。并且尿液中经肌酐标化的Endocan与膀胱癌恶性程度相关。
  5.在组织芯片研究中,Endocan在膀胱癌中总体表达高于正常尿路上皮,并且Endocan在肌层浸润性膀胱癌表达显著高于非肌层浸润膀胱癌。
  6.用siRNA干扰Endocan,可以显著降低T24、T921膀胱癌细胞系的增殖、迁移、侵袭等生物学表型。
  7.在裸鼠实验中,Endocan稳定敲减T24细胞系与对照细胞相比,成瘤率降低,瘤体增长速度受到抑制。
  8.用siRNA干扰Endocan,可抑制T24、T921膀胱癌细胞的早期凋亡,对膀胱癌细胞周期无显著影响。
  9.Endocan敲减可以上调膀胱癌细胞自噬。这一作用可能是通过mTOR介导的。
  研究结论:
  Endocan基因及编码蛋白膀胱癌组织中过表达,且表达水平与膀胱癌恶性程度相关。膀胱癌患者尿液中标化Endocan的浓度显著高于对照人群,Endocan具有潜在的膀胱癌无创性诊断标志物价值。Endocan参与膀胱癌发生、进展,干扰Endocan可以显著降低膀胱癌细胞的增殖、侵袭能力,并抑制细胞凋亡,这种作用可能是通过上调mTOR介导的细胞自噬引起的。
[博士论文] 秦文昊
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:
  胆固醇对于维持细胞正常的生理功能有着重要的意义。随着人类生活方式及饮食结构的改变,高胆固醇血症患者急剧增多。大量研究表明,高胆固醇血症是许多严重疾病的危险因素,包括动脉粥样硬化,冠心病及脑卒中等。但是,胆固醇与恶性肿瘤之间的关系一直备受争议。在一些流行病学研究中,血液总胆固醇水平与肝癌、食管癌、肺癌、胃癌等的发病呈明显的负相关,而与膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌等的发病呈正相关,而且相关关系会受性别和人种等差异的影响。这些结果表明胆固醇在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,且在不同类型的肿瘤中具有不同的作用模式,但其分子机制一直未被阐述清楚。因此,深入研究高胆固醇血症对肿瘤的影响并明确相关分子机制,对于肿瘤的预防和治疗均具有重要意义。
  方法及步骤:
  1.利用循证医学方法研究血胆固醇水平与多种肿瘤发生风险的关系
  检索收集已发表文献,提取数据进行循证医学统计和分析,明确胆固醇代谢异常对总肿瘤、肝癌、肺癌发病率的影响,为本项目的研究题目提供可靠的现实依据。
  2.构建饮食诱导及基因型诱导小鼠高胆固醇血症模型
  高胆固醇饮食诱导:给予6-8周龄野生型C57小鼠高胆固醇饮食4周,诱导小鼠产生高胆固醇血症。
  ApoE基因缺失小鼠:C57遗传背景下的ApoE-/-小鼠会自发产生高胆固醇血症。被广泛用于动脉粥样硬化相关研究,本研究采用6-8周龄ApoE-/-小鼠进行后续实验。
  3.在高胆固醇血症小鼠模型基础上,构建小鼠荷瘤、诱癌以及肿瘤转移模型
  荷瘤模型:采用皮下荷瘤的方法,观察黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌细胞在高胆固醇血症小鼠模型中的生长情况。
  诱癌模型:通过给予出生15天小鼠腹腔DEN注射(25mg/kg)诱发肝癌形成,观察高胆固醇血症小鼠的肝癌发生发展情况。通过支气管灌注Cre病毒的方法,诱发KrasG12D小鼠肺部特异性的Kras突变激活,诱发小鼠肺癌,观察小鼠高胆固醇血症对肺癌发生发展的影响。
  黑色素瘤肺转移模型:经小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞,构建小鼠黑色素瘤肺转移模型,观察小鼠高胆固醇血症对黑色素瘤肺转移的影响。
  4.通过转录组测序等方法探寻高胆固醇影响肿瘤发生发展的途径
  收集对照组及高胆固醇组的小鼠荷瘤组织,进行转录组测序分析,并对差异基因进行KEGG及GSEA分析,探索相关的基因及信号通路改变。
  5.检测高胆固醇对免疫细胞的影响,明确发挥作用的关键免疫细胞亚群
  利用PCR及流式检测方法检测荷瘤组织中免疫细胞的相对比例,观察自然杀伤细胞(NK)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NKT细胞及DC细胞的相对比例和绝对数变化。
  利用相应清除性抗体清除各类免疫细胞,观察对照小鼠及高胆固醇小鼠的肿瘤生长差异,明确发挥作用的免疫细胞亚群。
  6.检测高胆固醇对于关键免疫细胞功能以及杀伤能力的影响
  利用PCR及流式检测方法,分析高胆固醇组免疫细胞的活性,并通过细胞毒性实验、脱颗粒实验及细胞过继实验,证明高胆固醇组来源的免疫细胞在体内外,均具有较强的杀伤肿瘤细胞的能力。
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞胆固醇含量的变化,并通过体外人为调节免疫细胞胆固醇水平,调节其杀伤肿瘤细胞的能力。
  7.探索高胆固醇影响关键免疫细胞功能的分子机制
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞中免疫受体数量、定位的变化,相关通路的活化情况,明确高胆固醇调控免疫细胞功能的关键通路与分子事件。
  8.探索通过调节胆固醇代谢改善免疫细胞抗肿瘤活性的方式方法
  利用慢病毒过表达低密度脂蛋白受体(LDLR)或PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,检测这些方法对免疫细胞内胆固醇含量及其肿瘤杀伤能力的影响。
  结果:
  首先,我们通过荟萃分析(Meta),发现人群恶性肿瘤总体发病率,以及肝癌、肺癌的发生率与血总胆固醇水平呈明显的负相关。在高胆固醇组小鼠体内,多种肿瘤的发生、生长及转移受到抑制。转录组测序分析证明,对照组与高胆固醇组的差异基因在免疫系统及免疫细胞活化相关通路有着明显富集。同时,高胆固醇血症对肿瘤的抑制现象在NSG小鼠中不复存在,这表明此抑制作用可能和免疫系统密切相关。随后,我们发现在高胆固醇小鼠的肿瘤组织中NK细胞比例明显上调,而其他免疫细胞的比例则没有显著变化。NK细胞清除性抗体或清除剂可以消除高胆固醇对肿瘤生长的抑制作用,这表明高胆固醇主要通过NK细胞发挥抗肿瘤作用。
  随后,我们检测发现高胆固醇组小鼠体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力明显增强,细胞内总胆固醇含量及膜胆固醇含量明显上升。在体外,以胆固醇处理正常NK细胞可增强其细胞毒性,而用环糊精降低细胞胆固醇含量可下调高胆固醇组NK细胞肿瘤杀伤能力。在机制方面,我们发现细胞内胆固醇蓄积会增加细胞表面的脂筏数量,使NK细胞的激活性受体NCR1及NKG2D在脂筏定位增多,下游的信号通路激活,从而上调了NK细胞的活化能力。
  最后,我们证实过表达LDLR,或通过PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,均可以增加NK细胞的胆固醇含量,进而增强其抗肿瘤活性。
  结论:
  血液中的胆固醇水平对免疫细胞的抗肿瘤作用具有重大影响。NK细胞内胆固醇蓄积可增加细胞膜表面的脂筏数量,促进激活性受体向脂筏的移位,进而激活下游信号通路,增强其肿瘤杀伤能力。目前,肿瘤的免疫治疗正在快速发展。我们的研究表明升高免疫细胞内胆固醇水平,可增强其杀伤功能,改善其抗肿瘤作用,为肿瘤的免疫治疗提供了新思路与新策略。
[博士论文] 王扬
内科学(血液病学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究第一部分应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人存在显著差异表达的lncRNA CUST37778。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。第二部分观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性。第三部分阐明了lncRNA CUST37778可增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  第一部分 急性B淋巴细胞白血病中差异表达的lncRNA的筛选
  目的:应用新型基因表达谱芯片筛选出在急性B淋巴细胞白血病中存在显著差异表达的lncRNA。
  方法:应用新型基因表达谱芯片检测lncRNA,筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人表达存在显著差异的lncRNA。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。利用核质分离实验确定lncRNA CUST37778的亚细胞分布。
  结果:1.采用新型表达谱芯片检测了6对初发急性B淋巴细胞白血病患者单个核细胞和正常人单个核细胞,获得lncRNAs差异表达谱,发现lncRNA CUST37778在初发或复发急性B淋巴细胞白血病中的表达水平明显高于急性B淋巴细胞缓解组与正常对照组。
  2.扩大临床样本量,利用定量PCR对差异表达的lncRNA CUST37778进行验证,27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病骨髓单个核样本,32例急性B淋巴细胞白血病完全缓解骨髓单个核样本及48例健康人骨髓单个核样本,检测发现lncRNA CUST37778在初发及复发样本中的表达显著高于完全缓解组及对照组。
  3.lncRNA CUST37778同时存在于急性B淋巴细胞白血病细胞的胞质和胞核,胞核中含量约占总量的60%。
  结论:应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人显著高表达的lncRNA CUST37778,且lncRNA CUST37778同时存在于细胞胞质和胞核。
  第二部分 lncRNA CUST37778表达水平与初发及复发ALL患者临床参数相关性分析
  目的:观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性
  方法:收集自2015年8月至2016年10月在我院血液科诊疗的27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病患者的临床资料,观察指标为基本临床特征及诊断信息即性别、年龄、初诊外周血白细胞计数、初诊骨髓原始细胞比例(%)、细胞遗传学及分子生物学异常、预后分层评估、首次诱导治疗后是否达完全缓解(CR1)、生存情况(包括复发或死亡)。利用ROC曲线分析界定lncRNA CUST37778的表达量界值,将27例初发及复发B-ALL患者分为高、低表达两组,统计分析在lncRNA CUST37778高、低表达组中所收集的B-ALL患者的临床参数是否存在统计学差异。两组间比较采用卡方检验,生存资料分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验,生存分析采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析,所有多变量回归分析均列出OR或HR以及95%的置信区间用于风险评估。
  结果:1.利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,将27例初发及复发B-ALL患者分为高表达、低表达两组。外周血血小板计数<100×109(p=0.0370*)、骨髓原始细胞比例≥42%(p=0.0130*)在lncRNA CUST37778高表达组中的发生率显著高于lncRNA CUST37778低表达组中。而高表达组和低表达组在性别(p=0.125)、年龄(p=0.8947)、外周血白细胞计数(p=0.2059)、外周血血红蛋白水平(p=0.8857)、是否Ph染色体阳性(p=0.3261)、危险分层(p=0.4113)方面均无显著统计学差异。
  2.27例B-ALL患者接受一个疗程诱导化疗后,共14例达缓解,首次诱导缓解率为51.85%,lncRNA CUST37778高表达组与低表达组在首次诱导完全缓解率上未发现存在统计学差异(P=0.7448)。
  3.1ncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势,与低表达组相比OS(p=0.0436)和DFS(p=0.0471)存在显著统计学差异。
  结论:利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,在lncRNA CUST37778高表达组中的患者更易出现较低的外周血血小板水平和较高的骨髓原始细胞比例。lncRNA CUST37778的表达水平对患者对化疗敏感性并无明显影响。lncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势。
  第三部分 lncRNA CUST37778增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  目的:明确lncRNA CUST37778在B-ALL发生发展中的作用机制。
  方法:利用Real-time PCR方法检测B-ALL和Nalm-6细胞中lncRNA CUST37778的表达水平。筛选出干扰效率最佳的siRNA,应用其对于lncRNA CUST37778在B-ALL和Nalm-6细胞中的表达水平进行干扰,Real-time PCR鉴定干扰效率;干扰B-ALL和Nalm-6细胞后,CCK-8检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,Q-PCR和Western blot检测细胞凋亡与细胞增殖关键因子Bcl-2、Bax、PCNA、P21、P27的表达水平;Western blot检测MAPK通路关键因子ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、P38、p-P38的表达和PI3K-AKT信号通路关键分子AKT、p-AKT、NF-kB、p-NF-kB、STAT3、p-STAT3、β-catenin和Notch1的表达。构建过表达lncRNA CUST37778的稳转Nalm-6细胞,Real-time PCR验证过表达效率,对上述干扰实验所得结果应用受影响的关键分子的相应抑制剂进行进一步验证。
  结果:1.利用Real-time PCR方法确认lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,与非B-ALL细胞系K562细胞、Molt4细胞存在显著统计学差异。
  2.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进B-ALL肿瘤细胞凋亡,抑制B-ALL肿瘤细胞增殖,使得G1期延长、G2期缩短。
  3.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA的表达,从而促进B-ALL肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖。
  4.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制MAPK通路关键因子ERK1/2磷酸化水平,故选择ERK1/2抑制剂PD98059进行进一步挽救实验。
  5.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制PI3K-AKT信号通路p-AKT和p-NF-kB的表达,故选择AKT抑制剂LY294002进行进一步挽救实验。
  6.过表达lncRNA CUST37778可促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。
  7.过表达lncRNA CUST37778可促进p-ERK1/2激活,ERK1/2抑制剂PD98059可以阻断此作用;还可促进p-AKT激活,AKT抑制剂LY294002可以阻断此作用。
  8.过表达lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长,干扰其则可抑制皮下肿瘤生长。
  9.lncRNA CUST37778过表达接种组和Nalm-6空载接种组的裸鼠肝脏存在Nalm-6细胞来源的白血病浸润灶。
  结论:lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,干扰lncRNA CUST37778的表达水平可抑制B-ALL细胞增殖活性,促进细胞凋亡,使G1期延长、G2期缩短,促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA表达,并可显著抑制PI3K-AKT信号通路中p-AKT和p-NF-kB的表达水平、抑制MAPK信号通路中p-ERK1/2的表达水平。过表达lncRNA CUST37778促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,促进Bcl-2和PCNA表达,并促进p-ERK1/2和p-AKT激活,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。体内实验证实lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长及浸润能力。
[硕士论文] 彭东宇
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:尤文肉瘤(Ewing's sarcoma,ES)是儿童和青少年中第二大常见骨肿瘤,是一种侵袭性骨和软组织肉瘤,其年发病率是2.93/1000000,常发生于骨骼,特别是下肢(41%),骨盆(26%),胸壁(16%),椎骨(6%)和颅骨(2%)。约四分之一的尤因肉瘤出现在软组织中而不是骨,大约四分之一的患者有诊断时可检测到转移。肺是最常见的转移部位(50%),其次是骨(25%)和骨髓(20%)。临床早期症状不明显,故极易漏诊。尤文肉瘤患者对放疗极为敏感,通过小剂量照射后,肿瘤可迅速减小,局部的疼痛感显著减轻。但值得注意的是,放疗对起源于椎体的尤文肉瘤同时容易造成脊髓及神经的损伤甚至导致神经功能不可逆性损害而致患者瘫痪。而且尤文肉瘤又容易早期转移,单纯放疗对于此类病人远期疗效差。但其具体的发病机制尚不明确。
  蛋白酶体系统是最重要的系统之一,蛋白质降解系统在真核生物中具有调节细胞过程如细胞周期,转录,细胞信号传导,细胞死亡和免疫反应的能力。REGγ(也被称为PA28γ、11Sγ或Proteasome activator complex subunit3,PSME3)蛋白是20S蛋白酶体激活因子家族中的一员,主要定位在细胞核中,可以形成同源七聚体,作为细胞内一种重要的蛋白酶体激活因子,参与到许多与疾病相关的通路调节中。以非泛素和非ATP依赖的方式促进一些靶蛋白的降解,如SRC-3、P21、P53、P16、CK-1δ、SirT1等。已有研究证实REGγ在许多癌症组织中高表达及恶性生物学行为中发挥着重要作用,如结肠癌、肺癌、胃癌、脊索瘤等。但它在尤文肉瘤中的作用尚未有报道,此研究REGγ在尤文肉瘤中的功能,为了解和阐明尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究目的:通过检测REGγ在尤文肉瘤组织中的表达水平及预后相关性,初步探究REGγ在尤文肉瘤发生发展中的作用及相互关系。为深入探索尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究方法:1.通过免疫组化染色评估REGγ在尤文肉瘤组织中的表达情况,并结合临床随访资料行相关性分析;2.在尤文肉瘤细胞系中干扰REGγ的表达,肿瘤细胞生物学行为的改变;3.在尤文肉瘤细胞系中过表达REGγ基因,检测肿瘤细胞生物学行为的改变。
  研究结果:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,瘤旁正常组织中REGγ表达水平相对较低;2.REGγ在尤文肉瘤组织中的高表达与患者的不良预后存在显著的相关性;3.在尤文肉瘤细胞系中,REGγ敲减干扰后均出现凋亡敏感性的增加而使其增殖能力、侵袭能力、迁移能力均明显下降的肿瘤细胞生物学行为的改变;4.在尤文肉瘤细胞系中,过表达REGγ基因,尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强。
  研究结论:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,这表明REGy可能有促进肿瘤细胞生长的作用;2.REGγ的表达与尤文肉瘤患者的无瘤生存时间呈负相关;3.在尤文肉瘤中,蛋白酶体REGγ敲减干扰后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显下降,而其凋亡增加。REGγ过表达后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强,而其凋亡敏感性降低。提示REGγ与尤文肉瘤的发生及预后密切相关,这将为提高尤文肉瘤的治愈率提供非常重要的思路。
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