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[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
[硕士论文] 陈泉
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分:不同强度的有氧运动对DEN诱导的小鼠肝癌形成的影响
  目的:以有氧运动作为干预方式,设定12米/分钟和18米/分钟的速度对DEN诱导小鼠进行干预,观察小鼠一般状态,检测肝肾功能等相关指标以及肝癌成瘤率和小鼠死亡率,明确有氧运动对于DEN诱导小鼠的死亡率及肝癌成瘤率的影响,为有氧运动抑制肝癌形成提供实验依据。
  方法:通过DEN灌胃诱导小鼠肝癌模型,并对各组小鼠实施不同强度的运动干预,观察小鼠肝功能、肾功能、死亡率、肝癌发生率的不同变化。
  结果:1.相较于空白组,DEN组ALT、AST均升高,差异具有统计学意义(ALT:40.40±5.63VS110.70±7.08;AST:140.90±21.89VS677.00±77.47;P<0.01);相较于DEN组,DEN+中速组、DEN+高速组小鼠ALT、AST显著降低,且差异具有统计学意义(ALT:110.70±7.08VS64.11±7.27;110.70±7.08VS61.13±6.62;AST:677.00±77.47VS208.50±43.45;677.00±77.47VS198.9±45.69;P<0.01)。2.相较于空白组,DEN组的BUN、UA显著增高,差异均有统计学意义(BUN:3.055±0.798VS9.875±1.089;UA:114.40±29.54VS317.30±43.26;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠UA均降低,且差异具有统计学意义(317.30±43.26VS192.0±38.59;317.30±43.26VS199.9±40.39;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠BUN无明显差异(P>0.05)。3.空白组、DEN组、DEN+中速组、DEN+高速组小鼠,死亡率均无统计学差异。4.与空白组相比,DEN组小鼠肝癌发生率显著增高,差异具有统计学差异(0%VS94.73%;P<0.05);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠肝癌发生率显著降低,且差异具有统计学意义(94.73%VS66.67%;94.73%VS56.25%;P<0.05)。
  结论:有氧运动对于DEN诱导肝癌小鼠的一般状态有明显改善作用,有氧运动能够降低DEN诱导小鼠的肝癌发生率。
  第二部分:有氧运动对DEN诱导的模型小鼠铁代谢的影响
  目的:通过观察各组小鼠铁代谢相关指标的差别,证明有氧运动、铁代谢及肝癌形成三者之间的相关性,以观察有氧运动是否是通过影响铁代谢从而抑制DEN诱导的模型小鼠肝癌的发生。
  方法:在第一部分实验基础上,分别检测各组小鼠血清、肌肉组织和肝脏组织中铁、Ferritin和Hepcidin,并观察肌细胞膜上TfR1、TfR2和FPN1的表达差异,以证实有氧运动是否是通过促进铁代谢从而抑制DEN模型小鼠肝癌的发生。
  结果:1、与空白组相比,DEN组小鼠血清Fe含量明显升高差异有统计学意义(23.71±9.895VS54.86±5.383;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠血清Fe含量显著降低,且差异具有统计学意义(54.86±5.383VS29.31±9.997)。与空白组相比,DEN组小鼠血清Ferritin含量明显升高,差异具有统计学意义(1944±439.6VS3799±685.5;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠血清Ferritin含量显著降低,且差异有统计学意义(3799±685.5VS2318±555.4;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠血清Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(239.2±16.90VS318.1±28.80;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组血清Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(318.1±28.80VS512.7±26.35;P<0.01)。2、与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织铁含量明显降低,差异有统计学意义(3.117±0.325VS2.876±0.232;P<0.05);与DEN组比DEN+中速组小鼠肌肉组织铁含量显著提高,且差异有统计学意义(2.876±0.232VS4.199±0.313;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织Ferritin含量显著增高(13.32±0.909VS17.34±1.416;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组肌肉组织Ferritin含量显著降低,差异有统计学意义(17.34±1.416VS11.01±1.330;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织Hepcidin含量无显著改变;与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肌肉组织Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(48.83±3.409VS81.67±7.090;P<0.01)。3、与空白组相比,DEN组小鼠肝脏组织Fe含量显著升高,且差异具有统计学意义(5.007±0.738VS8.118±0.865;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肝脏组织Fe显著降低,差异有统计学意义(8.118±0.865VS4.997±0.589;P<0.01)。与空白组相比DEN组小鼠肝脏组织Ferritin含量显著增高(28.79±4.093VS41.89±3.069;P<0.01);与DEN组相比DEN+中速组肝脏组织Ferritin含量显著降低,差异有统计学意义(41.89±3.069VS26.71±4.567;P<0.01);与空白组相比,DEN组肝脏组织Hepcidin含量无明显差异;与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肝脏组织Hepcidin含量显著增高,差异有统计学意义(4.492±0.776VS10.290±0.867;P<0.01)。
  结论:有氧运动通过增加运动过程中肌肉组织对铁的摄入,升高体内Hepcidin的水平,降低血清Fe和体内Ferritin的水平,这可能与运动抑制小鼠肝癌的发生存在相关性。
[硕士论文] 许洋
放射医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  原花青素是目前已知的抗氧化能力最强的天然提取物,远高于日常使用的维生素C及维生素E。其具有来源广泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的优势。此外,原花青素的生物体内的半数致死剂量超过5000mg/kg,远远大于治疗剂量。原花青素对肺组织相关炎症及疾病具有较好的治疗作用:原花青素可以有效减轻角夹胶诱导的肺组织急性炎症反应,减轻小鼠哮喘模型的急性气道炎症反应,抑制肺水肿的形成,且对博来霉素诱导的肺炎具有很好的治疗作用。本实验室前期研究成果发现,原花青素可以显著减轻辐照后早期放射性肺炎的炎症渗出和晚期放射性肺纤维化的发生,降低辐射所导致的肺组织上皮间质转化程度,减轻炎症因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改变程度。另外,与其他抗氧化剂不同的是,原花青素是一种缓释抗氧化剂,他可以在血液和组织中存留7-10天,发挥持续的抗氧化作用,这对于病情进行性进展的放射性肺损伤的防治具有独到的优势。此外,原花青素还具有抗肿瘤作用。过去的十年体外细胞实验和动物实验均已经证明原花青素对皮肤癌,乳腺癌,前列腺癌,头颈部肿瘤和肺癌等肿瘤细胞增殖具有明确抑制作用。研究者还在体外实验中证实原花青素对正常细胞的生长和活力没有明显影响,而只对肿瘤细胞表现出杀伤作用。综合以上的特点,推测,原花青素有希望在肺癌放疗过程中,防护放射野内正常的肺组织的同时,对肺癌细胞又起到抑制增殖的作用。本课题将重点研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用及其分子机制。
  研究目的:
  (一)小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。
  通过原位肺内注射法建立原位肺癌模型。特点:以左肺上叶作为肺癌细胞的生长环境,通过基质胶固定细胞位置。
  (二)原花青素在肺癌放疗中的双向作用。
  1、原花青素在细胞作用中的研究。
  (1)通过CCK8检测原花青素在小鼠正常肺上皮细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的毒性;
  (2)通过流式检测及克隆形成率实验检测原花青素对肺正常细胞的辐射防护作用及对肺肿瘤细胞的辐射增敏作用。
  2、原花青素在肺癌模型中的作用。
  (1)原花青素能够抑制小鼠肿瘤的生长及转移
  ①原花青素抑制小鼠皮下肿瘤的生长;
  ②原花青素抑制小鼠肿瘤的转移。
  (2)原花青素影响荷瘤小鼠局照后的生存状况;
  (3)原花青素对荷瘤小鼠局照后肿瘤大小及肺叶重量的影响;
  (4)原花青素减少荷瘤小鼠局照后正常肺组织的炎性渗出;
  (5)原花青素能够减少小鼠肺正常组织照射后的凋亡,而促进照射后肿瘤组织的凋亡,同时抑制其增值;
  (6)原花青素能够调节Th1/Th2相关细胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的机制研究。
  1、原花青素可以明显降低辐照后A549及BEAS-2B细胞中活性氧的产生;
  2、原花青素对肺正常细胞及肿瘤细胞内的p-ERK、p-JNK及p-P38表达情况的影响具有差异;
  3、原花青素可以激活肺正常细胞及肿瘤细胞Sirt6蛋白的表达;
  4、研究肺正常细胞及肿瘤细胞过表达Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表达情况;
  5、通过抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况,判断Sirt6蛋白在原花青素中的作用。
  研究方法:
  (一)建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。
  1、用胰岛素注射器将肿瘤细胞与基质胶的混悬液注射入小鼠左上肺叶,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;
  2、使用本实验室设计的固定小鼠模具,采取铅块遮挡的方式建立肺部局照放射模型;
  3、照射方式:采用25Gy60Coγ射线单次照射,剂量率为1Gy/min。
  (二)研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用
  1、选取小鼠肺上皮细胞MLE-12、肺癌细胞LLC及人正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺腺癌细胞A549进行试验;
  (1)细胞分组:对照组、原花青素处理组、照射组、照射组加原花青素处理组,每种细胞分组相同,照射剂量为8Gy;
  (2)细胞照射及原花青素处理后对正常细胞及肿瘤细胞增殖能力的影响:流式细胞仪检测及克隆形成率;
  2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基础上检测原花青素的双向作用
  (1)小鼠分为:假手术对照组、假手术肺部照射组、肺部荷瘤对照组、肺部荷瘤原花青素处理组、肺部荷瘤照射组及肺部荷瘤原花青素加照射组,共6组,每组选用雄性8周C57BL/6小鼠3只;
  (2)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠的生存影响:检测荷瘤小鼠生存期及体重;
  (3)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠肿瘤的影响:检测肿瘤大小,H&E染色及小鼠左上肺叶重量;
  (4)免疫荧光检测正常肺组织及肿瘤组织的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;
  (5)检测原花青素对小鼠免疫细胞因子的影响:用ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-6和IFN-γ。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的分子机制
  1、检测原花青素对照射后细胞内活性氧的清除:ROS检测试剂盒;
  2、检测原花青素对照射后细胞内相关蛋白变化的影响:Western blot;
  3、检测原花青素对照射后原位荷瘤小鼠正常肺组织及肿瘤组织蛋白的影响:Western blot;
  4、通过改变细胞内Sirt6的表达检测p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达:Sirt6过表达质粒的转染、Western blot;
  5、通过选取抑制剂S1805、SP600125及SB203580分别抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况:Western blot。
  研究结果:
  (一)成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型
  1、成功建立小鼠左上肺叶原位肺癌荷瘤模型,肿瘤生长符合实验要求;
  2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。
  (二)原花青素在肺正常细胞及肿瘤细胞放疗中的双向作用
  1、对小鼠肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少小鼠肺上皮细胞MLE-12照射后的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对小鼠肺上皮细胞MLE-12具有辐射防护作用,对小鼠肺癌细胞LLC具有辐射增敏作用;
  2、对人肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少人正常肺上皮细胞BEAS-2B凋亡且促进人肺腺癌细胞A549的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞具有辐射防护作用,且能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,具有辐射增敏作用;
  (三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放疗中的双向作用研究
  1、通过观察并记录原位肺癌荷瘤小鼠的生存情况,发现:原花青素处理加照射组相比于照射组,其存活时间更长;
  2、通过对小鼠肺内肿瘤的测量,发现:原花青素处理加照射抑制小鼠左上肺叶内肿瘤的生长,相比较于单纯照射组,效果更加明显;
  3、通过荧光免疫分别标记增殖相关蛋白Ki67及凋亡相关蛋白p53,发现:在小鼠正常肺组织内,原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显降低;在肿瘤组织内,单纯处理组的Ki67的表达量相比于对照组明显降低,而原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显升高;
  4、通过ELISA检测荷瘤小鼠血清细胞因子的表达量,发现:原花青素加照射组相比于单纯照射组,能够明显抑制IL-6、提高IFN-γ的表达,促进对肿瘤的抑制,降低炎性损伤。
  (四)原花青素在肺癌放疗中的可能作用机制
  1、原花青素能够显著清除人肺癌细胞A549及正常肺上皮细胞BEAS-2B照射后所产生的自由基;
  2、在人肺癌细胞A549中,原花青素明显提高照射后p-JNK蛋白的表达;在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可以明显抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而这与其能够清除活性氧自由基有关。
  3、在人肺癌细胞A549中,原花青素通过增加Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用
  研究结论:
  在细胞层面上发现,原花青素对小鼠肺癌细胞LLC及人肺癌细胞A549具有辐射增敏作用,对小鼠肺正常细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B具有辐射防护作用。在人肺癌细胞A549中,原花青素可以通过提高Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用。在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可能通过清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎症作用。通过建立小鼠原位肺癌的放疗模型,发现原花青素能提高小鼠的生存期,可以改变血清细胞因子的表达,能够减少小鼠肺正常组织的辐射损伤,同时对肿瘤具有放疗增敏的作用。
[博士论文] 马重
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:膀胱癌是世界范围内发病率和致死率都很高的一种恶性疾病,是我国泌尿系统中发病率第一的肿瘤。根据膀胱癌细胞侵袭下层组织的深度,可以分为非肌层浸润和肌层浸润性。这两种类型的膀胱癌生物学表型不同、预后不同,临床对应的治疗方法也不同。非肌层浸润性膀胱癌,约占所有膀胱肿瘤的75%,若能早期诊断和治疗,预后较好,但是容易复发。非肌层浸润性膀胱癌,治疗上以经尿道膀胱肿瘤切除术为标准,术后可辅助丝裂霉素等化疗药物或卡介苗膀胱灌注来预防复发和进展。肌层浸润性膀胱癌,对局部组织侵袭严重,转移风险高,预后不良。膀胱癌一旦确诊浸润肌层,在尚未转移时,应当采用更积极的根治性全膀胱癌切除+尿流改道术治疗;根据术中切缘情况,以及术后局部复发、远处转移情况,进行放疗或全身化疗。膀胱癌侵袭深度和临床预后的异质性,反映了膀胱癌细胞在基因、蛋白质水平的差异。研究不同类型膀胱癌的基因差异,探讨高恶性程度膀胱癌的进展机制,是实现膀胱癌早期诊断、精准治疗的前提。
  现有的膀胱癌诊断技术以尿脱落细胞检查和膀胱镜检查为主。尿脱落细胞检查是一项无创性诊断技术,特异性高,但总体敏感性低,诊断低级别膀胱癌的敏感性不到20%。膀胱镜检查是将膀胱内窥镜经过尿道插入被检者膀胱,通过医生肉眼观察,发现形态可疑的新生物后,用活检钳夹取组织样本,进行病理学检查。膀胱镜检查是一项有创性操作,镜检过程会造成尿道、膀胱粘膜的破损,引起出血;检查后尿路感染风险很高。不仅如此,膀胱镜检会造成被检者疼痛和心理不适,患者依从性不够高。鉴于现有膀胱癌诊断技术的不足,发现基于尿液的无创性诊断标志物,具有较高的临床应用价值。新一代测序技术的发展、生物信息学平台的完善,为寻找膀胱癌诊断和分子分型的标志物提供了丰富的资源。也为了解膀胱癌发生、进展机制,提供了强大的工具和线索。
  研究目的:
  为了解国人膀胱癌测序结果,寻找潜在的膀胱癌诊断标志物,探索膀胱癌进展中的分子机制,课题组收集了一系列不同恶性程度的膀胱癌组织样本和患者尿液样本,利用高通量测序技术、体外及活体的细胞分子实验技术,对膀胱癌诊断标志物和分子机制进行研究。
  研究方法:
  1.利用转录组测序技术和生物信息学分析,对膀胱癌组织样本和自身配对的正常尿路上皮样本进行测序和分析,发现差异化表达基因,筛选具有潜在膀胱癌诊断价值、可能调控膀胱癌进展的关键分子。
  2.扩大样本量,抽取组织RNA,通过定量PCR方法,对发现的差异化表达基因Endocan进行验证。
  3.检索生物信息学平台Oncomine,分析Endocan在其他膀胱癌研究中的结果。
  4.构建尿液中Endocan蛋白的检测体系。收集膀胱癌患者和对照人群的尿液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Endocan浓度,用尿肌酐浓度对检测结果进行标化、分析。
  5.制作含有不同恶性程度膀胱癌及正常尿路上皮的组织芯片。用免疫组织化学技术研究Endocan在组织芯片中的表达量。
  6.在膀胱癌细胞中用siRNA干扰Endocan表达,研究Endocan对增殖、迁移、侵袭等膀胱癌生物学表型的影响。
  7.利用慢病毒建立稳转的Endocan敲减膀胱癌细胞系,在裸鼠实验中,探索Endocan在膀胱癌发生、进展中的作用。
  8.通过流式细胞术,研究Endocan对膀胱癌细胞周期、凋亡的影响。
  9.用蛋白免疫印迹(Western-Blotting)研究Endocan与膀胱癌细胞自噬的关系,分析可能的分子机制。
  研究结果:
  1.在10对膀胱癌组织与自身配对的正常粘膜组织的转录组测序中,发现Endocan在膀胱癌组织中显著过表达。
  2.在扩大的组织样本中验证,Endocan在膀胱癌中的表达显著高于正常尿路上皮样本,并且Endocan表达量与膀胱癌恶性程度有关。
  3.在Oncomine数据库中,证实其他研究中Endocan在膀胱癌中也呈现过表达。
  4.在92例膀胱癌患者中检测经肌酐标化的Endocan含量为6.08±0.75,而37例对照人群的尿液中经肌酐标化的Endocan含量为0.75±0.18,差异显著。并且尿液中经肌酐标化的Endocan与膀胱癌恶性程度相关。
  5.在组织芯片研究中,Endocan在膀胱癌中总体表达高于正常尿路上皮,并且Endocan在肌层浸润性膀胱癌表达显著高于非肌层浸润膀胱癌。
  6.用siRNA干扰Endocan,可以显著降低T24、T921膀胱癌细胞系的增殖、迁移、侵袭等生物学表型。
  7.在裸鼠实验中,Endocan稳定敲减T24细胞系与对照细胞相比,成瘤率降低,瘤体增长速度受到抑制。
  8.用siRNA干扰Endocan,可抑制T24、T921膀胱癌细胞的早期凋亡,对膀胱癌细胞周期无显著影响。
  9.Endocan敲减可以上调膀胱癌细胞自噬。这一作用可能是通过mTOR介导的。
  研究结论:
  Endocan基因及编码蛋白膀胱癌组织中过表达,且表达水平与膀胱癌恶性程度相关。膀胱癌患者尿液中标化Endocan的浓度显著高于对照人群,Endocan具有潜在的膀胱癌无创性诊断标志物价值。Endocan参与膀胱癌发生、进展,干扰Endocan可以显著降低膀胱癌细胞的增殖、侵袭能力,并抑制细胞凋亡,这种作用可能是通过上调mTOR介导的细胞自噬引起的。
[硕士论文] 程小龙
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:
  肺癌是当前全球范围内发病率及肿瘤相关病死率均最高的恶性肿瘤。糖尿病(diabetes mellitus,DM)是最常见的内分泌疾病,其中绝大部分为2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)。流行病学资料显示T2DM是多种肿瘤发病及预后的危险因素。但目前关于T2DM与肺癌预后关系的研究相对较少,且结论相互矛盾。本文旨在通过对52例在我院接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ肺癌合并T2DM患者与63例同期在我院接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ肺癌不合并T2DM患者进行回顾性预后分析,探讨合并T2DM对接受一线含铂类双药联合方案化疗的晚期肺癌患者预后的影响。
  方法:
  通过检索第二军医大学附属长海医院病案管理系统,收集2011年1月至2015年12月期间在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ期肺癌合并T2DM患者为DM组,同时以1∶1的比例收集同期在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗的Ⅳ期肺癌不合并T2DM患者为对照组,记录患者肺癌确诊时的年龄、性别、有无吸烟史、是否合并其他慢性疾病、肺癌病理类型等一般临床特征。并通过住院记录、门诊记录、电话咨询或邮件及信件联系,随访患者的无进展生存期(progression free survival,PFS)及总体生存期(overall survival,OS)。应用卡方检验及T检验比较两组患者之间一般临床特征的差异。应用单因素生存曲线比较法(Kaplan-Meier法)比较两组患者之间PFS与OS是否存在差异。行多因素生存分析(Cox回归分析),评估T2DM、年龄、性别、吸烟史、其他慢性合并症、病理类型等相关因素对晚期肺癌化疗患者PFS与OS的影响。
  结果:
  共收集到5年时间内在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗Ⅳ期肺癌合并T2DM患者88例,同时收集同期在第二军医大学附属长海医院呼吸内科接受一线含铂类双药联合方案化疗Ⅳ期肺癌不合并T2DM患者88例。按照纳入标准,最终共115例患者纳入研究,其中DM组52例,对照组63例。一般临床特征比较结果显示DM组患者年龄大于对照组,平均年龄为64±7岁vs61±8岁(t=2.669,P=0.009);DM组男性、有吸烟史、有其他慢性疾病史的患者比例高于对照组,分为38/52vs32/63(X2=5.939,P=0.015)、25/52vs18/63(X2=4.630P=0.031)、30/52vs21/63(X2=6.849P=0.009)。病理类型分为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两大类,两组患者之间病理类无显著差异,SCLC/NSCLC为5/47vs3/60(X2=1.037P=0.422)。单因素生存曲线分析显示对照组与DM组患者PFS为13月(95%CI9-17月)vs8月(95%CI6-9月),(P=0.135),对照组患者PFS有长于DM组的趋势,但差异无统计学意义。而对照组患者OS显著长于DM组为36月(95%CI28-43月)vs18月(95%CI15-22月),(P<0.001)。多因素生存分析显示T2DM对患者PFS的影响为(HR=0.719,95%CI:0.451-0.145;P=0.165),对OS的影响为(HR=0.539;95%CI:0.334-0.870;P=0.011),合并T2DM以外其他慢性疾病对患者PFS与OS的影响分别为(HR=1.179;95%CI.:0.736-1.890;P=0.493)与(HR=1.756;95%CI:1.080-2.856;P=0.023)。
  结论:
  接受一线含铂类双药联合方案化疗的晚期肺癌合并T2DM患者总生存期显著短于不合并T2DM者,T2DM是此类患者长期生存独立且显著的危险因素,而T2DM对晚期接受化疗肺癌患者疾病进展期无显著影响。此外,合并T2DM以外其他慢性疾病也是晚期肺癌化疗患者长期生存独立且显著的危险因素。这说明晚期肺癌患者的治疗,是需要以病人为中心,以患者整体健康的维护与促进为目标的长期综合性健康管理。
[博士论文] 程利鹏
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是世界第三大恶性肿瘤,也是导致癌症相关死亡的第四大原因。肿瘤复发及远处转移是CRC患者死亡的主要原因,而肝脏是其远处转移最常见的靶器官。大量研究证实,结直肠癌肝转移(Colorectal Liver Metastasis,CRLM)在伴有慢性肝病的患者中发病率较低。对于病理性肝病影响CRLM确切分子机制仍有争议。
  微小RNA(miRNA),作为一种内源性非编码RNA,在转录后水平调节人类近60%基因(尤其是癌基因)的表达。miRNA let-7超家族由12个成员组成,它作为一种肿瘤抑制因子,在多种恶性肿瘤中(包括CRC)发挥重要作用。前期研究已表明,IFN-γ刺激CRC细胞系HT29能下调let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p(let-7a簇)表达,增强其对Fas介导凋亡的敏感性。
  本文旨在进一步探讨肝炎微环境中IRF-1介导IFN-γ下调CRC细胞let-7a簇表达并降低其肝转移能力的相关分子机制。
  方法:
  采用4-6周雄性BALB/c小鼠,以40%四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)灌胃法构建慢性肝炎模型,经脾静脉注入鼠源性结直肠癌细胞系CT26.WT构建CRLM模型。活体成像和肝组织H&E染色确立成模时间。
  ELISA法检测炎症模型肝组织和血清中IFN-γ,TNF-α和IL-1β等炎症因子的表达水平。慢病毒稳转,构建IFN-γ受体1(IFNGR1)敲低细胞系(shRNA-IRFGR1-CT26),并在肝炎模型的基础上构建转移瘤模型,明确IFN-γ在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。IFN-γ刺激CRC细胞HT29和CT26.WT,体外模拟炎症微坏境,qRT-PCR、Western blot和IHC检测炎症状态下CRC细胞和小鼠肝组织中干扰素调节因子(IRF-1/IRF-2)及let-7a簇表达变化。检索UCSC网站,确立IRF-1/2与let-7a簇表达调控的相关性。Rescue实验、ChIP和双荧光素酶报告基因等实验,阐明IRF-1调控let-7a簇表达可能的相关机制。
  慢病毒构建let-7a-1-5p敲低(shRNA-let-7a-1-5p-CT26)和高表达(LV-let-7a-1-5p-CT26)细胞株,在正常和炎症小鼠模型基础上构建转移瘤模型,研究let-7a簇对结直肠癌肝转移的影响,同时探索其在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。
  用qRT-PCR、Western blot和IHC法检测CRC在体内外炎症微环境及let-7a-1-5p低表达情况下EMT相关marker(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表达情况,探索上皮-间质转化在炎症抵抗肿瘤转移过程中的作用。
  结果:
  1、肝炎微环境影响结直肠癌肝转移
  CCl4灌胃法和脾静脉注射法构建肝炎模型和CRLM模型。苏木精-伊红(H&E)染色后发现,当40%的CCl4灌胃(6ml/kg小鼠体重,每周2次)5周后肝炎模型构建成功。灌胃7周,肝硬化模型构建成功。CRLM造模6天后小鼠即可出现CRLM(1/6),而当建模12天后,超过80%(5/6)的小鼠肝脏出现了转移瘤。
  在肝炎的基础上构建CRLM模型。结果表明,炎症组肝转移率低于正常组(2/6vs.5/6),且活体成像总荧光强度、肝转移瘤最大直径和转移瘤个数等转移瘤负荷显著低于正常组(P值均小于0.05)。
  2、IFN-γ可能影响肝炎微环境中CRLM的发生过程
  ELISA法检测炎症小鼠血清及肝组织中IFN-γ,TNF-α和IL-1β的表达变化。结果发现,三者在炎症肝组织中表达无差异。而在炎症小鼠的血清中,表达均显著上调,尤其是IFN-γ,表达上调最为显著(倍数=6.55)。
  用shRNA-IRFGR1-CT26细胞在炎症模型基础上构建CRLM模型,IRFNG1敲低组肝转移率较高(8/10vs.3/10),转移瘤负荷也显著增高(P值均小于0.05)。
  3、肝脏炎症环境中let-7a簇与IRF-1表达呈负相关
  检索UCSC网站发现,let-7a簇转录起始位点上游存在多个IRF-1/2结合位点。qRT-PCR和Western blot检测发现,IFN-γ的刺激均能显著上调HT29和CT26.WT细胞IRF-1的表达,而IRF-2的表达无显著差异。IHC检测伴有肝炎的转移瘤肝组织进一步验证了上述结论。同时,研究还发现,IFN-γ刺激CRC细胞显著下调let-7a簇表达,但是,let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p表达下调无明显差异。
  4、IRF-1参与IFN-γ下调let-7a簇的表达
  Rescue实验结果显示,在HT29细胞中,干扰IRF-1的表达能显著削弱IFN-γ下调let-7a簇表达的趋势(P<0.01)。IFN-γ处理HT29,能同时显著下调let-7a-1-5p及其前体的表达水平(P<0.05),但二者下调趋势无差异(P>0.05)。
  染色质免疫共沉淀实验(ChIP)结果显示,引物4(chr9:96,931,077-96,931,229)扩增效率显著增高,提示该位点可能存在IRF-1的结合位点。本研究将879bp目的基因(包含chr9:96,931,077-96,931,229)构入报告质粒(let-7a-Report-WT)中,并在718-721(AATC)处构建缺失突变(let-7a-Report-MT)。双荧光素酶报告基因实验发现,IRF-1能结合在位点(718-721)上。
  5、结直肠癌细胞的let-7a-1-5p表达水平与其肝转移能力相关
  用shRNA-let-7a-1-5p-CT26和LV-let-7a-1-5p-CT26细胞株建立转移瘤模型。结果显示,与对照组相比,let-7a-1-5p敲低组CRLM发生率降低(1/6vs.4/6),荧光强度强度较弱(P=0.05),转移灶数目少(P<0.05),转移瘤最大直径较小(P=0.05)。而let-7a-1-5p高表达组CRLM发生率稍高(6/6vs.5/6),转移瘤负荷显著增高(P<0.05)。此外,在肝炎小鼠中,let-7a-1-5p敲低同样降低CRLM发生(1/10vs.5/10),且肿瘤负荷均显著低于高表达组(均P<0.05)。
  6、抑制let-7a簇的表达维持CRC细胞的间质表型
  在构建shRNA-let-7a-1-5p-HT29细胞系的过程中,HT29的细胞形态由上皮细胞型态转变成间质样细胞型态。我们用qRT-PCR和Western blot检测EMT相关marker后发现,IFN-γ刺激HT29后,E-cadherin表达显著增加,而N-cadherin和Vimentin的表达未见显著差异。敲低HT29细胞let-7a-1-5p表达也得到了相同的结论。再用IHC检测肝转移瘤组织中的N-cadherin,结果发现,肝脏炎症组和let-7a-1-5p低表达组的转移瘤组织中N-cadherin阳性率显著增加。
  结论:
  1.CCl4诱导的肝脏炎症微环境能降低结直肠癌肝转移的发生,IFN-γ在调控中起重要作用;
  2.IRF-1通过结合let-7a簇转录本上游区域,介导IFN-γ下调let-7a簇的表达,降低CRC细胞肝转移潜能;
  3.在炎症微环境中let-7a-1-5p低表达能减少CRLM的发生;
  4.Let-7a簇通过上调结直肠癌细胞的N-cadherin表达,促进了上皮-间质转化,从而降低了肿瘤细胞在肝脏中的定值能力。
[博士论文] 乔苏迟
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是骨骼系统最常见的的原发恶性肿瘤,年发病率约(1-3)/1000,000,可于任何年龄发病,但高级别骨肉瘤(High-grade osteosarcoma,HGOS)主要发生于10-20岁的青少年和儿童。OS多累及长骨末端,尤其是生长快速的骨骼,如股骨远端、胫骨近端、肱骨近端等。
  得益于新辅助化疗的发展、假体以及材料学技术的进步,目前OS的保肢率和生存率都得到了较大的提升。但复发及远处转移的患者预后仍然较差,新型药物的研发也迟滞不前,OS的治疗已经进入到瓶颈。阐明OS发生发展的分子机制,研发新型药物是目前迫切需要解决的问题。
  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)的是一类重要的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。已有大量研究报道,LncRNA出现异常表达或是突变,与恶性肿瘤增殖、侵袭、转移、耐药等机制密切相关。而在OS中,LncRNA的相关研究尚处于起步阶段,是否可以利用下调或上调异常表达的LncRNA方式治疗OS,或是逆转OS耐药,有待深入探索。此外,LncRNA能否作为OS患者临床诊断的重要参考,以及判断化疗敏感性和预后的分子标志物,有待临床实践检验。
  LINC00511是一个较为全新的LncRNA,在非小细胞肺癌、舌鳞癌以及胰腺导管腺癌中,已证实LINC00511呈现高表达,并在其中作为癌基因发挥作用,促进相应恶性肿瘤增殖、迁移,与患者预后不良密切相关。
  通过芯片筛选等前期预实验,发现,相对于癌旁正常组织,LINC00511在OS组织中呈现低表达。本研究旨在进一步探索LINC00511在OS中的表达情况,并分析其表达与患者临床特征及预后的相关性,此外,分别从体外和体内层面对LINC00511的功能展开研究并初步揭示LINC00511在OS中的调控机制。
  第一部分:LINC00511在骨肉瘤组织、细胞株中的表达及其意义
  第一部分研究中,通过定量PCR检测LINC00511在OS组织标本和癌旁正常组织标本的表达情况,并结合临床资料分析LINC00511的表达水平与OS患者年龄、性别、肿瘤分期、化疗敏感性、预后等临床特征之间的相关性。此外,同时采用定量PCR检测LINC00511在不同OS细胞株及正常成骨细胞细胞株中的表达水平差异。结果显示,LINC00511在OS组织及细胞株中呈现低表达;LINC00511的表达与患者肿瘤坏死率显著相关,高表达患者呈现出更好的化疗敏感性;LINC00511的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分期、肿瘤体积变化、手术方式等无关;LINC00511表达水平与骨肉瘤患者预后明显相关,高表达患者三年生存率更高,预后更好。上述结果提示,LINC00511可能是骨肉瘤疾病发生发展中的重要抑癌基因,其表达升高预示更好的化疗敏感性及预后,有望成为骨肉瘤诊断以及预后判断中的重要分子标志物。
  第二部分:LINC00511对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其作用
  第二部分研究中,构建了OS细胞株MG-63及Saos-2的LINC00511的过表达稳定株,并检测比较肿瘤生物学行为的变化。在体外细胞层面上,LINC00511表达上调后,进行CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞划痕实验、细胞transwell实验等观察LINC00511对OS细胞增殖、凋亡以及迁移的影响。在体内层面上,通过裸鼠成瘤实验,进一步验证LINC00511对OS发生发展的作用。结果显示,MG-63及Saos-2中过表达LINC00511能够显著抑制OS细胞增殖、迁移,但不影响细胞凋亡;裸鼠成瘤实验中LINC00511过表达的裸鼠肿瘤生长更慢,相同时间内肿瘤体积更小,肿瘤质量更轻。上述结果提示,LINC00511在OS中能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移,是其发病机制中重要的抑癌基因。
  第三部分:LINC00511对骨肉瘤疾病进展的调控机制的初步研究
  第三部分研究中,对LINC00511调控OS的分子机制进行初步的研究。从OS上皮间质转化及PI3K/Akt信号通路的调控两方面进行观察。在Saos-2各组细胞中,利用Western Blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimemin和α-SMA的表达,以及PI3K/Akt信号通路中PI3K和p-Akt的蛋白表达量,初步探讨LINC00511抑制OS增殖、迁移的分子调控机制。结果显示,Saos-2中过表达LINC00511后OS中的E-cadherin蛋白表达显著升高,而Vimentin和α-SMA蛋白表达显著降低,OS的EMT受到显著抑制。此外,PI3K和p-Akt(308)蛋白表达显著降低,而p-Akt(473)蛋白表达并无明显变化,PI3K/Akt信号通路受到明显抑制。上述结果提示,LINC00511可能通过抑制OS的EMT以及PI3K/Akt信号通路,对OS细胞增殖、迁移产生调控作用,其中,PI3K/Akt信号通路产生作用的Akt的磷酸化位点是苏氨酸308(Thr308)。
[硕士论文] 唐渊
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:胃癌是中国最常见的消化道恶性肿瘤,中国新发生的胃癌,其中90%以上患者是进展期胃癌。目前胃癌主要治疗方式是手术加上化疗,部分进展期的胃癌通常不能直接进行手术,需要进行术前的新辅助化疗。目前临床胃癌新辅助化疗,存在化疗耐药问题。课题组前期研究发现,胃癌新辅助化疗能够诱导肿瘤细胞衰老。衰老的细胞会分泌大量的炎性因子,趋化因子,蛋白酶体等,这种表型是细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),能够通过多种方式,导致化疗耐药。进一步研究发现胃癌新辅助化疗标本耐药的患者存在SASP相关因子升高。课题组前期对胃癌新辅助化疗组织标本进行回顾性研究发现:胃癌新辅助化疗的效果与tristetraprolin(TTP)的表达有着密切相关,TTP高表达的患者胃癌新辅助化疗敏感性好,TTP低表达的患者新辅助化疗敏感性差。TTP作为一个RNA结合蛋白,能够与大量细胞因子mRNA的3'UTR区的AU富集区(AU-rich element,ARE)结合,进而降解目标因子的mRNA,也是一个重要的抑炎和抑癌蛋白。TTP调控的靶因子的mRNA与SASP相关分泌因子的mRNA有大量重叠。由此推测:TTP可能通过调控胃癌新辅助化疗引起的SASP,进而增加胃癌新辅助化疗敏感性。TTP其有可能成为候选的胃癌新辅助化疗敏感性的生物标志物。本研究拟在此研究基础上,通过在体外胃癌细胞衰老模型下,研究TTP通过调控SASP相关因子表达,提高新辅助化疗敏感性具体作用及其分子调控机制。为进一步探讨如何通过TTP改善胃癌新辅助化疗敏感性,以及胃癌患者治疗个体化治疗方案,也为TTP作为胃癌新辅助化疗有效的生物标志物提供基础理论支持,具有重要的临床意义。
  方法:第一部分:根据课题前期相关实验结果,选取胃癌BGC-823细胞系。分别在0、25nM、35nM、45nM浓度下紫杉醇诱导处理BGC-823细胞24h、48h、72h。衰老相关的β-gal半乳糖苷酶染色,分析构建稳定体外的胃癌细胞衰老模型。
  第二部分:基于胃癌BGC-823细胞系构建TTP过表达和TTP干扰细胞株,嘌呤霉素筛选稳定表达和稳定干扰的细胞株。实验分为三组:TTP过表达组,TTP干扰组,空白对照组。在紫杉醇35nM浓度下,诱导胃癌BGC-823细胞72h,分别通过qPCR和ELISA检测SASP部分相关因子的mRNA水平和蛋白分泌水平。
  第三部分,在体外紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞衰老模型上,通过Western blot方法检测p65在TTP过表达,TTP干扰的细胞核内外表达水平变化。进一步通过细胞免疫荧光,确定核内外p65表达水平,使用Image pro plus软件进行核内外p65荧光强度半定量分析。
  结果:第一部分:成功构建胃癌BGC-823细胞衰老模型构建:在35nM浓度下,紫杉醇诱导BGC-823细胞72h,β-gal染色,染色阳性,说明成功构建体外的胃癌细胞BGC-823衰老模型,其中胃癌BGC-823细胞衰老染色在紫杉醇诱导72h细胞衰老的比例达到60%以上
  第二部分:构建胃癌BGC-823细胞的TTP过表达和TTP干扰的细胞株,通过RT-qPCR验证TTP过表达和TTP干扰细胞株构建成功。通过嘌呤霉素在2μg/ml浓度作用下,筛选得到TTP稳定过表达和TTP稳定干扰的胃癌BGC-823细胞株。在35nM浓度紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞72h,通过qPCR和ELISA分别检测SASP部分相关因子的mRNA和蛋白变化。结果显示:TTP过表达时,能够下调SASP部分相关因子的表达,TTP干扰时,上调SASP部分相关因子表达,相比空白对照组差异具有统计学意义。
  第三部分:为了进一步研究TTP对SASP调控分子机制,在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型上,Western blot结果显示p65核内外的表达,TTP过表达组相比空白对照组显著减少,TTP干扰组核内p65相比空白对照也是显著增多。为了进一步验证TTP过表达和TTP干扰是否对p65入核影响,细胞免疫荧光,TTP过表达,TTP干扰组,空白对照组在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞72h条件下,细胞免疫荧光分析结果显示:在TTP过表达,核内的p65的荧光相比空白对照组和TTP干扰组有差异具有统计学意义。
  结论:成功构建紫杉醇体外诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型,在胃癌细胞衰老模型上,发现TTP能够调控胃癌BGC-823细胞的衰老相关分泌表型。TTP通过ARE结合途径直接降解SASP相关因子表达,还可以通过减少p65入核,抑制NF-κB信号通路激活,进而调控胃癌细胞衰老相关分泌表型。这也揭示:TTP可能通过调控SASP相关因子的表达,增加胃癌新辅助化疗敏感性。
[硕士论文] 彭东宇
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:尤文肉瘤(Ewing's sarcoma,ES)是儿童和青少年中第二大常见骨肿瘤,是一种侵袭性骨和软组织肉瘤,其年发病率是2.93/1000000,常发生于骨骼,特别是下肢(41%),骨盆(26%),胸壁(16%),椎骨(6%)和颅骨(2%)。约四分之一的尤因肉瘤出现在软组织中而不是骨,大约四分之一的患者有诊断时可检测到转移。肺是最常见的转移部位(50%),其次是骨(25%)和骨髓(20%)。临床早期症状不明显,故极易漏诊。尤文肉瘤患者对放疗极为敏感,通过小剂量照射后,肿瘤可迅速减小,局部的疼痛感显著减轻。但值得注意的是,放疗对起源于椎体的尤文肉瘤同时容易造成脊髓及神经的损伤甚至导致神经功能不可逆性损害而致患者瘫痪。而且尤文肉瘤又容易早期转移,单纯放疗对于此类病人远期疗效差。但其具体的发病机制尚不明确。
  蛋白酶体系统是最重要的系统之一,蛋白质降解系统在真核生物中具有调节细胞过程如细胞周期,转录,细胞信号传导,细胞死亡和免疫反应的能力。REGγ(也被称为PA28γ、11Sγ或Proteasome activator complex subunit3,PSME3)蛋白是20S蛋白酶体激活因子家族中的一员,主要定位在细胞核中,可以形成同源七聚体,作为细胞内一种重要的蛋白酶体激活因子,参与到许多与疾病相关的通路调节中。以非泛素和非ATP依赖的方式促进一些靶蛋白的降解,如SRC-3、P21、P53、P16、CK-1δ、SirT1等。已有研究证实REGγ在许多癌症组织中高表达及恶性生物学行为中发挥着重要作用,如结肠癌、肺癌、胃癌、脊索瘤等。但它在尤文肉瘤中的作用尚未有报道,此研究REGγ在尤文肉瘤中的功能,为了解和阐明尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究目的:通过检测REGγ在尤文肉瘤组织中的表达水平及预后相关性,初步探究REGγ在尤文肉瘤发生发展中的作用及相互关系。为深入探索尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究方法:1.通过免疫组化染色评估REGγ在尤文肉瘤组织中的表达情况,并结合临床随访资料行相关性分析;2.在尤文肉瘤细胞系中干扰REGγ的表达,肿瘤细胞生物学行为的改变;3.在尤文肉瘤细胞系中过表达REGγ基因,检测肿瘤细胞生物学行为的改变。
  研究结果:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,瘤旁正常组织中REGγ表达水平相对较低;2.REGγ在尤文肉瘤组织中的高表达与患者的不良预后存在显著的相关性;3.在尤文肉瘤细胞系中,REGγ敲减干扰后均出现凋亡敏感性的增加而使其增殖能力、侵袭能力、迁移能力均明显下降的肿瘤细胞生物学行为的改变;4.在尤文肉瘤细胞系中,过表达REGγ基因,尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强。
  研究结论:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,这表明REGy可能有促进肿瘤细胞生长的作用;2.REGγ的表达与尤文肉瘤患者的无瘤生存时间呈负相关;3.在尤文肉瘤中,蛋白酶体REGγ敲减干扰后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显下降,而其凋亡增加。REGγ过表达后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强,而其凋亡敏感性降低。提示REGγ与尤文肉瘤的发生及预后密切相关,这将为提高尤文肉瘤的治愈率提供非常重要的思路。
[硕士论文] 李高峰
外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本文目的是研究肝脏肿瘤细胞调控氧化应激的机制及肿瘤干细胞在抗氧化应激过程中的作用,探寻参与调节肿瘤干性特征与抗氧化应激过程的相交叉的分子靶点,并人为干预后,进一步对比肝脏肿瘤细胞抗氧化应激能力及干性特征的变化。从而从肿瘤干细胞具有较强抗氧化应激能力的生物学特性角度为肿瘤的临床治疗、基础研究及新药研发提供新的策略与思路。
  方法:
  1.对比肝细胞癌(HCC)细胞系Huh7与SMMC-7721对外源性ROS(H2O2)抵抗能力及两组细胞系中参与ROS调控的相关分子表达差异,探究肝癌细胞对ROS抵抗的初步机制;2.进一步分离Huh7细胞中抗ROS的亚群,并与普通Huh7细胞比较抗ROS能力及调控ROS代谢的相关分子表达的差异,筛选出调节通路中的关键分子(β-catenin);3.使用β-catenin阻滞剂XAV939阻断Wnt/β-catenin信号通路,观察Huh7细胞抗ROS能力的变化;4.通过慢病毒干扰Huh7细胞系内ROS产生基因Nox1,人为减少细胞内ROS的产生,来比较Nox1基因干扰组与GFP(绿色荧光)对照组细胞抗ROS能力、干性特征及相关分子表达的变化,进而探究ROS调控能力与肿瘤干性特征之间的关系。
  结果:
  1.经H2O2作用后,相对于SMMC-7721细胞,Huh7细胞凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低,同时相对高表达干性分子CD133、bmi-1,DNA修复基因Rad51、ROS清除酶基因SOD2。2.肝癌细胞Huh7内存在具有较强抗ROS能力的亚群(Huh7-ROS),该亚群细胞相对于普通的Huh7细胞高表达bmi-1、CD133、Bcl-2、SOD1,并且在经H2O2作用后,凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低。3.相对于未用XAV939处理的Huh7细胞,经XAV939处理的Huh7-XAV939组细胞在H2O2作用后,细胞凋亡坏死数目更多,活性更低,细胞内ROS水平更高,而在不使用H2O2情况下即H2O2浓度为0umol/ml时,Huh7细胞的凋亡和坏死及细胞活性都没有差异。4.干扰Huh7细胞内ROS产生基因Nox1的实验组细胞(Huh7-siNox1),相对于普通的对照组绿色荧光细胞(Huh7-GFP),不但在H2O2作用后细胞活性更高,而且还有更强体内致瘤能力、集落形成能力。
  结论:
  1.肝癌细胞拥有较强的抗ROS的能力有赖于肿瘤干性分子、DNA修复基因及清除酶基因的共同作用。2.肝癌细胞内存在抗ROS的亚群细胞,这一亚群也同时高表达肿瘤干性分子、ROS清除酶基因、DNA修复基因以及肿瘤干细胞信号通路分子β-catenin基因。3.β-catenin基因调控肿瘤细胞的自我更新等干性细胞学特性,在肿瘤细胞抗ROS过程中同样发挥作用。XAV939作为β-catenin基因的特异性阻滞剂,可以在不会诱导细胞凋亡和坏死的浓度水平抑制肝脏肿瘤细胞调控ROS抵抗的能力,进而可增加化疗药杀伤肿瘤细胞的效应,其有可能成为化疗“增敏剂”,进而在化疗过程中起到辅助作用。4.通过干扰Nox1基因降低内源性ROS的产生可以增强Huh7细胞抗ROS的能力并激活肿瘤细胞的干性特征,Nox1分子表达的高低及肿瘤细胞中ROS的水平可能作为为患者预后评判的标准和相关治疗的分子靶点来研究。
[硕士论文] 沈皓
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:中国HCC的发病例数和死亡例数占全球的50%以上,但各个地区的HCC发病率差异明显。本研究旨在比较中国大陆肝癌高发地区(High HCC prevalence regions)和肝癌低发地区(Low HCC prevalence regions)的肝癌病人在肝切术后的远期预后情况,找出不同地区之间影响预后的危险因素的差异。
  研究方法:回顾性分析了1996-2010年间在东方肝胆外科医院进行肝癌切除术并获得组织病理学证实的肝癌病人临床病例资料。参照《2012年中国癌症登记年报》,将病人按照出生地分为高发地区组和低发地区组。计量资料的比较采用Mann-Whitney非参数U-检验,计数资料的比较采用卡方检验,生存资料的分析采用Kaplan-Meier法、对数秩检验和Cox风险回归分析。使用R3.4.1和SPSS18.0统计软件对统计结果进行分析。
  研究结果:本研究随访日期截止至2013年6月30日,中位随访时间为24.1个月。研究共纳入4919例病人,其中3370例来自肝癌高发地区,1549例来自肝癌低发地区。在全部病人中,高发地区组的5年肿瘤复发率明显高于低发地区组(82.9%比69.2%;p<0.001),而其5年生存率则低于低发地区组(48.8%比53.7%;p<0.001)。多因素分析发现,来自高发地区在肿瘤复发和总体生存中都是独立危险因素(TTR[HR]:1.18;OS[HR]:1.24)。
  按地区不同对病人进行亚组分析后发现,来自高发地区的病人HBsAg、HBeAg和HBcAb阳性率更高并且HBV-DNA>2000IU/mL,AFP>20ng/ml,微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)阳性及肿瘤低分化(Edmondson-Steiner分级:Ⅲ-Ⅳ级)的比例也更高。两地区病人共同的预后独立危险因素为AFP水平>20ng/mL,肿瘤直径>5cm以及MVI阳性。低发地区组的预后独立危险因素是年龄≤50岁,男性和输血,而高发地区组的独立危险因素为HBeAg阳性,HBV-DNA>2000IU/mL,TBIL>17.1umol/L,非解剖性肝切除以及肿瘤低分化。
  全部病人中,符合米兰标准的病人共2497例(高发地区组1739例,低发地区组758例);符合BCLC0期标准的病人共370例(高发地区组264例,低发地区组106例)。多因素分析发现,来自高发地区在以上两个分期中依旧是肿瘤复发和总体生存的独立危险因素(米兰标准:TTR:1.27;OS:1.37;BCLC0期:TTR:1.94;OS:2.50)。
  对全部病人、符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中HBeAg阳性病人分别进行亚组分析后发现,高发地区组的1、3、5年复发率均高于低发地区组(全部病人:p=0.030;米兰标准:p=0.004;BCLC0期:p=0.048),符合米兰标准的病人和符合BCLC0期标准的病人中高发地区组的1、3、5年生存率低于低发地区组(米兰标准:p=0.043;BCLC0期:p=0.046)。但在全部病人中,两者的1、3、5年生存率并没有明显差异(p=0.182)。
  研究结论:本研究首次发现了中国大陆肝癌高发地区和肝癌低发地区病人术后远期预后存在明显差异,来自高发地区的病人预后更差。来自高发地区在多个肿瘤分期中都是预后的独立危险因素。高发地区的病人HBV感染率更高且环境毒素暴露机会更多可能是导致这种现象的原因。
[博士论文] 沈頔
外科学(整形外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:婴幼儿血管瘤是一种婴幼儿期较为常见的内皮细胞良性肿瘤。该肿瘤通常具有增殖期、消退期和消退完成期的临床病理特征。患者在出生后3-6个月发病并迅速进入增殖期。该病一般在患者3-7岁可自发出现消退。在增殖期,由于血管瘤内血流量迅速增加,瘤体快速增殖,可使肿瘤体积明显增大,从而对周围组织器官造成压迫症状。多发者可伴随其它相关病理表现。在消退期,肿瘤瘤体停止生长,并自发消退。多数患儿可不残留明显皮肤改变。但部分婴幼儿血管瘤因其深在,或者并发其他疾病,可导致严重的并发症。某些病例中最终残留的病变可影响患儿正常生活。目前对于婴幼儿血管瘤的治疗方法已逐渐统一,但是还没有一种治疗方法是完全有效和没有副作用的。这主要是因为对于其发病机制还没有完全研究清楚。目前普遍认为,相对于增殖期,消退期的婴幼儿血管瘤中内皮细胞的凋亡是一个重要的促进因素。
  miRNA又称为微小RNA,是一类自然界中普遍存在的小分子RNA。该类RNA对于维持机体内环境稳定,调控细胞和组织分化有重要意义。该类RNA并不通过编码蛋白质发挥作用,而是通过识别特定靶目标的mRNA,降解mRNA或部分抑制mRNA的表达,从而抑制靶目标蛋白的形成和发挥作用。目前有诸多文献均认为,在肿瘤中miRNA与细胞凋亡有着重要的关系。在前列腺癌中[1],miRNA-34可以下调Bcl-2蛋白表达,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。在恶性胶质瘤中[2],miRNA-153可以通过下调Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡。在直肠癌中[3]存在着低表达的miRNA-195。通过在直肠癌细胞内高表达miRNA-195,可以促进直肠癌细胞的凋亡。我们之前对增殖期及消退期的婴幼儿血管瘤组织进行差异microRNA芯片检测和筛选,发现miR-29a-3p在不同期的组织中差异明显,且在消退期的婴幼儿血管瘤组织中明显高表达。同时,在诸多文献中,均发现miR-29家族成员可以通过作用于凋亡相关因素而抑制肿瘤的发展。通过实验[4]发现,在恶性肝细胞癌细胞株中,miR-29a可调控抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2,从而导致肝癌细胞的凋亡。在慢性淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌中,miR-29a均表达下调。上调miR-29a表达可以激活P53的表达,并抑制CDC42、Tcl-1等多种增殖相关基因的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。
  通过本研究,我们试图探讨miR-29a对婴幼儿血管瘤生物活性的影响,以及在婴幼儿血管瘤消退中的作用及其机制。以期对进一步了解婴幼儿血管瘤自发消退的机制有所裨益。
  第一部分:婴幼儿血管瘤内皮细胞的培养及鉴定
  实验目的:
  通过原代细胞培养的方法,获得可用于实验的增殖期婴幼儿血管瘤内皮细胞。
  实验方法:
  1、无菌条件下收集手术中新鲜的增殖期婴幼儿血管瘤标本,于6小时内转入实验室超净台中。以组织块贴壁培养法处理并培养血管瘤组织。培养数周后,获取其周围爬出的细胞,通过酶消化法收集。经过传代再培养。传至3-4代,细胞量足够时,收集并以CD31免疫磁珠分选,获得CD31阳性细胞。将细胞进行CD31-FITC的流式细胞学检验,以保证阳性细胞率达90%以上。
  2、将获得的高纯度的CD31阳性细胞进行培养,在倒置相差显微镜下观察其生长形态,并绘制生长曲线,行Matrigel基质胶成管实验,以确定该细胞的生长特性。
  3、通过CD31、vWF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,以明确该细胞为可用于下一步实验的婴幼儿血管瘤内皮细胞。
  实验结果:
  1、通过对增殖期婴幼儿血管瘤新鲜标本组织块的培养,细胞的收集、扩增、传代、并经CD31免疫磁珠分选,获得了足够量的细胞。通过CD31-FITC的流式细胞学检验,所获得CD31阳性细胞率为96%左右。
  2、获得的细胞通过培养,在倒置相差显微镜下观察,可见其形态为梭形,生长较为杂乱。生长曲线显示其具有较为旺盛的增殖活性。Matrigel基质胶成管实验显示其具有早期成管能力。
  3、通过CD31、vWF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,可见该细胞上述表面标志物表达均为较强阳性。
  实验结论:
  我们通过收集增殖期婴幼儿血管瘤标本,并经体外扩增培养并获得细胞。经形态学及免疫荧光抗体检测,其特征均符合文献的一般描述,证实为所需婴幼儿血管瘤内皮细胞。经流式细胞仪检测,该细胞纯度较高,活力较强,可用于下一步实验。
  第二部分:上调miR-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响
  实验方法:
  1、体外构建能够转染并可在细胞内稳定表达miR-29a的慢病毒颗粒Lv-hsa-miR-29a及阴性对照病毒Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin。
  2、以自身细胞作为阴性对照组,以Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin转染的细胞作为阴性病毒转染组,以Lv-hsa-miR-29a转染的细胞作为慢病毒转染组。通过荧光显微镜观察其荧光表达情况。通过qRT-PCR检测细胞在转染前后miR-29a表达的变化,从而确定其转染效率。
  3、在婴幼儿血管瘤细胞内过表达miR-29a后,采用MTT法检测其增殖能力的改变。流式细胞仪检测其周期及凋亡水平的改变,Transwell侵袭法检测其侵袭能力的改变,以研究过表达miR-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响。
  实验结果:
  荧光显微镜下观察,FITC荧光表达显示miR-29a转染效果良好,转染效率约为95%左右。qRT-PCR结果显示miR-29a在婴幼儿血管瘤内皮细胞中的表达丰度为中等,转染慢病毒颗粒后,miR-29a基因的表达丰度是阴性对照组的2.643倍。转染病毒后72h,过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,其早期凋亡率约为10.82%,较阴性对照组及阴性病毒转染组有显著性差异。其晚期凋亡率约为1.72%,较阴性对照组有显著性差异。而细胞周期、侵袭及增殖实验结果均无显著性差异。
  实验结论:
  通过转染慢病毒颗粒Lv-hsa-miR-29a,可以构建稳定高表达miR-29a的细胞模型。过表达miR-29a后,婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡率有显著性变化。而对于细胞周期、增殖及侵袭均无显著性影响。
  第三部分:miR-29a在婴幼儿血管瘤中作用机制的研究
  实验方法:
  1、以miR-29a过表达后的婴幼儿血管瘤细胞作为目标样本,以自身细胞作为阴性对照,采用miRNA基因表达谱芯片筛选的方法,获得两者之间有较大表达差异的mRNA表达谱。通过与TargetScan数据库进行比对,结合之前细胞功能学研究结果,参考相关文献,选取可能为miR-29a下游的靶基因作验证。
  2、通过双荧光素酶检测显示,miR-29a的下游作用分子可能为Mcl-1分子。
  3、通过Western-blot检测的方法,进一步验证在过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平是否有显著性变化。
  4、通过查阅文献及相关数据库,我们选取Stat3及Akt3这两个可能同时是Mcl-1上游及miR-29a下游靶蛋白的分子加以验证,进一步研究miR-29a是否通过调控Mcl-1上游分子表达以调控Mcl-1表达的可能。
  实验结果:
  参考miRNA芯片筛选、数据库分析结果及相关文献,我们获取相关分子作为miR-29a可能的下游靶蛋白并进行验证。通过双荧光素酶检测确定Mcl-1具有与miR-29a结合的相关位点,其为miR-29a可能的下游分子。通过Western-blot检测,证实了Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平均有显著性变化。同时,通过Western-blot检测,证实了Stat3及Akt3蛋白水平无显著性变化。
  实验结论:
  双荧光素酶检测发现,miR-29a与Mcl-1是直接相互作用并且可以找出相互作用的结合位点。通过Western-blot检测,在过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白表达明显下调。而miR-29a与Mcl-1的上游分子Stat3和Ark3没有表达相关性,miR-29a并不能抑制或者激活Stat3和Ark3的表达。
[硕士论文] 刘永刚
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)属于起源于间充质的一种恶性骨肿瘤,是儿童与青少年罹患原发性恶性骨肿瘤疾病谱中最常见的。骨肉瘤患者的年龄分布呈现双峰状态,分别为青春期人群与老年人群。青春期高峰集中在大约15岁。0~24岁组的骨肉瘤发病率为4.4/百万。第二个峰值集中在75岁左右,主要由与佩吉特病或其他骨性病变相关的继发性骨肉瘤组成。男性与女性的发病率之比为1.22∶1。转移仍然是骨肉瘤最重要的致命性并发症,约有80%的骨肉瘤患者在确诊时发现已存在转移性或微小转移性病灶。由于治疗原则和化学疗法的进展,患者的5年生存率从不到30%提高到70%以上。尽管有了上述进展,但骨肉瘤发生发展的生物学机制研究仍任重而道远,如何从根源上治愈骨肉瘤是当今医学界面临的难题之一。
  整合素连接激酶相关磷酸酶(integrin-linked kinase-associated phosphatase,ILKAP)是一种丝氨酸/苏氨酸(S/T)磷酸化酶,与细胞的生存和凋亡有关。ILKAP同时也是一种具有调控肿瘤发生发展功能的抑癌基因表达产物。ILKAP广泛表达于人体组织中,主要在肾脏、骨骼肌、肝脏等脏器中表达水平较高。介导细胞凋亡是ILKAP的主要生理功能。ILKAP与肿瘤细胞的发生、发展息息相关。
  低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是肿瘤微环境与肿瘤病因学研究中的重点。作为一种转录因子,HIF-1有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等一系列作用。HIF-1的含量一旦失调,细胞将具备多种恶性能力并演变成肿瘤。早期研究认为,细胞在正常微环境下,HIF-1主要受羟化酶的调节而进入泛素降解途径,而仅当细胞处于低氧条件时HIF-1不能被降解,进而发挥功能。近年来随着对HIF-1调节方式的深入研究,人们发现羟化反应并不是HIF-1转录活性调节的唯一途径,磷酸化调节也是调控HIF-1的一种重要方式,尤其是在非低氧条件下。
  研究目的:
  证实低氧可导致细胞发生凋亡;研究低氧条件下ILKAP通过与HIF-1α相互作用,对骨肉瘤细胞凋亡产生的相关影响。
  研究方法:
  1、细胞低氧模型的构建与监测:使用Billups Rothenberg公司生产的二氧化碳培养箱将骨肉瘤细胞进行培养。连续从0h至96h将气罐中充入了混合的O2(1%)与N2(94%)和CO2(5%)。调节二氧化碳培养箱的温度(37℃)、湿度(95%)。每24h更换细胞培养液。通过YSI模型55溶氧测定仪来监测培养箱内溶氧量,从而监测低氧环境。
  2、骨肉瘤细胞活力测定:台盼蓝染色试验测定细胞存活率。将单细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合混匀。每0.1mL单细胞悬液中加入一滴台盼蓝染液,室温下染色3~5min,记录活细胞和死细胞数。将处理过的骨肿瘤细胞材料在高倍镜下观察。分别计数1000个细胞内的活细胞和死细胞数,统计未染色细胞,用公式计算细胞存活率。
  3、骨肉瘤细胞凋亡检测:本实验采用激光共聚焦显微镜技术通过观察骨肉瘤细胞内DAPI与TUNEL的共定位,判断骨肉瘤细胞是否经历凋亡。
  4、检测HIF-1α、细胞凋亡标记物:采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)—底物化学发光ECL法。
  5、研究ILKAP在导细胞凋亡过程中的作用:采用ILKAP shRNA腺病毒转染与Ad-ILKAP过表达的研究方法。
  6、研究HIF-1α、ILKAP、p53之间的相互作用:对细胞进行了72h低氧处理,而后进行免疫共沉淀实验。
  研究结果:
  1、细胞活力随着时间延长而下降,细胞凋亡增加(P<0.05)。HIF-1α随低氧处理时间延长逐步被诱导,磷酸化HIF-1α逐渐减少。通过400U ILKAP处理HIF-1α,PBS作为阴性对照,400Uλ磷酸酶作为阳性对照,发现ILKAP和λ磷酸酶对于HIF-1α的作用相似,可使去磷酸化HIF-1α逐渐增多。
  2、低氧条件下细胞存活由ILKAP shRNA维持。低氧条件下细胞凋亡与ILKAP有关。相同低氧时间下,ILKAP shRNA组的细胞凋亡数明显少于对照组(P<0.05)。Western blot条带显示HIF-1α在ILKAP shRNA组与对照组比较,大部分没有转为去磷酸化形式。
  3、通过免疫共沉淀实验发现,磷酸化形式的HIF-1α优先与抗ILKAP抗体免疫沉淀,去磷酸化形式的HIF-1α优先与p53抗体免疫共沉淀,ILKAP与p53之间没有相互作用。
  4、相比于对照组,Ad-ILKAP组的细胞存活率显著减少,呈时间依赖性(P<0.05)。细胞凋亡标记物和TUNEL法在Ad-ILKAP组相比于对照组,反映出显著增加的细胞凋亡现象。常氧条件无法诱导HIF-1α表达,但在Ad-ILKAP组可检测。
  研究结论:
  1、细胞凋亡数量会随着低氧处理时间延长而显著增加。ILKAP可以起到类似于λ磷酸酶的去磷酸化作用。HIF-1α磷酸化状态在持续的低氧诱导细胞凋亡过程中发生改变,ILKAP可使HIF-1α从磷酸化状态转为去磷酸化状态。
  2、长时间低氧诱导情况下,下调细胞内ILKAP表达,则细胞凋亡减少。由此可见,ILKAP在长时间低氧诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用。
  3、ILKAP结合磷酸化形式的HIF-1α使其去磷酸化,然后与去磷酸化形式的HIF-1α分离,去磷酸化的HIF-1α则与p53结合。ILKAP不与p53直接作用。
  4、常氧无法诱导HIF-1α表达。在常氧情况下,上调细胞内ILKAP表达可诱导细胞凋亡,并且使HIF-1α去磷酸化。
  综上所述,ILKAP直接使HIF-1α去磷酸化,并且对后续p53依赖的细胞凋亡发挥重要作用。考虑到其与p53及p53本身的复杂作用,现阶段的实验结果为进一步研究不同HIF-1α类型在多种疾病中的作用基因奠定了基础。
[硕士论文] 张瑞瑞
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:肺癌是当前世界对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一,其高发病率及难治愈率均位于恶性肿瘤之首。癌症的主要特征是细胞迁移和侵袭,其迁移过程涉及到各种蛋白分子之间的相互协调、细胞骨架在迁移中的相互作用机制以及改变的肌动蛋白动力学。WDR1(WD-重复结构域1)是肌动蛋白解聚因子ADF/cofilin的主要辅助因子,能够强烈加速ADF/cofilin介导的肌动蛋白分解。目前,WDR1在非小细胞肺癌(NSCLC)进展中的作用尚无报道。我们通过RT-PCR实验检测发现在人类非小细胞肺癌组织中WDR1的表达水平与相邻的非肿瘤组织相比异常增加,并且高表达WDR1与非小细胞肺癌患者的不良预后相关。鉴于此,本文对WDR1在非小细胞肺癌中的生物学功能进行较为系统的研究及分析。我们利用shRNA干扰技术和过表达技术,在A549及H1299细胞中下调和高表达WDR1。结果发现在非小细胞肺癌细胞中WDR1的敲低显著抑制了细胞增殖、迁移和侵袭以及EMT进程,过表达WDR1则促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移。通过构建裸鼠模型,小鼠体内原位成瘤实验的结果与体外细胞实验结果相吻合。通过进一步的机制研究,我们发现WDR1通过促进ADF/cofilin介导的actin解聚,调控肿瘤细胞的运动能力和细胞连接,进而促进非小细胞肺癌的转移。我们的研究结果提示ADF/cofilin-WDR1-actin的特异性抑制剂有望成为治疗肿瘤转移的新靶点。
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