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[硕士论文] 徐俊
外科学(普通外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究将探讨在脓毒症发生过程中Robo4基因表达对EPCs数量和功能的影响,及其诱导EPCs定向分化作用,为临床防治脓毒症探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。
  本研究共分为三个部分,首先通过基因敲除技术构建Robo4-/+、Robo4-/-小鼠,通过盲肠穿孔+腹腔注射内毒素(LPS)制造出创伤后基因敲除小鼠的脓毒症模型。然后动态观察创伤后脓毒症发展过程中EPCs内Robo4表达水平和内皮祖细胞数量变化。最后对三种不同基因表达小鼠骨髓来源的EPCs进行体外培养和功能鉴定。
  第一部分 多器官功能障碍小鼠模型的建立
  目的:建立基因敲除小鼠脓毒症模型,为研究Robo4影响内皮祖细胞增殖和分化提供实验基础。
  方法:将体重20-25g的Robo4-/+、Robo4-/-和WT三种基因类型的小鼠100只分为2组:实验组(M组)90只,施行腹腔内毒素注射+盲肠穿孔;对照组(C组),施行假手术。观察各组动物的症状、体征、生存率、脏器功能指标(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并观察主要脏器的大体及显微镜下病理改变。
  结果:实验组小鼠的症状、体征与功能指标均发生明显变化,肺、肝、心、肾及胃肠道等脏器病理改变严重。实验组和对照组MODS发生率为(82.2%,0),死亡率(75%,10%),显著高于对照组。
  结论:采用腹腔注射内毒素+盲肠穿孔的方法,可以成功地复制出小鼠脓毒症模型,且有较高的死亡率和可重复的稳定性,并可进一步发展成为MODS。
  第二部分 脓毒症进展过程中EPCs数量的变化及EPCs内Robo4表达水平变化
  目的:监测脓毒症各个阶段正常小鼠骨髓中内皮祖细胞的数量变化,检测EPCsRobo4的mRNA和蛋白水平变化,探讨Robo4表达水平与EPCs数量变化的相关性。
  方法:按照第一部分造模后,分别在正常状态下、注射内毒素2小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取骨髓,按照密度梯度离心法获得单个核细胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×105PMC/孔的密度种于铺有纤维连接蛋白(FN)的培养板中培养,培养48小时后收集未贴壁细胞,再按1×105PMC/孔的密度接种于FN包被的培养板中进行培养,培养72小时进行贴壁细胞的计数。取1×105细胞进行裂解,利用RealTime-PCR检测MODS各个阶段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平变化。
  结果:脓毒症发展过程中,Robo4表达水平逐渐升高,至T4达到峰值,随后逐渐下降;内皮祖细胞的数量先增加,在T5时达到峰值,随后出现明显下降。相关性分析表明,二者在脓毒症进展过程中的变化成正相关。
  结论:在LPS介导的小鼠脓毒症模型中,Robo4表达水平与骨髓中EPCs数量具有相关性,因此Robo4可能参与调控EPCs的增殖。
  第三部分 三种不同基因表型的小鼠骨髓来源EPCs培养鉴定和功能特征比较
  目的:对三种不同基因表表型小鼠骨髓来源的EPCs进行分离、培养、鉴定和功能比较。
  方法:从小鼠骨髓分离出单个核细胞,进行诱导分化培养,对培养至P6代的EPC进行细胞形态学特征、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管形成功能等方法进行鉴定,并对照分析。
  结果:三种不同基因表达的EPC鉴定如下:贴壁细胞均特异性摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,摄取率均超过80%。免疫组化:Robo4-/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4+/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式细胞仪技术鉴定:Robo4-/-组:CD133阳性率:17.25±6.43%;CD34阳性率:48.75±6.83%;CD31阳性率:72.53±12.38%;KDR阳性率:87.25±10.23%;Robo4+/-组:CD133阳性率:16.55±7.29%;CD34阳性率:46.65±7.23%;CD31阳性率:75.93±11.28%;KDR阳性率:89.25±11.33%;WT组:CD133阳性率:18.25±8.57%;CD34阳性率:47.15±5.72%;CD31阳性率:74.61±10.69%;KDR阳性率:88.25±11.35%。体外血管生成功能:Robo4-/+组:28.49±4.38个/HP;Robo4-/-组:25.82±3.62个/HP;WT组:42.32±3.92个/HP(P<0.05)。粘附功能:贴壁率(Robo4-/+组:42.7±3.1%;Robo4-/-组:39.5±1.7%;WT组:64.5±2.6%(P<0.05))。迁徙功能:迁徙率(Robo4-/+组:18.5±1.7%;Robo4-/-组:13.3±2.6%;WT组:27.5±1.8%(P<0.05))。增殖功能:Robo4-/+组:23.06±2.63×104;Robo4-/-组:19.24±2.65×104;WT组:40.33±3.65×104(P<0.05)。
  结论:Robo4+/-、Robo4-/-和WT三种基因来源的EPC的细胞形态和鉴定无明显差别。基因敲除小鼠EPCs的血管形成能力、迁徙功能、粘附功能和细胞增殖能力要劣于野生型组。
  小结:通过CLP+腹腔LPS注射建立复制小鼠脓毒症模型与临床脓毒症发生的常见诱因和实际过程相近。脓毒症发展过程中Robo4表达水平和内皮祖细胞数量呈上升趋势,而随着死亡的升高,二者逐渐下降。通过对三种基因表达小鼠诱导分离骨髓来源EPCs比较分析,发现Robo4基因敲除小鼠与野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鉴定、形态学特征、双吞噬功能基本一致。基因敲除小鼠在迁徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明显低于野生型小鼠。证实Robo4基因表型对EPCs的部分功能存在调控作用。
[博士论文] 罗益滨
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:颈椎病是临床多发病和常见病之一,广义的颈椎病是由颈椎间盘退变及继发病理改变导致周围解耦的变化,出现神经肌肉相关症状的一类疾病总称,又叫颈椎综合征。据粗略统计,我国颈椎病发病率在8.1%-19.1%之间。根据颈椎病的临床表现,颈椎病有多种分型,其中,伴交感神经症状颈椎病是较为特殊的一种。所谓伴交感神经症状颈椎病,是由于各种颈椎病损(如不稳、退变、间盘突出、炎症等)刺激颈部交感神经节,引起眩晕、视物模糊、头痛、失眠、胸闷、潮热甚至腹胀等交感神经症状的颈椎病。对该类型颈椎病形成的命名、分型、形成机制、发病过程、诊断标准、治疗规范,目前还存在较大的争议,其中机制研究是伴交感神经症状颈椎病的热点和难点之一。据已经发表的文献,主要有颈椎椎间不稳学说、体液因子学说、后纵韧带交感神经学说、关节周围本体感受器刺激学说、颈部Ruffini小体受激学说等。迄今没有一种假说能完美解释这种特殊类型颈椎病的发病机制。近年来,较为热门的是颈椎后纵韧带上交感神经纤维刺激学说。现有实验表明,刺激后纵韧带上交感神经纤维可以引起颈部交感神经节电位变化,并诱发相应交感神经症状。基于此学说,临床上选择术中切断后纵韧带,以对颈段脊髓充分减压、阻断交感神经反射通路,部分患者得到症状的缓解。还有学者围绕椎动脉、心脏等效应器对颈部交感纤维与交感症状之间的对应关系做了探索。但这一学说还有不完善和不成熟的地方,本研究拟对这种机制展开进一步研究。
  目的:
  1、在前人研究的基础上,通过形态学研究,进一步明确交感神经在后纵韧带上的节段性分布形态学规律,为后续的实验和其他类型的研究提供必要的证据。
  2、进一步明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维受激惹引起的相应交感神经症状。通过选取呼吸和血压两个效应器,明确颈部交感神经节→后纵韧带上交感神经纤维→效应器的传导关系,理清伴交感神经症状颈椎病的发病机制。
  3、通过上述实验,巩固伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究的其中一种学说:即颈后纵韧带上交感神经纤维致病机制。
  4、通过研究伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究,明确症状与病变部位的对应关系,为临床上精确定位和治疗伴交感神经症状颈椎病提供客观依据。
  方法:
  实验一:研究颈椎后纵韧带上交感神经纤维的分布情况。手术切取10只实验动物新西兰白兔的颈椎后纵韧带、交感神经节,通过不同染色方法进行形态学研究。将实验兔分为两组,每组5只,第一组进行颈椎交感神经节的切取,第二组进行颈椎后纵韧带的切取。将实验动物新西兰白兔进行耳缘静脉麻醉后,妥善安置于颈椎操作台,充分伸展颈椎,术区备皮消毒。切开皮肤,显露颈椎及周围附属结构,分别切取相应的组织。取出材料后,迅速放入中性甲醛溶液固定,进行HE、NPY以及S100的组织染色,并进行读片分析,以明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维存在的证据以及神经组织的来源。
  实验二:研究电刺激不同部位颈交感神经节时,观察效应器官(以呼吸频率为参数)的变化情况。取实验动物新西兰白兔35只,实验组(颈上、中、下交感神经节组)分为3组,每组10只;对照组5只。麻醉后捆绑胸部呼吸换能器。显露颈椎及周围附属结构,对不同部位颈部交感神经节进行电刺激,测量刺激前后呼吸频率变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录呼吸频率变化。以明确不同部位颈交感神经节和呼吸频率之间的关系。
  实验三:研究电刺激不同部位颈交感神经节,观察血压变化情况以及与神经节对应关系。取实验动物新西兰白兔35只,实验组分为3组(颈上、中、下交感神经节组),每组10只;对照组5只。进行耳缘静脉麻醉后,显露颈椎及周围附属结构,游离颈动脉,进行动脉置管及换能器连接。对不同部位颈部交感神经节进行电刺激(50mV),记录血压变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录血压变化。明确不同部位颈部交感神经节和血压之间的对应关系。统计学方法:实验中涉及的计量资料以均数±标准差(x±s)表示。应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析,组内采用配对t检验的方法。3个实验组(分别为颈部上、中、下交感神经节)与对照组(0mV电刺激组)刺激后的数据组间比较,采用Dunnett-t检验。设置检验水准a=0.05,当P<0.05认为差异有统计学意义。
  结果:
  实验一:通过形态学研究后纵韧带上交感神经纤维的分布及来源。结果发现,①通过观察染色后的切片,到颈椎后纵韧带表面神经染色呈阳性反应。②阳性反应的密度较低,提示交感神经纤维分布较少。③不是所有实验动物的后纵韧带都能检测出神经染色阳性反应,提示交感神经纤维在后纵韧带上分布不具有普遍性。④经过特异性NPY染色,观察到后纵韧带表面分布的神经纤维,和颈部交感神经节的来源相同。
  实验二:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察呼吸频率的相应改变。结果发现,颈上神经节刺激组于对照组刺激后相比,呼吸频率存在的统计学意义(P<0.05)。颈中、下神经节刺激后和对照组刺激后比,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  实验三:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察血压的相应改变。结果发现,颈上、中神经节刺激组可以观察到血压的改变,和对照组相比,变化存在统计学意义(P<0.05)。颈下神经节刺激后和对照组比较,血压不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,血压变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1、形态学研究证实了交感神经纤维存在于后纵韧带本研究从形态学上进一步证实了后纵韧带上分布的交感神经纤维。通过多项神经染色技术在光镜下仔细观察,确认交感神经纤维存在于颈椎后纵韧带表面。且交感神经纤维的来源与颈交感神经节同源,这是作为后纵韧带交感神经纤维致病机制的解剖学证据。
  2、通过效应器研究明确了不同部位交感神经节和症状对应关系实验证实,刺激不同节段颈交感神经节后,可引起相应交感神经症状(以呼吸频率和血压为对象)。通过药物阻滞后纵韧带上的神经纤维,不能再次触发相应症状。结合既往发现的颈交感神经节与后纵韧带表面交感神经纤维的对应关系,得出以下结论:颈椎病变刺激后纵韧带上不同节段的交感神经纤维,可以引起对应的不同症状。其中,颈4/5节段病变对应呼吸频率变化,颈5/6节段病变对应血压变化。证实了后纵韧带上交感神经纤维致病机制的合理性。
  3、本系列实验的结果对临床诊治具有一定的指导意义本实验发现了呼吸频率和血压与颈部交感神经节之间的对应关系。通过这一结果,可以由不同症状准确定位颈椎的病变节段。这一发现,为临床上对伴交感神经症状颈椎病的精准诊断和治疗带来了新的启发。
[博士论文] 刘伟聪
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景与目的:
  颈椎病的理想治疗目标包括彻底清除产生疼痛或者压迫的局部病灶、完全缓解疼痛及神经功能全面得到恢复、局部颈椎节段达到良好的稳定性重建、恢复并维持脊柱生理性的动力学状态四个方面。由于能保持手术节段活动度,作为不同于经前路颈椎间盘切除椎间植骨融合术的非融合手术方式,颈人工椎间盘置换术在临床中越来越广泛应用于颈椎退变性疾病。颈人工椎间盘置换术的近期临床疗效优于或者等同于经前路颈椎间盘切除椎间植骨融合术,而中长期疗效尚待进一步证实。随着临床资料的积累,关于颈椎间盘置换术后的异位骨化也陆续报道,多个随机对照研究报道认为非限制型假体术后在两年随访期间之内异位骨化的发生率超过50%。由于假体磨损、下沉等其他远期并发症目前发生率报道比较低,手术节段术后产生的异位骨化成为颈人工椎间盘置换当前面临的主要障碍。异位骨化的产生能导致置换节段活动度的下降甚至丧失,其病因学至今仍未明确。有分子生物学、活动度差异及力学变化等各种全身及局部机制等各种假说。尽管很多临床报道认为生物力学因素会刺激异位骨化产生,并且在压力情况或者载荷情况下同异位骨化形成相关,但其具体发生机制尚未明确。全面了解颈椎基本的生物力学变化,对防治颈椎伤病、改进颈椎病治疗方法和提高临床疗效有着非常重要的现实意义。相对于其他力学研究方法,有限元模型在研究颈椎内部的压应力及张力等生物力学方面有着独特的优势。它能为研究者提供机体在不同状态下的应力、载荷、结构形变及运动稳定性等脊柱各方面生物力学状况定量及定性分析,在对颈人工椎间盘置换术后颈椎各个方面的力学情况变化进行测试和评估方面应用广泛。但到目前为止,关于颈人工椎间盘的不同高度选择对于患者术后颈椎生理参数变化及临床疗效的影响尚未得到明确的研究,置换节段的椎间高度变化对于异位骨化形成、活动度的影响目前也尚未明确。
  本研究拟将生物力学分析及临床应用相结合的方法,通过建立的全颈椎三维有限元模型,测试不同高度的颈人工椎间盘置换对于术后颈椎局部活动度、骨终板界面的压力分布及后方关节突关节关节囊的应力变化的影响,结合力学实验结果观察颈人工椎间盘置换术后的临床应用疗效、颈椎活动度的维持情况及术后手术节段异位骨化的情况,探讨颈人工椎间盘术后异位骨化的发生机制及其影响因素,为改善颈椎病治疗的疗效,优化颈人工椎间盘置换手术方案提供理论依据。
  研究方法与结果:
  第一部分 生物力学测试部分(三维有限元研究)
  第1节 正常人体全颈椎三维有限元模型的建立及其有效性验证
  一、材料与方法
  选择1位正常健康成人志愿者作为本实验研究原始数据来源的对象,将通过CT薄层扫描获得的原始数据导入硬盘,使用软件将像素提取并编辑,实施逆向重建,通过模拟计算建立C0-T1全颈椎三维有限元模型,并对其进行验证。
  二、结果
  该模型在各个方向上的活动度及力学特性与既往文献资料相符,通过模型验证。
  第2节 不同高度人工椎间盘的模型建立及生物力学分析
  一、材料与方法
  通过在前期建立的全颈椎三维有限元模型基础上建立5mm、6mm、7mm三种不同高度的DiscoverTM颈人工椎间盘置换模型,在1.5Nm的扭矩载荷条件下,比较不同高度的颈人工椎间盘假体置换对颈椎活动度、骨终板界面的压力分布及后方关节突关节关节囊等力学变化的影响。
  二、结果
  三种高度的颈人工椎间盘假体都能较好地维持并在不同方向和程度上增加置换节段的活动度。随着假体高度的增加,假体-骨终板界面在各个方向上的压力增加显著。与5mm为标准假体骨终板界面压力进行比较,在后伸位时,6mm假体上下骨终板界面压力分别增加了52%和260%,7mm高度假体则增加了242%和720%;在前屈位时,6mm假体上下骨终板界面压力分别增加了66%和142%,7mm高度假体则增加了247%和407%;在左侧方屈曲时,6mm假体上下骨终板界面压力分别增加了153%和31%,7mm高度假体则增加了537%和179%,与右侧屈曲结果相似。不同高度假体应力在骨终板界面上分布不均。三种高度的假体均以在后伸状态下的上方骨终板界面压力为最高,关节突关节压力也随着假体规格的改变而变化明显。
  第二部分 相关临床研究部分
  一、资料与方法
  通过对长征医院2009.01-2014.01期间本手术组接受颈人工椎间盘置换的84例患者、共108个置换节段进行术前术后临床疗效及影像学两方面随访评估。观察比较颈人工椎间盘置换术后的临床应用疗效、椎间高度、颈椎活动度的变化情况及术后手术节段发生异位骨化的情况,并按照McAfee骨化分级法将患者分为对节段活动度无影响组(0-1级)和有影响组(2-4级),对不同高度假体等异位骨化相关因素进行比较分析。
  二、结果
  在术后3年左右中期随访时间内,使用DiscoverTM假体进行颈人工椎间盘置换治疗颈椎病临床疗效良好,术后手术节段椎间高度较术前增加明显,异位骨化总发生率为66.7%,其中有2个节段出现4级异位骨化,20个节段出现3级异位骨化。大高度的假体有增加异位骨化发生的倾向性,但无统计学意义。不同级别异位骨化患者之间的临床疗效无显著性差异,而节段活动度有显著性差异。多节段手术、置换节段活动度大是产生异位骨化的高危因素。
  三、结论
  1.根据正常健康成人的CT扫描数据构建的全颈椎三维有限元模型能较好地模拟真实的活动度及力学情况,可以作为进一步开展生物力学研究的基础模型;
  2.使用不同高度规格的DiscoverTM颈人工椎间盘假体都增加了该节段的活动度,不同高度假体应力在骨终板界面上的分布不均。随着假体高度的增加,节段活动度、假体-骨终板界面在各个方向上的压力、邻近节段椎间盘压力也明显增大,后方关节突关节压力则先降低,再升高,不同高度规格颈人工椎间盘假体对局部节段的压力有较大影响。
  3.在中期随访时,DiscoverTM颈人工椎间盘置换治疗颈椎病安全、有效,异位骨化的发生与否、严重程度对临床疗效无明显影响,不同高度规格的假体之间的异位骨化发生率无显著性差异,多节段手术、置换节段活动度大是产生异位骨化的高危因素。
[硕士论文] 李海航
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:组织工程学为皮肤替代物的研究提供很好的方法,但目前遇到瓶颈难以解决。本研究围绕生物3D打印构建人工皮肤进行开展,研发一种可用于进行人工皮肤构建的生物型3D打印机,并进行体外的生物3D打印构建人工皮肤的初步探索。
  第一部分:生物型3D打印机研发与测试
  研究目的:研发一种可用于进行生物3D打印人工皮肤的生物型3D打印机,并对其进行稳定性测试。
  研究方法:为实现通过生物型3D打印机体外构建人工皮肤,课题组提出课题研究需要的生物型3D打印机设备的设计要求,并交由器械公司完成设备的制造。完成生物型3D打印机PrototypeSK00的制造后,通过3D Studio Max软件设计2种不同参数的三维模型(Cylinder001.stl和Cylinder002.stl)并通过RepetierHost软件解析成GOC文件,配置1%、2.5%和5%的海藻酸钠溶液,基于2种不同参数的模型和3种不同的打印成分测试5种不同内径的打印头(0.09mm,0.16mm,0.25mm,0.41mm和1.00mm)的运行情况。将成纤维细胞和表皮细胞消化形成细胞密度为1×108/ml DMEM悬液,将2种细胞经过不同内径的打印头的直接打印种植于12孔板中,检测经过打印操作后0h、6h、24h和48h的细胞存活率,对照组为直接通过微量移液枪将细胞种植于培养孔中。此外,为检测生物型3D打印机PrototypeSK00构建人工器官的稳定性,设计一个仿真鼻的三维模型并基于2.5%海藻酸钠和0.41mm打印头进行体外打印运行测试,对照为相同的三维模型在工业型3D打印机构建的聚乳酸人工鼻模型。
  研究结果:经课题组设计并完成制造生物型3D打印机-PrototypeSK00。运行检测过程发现基于0.09mm打印浓度较高的海藻酸钠溶液时,容易发生堵头现象。打印浓度较低海藻酸钠溶液时,总体积较大的模型在打印后期,容易发生水分蒸发导致前期构建的模型干燥坍塌而致使打印失败。成纤维细胞和表皮细胞经过打印操作后,0h-48h的细胞存活率最低95%,最高100%,与对照组无明显统计学差异。通过生物型3D打印机PrototypeSK00的仿真鼻能够与工业型3D打印机构建的人工鼻模型接近。
  研究结论:课题组研发了一种运行相对稳定的生物型3D打印机-PrototypeSK00,其运行过程无明显错误发生,经过其打印操作后细胞存活率与微量移液枪无差异,通过该打印能稳定运行体外构建高级人工结构。
  第二部分:应用于生物型3D打印机的皮肤“生物墨水”的研发与检测
  研究目的:研制一种能够在生物3D打印机使用的进行体外构建人工皮肤需要的作为支架成分的“生物墨水”。
  研究方法:将重组胶原蛋白与藻酸盐溶液混合灭菌形成“生物墨水”,对照品为不含胶原蛋白成分的藻酸盐溶液。将部分样品冻干形成固态进行扫描电镜检测观察材料的物理表征,并于流体旋转流变仪上进行样品的流体力学检测。以传代培养旺盛的成纤维细胞和表皮细胞为实验体系,检测“生物墨水”的细胞毒性。通过bal/bc裸鼠及SD大鼠的全层皮肤缺损模型检测该“生物墨水”修复创面的作用,第1、2、3、4周取病理,观察创面愈合情况、血管化情况、胶原残留情况及表皮爬行情况。
  研究结果:通过重组人胶原蛋白构建了一种孔隙均匀的具有高生物活性的胶原蛋白“生物墨水”,对表皮细胞及成纤维细胞无明显毒性。裸鼠的创面治疗实验证实了含有胶原蛋白的“生物墨水”能够有利于促进创面血管化、促进皮肤真皮层厚度恢复以及提高创面的胶原蛋白含量。
  研究结论:本部分的研究内容为通过应用重组人Ⅲ型胶原蛋白作为本课题使用的“生物墨水”材料,构建一种与皮肤的细胞外基质相接近的“生物墨水”,检测其生物毒性与创面治疗作用,其本身具有加速创面愈合和改善创面愈合质量作用,为构建生物3D打印人工皮肤做准备。
  第三部分:基于生物型3D打印机的人工皮肤的初步构建与检测
  研究目的:基于自主研发生物型3D打印机PrototypeSK00和研制的胶原蛋白“生物墨水”,结合成纤维细胞和表皮细胞,进行通过生物3D打印的方式初步探索体外模拟构建生物3D打印人工皮肤的试验,并对其进行初步的生物学评价。
  研究方法:以计算机3D Studio Max程序(Autodesk公司,美国)作为模型建立软件,建立了模拟人皮肤真皮层和表皮层的多层次三维模型数据。将成纤维细胞与表皮细胞混合入“生物墨水”中,进行模拟人体皮肤结构的体外3D打印,并立刻进行冰冻切片的方式结合HE染色观察其显微结构。通过转染EGFP基因序列成纤维细胞中,并以嘌呤霉素进行筛选构建能稳定表达EGFP蛋白的成纤维细胞,以该细胞体系为种子细胞体外3D打印构建多层结构,并在荧光显微镜下观察体外培养7天后的细胞状态。
  研究结果:基于生物型3D打印机和“生物墨水”成果完成人工皮肤的体外生物3D打印构建,冰冻切片后的HE染色观察,能够明显区分“真皮层”和“表皮层”。体外培养7天后,具有稳定表达EGFP的成纤维细胞的通过3D打印构建的多层结构证明成纤维细胞在“生物墨水”中存活良好,并且底层的细胞呈贴壁增殖。
  研究结论:通过生物3D打印的方式,以胶原蛋白“生物墨水”为支架,成纤维细胞和表皮细胞为种子细胞,能够在体外模拟皮肤的结构仿生构建人工皮肤。
[硕士论文] 徐铮
骨外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  髋部骨折是老年人最常见损伤之一,其预后效果差,老年髋部骨折患者预后不良与术后并发症发生率高有关,骨折后1年内致残率超过50%,死亡率高达36%。目前的治疗方案虽然强调早期手术固定以及功能康复锻炼,但致死率、致残率仍高居不下。近些年发现,老年髋部骨折后出现的高致残率、高死亡率与骨折后机体出现的免疫炎症紊乱有着密切的关系!因此,在外科治疗的同时,纠正老年髋部骨折患者机体内出现的免疫功能紊乱状态,将会是解决这一问题的关键。而骨髓间充质干细胞具有很强的抗炎作用、组织修复及免疫调节功能,在许多与免疫炎症相关疾病的治疗过程中已取得了很大成功,但是对老年患者创伤后免疫功能调节目前尚无相关报道。骨髓间充质干细胞是一类高度异质性的细胞群,而以往对异质性的细胞群体的认识都是停留在群体水平上面。因此,更加系统而全面韵认识和探索各亚群之间的构成,找到真正有意义的亚群/亚群比例(与免疫调节有关系)是十分必要的。近年来,单细胞转录组测序技术的发展为异质性细胞群体在单细胞水平方面的研究上奠定了重要基础。
  研究目的:
  通过单细胞转录组测序技术分析老年髋部骨折患者骨髓间充质干细胞的异质性,找出不同的亚群,并且分析各个群的功能;对于每个细胞亚群,将该亚群与其他所有亚群做差异分析比较,获得每个亚群差异高表达的基因,作为亚群的特征基因;在每群特异性表达的基因里通过数据库分析找到特异性表达的基因与哪些疾病相关;找到与免疫调节有关的亚群/亚群比例,为后期通过干细胞治疗降低老年髋部骨折患者术后并发症打下坚实的基础。
  研究方法:
  1、选取一例股骨粗隆间骨折需行手术治疗的患者,在术中扩髓过程中用注射器抽取约10ml骨髓,置于无菌袋中立即送入实验室。
  2、将骨髓间充质干细胞混合液进行分离、培养,待细胞生长至80%时进行融合,随后进行传代培养,获取第二代MSCs。
  3、采用流式细胞荧光分选技术对获得的第二代MSCs进行鉴定,并进行成骨、成软骨、成脂肪方向分化,确定为骨髓间充质干细胞。
  4、对第二代MSCs进行细胞消化,使细胞量达到1000个/ul,体积100ul,并溶于PBS中,置于无菌袋中送至北京博奥晶典生物技术有限公司进行单细胞基因测序及亚群分析。
  研究结果:
  扩髓过程中抽取的老年患者骨髓按照一定方法可培养出来骨髓间充质干细胞;培养出来的骨髓间充质干细胞在第二代时细胞形态、贴壁性最好;第三代时即出现增殖不明显,贴壁性不好;第四代时细胞已不再增殖;培养出来的骨髓间充质干细胞表达为CD90(+)、CD105(+)、CD29(+)、CD44(+),CD34(-)、CD45(-)、HLA-DR(-);培养出来的骨髓间充质干细胞混悬液可分为10个亚群,10个亚群之间的相关性较好,每个群的比例各不相同,功能不尽相同。
  研究结论:
  用单细胞测序技术对老年髋部骨折患者骨髓间充质干细胞进行亚群分析是可行的;不同细胞亚群决定细胞性质;每个群的特异性差异表达top20基因在功能上不尽相同,差异表达的top20基因与体内许多疾病相关。
[硕士论文] 董浩
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:利用基因芯片技术分析小鼠草酸钙肾结晶模型的基因表达谱的变化,筛选出有研究价值的目的基因,并进行初步的临床验证,再通过动物及细胞学实验检测目的基因的表达变化,及其对肾小管上皮细胞凋亡的影响,并探索其在草酸钙肾结晶形成中的作用和机制。
  方法:通过乙醛酸腹腔注射,构建小鼠草酸钙肾结晶模型,Von Kossa染色检测小鼠肾脏组织钙盐沉积情况。再通过基因芯片技术分析模型组肾脏组织基因谱的变化并筛选出目的基因;分别收取肾结石患者肾脏组织和肾癌根治患者正常部位肾脏组织标本,利用电镜扫描观察患者肾小管上皮细胞的微观结构,并用免疫组化检测患者肾脏组织目的基因的表达差异。再次构建小鼠草酸钙肾结晶模型,利用qPCR和Western blot检测小鼠肾脏组织目的基因的表达水平,HE染色和TUNEL凋亡实验分别检测小鼠肾脏组织细胞的微观结构改变和细胞凋亡情况,用免疫组化检测目的基因在小鼠肾脏组织的表达及利用Western blot检测凋亡相关蛋白水平。用一水草酸钙晶体刺激肾小管上皮细胞,构建草酸钙晶体刺激的细胞模型,同时构建PANK1过表达和PANK1-siRNA慢病毒,免疫荧光检测细胞感染情况,Western blot检测细胞水平目的基因的表达及细胞凋亡情况,qPCR检测下游相关蛋白的表达变化。
  结果:成功构建了小鼠草酸钙肾结晶模型,Von Kossa染色显示模型组肾脏组织切片均有明显的钙盐沉积;基因芯片筛选出结晶模型中下调最明显的目的基因PANK1(p<0.05);扫描电镜结果显示,草酸钙肾结石患者肾脏超微结构较对照组发生了明显的损伤和凋亡性改变;免疫组化结果显示,草酸钙肾结石患者肾脏组织中PANK1的表达水平明显低于对照组。在小鼠模型中,qPCR结果显示,模型组小鼠肾脏组织的PANK1mRNA水平显著低于对照组(p<0.05);Western blot显示模型组小鼠肾脏组织中的PANK1蛋白的水平相对于对照组也显著下调;免疫组化结果显示,模型组小鼠肾脏组织PANK1的表达也明显降低,且PANK1的表达主要集中在肾小管上皮细胞中;HE染色和TUNEL检测结果显示,相对于对照组,模型组小鼠肾脏组织细胞发生明显的凋亡性改变,且凋亡主要发生在肾小管上皮细胞中;Western blot结果显示,模型组小鼠肾脏组织的促凋亡蛋白Bax水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。在草酸钙晶体细胞模型中,Western blot结果显示,草酸钙结晶刺激后,肾小管上皮细胞内PANK1的表达水平显著下调。流式细胞仪结果显示,相对于对照组,结晶刺激组的细胞凋亡水平明显增高;成功构建PANK1过表达和PANK1-siRNA慢病毒并感染细胞后,流式细胞仪检测结果发现,PANK1过表达组细胞凋亡水平明显降低,而PANK1-siRNA组凋亡明显增加;qPCR结果显示,与能量代谢凋亡相关的信号通路中,下游蛋白SIRT3和FOXO3a的表达水平与PANK1的表达呈正相关。
  结论:草酸钙结晶刺激会下调肾小管上皮细胞内PANK1的表达,PANK1对肾小管上皮细胞的损伤和凋亡起到调控的作用。PANK1可能通过影响细胞能量代谢,激活能量感受器,并影响下游关键蛋白SIRT3的表达变化及转录因子FOXO3的转录活性,从而调节肾小管上皮细胞的凋亡,并促进草酸钙肾结晶的形成。
[硕士论文] 罗盛昌
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:自从1996年脊柱外科领域权威杂志《SPINE》上发表关于腰痛作为人类世纪难题的文章,腰痛也越来越引起大家的重视,椎间盘变性引起的慢性背痛和颈肩痛是威胁人类健康的严重问题,目前没有有效的治疗方法。慢性腰背部疼痛是造成劳动力丧失的常见原因。对于严重的椎间盘退行性病变的患者,目前主要采用手术治疗为主的治疗方法:腰椎间融合,人工椎间盘置换术,微创髓核摘除术等。手术治疗可以一定程度的减轻患者的症状,但手术合并很多并发症,例如相邻节段椎间盘退变加重,椎间隙感染等,这常常需要进一步的外科手术。虽然手术可以减轻临床症状,但既不阻止变性的进展,也不能恢复椎间盘(Intervertebral disc,IVD)的天然功能状态。基于上述外科干扰的情况和限制,因此,在探寻椎间盘退变机制及寻求无创治疗的研究一直并未停止。
  椎间盘退变是复杂的多因素过程,虽然做了长期大量的研究工作,其确切机制并未完全了解。当前研究以炎症通路为主,大量研究表明退变的椎间盘细胞能产生炎性介质,包括:TNF-α,IL-1α/β,IL-6,IL-10和IFN-γ等等。这些因子导致炎症级联反应促进基质降解,趋化因子的产生和细胞表型的改变。由此导致了基质成分分解和合成之间出现严重不平衡最终导致椎间盘退变。炎症因子对椎间盘细胞的作用并不存在疾病特异性,具有的局限性,转化效益差等
  椎间盘是人体中最大的无血管组织。椎间盘由内层的富含水和胶原的髓核和外层富含纤维的纤维环两部分组成。椎间盘退变的特征在于细胞外基质中主要成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的含量明显较少,直接导致与水结合能力的降低,椎间盘含水量减少,髓核细胞数量减少,被成纤维细胞样表型的细胞的替换。椎间盘作为特殊的软骨组织,其退变过程可能与骨化相关基因有着密切的联系。
  课题组在前期研究中已经发现有报道关于骨化相关基因RUNX2能够引起椎间盘退变。TWIST作为骨化相关基因的重要一员,参与早期抑制RUNX2调控成骨细胞化。基于上述内容,我们推测在椎间盘退变中,TWIST基因也起着至关重要的作用。
  第一部分:TWIST基因在髓核组织中的表达
  目的:研究TWIST基因在人髓核组织中的表达情况。
  方法:(1)利用GEO数据库,生物信息学筛选椎间盘退变中骨化相关基因。(2)收集2016年3月-2017年6月因腰突症于我院行腰椎手术的患者的椎间盘标本,根据磁共振Pfirrmann分级系统,Ⅰ-Ⅱ级为轻度退变对照组,Ⅲ-Ⅴ级为重度退变退变组。共采集患者标本32例,其中对照组12例,退变组20例。对收集的椎间盘组织进行鉴定。(3)对椎间盘组织细胞针对筛选的骨化相关基因进行免疫组化。(4)椎间盘组织RNA提取及验证,通过实时定量PCR的检测方式明确骨化基因在椎间盘退变中的表达。
  结果:(1)骨化相关IBSP、ENPP、OPN等在椎间盘退变网路中存在,提示骨化相关基因在椎间盘退变中可能具有重要地位。(2)经组织学鉴定,椎间盘退变程度与Pfirrmann分级一致,分组合理。(3)组化显示成骨相关基因均呈不同程度的上调,而骨化抑制相关基因中TWIST1及TWIST2能够随着退变逐渐下调。(4)通过椎间盘髓核组织的RNA检测结果显示TWIST1及TWIST2确实如组化所示在退变中出现明显下调。
  结论:我们利用GEO数据库、椎间盘标本免疫组化、椎间盘组织RNA提取与验证对退变椎间盘中骨化基因进行检测,明确骨化相关基因在退变椎间盘中异常表达,TWIST1及TWIST2在退变椎间盘中明显下调。
  第二部分:TWIST基因在人髓核细胞退变过程中的作用
  目的:研究TWIST基因在人髓核细胞中的表达情况。
  方法:(1)收集2016年5月-2017年7月因脊柱外伤或脊柱侧弯等患者的Pfirrmann分级Ⅰ-Ⅱ级的椎间盘组织,进行原代人髓核细胞培养。(2)通过TWIST1及2基因全长PCR将TWIST表达CDS区纯化、克隆入表达载体,并于髓核细胞中利用转染试剂进行TWIST1及2基因的过表达,构建TWIST的过表达及干扰载体。(3)利用炎症因子IL-1β与TNF-α进行体外髓核细胞的炎性刺激,构建体外髓核细胞退变模型。(4)通过转染TWIST1/TWIST2过表达及干扰载体于髓核细胞中,培养24h后通过Real-time PCR检测处理后髓核细胞ECM降解相关MMP、ADAMTS的表达情况明确退变情况。(5)同上处理后通过Western Blot检测处理后髓核细胞ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。
  结果:(1)通过原代培养髓核组织,成功建立体外髓核细胞系6株。(2)检测细胞TWIST1及2的表达发现确实出现上调,提示过表达及干扰载体构建成功。(3)通过检测发现刺激后髓核细胞CHSY、ACAN、Ⅱ型胶原等基质相关基因表达减少,基质降解相关MMP、ADAMTS表达显著增加,体外模型构建成功。(4)过表达TWIST1及2基因,髓核细胞CHSY、ACAN、Ⅱ型胶原等基质相关基因表达较对照组显著增加,基质降解相关MMP、ADAMTS表达显著减少。
  结论:我们通过髓核细胞原代培养、构建TWIST过表达载体、构建体外退变模型、转染过表达载体等方法,明确TWIST基因在体外确实具有抑制椎间盘退变,保护椎间盘的作用。
  第三部分:TWIST基因保护椎间盘退变的机制研究
  目的:研究TWIST基因保护椎间盘退变的机制研究。
  方法:(1)构建RUNX2过表达及干扰载体。(2)于人髓核细胞中过表达RUNX2基因并检测ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。(3)利用共转染的方式将TWIST与RUNX2于退变髓核中共表达,检测ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。(4)构建RUNX2启动子双荧光报告载体,检测TWIST过表达后RUNX2启动子的活性情况。
  结果:(1)成功构建RUNX2过表达及干扰载体。(2)RUNX2过表达后髓核基质合成相关ACAN、COL2A1等基因出现显著下调,提示其具有促进退变发生的作用。(3)共转染TWIST与RUNX2于退变髓核后,RUNX2基因引起的促退变效应出现一定程度上的缓解。(4)利用双荧光素酶报告基因检测过表达TWIST后对RUNX2下游功能的影响,发现TWIST能够显著抑制RUNX2的活性。
  结论:我们通过构建RUNX2过表达及干扰载体、共转染TWIST与RUNX2、双荧光素酶报告基因检测等方法,进一步明确TWIST制椎间盘退变,保护椎间盘的作用主要是通过抑制RUNX2的活性来实现的。
[硕士论文] 阮梦娜
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  慢性肾脏病(CKD)患者肾功能逐渐减退,通常伴随大量代谢产物的蓄积,其中有多种物质具有生物活性,影响机体及细胞的功能,其表现称之为尿毒症症状,而引起这些症状的相关物质称其为尿毒症毒素。欧洲尿毒症毒素工作组(EUTox)将目前已证实的尿毒症毒素建立了数据库(EUTox Database),截止2012年共计有146种尿毒症毒素。对于CKD患者,肾脏无法彻底清除潴留的尿毒症毒素,故需要肾脏替代治疗包括肾移植,血液透析及腹膜透析(PD)发挥清除作用。迄今为止,仍有诸多研究者致力于识别更多的尿毒症毒素,并证实其作用机制。
  通常将尿毒症毒素根据分子大小,水溶性或脂溶性,是否能被透析清除等特性分为三大类:(1)小分子水溶性毒素,分子量<500Da,如肌酐、尿素氮等;(2)蛋白结合毒素(PBUT),分子量通常<500Da;(3)中分子毒素,通常包括一些小分子多肽。也有按照产生部位的分类方法,如肠源性或非肠源性毒素。而PBUT指大部分为与蛋白结合的小分子毒素,如硫酸吲哚酚(IS)、硫酸对甲酚(PCS),也包括少量蛋白结合的中分子毒素,且PBUT多在肠道内产生。目前已知的PBUT总计10大类,32种。随着研究的深入,越来越多的证据表明,PBUT直接或间接地对心、脑、肾等重要脏器造成严重损害。
  通过文献检索,选用超高效液相色谱/质谱-电喷雾电离串联(UHPLC-ESI-MS/MS)技术,拟对包括硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS),马尿酸(Hippuric acid,HA),对羟基马尿酸(p-hydroxyhippuric acid,p-OH HA),犬尿喹啉酸(Kynurenic acid,KYNA),3-羧-4-甲-5-丙基呋喃戊酮酸(3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropionic acid,CMPF)等进行检测及探讨,证实上述研究对象在PD患者中血清浓度异常,探讨可能影响PBUT浓度的相关因素,最后对患者进行随访,探究PBUT是否会影响PD患者长期预后。
  目的:
  本试验研究主要分为三部分,研究目的为:1证实健康志愿者、CKD4-5期未透析患者及PD患者三类人群PBUT(IS、HA、p-OH HA、KYNA、CMPF)浓度差异;2.在腹膜透析患者中,对血清PBUT影响因素进行分析;3.探究蛋白结合毒素对PD患者长期预后的影响。通过以上研究,明确肾功能不全的患者可导致蛋白结合毒素在体内的蓄积,拟探究对血清蛋白结合毒素浓度的影响因素,并探讨PBUT对腹膜透析患者长期预后的影响。
  方法:
  (一)健康志愿者、CKD4-5期未透析患者及PD患者三类人群血清蛋白结合毒素浓度差异
  招募海军军医大学上海长征医院腹透中心2016年1月至2016年12月期间符合入选标准PD患者(n=50),性别比例男∶女=1∶1,排除年龄大于75岁或小于18岁,腹膜透析维持时长小于1个月,合并血液透析患者,1月内发生腹膜炎或合并其他感染性疾病,处于自身免疫性疾病活动期,合并恶性肿瘤,近1月内发生心血管事件的患者。收集同时间段至长征医院肾内科住院诊治,病情稳定的慢性肾脏病患者(n=50)(根据EPI公式计算eGFR值),收集两类患者血清标本,测定血清蛋白结合毒素浓度。同时至长征医院体检中心招募50例健康志愿者,收集血清标本按上述方法处理作为对照组。三组研究对象均签署知情同意书。本临床试验已通过海军军医大学上海长征医院生物医学研究伦理委员会审批,批件编号2014SL027。选择超高效液相色谱/质谱-电喷雾电离串联(UHPLC-ESI-MS/MS)技术同时检测样本血清中7种PBUT的浓度。分析三组人群血清PBUT浓度差异。计量资料以均数±标准差((x)±SD),中位数(第一四分位数,第三四分位数)表示,选用SPSS21.0软件进行统计分析,三组计量数据服从正态分布并方差齐性的前提下,组间两两比较采用LSD-t检验,不满足上述条件的,选用Kruskal-Walhs H检验检验,组间两两比较采用nemenyi法检验。计数资料采用频数描述,计数资料组间比较采用Fisher确切概率检验。P<0.05为差异有统计学意义。
  (二)腹膜透析患者多种血清蛋白结合毒素影响因素分析
  2016年1月至2017年7月,招募上海长征医院腹透中心符合入选条件的PD患者进行研究。研究对象是慢性肾衰竭维持性腹膜透析治疗的患者,排除年龄小于18岁或超过75岁,要求腹透维持时间超过1个月,不合并血液透析治疗。同时排除有慢性自身免疫性疾病活动期或活动性感染;哺乳期或妊娠期;合并晚期恶性肿瘤;既往1个月内发生过心脑血管事件的患者。所有参与研究的患者均要求签署知情同意书。收集患者各项临床资料,血检验结果等。收集血清标本,采用UHPLC-ESI-MS/MS法检测血清标本中IS、HA、p-OH HA、KYNA、CMPF浓度,分析血清PBUT浓度与性别、残余肾功能、小分子毒素、腹透充分性、腹膜转运性质,营养及炎症指标CRP等之间的关系。计量资料以均数±标准差((x)±SD),中位数(第一四分位数,第三四分位数)表示,选用SPSS21.0软件进行统计分析,对于未满足双变量正态分布的数据,单因素相关性分析采用Spearman等级相关,多因素分析采用多重线性回归分析方法。P<0.05为有统计学意义。
  (三)蛋白结合毒素影响腹膜透析患者预后的队列研究
  按上述第二部分纳入、排除标准,招募PD患者242人,按上述要求留取患者血清标本,行PBUT浓度检测。按PBUT浓度水平分为高浓度及低浓度两组,并对其进行随访。设定终点事件为发生心脑血管事件,腹透相关性腹膜炎。研究终点时间为2018年2月10日,时间度量单位为天。采用SPSS21.0软件行Kaplan-Meier检验,绘制生存曲线。两组生存曲线比较行Log-rank检验。检验水准(α)为0.05,P<0.05差异有统计学差异。
  结果:
  (一)健康志愿者、CKD4-5期未透析患者及PD患者三类人群血清蛋白结合毒素浓度差异
  健康志愿者年龄54.38±8.95岁,慢性肾脏病患者年龄5822±10.30岁,PD患者年龄为55.14±13.09岁。三组之间年龄无统计学差异。健康志愿者组:IS170.88(79.17,398.06)ng/ml,HA101.19(52.99,266.68)ng/ml,p-OH HA5.94(0.00,36.72)ng/ml,KYNA1.15(0.00,4.34)ng/ml,CMPF166.05(119.53,279.37)ng/ml;CKD患者:IS7922.58(2650.39,14589.39)ng/m1,HA1163.51(363.17,3200.91)ng/ml,p-OH HA222.47(100.43,714.56)ng/ml,KYNA75.04(36.48,180.32)ng/ml,CMPF1789.04(803.39,3557.57)ng/ml;PD患者:IS26554.56(7282.30,55338.06)ng/ml,HA4203.98(1350.10,17691.15)ng/ml,p-OH HA1730.12(47852,3695.43)ng/ml,KYNA252.16(134.12,444.34)ng/ml,CMPF730.14(390.81,1448.12)ng/ml。健康志愿者分别与CKD患者及PD患者比较血清PBUT浓度,有统计学差异。CKD患者及PD患者,比较IS、HA、p-OH HA、KYNA血清浓度,P<0.05,差异有统计学意义。
  (二)腹膜透析患者多种血清蛋白结合毒素影响因素分析
  共有122例PD患者入组,年龄48.61±15.24岁,其中女性42例(344%),透析龄18.53±26.99个月。PD患者血清IS21371.31(10875.88,46991.80)ng/mL,HA4049.45(1350.10,16299.32)ng/mL,p-OH HA1607.74(657.72,3319.72)ng/mL,KYNA257.41(137.74,466.40)ng/mL,CMPF845.30(376.78,1588.37)ng/mL。血清IS与透析龄、腹膜Kt/V、腹膜Ccr、BUN、Scr、P、CaP乘积正相关,与总Kt/V、残肾Kt/V、总Ccr、残肾Ccr、残肾eGFR、AST、Na、HDL呈负相关。
  结论:
  1.肾功能异常患者血清蛋白结合毒素明显高于健康志愿者。同时PD患者的血清多种蛋白结合毒素与慢性肾功能不全未透析患者比较,浓度存在差异,考虑腹膜透析对PBUT浓度有影响。
  2.蛋白结合毒素IS、HA、p-OH HA、KYNA与小分子毒素(BUN、Scr)、磷代谢指标(P、CaP乘积)呈正相关,与残肾功能(Kt/V、Ccr、eGFR)、总Kt/V、总Ccr呈负相关。而与WBC、PLT,CRP,Ca、PTH等指标无相关性。而蛋白结合毒素CMPF与腹膜功能、残肾功能无相关性。以上数据提示PBUT主要依靠残肾功能清除,腹膜具有部分清除能力,保护残肾功能有利于PD患者清除血清PBUT。
  3.蛋白结合毒素IS、HA、p-OH HA、KYNA对PD患者长期预后无影响。
[硕士论文] 沈毓
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:主动脉夹层(Aortic dissection,AD)近端裂口治疗后,远端裂口是否需要处理,一直是临床医生和患者关注的问题。临床上,大部分B型主动脉夹层(Type B aortic dissection,TBAD)患者经腔内治疗封闭近端裂口后,远端通常可保守观察,但也有患者会出现远端主动脉扩张(Distal aortic expansion,DAE)、甚至破裂。因此,越来越多的研究者提出仅治疗近端裂口远远不够。按照远端残余裂口的处理难度,我们将其分为三段,支架以远胸降主动脉段、腹主动脉分支区段以及肾下腹主动脉段。其中胸降主动脉及肾下腹主动脉的裂口可以通过覆膜支架进行隔绝。根据文献资料及本科室病例收治经验总结,远端裂口涉及腹主动脉分支区占到了49%~88%,而腹主动脉分支区由于分支血管的存在,导致治疗变得复杂而困难。既要隔绝裂口,又要保证分支的通畅,付出的代价高,风险大。目前国内外针对腹主分支区裂口的治疗方式主要有:分支、开窗技术,复合手术、封堵器、多层裸支架、裸支架联合弹簧圈等方法。但由于技术难度大、并发症率高等问题,难以广泛开展。
  目的:1.了解胸主动脉腔内修复术(Thoracic endovascular aortic repair,TEVAR)后远端主动脉扩张的发病情况,分析引起远端主动脉扩张的危险因素,为治疗、随访提供经验指导。2.完成体外实验,验证带圈支架裂口封堵器植入操作的可行性,并进一步优化结构设计及规范操作流程。3.构建形态学相似,血流动力学相符的夹层动物模型,完成带圈支架裂口封堵器植入,初步探讨带圈支架裂口封堵器治疗腹主动脉分支区夹层裂口的安全性和有效性。
  方法:1.通过调查本中心1999年4月至2016年10月期间初诊入院的B型主动脉夹层患者行腔内隔绝术后随访期间支架远端主动脉扩张情况,回顾性研究分析发生远端主动脉扩张的危险因素,为远端残余裂口的治疗和随访提供线索。2.根据研究目的,构建适合用于器具研发的累及肾动脉的腹主动脉夹层体外模型。完成带圈支架裂口封堵器体外模拟释放,并进一步对输送系统结构和装配方式进行改良、对释放操作规范进行优化。3.构建一种形态学相似、血流动力学相符的腹主动脉夹层动物模型,近端累及肾动脉开口,远端位于髂动脉分叉近端。在动物模型中植入带圈支架裂口封堵器,随访观察1个月,通过CT血管造影(Computed tomography angiography,CTA)观察假腔(False lumen,FL)血栓化变化、主动脉直径变化、分支血管通畅情况,明确其治疗效果,从而分析其安全性及有效性。
  结果:1.一共333例患者纳入研究,随访期间共70名患者在TEVAR术后发生远端主动脉扩张,发生率21.02%,平均发生在术后51.18±15.05月。经多因素分析,认为术后未血栓化长度、胸降主动脉剩余裂口数、术前最宽主动脉直径、Ⅲ型主动脉弓是术后远端主动脉扩张的独立危险因素,而无吸烟史、使用限制性裸支架、腹主动脉剩余裂口数是保护性因素。2.利用石英及硅胶分别定制一套适用于器具研发的近肾动脉腹主动脉夹层模型,通过对带圈支架裂口封堵器及其输送系统的设计改进,实现了裸支架与弹簧圈的链接,解决了带圈支架裂口封堵器装配过程中弹簧圈与裸支架易缠绕问题,成功完成带圈支架裂口封堵器体外释放。3.对18例动物进行腹主动脉夹层建模实验,其中2例术中出现呼吸心跳骤停,动物死亡。建模成功16例,2例于术后3天复查CTA,假腔内完全血栓化,其余14例近远端裂口间假腔保持通畅。于剩余14例动物模型植入带圈支架裂口封堵器,其中1例在释放过程中因弹簧圈与支架缠绕,导致支架变形,牵拉至近端裂口撕裂,裂口填塞效果不佳。手术成功13例,成功率92.86%。术后1个月随访发现,带圈支架裂口封堵器植入后主动脉夹层最宽处直径减少,真腔(Truth lumen,TL)短径增大,假腔短径减少,假腔内血栓化效果明显,肾动脉通常率100%,达到预期疗效。
  结论:B型主动脉夹层行TEVAR术后发生远端主动脉扩张的发病率较高,危险性较大。因根据远端主动脉扩张的危险因素并存情况结合临床经验对远端残余裂口采取及时有效的干预,避免主动脉相关不良事件的发生。治疗上,由于腹主动脉分支区夹层裂口累及重要分支血管,传统的腔内方式存在局限性。采用带圈支架裂口封堵器能够准确封堵裂口,促进假腔内血栓化形成,同时保持分支血管通畅,为治疗累及腹主动脉分支区夹层裂口提供了新的方法选择,值得进一步研究和推广应用。
[博士论文] 吴卉乔
外科学(骨外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 Nampt参与介导椎间盘退变过程
  背景:
  腰痛在临床上极为常见,超过80%的人一生某个时间中将受到下腰痛的困扰,是目前导致人类残疾的首要原因。椎间盘退变及其继发疾病的一系列相关疾病是导致腰痛最重要的病因。研究证实,椎间盘退变伴随炎症因子表达增加,炎症反应是介导椎间盘退变最重要的病理生理过程,炎症因子或介质不仅能诱导细胞外基质分解酶表达增加、降低细胞外基质合成基因表达、还能诱导神经血管长入,从而引发椎间盘退变及疼痛。
  烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又称内胀脂肪素(Visfatin)和前B细胞克隆增强因子(PBEF),在1994年被首次发现。Nampt在有机体内广泛存在,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的限速酶,研究表明,Nampt具有类炎症细胞因子样作用,参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,在免疫调节、炎症反应、代谢等相关疾病中均发挥重要作用。研究已证实Nampt可通过促炎作用介导细胞外基质降解,参与骨关节炎、类风湿关节炎等疾病的发生。但Nampt在椎间盘退变中的作用目前尚无文献报道,考虑椎间盘退变与骨关节炎、类风湿关节炎具有相似的病理生理机制,本研究拟对Nampt在椎间盘退变中的具体作用机制进行探讨。
  目的:
  1、探讨Nampt在椎间盘退变过程中的表达;
  2、探讨阻断Nampt对椎间盘细胞外基质代谢的影响。
  方法:
  1、获取因腰椎滑脱、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出症需手术治疗患者的椎间盘组织(50例),按Pfirrmann分级分组,退变等级Ⅱ级和Ⅲ级为轻度退变组,退变等级Ⅳ级和Ⅴ级为重度退变组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(WesternBlot)和免疫荧光法检测Nampt在不同退变等椎间盘标本中的表达。
  2、获取椎间盘标本后,采用酶消化法消化、培养髓核细胞,给予不同浓度IL-1β干预48小时或给予IL-1β(10ng/mL)干预不同时间后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,采用NAD活性检测试剂盒检测干预后髓核细胞NAD的活性。
  3、采用Nampt酶活性抑制剂APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  4、采用IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞后联合IL-1β(10ng/mL)共干预髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、以及MMP-3和MMP-13的表达差异;采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞合成相关基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  5、构建三种shRNA质粒敲除载体(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)转染髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  6、采用空质粒颗粒Src、shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#预先转染髓核细胞后,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,细胞免疫荧光检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  结果:
  1、本研究纳入的50例标本中,轻度退变等级26例,重度退变等级24例;qRT-PCR检测结果显示重度退变组Nampt在mRNA表达水平显著高于轻度退变组;蛋白印迹法和免疫组化结果显示重度退变组Nampt在蛋白表达水平也显著高于轻度退变组。2、不同浓度IL-1β干预后检测发现Nampt在mRNA水平和蛋白水平表达均随着IL-1β干预浓度增加而增加,呈剂量依赖性;且IL-1β干预不同时间后也发现Nampt表达随着干预时间延长而逐步增加,呈时间依赖性。
  3、APO866干预细胞后,Nampt表达不变,且APO866并不影响IL-1β诱导Nampt表达上调的作用;但APO866可显著降低髓核细胞中NAD活性,且可显著抑制IL-1β上调NAD活性的作用。
  4、IL-1β干预可显著上调细胞外基质分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的表达,且显著下调细胞外基质合成基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;而APO866并不影响这些基因的表达,但可显著抑制IL-1β上调ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的作用,以及抑制IL-1β下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用。
  5、三种质粒载体均可显著敲除髓核细胞中Nampt基因表达,无论mRNA层面还是蛋白层面,且可显著抑制细胞NAD活性。
  6、Nampt敲除后并不影响ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用,但shRNA1#和shRNA3#转染后可显著逆转IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调作用,且显著逆转IL-1β对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分解的作用。
  结论:
  1、椎间盘退变过程中伴随Nampt表达增加,且Nampt表达水平与椎间盘退变严重程度呈正相关,说明Nampt参与介导椎间盘退变过程。
  2、IL-1β具有诱导Nampt表达上调的作用,且抑制Nampt酶活性或敲除Nampt均可显著抑制IL-1β对细胞外基质分解的作用,说明IL-1β可能通过诱导Nampt介导椎间盘细胞外基质分解,从而诱导椎间盘退变,且阻断Nampt具有逆转椎间盘退变的作用。该研究为为椎间盘退变及腰痛的治疗提供新思路和新策略。
  第二部分 APO866诱导细胞自噬延缓椎间盘退变的作用及机制
  背景:
  自噬是哺乳动物体内细胞的一种分解代谢方式,在细胞代谢增加或在缺氧、营养匮乏等应激条件下,细胞将通过自噬机制,将受损的细胞器或蛋白等物质转运至自噬溶酶体中进行降解。细胞自噬是细胞发育和存活的重要途径,自噬持续时间过久或程度过强,超出细胞自身调节能力,将导致细胞代谢紊乱甚至凋亡等变化,因此细胞自噬对于维持细胞稳态具有重要作用。目前研究已证实,自噬与多种疾病的发生发展均密切相关,如炎症及免疫性疾病、神经及心血管系统疾病、以及癌症等。椎间盘退变与细胞衰老、缺氧、营养匮乏等具有紧密联系,椎间盘细胞凋亡、衰老或功能减弱是导致椎间盘退变的主要原因。近年来,研究发现细胞自噬也参与椎间盘退变过程,且大多数情况下对椎间盘退变起到保护作用。
  Nampt参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,既往研究表明,APO866可诱导细胞自噬,在缓解急性肝损伤以及抑制肿瘤方面发挥重要作用。然而,APO866是否具有诱导髓核细胞自噬及其在椎间盘退变中的作用目前尚不明确。
  目的:
  1、探讨APO866诱导髓核细胞自噬的作用
  2、探讨APO866通过细胞自噬拮抗IL-1β对椎间盘细胞外基质降解的作用。
  方法:
  1、体外培养髓核细胞,采用不同浓度APO866(0、1、5、10、20、100nmol/L)干预48小时后、或采用APO866 (10nmol/L)干预不同时间(0、24、48、72、96h)后,CCK-8法检测细胞活性、单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  2、米用自噬抑制剂3-MA、或烟酰胺单核苷酸(NMN)、或人重组Nampt(rNampt)预处理髓核细胞,再辅助IL-1β干预与不干预,单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  3、髓核细胞单独给予IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866预干预2小时后给予IL-1β共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA(10mmol/L)和IL-1β(10ng/mL)共处理48小时,无干预髓核细胞作为对照。qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况;Tunel检测细胞凋亡情况。
  结果:
  1、APO866干预浓度达到20nmol/L以上时,髓核细胞活性显著下降。MDC染色发现髓核细胞自噬小体形成数量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。蛋白印迹检测发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性,且APO866干预48h时表达量达到峰值。细胞免疫荧光检测显示LC3蛋白阳性的自噬体膜含量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。
  2、自噬抑制剂3-MA可显著抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。NMN和rNampt干预同样可抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。
  3、自噬抑制剂3-MA并不能影响IL-1β对Nampt的诱导作用;APO866抑制IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调的作用被3-MA显著逆转;APO866抑制IL-1β降解蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用被3-MA显著逆转;APO866具有拮抗IL-1β诱导髓核细胞凋亡的作用,而这一作用被3-MA所逆转。
  结论:
  Nampt酶活性抑制剂APO866具有诱导髓核细胞自噬的作用,且通过自噬作用可显著逆转由IL-1β介导的髓核细胞外基质分解作用。提示APO866有望成为治疗椎间盘退变新的分子靶点及药物。
[硕士论文] 张永存
外科学(烧伤外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在烧伤病人的救治工作中,皮肤移植和削痂是非常重要的基础治疗技术。皮肤移植不仅可以修复烧伤创面,亦广泛的应用于创伤、糖尿病溃疡、压疮、皮肤肿瘤以及疤痕切除后皮肤损伤的修复。随着负压封闭引流等技术的应用拓展,越来越多采用游离皮片进行创面修复,皮片种类包括刃厚皮片、中厚皮片、全厚皮片、含真皮下血管网皮片。皮片的厚度和创面修复的效果密切相关,合适的厚度不仅能很好契合创面修复需要,而且对供皮区损伤控制在最小程度,避免临床上主要依靠医生经验取皮所导致的厚度控制不佳,出现皮片过薄满足不了创面修复的需求,或者皮片过厚加重了供皮区损伤,以及疤痕形成、色素沉积、瘙痒、疼痛等问题。类似的问题在烧伤创面处理中并不少见,按烧伤经典的三度四分法,一度到浅二度可自愈,三度一般需要切削痂植皮治疗,这些在治疗上都是明确的,唯深二度烧伤的治疗存在较大的困惑,深二度烧伤深及真皮乳头层以下,没有损伤真皮全层,进一步可细分偏浅、偏深等深二度,同薄中厚皮片、厚中厚皮片的皮肤层次类似。理论上,偏浅深二度创面存在自愈可能,偏深深二度创面痂皮手术处理的方式有磨痂、削痂、剥痂等,达到创面广泛的点状出血之后再进一步处理。同取皮一样,这种通过手术去除痂皮的深度主要靠医生经验判断,具体深度因人而异,但对于烧伤创面而言,去除痂皮最理想的深度却只有一个,削痂过浅,坏死组织清理不彻底影响创面愈合,削痂过深则破坏了机体的健康组织。因此,无论取皮还是削痂,如何在术前获得这个最佳深度,对于治疗效果非常重要。同样,找到一个对取皮和削痂后的创面效果进行实时、无创的评价方法也很重要,其可决定下一步的医疗决策,提示医疗人员及时调整对创面的处理方法。
  高频超声具备超高的分辨率,被称为“超声显微镜”,测量结果可以精确到微米级,可对皮肤组织的纵深情况进行清晰地呈现,并计算不同层次皮肤组织的厚度,且无创、操作简单。皮肤镜也叫皮表透光显微镜,其通过自带光源模式的调整,分为偏振和非偏振法,是一种可以观察皮肤表面情况,并使表皮下解剖结构的可视化的技术,可充当临床观察和组织病理学的桥梁,又被称为皮肤科医生的“听诊器”。随着近年来人工智能在图像识别领域的快速进展,Andre Esteva等利用深度学习技术对皮肤癌和黑色素瘤的图片进行学习后,取得准确率高达91%的识别效果。2018年张康等利用基于图像的深度学习技术,采用“迁移学习”方式,已取得了对肺部、眼部部分疾病医学图像高达96.6%诊断准确度。基于此,未来人工智能图像识别技术在烧伤图像方面的应用值得期待。
  课题拟建立稳定的、易于获取的SD大鼠的供皮区模型、深二度烧伤削痂模型,通过组织学病理结果验证其稳定性,为涉及供皮区、深二度削痂方面的研究提供一个稳定的动物平台,并采用皮肤镜和高频皮肤超声对其鉴定,探索相关影像和创面层次之间的关系,进一步探究其在未来临床应用中的潜在价值。并为未来可能的人工智能图像识别技术在烧伤领域的应用提供基础数据和实验方法。
  研究目的:
  1.建立SD大鼠供皮区和深二度烧伤削痂模型,通过组织病理学切片验证其稳定性。
  2.在皮肤纵深维度,探索高频超声,对于精确取皮、削痂操作的应用价值。
  3.通过皮肤镜对取皮或削痂创面图像的获取和特征分析,探索皮肤镜在创面观察和评价中应用价值,为创面深度的评价提供一个新方法。
  研究方法:
  第一部分:20只SD大鼠随机分为2组(辊轴取皮刀取皮组、电动取皮刀取皮组),每组10只,使用各自的取皮刀在大鼠背部皮肤取皮,每只SD大鼠背部设定4个供皮区,通过皮下注射肿胀液形成局部隆起后,两名实验人员相互配合,设定取皮厚度分别为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm进行取皮。取皮前后分别用数码相机记录大体形态;用皮肤镜采集图像,对图像特征,包括色彩、出血、毛细血管形态等进行观察、归纳、分析;通过高频超声仪图像,测量皮肤不同层次厚度,记录并保存。图像数据采集完成后,取皮肤创面标本,进行组织学病理观察,计算断层皮片厚度。比较分析正常皮肤表皮、真皮、全层(表皮+真皮)及断层皮片厚度的病理测量数据与高频超声所测量结果之间的关系。
  第二部分:采用15mm×15mm×30mm大小铜块,浸入沸水5分钟后,予以铜块15mm×15mm面紧贴背部皮肤,靠铜块自重作用于大鼠背部8秒可致大鼠背部深二度烧伤。20只SD大鼠随机分为2组(辊轴取皮刀削痂组、电动取皮刀削痂组),每组10只。使用铜块在大鼠背部制作四个深二度烧伤的创面两组使用各自取皮刀分别对各自组内10只深二度烧伤的SD大鼠背部皮肤削痂,置烫伤面积同样大小的铜块于待削痂的创面下方,左手固定创面平展于铜块上,右手进行削痂,每个大鼠背部四个创面设定削痂深度分别为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm进行削痂,随后进行图像采集、分析和病理观察(方法同实验第一部分)。比较分析痂皮厚度的病理测量数据与高频超声所测量结果之间的关系。
  以上数据均采用用SAS9.4统计软件进行分析。
  研究结果:
  第一部分:SD大鼠供皮区模型的构建及高频皮肤超声仪、皮肤镜在其稳定性评估中的应用探索
  电动取皮刀组多次尝试,获得创面不理想。辊轴取皮刀组共获得不同深度的供皮区40个,每组10个,其中1个取皮过深导致皮下筋膜暴露,其余创面外观规整,形态均一性较好。
  图像特征:
  皮肤镜:设置0.1mm刻度取皮的创面可见粉白色,散在分布的点状出血点;设置0.2mm深度取皮的创面可见密度远高于前者的点状出血点,毛细血管末梢呈碎发样分布;设置0.3mm深度取皮的创面密集网状结构清晰可见,散在分布较大出血点,毛细血管分布可见,较多毛细血管纹路清晰呈现,设置0.4mm深度取皮的创面可见弥散性大出血点,毛细血管广泛可见,皮下筋膜隐约呈现。
  高频皮肤超声:SD大鼠表皮呈一条连续的平滑线状强回声,真皮层回声较表皮明显降低,真皮—皮下分界处呈不连续的线状回声,回声强度介于表皮、真皮之间,浅筋膜表现为规则的线状高回声。取皮后超声图像中表层线状强回声带消失,真皮层回声带宽度随着取皮厚度的递增而递减,随着取皮厚度进一步增加,真皮回声带亦消失。
  组织学观察:所取皮片、及相应的供皮区镜下厚薄均匀一致,无明显起伏。皮肤各层次组织结构清晰可见。
  使用SAS9.4统计软件对数据进行分析,SD大鼠背部皮肤表皮、真皮、全层病理厚度与其高频超声图像计算结果正相关,其中:表皮相关系数0.836,P<0.01;真皮相关系数0.932,P<0.01;皮肤厚度0.855,P<0.01。断层皮片病理厚度与超声检查结呈正相关。
  第二部分:SD大鼠深二度烧伤削痂模型的构建及高频皮肤超声仪、皮肤镜在其稳定性评估中的应用研究
  电动取皮刀组,削痂效果不理,创面起伏较大不均一,不进行图像分析。辊轴取皮刀组共获得不同深度的供皮区40个,每组10个,其中2个取皮过深导致皮下筋膜暴露,其余创面外观规整,形态均一性较好。
  图像特征:
  皮肤镜:设置0.1mm刻度削痂后创面呈现一片瓷白色,可见网样外观,网眼空隙较小,密集分布;;设置0.2mm刻度削痂后创面呈白色、淡红色相间,可见网样外观,空隙变大,网眼密度下降,散在较为规则、尺寸大小相仿的点状血管,局部可见细网状毛细血管纹路,;设置0.3mm刻度削痂后创面大部分呈现淡红色,依然可见网样外观,网眼空隙进一步变大,网眼密度稀疏,出血点分布较前者密集,可见广泛的毛细血管断端,血管纹路;设置0.4mm刻度削痂后创面呈鲜红色,弥漫性出血,毛细血管完整性和网样外观,不可见。
  高频皮肤超声:烧伤后可见真皮层水肿,厚度明显增加,削痂后超声图像中可见痂皮及削痂后的创面图像,痂皮回声带宽度随着削痂厚度的递增而递增。
  组织学观察:痂皮厚度镜下厚薄比较均一,无明显起伏。皮肤各层次组织清晰可见。使用SAS9.4统计软件对数据进行分析,病理结果和超声图像计算结果均比较稳定,变异性小,超声图像计算结果均大于病理结果,削下痂皮的病理厚度与超声检查结呈正相关。
  研究结论:
  1.通过辊轴取皮刀可以建立SD大鼠供皮区和深二度烧伤后削痂模型,该方法简单易行,稳定性和可重复性高。可以为涉及到上述两种创面的药物、敷料及治疗方研究提供一个稳定的动物模型平台。
  2.高频超声影像测量断层皮片、痂皮的厚度结果分别和各自病理测量结果正相关,可以为个性化、精确的取皮、削痂提供实时、无创的检测和参考。
  3.皮肤镜采集的平面图像,可以清晰地观察创面多维度的情况,尤其是对毛细血管损伤情况的清晰成像,能为供皮区及创面削痂效果的评价提供更准确、客观的方法。
[硕士论文] 陈思秀
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究主要探讨PHD锌指蛋白(PHF)14受缺氧诱导因子(HIF)1α诱导以及PHF14在马兜铃酸诱导的肾间质纤维化中的抑制效应及机制。
  方法:
  1.利用前期构建PHF14条件敲除小鼠,实验组小鼠基因型为phf14flox/floxCre+,同龄基因型为phf14flox/flox Cre-的小鼠为对照组。在8-12周龄时,予以他莫西芬连续5天腹腔注射敲除PHF14,确认实验组小鼠PHF14成功敲除后,马兜铃酸(3mg/kg体重)腹腔注射3周(每3天一次)诱导肾纤维化。6周后处死小鼠,留取肾组织行Masson染色及免疫组化检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、α平滑肌肌动蛋白(α-sma),用Western blot、Real time PCR分别检测PHF14、ColⅠ、α-sma、结缔组织生长因子(CTGF)表达,留血液标本检测肌酐、尿素氮。
  2.大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)予以HIF脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG刺激,使细胞内HIF-1α升高,另一组同时加入HIF-1α抑制剂KC7F2,抑制HIF-1α表达及入核,使用Western blot、Real time PCR检测不同时间点(0,1,3,6h)HIF-1α、PHF14和CTGF变化。
  3.在NRK-52E细胞中,利用染色质免疫共沉淀的方法,检测HIF-1α是否可分别结合在PHF14与CTGF启动子区域。
  4.利用siRNA技术干扰NRK-52E细胞中PHF14表达,给予DMOG升高细胞内HIF-1α,通过Western blot、Real time PCR检测CTGF表达。
  5.在NRK-52E细胞中,应用染色质免疫共沉淀的方法明确PHF14是否可结合在CTGF的启动子区域。
  结果:
  1.机体在遭受马兜铃酸的纤维化刺激后,敲除PHF14的小鼠纤维化指标ColⅠ、α-sma表达较对照组明显升高。相比野生型小鼠,敲除组小鼠的肌酐、尿素氮的指标明显升高。
  2.在细胞水平上,使用DMOG刺激细胞后,PHF14、CTGF的表达也升高,而抑制HIF-1α入核后,PHF14、CTGF的表达增加被抑制。通过染色质免疫共沉淀的方法证明了HIF-1α可结合在PHF14和CTGF的启动子区域。
  3.在细胞水平上干扰PHF14表达后,使用DMOG刺激后CTGF的表达明显升高,通过染色质免疫共沉淀的方法证明PHF14可结合在CTGF的启动子区域。
  结论:
  在马兜铃酸诱导的肾纤维化小鼠中,敲除PHF14的小鼠纤维化表型更重,肾功能损害更严重。通过细胞水平的研究发现,PHF14和CTGF都可以被HIF-1α诱导,在干扰PHF14表达后CTGF的表达增加,通过染色质免疫共沉淀的方法证明PHF14可结合在CTGF的启动子区域。PHF14通过调控CTGF表达抑制了HIF-1α促纤维化作用的过度激活,本研究进一步阐述了PHF14在抑制纤维化进展中的重要作用。
[博士论文] 郭瑛
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  建立稳定、可重复性好、操作简便的山羊腰椎临界大小骨缺损模型,制备具有良好生物活性的自体富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP),观察其与自固化可注射型磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate bone cement,CPC)复合后的可注射性,以及PRP/CPC复合物填充椎体骨缺损后的材料降解、新骨形成与椎体力学强度等方面的变化,以研究PRP与CPC复合后能否改善CPC的成骨性能及机械性能,从而更好地用于椎体骨缺损的修复。
  方法:
  1.羊全腰椎椎体临界大小骨缺损模型的建立:选取健康成年黑山羊18只,雌雄不限,使用盐酸氯胺酮+丙泊酚+戊巴比妥钠复合静肌麻醉,麻醉状态下取侧卧位、经腹膜后入路到达椎体侧方,在每只羊全部6个腰椎椎体(L1-L6)上分别制备一个大小为6mm×10mm的圆柱状空洞,根据数字表法随机对两个椎体填充PRP/CPC复合物、CPC或不填充任何材料,并因此将实验分为三组,实验组(PRP/CPC)、对照组(CPC)和空白组。观察术中实验动物在麻醉各阶段生命体征及血氧饱和度变化;并在术后6个月时对骨缺损大小进行影像学评估;
  2.PRP制备及与CPC复合后的生物活性及可注射性:用装有1ml复方柠檬酸钠的注射器抽取羊颈静脉全血5ml,利用改良的Landeasberg法制备PRP。测定PRP及全血中血小板及生长因子的含量;通过CaCl2和凝血酶将PRP激活后按10%wt比例与可注射型CPC复合,观察复合物凝固时间、可注射率和抗溃散性,以及植入椎体后的弥散情况;
  3.骨缺损内材料降解及新骨形成:术后1、3、6个月将动物处死后采集腰椎标本进行脱钙组织切片HE染色及未脱钙组织切片Van Gison染色进行组织形态学观察成骨情况,并通过未脱钙未染色组织切片计算PRP/CPC、CPC两组材料降解率;
  4.椎体的生物力学研究:术后1、3、6个月进行CT检查观察椎体骨缺损中皮质骨与松质骨的生长愈合情况;比较三组椎体术后1、3、6个月的抗压强度及刚度以评估其机械性能;
  结果:
  1.所有动物造模手术均顺利完成,麻醉效果满意,优良率为100%。各麻醉阶段血氧饱和度、体温、呼吸等指标比较无差异(P>0.05)。手术结束后动物苏醒时无明显挣扎、躁动等表现,无胃胀、呕吐等不良反应,所有动物均长时间存活。术后各时间点CT检查示椎体未发生骨折,空白组骨缺损在术后6个月时新骨形成有限,缺损未自然愈合,达到临界大小骨缺损标准;
  2.通过改良的Landeasberg法成功制备PRP,进行血小板计数发现PRP中血小板浓度是全血的5倍余(P<0.05),同时激活后的PRP中血小板衍生生长因子-AB(Platelet derived growth factor-AB,PDGF-AB)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等生长因子的含量明显高于全血(P<0.05)。CPC、PRP/CPC复合物最终均自然凝结,PRP/CPC复合物的初始凝结时间以及最终凝结时间均比单纯CPC要长(P<0.05)。两组水泥在推注时表现出良好的粘滞性。PRP/CPC可注射率高于CPC(P<0.05),PRP/CPC的抗溃散性也优于CPC;
  3.脱钙HE染色组织切片光镜下观察有材料填充的两组均未发生炎症及其它免疫排斥反应。空白组在术后1个月仅观察到成软骨形成,未见明显的新生编织骨及胶原骨形成。术后3、6个月可见少量沿缺损边缘的新生骨组织及无钙盐成积的胶原骨。实验组及对照组在术后6个月内可见连续性的成骨表现,术后6个月对照组在骨水泥及新生骨之间存在因成片的新生骨形成产生的“转化带”,实验组更为明显。未脱钙组织切片Van Gison染色观察发现从术后1个月开始实验组、对照组骨水泥均有不同程度吸收,被吸收的空隙内有新生骨形成。成骨活动主要集中在骨水泥-宿主骨界面,但对照组新生骨量少于实验组,且实验组有往骨水泥内部生长的趋势。术后3、6个月两组骨水泥进一步降解并伴新骨继续形成,并且实验组比对照组更明显。PRP/CPC复合物在术后1、3、6个月的降解率均比单独CPC高(P<0.05);
  4.CT平扫示空白组骨缺损大小在术后6个月内无明显变化,6个月时骨缺损边缘皮质骨虽然有少许生长,但缺损内部仍清晰,仅边缘毛糙。实验组及对照组在术后1个月时缺损内骨水泥呈高密度影,材料充盈确实。从术后3个月开始,两组骨水泥均有不同程度显影密度降低,边界模糊不清,实验组更为明显。术后6个月,实验组部分椎体无清晰的骨缺损轮廓,仅可见未被吸收的骨水泥,椎体外侧皮质骨达到完全骨性连接。除术后1个月椎体刚度对照组与空白组无明显差异外(P>0.05),其它时间点两材料填充组的椎体强度与刚度均高于空白组,而实验组椎体的强度及刚度高于对照组(P<0.05),实验组和对照组椎体的机械性能随着时间延长而逐渐提高(P<0.05)。空白组椎体强度及刚度各时间点无明显变化(P>0.05)。
  结论:
  PRP/CPC生物相容性好,植入体内后不会引起机体发生免疫排斥和炎症反应。同时PRP/CPC的可注射性好,可注射型CPC复合PRP后能延长骨水泥凝结时间,术中有充足的时间便于操作,粘滞性好不易渗漏。富含多种生长因子的PRP与CPC复合后能促进骨水泥的降解吸收,同时诱导新骨形成并向骨水泥内长入,从而提高了椎体的机械性能,更适合用于椎体等承重骨缺损的修复。
[博士论文] 汤学超
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:非瓣膜性房颤是老年人常见的心律失常,血栓栓塞性脑卒中是房颤最常见的并发症。左心耳是房颤患者血栓的主要来源,而抗凝治疗为预防房颤患者左心耳内血栓形成及缺血性脑卒中的经典手段。左心耳封堵术是近年新出现的预防非瓣膜性房颤患者脑卒中的微创治疗方法,通过有效地隔离左心耳远侧的不规则内腔,从而封闭产生血栓的基础,减少脑卒中的发生。多项研究显示左心耳封堵术预防非瓣膜性房颤脑卒中的效果不劣于华法林,尤其是对卒中高危不适合应用抗凝药物的患者,左心耳封堵术提供了一种可供选择的替代治疗方法。
  左心耳封堵术的核心是左心耳封堵器。目前应用较为广泛的有WATCHMAN封堵器及ACP封堵器,但这两种装置价格昂贵,导致国内受益人群的医疗负担较重;同时两种封堵器均不能反复完全回收和放置,一旦完全回收则不能再用,因此操作相对复杂。本中心自2004年就开始了左心耳封堵器的研发,经过不断地摸索及动物实验,发现保证左心耳封堵器植入稳定的关键构件是倒刺。近期本中心与上海普实医疗器械有限公司合作,研发了一种可以反复回收的一体化设计的J型微刺,并制作了两种不同类型的左心耳封堵器,分别为一体化的单盘圆柱型及分体型的双盘封堵器(Lacbes)。
  目的:
  在以往本中心研发左心耳封堵器的基础上,进一步改进左心耳封堵系统,通过体外测试及动物实验评价,并进行临床应用研究,为进一步推广提供依据。
  方法:
  1、新型左心耳封堵系统的研制:根据理想左心耳封堵器的设计理念,并对以往研制的左心耳封堵器的形状、大小、微刺等细微结构进行进一步的改进,与上海普实医疗共同研发两种新型左心耳封堵器。
  2、新型左心耳封堵系统的体外测试:分别在塑料圆管、离体猪心进行体外牢固性及阻隔效果的测试,体外验证两种不同封堵器进行左心耳封堵的可行性;在左心耳3D打印模型中进行封堵测试,探讨Lacbes封堵器的封堵策略;在37℃水浴下进行反复回收性能测试,验证一体化J型微刺的回收性能。
  3、新型左心耳封堵系统的动物实验研究:14只健康试验犬使用圆柱型或Lacbes左心耳封堵器经股静脉途径进行左心耳封堵;术中左房造影检查评价左心耳及封堵后的效果,术后给予阿司匹林预防血栓;对非预期死亡的试验犬立即进行大体标本检查;存活的试验犬术后分别于第45d、80d、110d、15月处死,对心脏、肝、脾脏、肾脏进行大体标本观察,对封堵器表面组织行HE染色及DAPI、CD31免疫荧光及电镜检查评价内皮化程度。
  4、Lacbes左心耳封堵系统的初步临床应用:自2016年6月~2017年4月连续入选就诊于本中心的非瓣膜性房颤患者38例,入选标准:CHADS2评分≥1,不适合长期使用华法林抗凝药物治疗;同期在全国其余7家中心共入选175例患者进行多中心临床注册研究。所有患者在食道超声引导下应用Lacbes左心耳封堵器进行左心耳封堵术。术后分别于1月、6月进行门诊随访,术后3月、12月进行住院随访。主要终点为左心耳完全闭合率及缺血性卒中发生率;次要终点为:严重心包积液、系统性栓塞、死亡、器械相关血栓以及复合主要不良事件等。将本中心自2017年7月~2018年1月前38例应用WATCHMAN封堵器的左心耳封堵术患者作为对照,比较单中心两种不同封堵器进行左心耳封堵的即时封堵情况。
  结果:
  1、新型左心耳封堵系统的研制:研制了两种不同类型左心耳封堵器,分别为一体化的单盘圆柱型左心耳封堵器,另外一种为分体型的双盘左心耳封堵器(Lacbes),两种封堵器均应用特殊设计的一体化雕刻J型微刺加强封堵器的稳固性。
  2、新型左心耳封堵系统的体外测试:
  (1)选择比心耳开口最大内径大2-4mm规格的圆柱型封堵器或比着陆区最大内径大于2-4mm规格的Lacbes封堵器,均可以有效固定在左心耳,释放后一定范围内的牵拉,封堵器无移位及脱落,同时封堵器微刺对心耳壁的损伤较小。
  (2)两种左心耳封堵器在37℃水浴中即使反复释放及回收8次以上,封堵器微刺的方向无改变。
  (3)Lacbes双盘封堵器可盖口封堵,亦可以堵口封堵,两种封堵方式可以转化。
  3、新型左心耳封堵系统的动物实验研究:
  (1)6只实验犬使用单盘圆柱型封堵器进行左心耳封堵,5条实验犬于术后30min~8h死亡,1条实验犬存活至15月后处死;大体心脏解剖发现4条试验犬封堵器表面均存在大量血栓,存活的1条试验犬封堵器表面约1/5未见新生组织覆盖。
  (2)8只试验犬使用Lacbes封堵器进行左心耳封堵,7例(87.5%)试验犬完全封堵;2条实验犬于分别于术后9h、36h死亡,死亡原因分别为封堵器移位及腹股沟血肿;存活的试验犬随访期内无明显行为异常及肢体活动障碍;术后110天封堵器表面组织HE染色,见封堵器表面组织呈现内皮、内皮下层及内膜下层排列,并可见新生血管形成。DAPI及CD31免疫荧光染色显示,术后45天可见DAPI及CD31阳性的新生内皮细胞,术后110天DAPI及CD31阳性细胞数目明显增加。扫描电镜检查可见术后80天及110天的试验犬封堵器表面一层扁平致密排列的梭形内皮细胞及内皮下层较厚的胶原纤维。
  4、Lacbes左心耳封堵系统的初步临床应用:
  (1)本中心38例患者CHADS2评分2.76±1.30,CHA2DS2-Vasc评分4.66±1.71。37例患者成功植入Lacbes左心耳封堵器,1例患者植入后因急性心包填塞取出封堵器,手术成功率97.4%,5例患者同期进行房间隔缺损/PFO封堵术;围术期发生严重心包积液3例(7.8%),均经外科或介入干预治愈;所有患者随访12~22月,1例患者因呼吸道感染并发心衰死亡,其余无严重不良事件发生。
  (2)多中心临床注册研究及短期随访显示Lacbes左心耳封堵器封堵左心耳成功率为98.9%,围术期主要不良事件发生率为2.3%,随访期主要不良事件年发生率为1.73%,其中缺血性脑卒中年发生率为0.58%,低于基于CHADS2及CHA2DS2-Vasc预测的脑卒中发生率7.56%及5.97%。
  (3)Lacbes封堵器与WATCHMAN封堵器进行对比,两组患者手术成功率均为97.4%;Lacbes组中植入时间显著少于WATCHMAN组(33±11min vs43±19min,p=0.010),封堵器全回收也略低于WATCHMAN组(5.3%vs21.1%,p=0.086);Lacbes组均经过1次穿刺或通过ASD/PFO孔完成封堵,但WATCHMAN组术中有4例(10.5%)需要重新进行房间隔穿刺。围术期心包填塞发生率Lacbes组高于WATCHMAN组,但两组没有显著性差异(7.8%vs2.6%,p=0.6148);两组患者均无器械栓塞、TIA、中风、血管并发症及死亡发生。
  结论:
  1、经体外测试显示单盘圆柱型及Lacbes双盘左心耳封堵器可以反复回收及定位,能有效封堵,牢靠固定;动物在体实验发现圆柱型封堵器植入左心耳后急性血栓发生率及即时死亡率高,需要进一步改进其结构;Lacbes左心耳封堵器用于封堵左心耳操作简单,即时成功率高,器械相关并发症低;左心耳封堵术后4月覆盖盘完全完整内膜化;多中心临床注册研究及短期随访显示应用Lacbes左心耳封堵器进行左心耳封堵成功率及左心耳闭合率高,缺血性脑卒中及器械表面血栓发生率低,有望在临床推广应用;Lacbes封堵器相对于WATCHMAN安全性相当,更容易操作,但需要进一步的随机对照研究比较。
[博士论文] 桑成林
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分:绝经后骨质疏松疾病中TNF-α通过JNK信号途径上调Semaphorin3D蛋白表达诱导破骨细胞分化
  一、目的:
  本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α诱导破骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α促进破骨细胞分化中的作用;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白促进破骨细胞分化的作用。本研究的完成对于探索绝经后骨质疏松的发生机制、寻找新的治疗靶点提供重要的理论依据。
  二、方法:
  1、培养正常小鼠来源的破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术对破骨细胞形成的标志性基因(TRAP、c-Fos和NFATc-1)表达检测等方法,明确TNF-α对破骨细胞分化的影响。
  2、在TNF-α促进RANKL诱导破骨细胞分化的过程中,通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E)表达量的变化,并进一步检测SemaⅢ家族蛋白受体(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表达量的改变。
  3、构建假手术组(Sham operation,Sham)小鼠、去卵巢组(Ovariectomized,OVX)小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+TNF-α中和性抗体(anti-TNF-α)小鼠模型,通过酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过微计算机断层扫描技术(micro computed tomography,micro-CT)技术确定模型构建是否成功。
  4、通过TRAP染色观察Sham组、OVX组、OVX+PBS组及OVX+anti-TNF-α组小鼠股骨干骺端的破骨细胞数量变化。
  三、结果:
  1、TNF-α能够增加TRAP阳性染色的破骨细胞数量,并且够促进破骨细胞中TRAP,NFATc1和c-Fos基因的表达,提示TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞形成。进一步研究发现,TNF-α通过作用于破骨细胞分化的早期阶段促进破骨细胞的形成。
  2、在TNF-α正向调控破骨细胞形成过程中SemaⅢ家族蛋白中的sema3D表达量增加最明显,并且TNF-α诱导的sema3D表达量的增加存在时间依赖性。此外,我们发现TNF-α在促进破骨细胞分化的过程中SemaⅢ家族蛋白受体NPR1的表达量明显减少,而Plx-A3的表达量轻微的减少。
  3、过表达Sema3D后能够明显的促进RANKL诱导破骨细胞分化,而阻断Sema3D后RANKL诱导的破骨细胞分化明显减少。此外,过表达Sema3D后能够明显的促进TNF-α正向调控RANKL诱导的破骨细胞分化,而阻断Sema3D后能够缓解TNF-α诱导的破骨细胞分化,提示Sema3D在TNF-α诱导破骨细胞分化的过程中具有重要功能。
  4、TNF-α能够明显的促进破骨细胞前体细胞的增殖,而基因沉默Sema3D后能够明显缓解TNF-α诱导的破骨细胞前体细胞增殖,这些结果证明Sema3D介导了TNF-α对破骨细胞前体细胞增殖的调控。过表达或基因沉默Sema3D后并未影响细胞的凋亡。
  四、结论:
  1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松中破骨细胞分化增加、骨吸收增强的重要因素。雌激素缺乏后导致TNF-α水平升高,过量的TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞分化,并且这种诱导作用发生在破骨细胞分化的早期阶段。
  2、在TNF-α促进RANKL诱导的破骨细胞分化过程中,Sema3D的表达量明显增加。Sema3D的增加一方面通过促进破骨细胞前体细胞的增殖增加破骨细胞的数量,另一方面通过促进RANKL诱导的破骨细胞分化影响破骨细胞的形成。
  3、TNF-α通过激活JNK途径上调了Sema3D的表达。体内抑制Sema3D能够有效缓解OVX诱导的小鼠骨质疏松。
  第二部分:绝经后骨质疏松中TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径下调Semaphorin3B表达抑制成骨细胞分化
  一、研究目的:
  本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化中的功能;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白抑制BMMSCs向成骨细胞分化的分子机制。本研究的完成有助于阐释PMOP的发病机制,尤其是TNF-α相关的骨形成减少的分子机制。
  二、研究方法:
  1、培养正常小鼠骨髓来源的MSCs(BMMSCs)细胞,在TNF-α抑制BMSCs向成骨细胞分化的不同时间点(0天、3天、7天、14天),通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E)表达量的变化,并通过Western blot技术进一步验证Sema3B在此过程中表达量的变化。
  2、构建Sham小鼠、OVX小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+anti-TNF-α小鼠模型,通过micro-CT技术确定模型构建是否成功,通过Elisa实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端TF-α表达量的变化。
  3、构建TNF-α中和抗体抑制OVX诱导骨质疏松的小鼠模型,免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端Sema3B表达量的变化,qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白受体(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表达量的变化。
  4、分离各组模型小鼠的BMMSCs,qRT-PCR技术检测细胞中Sema3B表达量的变化。
  三、结果:
  1、TNF-α在抑制BMMSCs向成骨细胞分化的过程中sema3A,sema3C,sema3D和sema3E的表达量并没有发生明显的变化,而sema3B的表达量明显的减少且具有时间依赖性。
  2、OVX组小梁骨密度(BMD)和静态微观结构参数(Tb.Th、BV/TV和Tb.N)明显小于Sham组,OVX+anti-TNF-α组小鼠骨量相对于OVX组小鼠明显增加。OVX组小鼠相对于Sham组小鼠小梁骨变细、数量减少,TNF-α中和抗体能够缓解OVX引起的小鼠股骨干骺端小梁骨结构的变化。
  3、OVX组小鼠TNF-α水平明显高于Sham组小鼠,而应用TNF-α中和抗体能够有效地降低OVX组小鼠的TNF-α水平;OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端TNF-α的表达明显增加,而应用TNF-α中和抗体能够明显减少TNF-α表达。
  4、OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端Sema3B的表达明显减少,而OVX小鼠应用TNF-α中和抗体后能够明显增加Sema3B的表达;相对于Sham组小鼠,OVX组小鼠来源的BMMSCs(OVX-MSCs)中Sema3B的表达量明显减少,而TNF-α中和抗体的应用能够明显的增加OVX小鼠BMMSCs中Sema3B的表达。
  四、结论:
  1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松疾病中BMMSCs向成骨细胞分化抑制、骨形成减少的重要因素。在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化过程中,Sema3B的表达量明显减少。Sema3B表达量的降低一方面通过影响BMMSCs的增殖来减少成骨细胞形成的数量,另一方面通过抑制BMMSCs细胞向成骨细胞分化影响骨形成。
  2、TNF-α抑制MSCs细胞向成骨细胞分化的过程中,DKK-1,GSK-3β和β-catenin的蛋白表达量明显降低,提示TNF-α能够明显的抑制MSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径。而Wnt/β-catenin信号途径的激活能够明显的缓解TNF-α对MSCs细胞中Sema3B表达的抑制作用,提示TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径负向调控Sema3B的表达。
[硕士论文] 蒋大伟
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:探讨体外冲击波对兔跟腱重建后BTJ腱骨愈合影响的研究。
  研究方法:选用新西兰白兔行双侧跟腱损伤修复造模,右侧利用冲击波干预,左侧不干预。观察术后4周及8周时腱骨愈合部位HE染色切片情况,利用PCR测定TGF-β1和bFGFmRNA含量,同时对腱骨愈合标本进行生物力学检测。
  研究结果:HE染色示冲击波治疗组组织愈合及炎性细胞减少速度较对照组快。bFGF在冲击波治疗组4周及8周的表达量与对照组比较有统计学差异(p<0.05),且治疗组高于对照组;对照组和治疗组两时间段组内比较无统计学差异(p>0.05);TGF-β1在治疗组术后4周及术后8周表达与对照组比较有统计学差异(p<0.05),且治疗组高于对照组;两时间段组内相比无显著差异(p>0.05)。生物力学检测结果显示,对照组在跟腱重建术后第4周、8周时跟腱与跟骨分离的最大负荷力分别为(35.39±7.15)N、(61.12±4.47)N。治疗组在跟腱重建术后第4周、8周时跟腱与跟骨分离的最大负荷力分别为(65.98±9.02)N、(97.23±5.94)N。对照组在术后第4周、8周时跟腱最大拉伸距离分别为(1.47±0.10)cm、(1.77±0.08)cm。治疗组在跟腱重建术后第4周、8周时跟腱与跟骨最大拉伸距离分别为(1.83±0.06)cm、(1.94±0.07)cm。治疗组与对照组间各时间段最大负荷力及最大拉伸距离比较有统计学差异(p<0.05),各组内不同时间段最大负荷力及最大拉伸距离比较有统计学差异(p<0.05)。
  研究结论:体外冲击波干预组在跟腱-骨结合部抗拉性能、腱-骨界面成熟度、促进腱骨愈合生长因子含量方面均优于对照组,说明体外冲击波可促进BTJ腱骨愈合进程,并可提高其强度和极限负荷。
[硕士论文] 王超
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:腰椎后路椎间融合内固定手术在治疗腰椎退变性疾病中的应用日益增多,而术后邻近节段退变是该手术重要的远期并发症,其中,症状性邻近节段退变会严重影响手术效果,甚至需要再手术治疗。既往的文献报道初步研究了腰椎融合术后邻近节段退变的危险因素,包括长节段固定、相邻节段减压未固定和术前存在的邻近节段病变。与此同时,矢状面平衡对腰椎融合手术后效果的影响也受到越来越多的关注,但症状性邻近节段退变与脊柱-骨盆矢状面参数的相关性研究较为缺乏。
  研究目的:
  通过比较病例组与对照组初次术前与末次随访时的脊柱-骨盆矢状面参数的差异,探讨腰椎融合术后症状性邻近节段退变与脊柱-骨盆矢状面参数的相关性。
  研究方法:
  病例对照研究。回顾性分析自2013年1月至2017年10月上海长海医院骨科收治的腰椎融合术后症状性邻近节段退变(symptomatic adjacent segment degeneration,SASD)再手术的病例25例,其中男性11例,女性14例,初次手术时平均年龄55.8岁(28岁~76岁),平均BMI为26.9Kg/m2(21.6Kg/m2~37.1Kg/m2),8例为L4-L5固定例,17例为L4-S1固定,发生于头侧的症状性邻近节段退变16例,发生于尾侧5例,双侧4例,两次手术间隔时间为79.6个月(12个月~168个月);获取其初次术前及末次随访时的站立位全脊柱侧位片,测量其脊柱-骨盆矢状面参数,包括胸椎后凸角(thoracic kyphosis,TK)、总腰椎前凸角(total lumbar lordosis,TLL)、下腰椎前凸角(low lumbar lordosis,LLL)、骨盆入射角(pelvic incidence,PI)、骨盆倾斜角(pelvic tilt,PT)、骶骨倾斜角(sacral slope,SS)、矢状面垂直轴(sagittal vertical axis,SVA),并计算LLL占TLL的比例,记为RL。按照1∶2配对的方法获取另外50例腰椎融合术后未发生邻近节段退变患者,其中男性24例,女性26例,L4-L5固定18例,L4-S1固定32例,初次手术时平均年龄55.2岁(32岁~82岁),平均BMI为24.8Kg/m2(19.2Kg/m2~31.4Kg/m2),平均随访时间为78.8个月(12个月~160个月),同样获取其初次术前及末次随访时的站立位全脊柱侧位片,并测量其脊柱-骨盆矢状面参数。
  研究结果与结论:
  两组病例在年龄、性别、BMI、随访时间及初次手术方式均无显著差异(P>0.05),病例组中,LLL在末次随访时小于术前,且RL<60%的人数多于术前,差异有统计学意义;对照组中,术前及末次随访时的腰骶矢状面参数差异无统计学意义。术前脊柱-骨盆矢状面参数中,与对照组相比,病例组TLL明显较小(P<0.01)而PT明显较大(P<0.01),PT-TLL≥10°及SVA>50mm的人数病例组明显多于对照组。末次随访时,病例组TLL明显低于对照组(P<0.01),且RL<60%的人数也是病例组明显较多(P<0.01);与术前相似,PT-TLL≥10°的人数病例组明显多于对照组。经统计学分析,术前TLL降低、SVA>50mm是腰椎融合术后发生症状性邻近节段退变患者的危险因素;且术后RL<60%与SASD的发生有明显关联性,由此可见,手术节段前凸恢复不良导致邻近节段代偿性后凸可能是引起腰椎融合术后症状性邻近节段退变的原因之一。
[硕士论文] 刘德琳
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  全髋关节置换术发展至今已是骨科领域较为成熟的手术之一。但是考虑到髋关节周围神经血管等软组织丰富,手术创伤较大,造成大量的术中出血以及术后渗血。为了将术后渗血引出以降低血肿形成的风险,术后留置引流管一直以来都是围术期常见的处理方法。
  近年来,也有一些学者认为全髋关节置换术后留置引流的益处并不明显,还可能会增加术后出血。因此很多临床医生对于髋关节置换术后引流管理的问题一直有所争论。然而,很多学者忽视了术后的引流液其实是稀释性的,其红细胞压积相对较低。简单将术后引流量作为术后的显性失血量实际上高估了髋关节置换的显性失血而低估了其隐性失血。引流液的真实失血量应根据引流液的红细胞压积计算而得。究其根本,引流的益处是建立在引流装置可以真正有效地将术后早期渗血排出的前提之下。引流的效率则主要取决于引流装置的负压大小,但是目前关于不同负压大小的引流对髋关节置换临床疗效影响的研究较少。
  因此,本研究通过更为准确的计算方法,旨在前瞻性地对比临床中常用的高、低负压两种引流装置对全髋关节置换术围术期失血、术后早期康复及术后并发症等方面的区别。
  方法:
  将我院2017年03月至2017年12月行全髋关节置换术的患者随机分成高负压(最大负压约98kPa)引流组和低负压(最大负压约20kPa)引流组,其中高负压组53例,低负压组51例。检测患者术后引流液的红细胞压积,并计算出相应的引流液真实失血量及隐性失血量。对两组患者引流液红细胞压积、术后引流量、引流液真实失血量、显性失血量、总失血量、异体输血、隐性失血量、隐性失血占比、围术期血红蛋白变化、术后早期康复及术后并发症等方面进行统计学对比。计量资料采用两独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  高、低负压两组患者一般资料(性别、年龄、身高、体重、身体质量指数、术前Harris评分、麻醉方式及手术时间)的对比均无统计学差异(P>0.05)。两组患者术后引流液红细胞压积均较低,组间比较差异无统计学意义(19.25±4.89%VS20.29±4.23%,P>0.05)。两组患者术中出血量相似,差异无统计学意义(P>0.05)。高负压组术后12小时、24小时、48小时引流量均明显高于低负压组(P<0.001)。通过引流液红细胞压积计算后,高负压组患者引流液真实失血量、围术期显性失血量均明显高于低负压组(P<0.001)。两组患者在围术期总失血量、输血例数、输血量方面的对比无统计学差异(P>0.05)。但高负压组隐性失血量比低负压组更少(647.64±299.85ml VS783.53±292.56ml,P<0.05),隐性失血占比也明显低于低负压组,(53.84±9.55%VS67.58±6.80%,P<0.001)。两组患者围术期血红蛋白变化基本相似,仅在术后第一天时高负压组血红蛋百要低于低负压组(111.42±15.28g/L VS117.88±16.43g/L)。在术后早期康复方面,高负压组术后第3天VAS疼痛评分更低(3.30±0.59VS3.86±0.49,P<0.001),术后第3天肿胀程度更轻(103.42±2.17%VS104.62±1.76%,P<0.05)。两组患者术后第7天VAS评分、术后首次下床时间、术后6周Harris评分的比较均无统计学差异。术后并发症方面,两组患者均无伤口内血肿和深部感染发生。两组患者在术后早期发热、伤口延迟愈合、伤口表面感染、深静脉血栓形成方面的比较均无统计学差异(P>0.05)。高负压组出现2例伤口周围瘀斑形成的患者,而低负压组有9例,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  全髋关节置换术后使用高负压引流不会增加患者的总失血量,但是其隐性失血量更少,早期疼痛、肿胀程度更轻,伤口周围瘀斑发生风险更低,临床疗效值得肯定。
[博士论文] 王萍
儿科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在我们前期研究的SRNS家系中,先证者7岁患SRNS,肾脏病理显示局灶节段性肾小球硬化,电镜显示足细胞足突数量减少伴融合。她于15岁进展至终末期肾脏病,16.4岁接受肾移植,至今未出现肾病综合征复发。NUP160基因致病突变2407G>A(E803K)遗传自母亲,NUP160基因致病突变3517C>T(R1173X)遗传自父亲,因此,这两个突变系NUP160基因复合杂合致病突变,可以解释先证者SRNS的病因,符合该SRNS家系的遗传方式,即常染色体隐性遗传。先证者肾组织超微结构显示足细胞足突数量减少伴融合,我们推测NUP160基因功能缺失可导致足细胞损伤,进而引起大量蛋白尿。
  研究目的:
  应用RNA干扰技术构建NUP160基因沉默的小鼠足细胞稳定细胞株,降低小鼠足细胞中Nup160蛋白的表达,观察其对小鼠足细胞增殖、凋亡、自噬、迁移能力及足细胞相关因子Nephrin、Podocin、CD2AP和α-actinin-4表达和分布的影响,探讨NUP160功能缺失是否会引起足细胞损伤。
  研究方法:
  1、设计并合成3对针对小鼠NUP160mRNA(NM_015231)的shRNA,应用分子克隆技术构建重组载体pLKO.1-NUP160_shRNA,酶切鉴定并测序后,将构建成功的重组质粒pLKO.1-NUP160_shRNA、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞,收集病毒上清感染条件永生化小鼠足细胞,嘌呤霉素筛选10d~14d,获得NUP160shRNA稳定转染的小鼠足细胞。应用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)和细胞免疫荧光检测NUP160敲低效果。
  2、探究NUP16基因沉默对小鼠足细胞增殖影响的实验:设空白对照组、阴性对照组和shNUP160稳定转染组。应用CCK-8实验测定OD值,绘制细胞生长曲线;应用流式细胞术PI染色法检测细胞周期分布;应用qRT-PCR检测CCND1、CDK4、CDKN1B mRNA的表达;应用Western Blot检测细胞周期调控因子Cyclin D1、CDK4、p27蛋白的表达。
  3、探究NUP160基因沉默对小鼠足细胞凋亡影响的实验:应用流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP的表达。
  4、探究NUP160基因沉默对小鼠足细胞自噬影响的实验:应用qRT-PCR检测自噬调控因子BECN1、LC3B mRNA的表达;应用Western Blot检测Beclin1、LC3B蛋白的表达;应用细胞免疫荧光检测LC3B蛋白的荧光强度。
  5、探究NUP160基因沉默对小鼠足细胞迁移能力影响的实验:应用划痕实验检测划痕修复率;应用Transwell实验检测穿过transwell小室的细胞数量。
  6、探究NUP160基因沉默对足细胞相关因子影响的实验:应用qRT-PCR检测NPHS1、NPHS2、CD2AP、ACTN4mRNA的表达;Western Blot检测Nephrin、Podocin、CD2AP、α-actinin-4蛋白的表达;应用细胞免疫荧光检测Nephrin、Podocin、CD2AP、α-actinin-4蛋白的荧光强度和亚细胞定位。
  所有实验均重复三次。应用SPSS18.0统计软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差((x)±s)表示,多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较分析当方差相等时采用最小显著性差异法(LSD),当方差不齐时采用Dunnett's T3。P<0.05表示差异有统计学意义。
  研究结果:
  1、3种NUP160shRNA均能有效抑制NUP160基因在MPC5细胞中的表达,NUP160-shRNA-1、NUP160-shRNA-2和NUP160-shRNA-3对NUP160mRNA表达的抑制率分别为49.43%、74.56%和62.02%,对Nup160蛋白表达抑制率分别降低39.28%、68.66%和57.78%。NUP160-shRNA-2干扰效果最明显,被用于后续实验。
  2、CCK-8实验结果显示在24h、48h、72h和96h这4个时间点,NUP160shRNA稳定转染细胞的OD值明显低于空白对照组细胞和阴性对照组细胞(P均<0.001);流式细胞术PI染色检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组G0/G1期细胞数显著增多,S期细胞数显著减少,细胞增殖指数明显低于两对照组(P均<0.001);qRT-PCR和Western Blot检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中CCND1mRNA(Cyclin D1)和CDK4mRNA(CDK4)表达水平显著降低(CCND1mRNA、Cyclin D1和CDK4mRNA,P均<0.001;CDK4,P<0.01),CDKN1B mRNA(p27)表达水平显著升高(P均<0.001);而在空白对照组和阴性对照组之间上述结果均无明显差异。
  3、流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中早凋细胞和晚凋细胞均较空白对照组与阴性对照组明显增多,细胞凋亡率较两对照组明显增高(P均<0.001);Western Blot结果显示NUP160shRNA稳定转染组中cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP的表达均较两对照组明显增多(P均<0.001);而在空白对照组和阴性对照组之间上述结果均无明显差异。
  4、qRT-PCR检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中BECN1mRNA和LC3B mRNA表达显著增多(P均<0.001);Western Blot检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中Beclin1和LC3BⅡ/LC3BⅠ明显高于空白对照组与阴性对照组(Beclin1,P均<0.01;LC3BⅡ/LC3BⅠ,P均<0.001);细胞免疫荧光检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中LC3BⅡ荧光强度明显高于两对照组(P均<0.01);而在空白对照组和阴性对照组之间上述结果均无明显差异。
  5、划痕实验结果显示NUP160shRNA稳定转染细胞划痕修复率高于空白对照组与阴性对照组(P均<0.001);Transwell实验结果显示NUP160shRNA稳定转染组穿过transwell小室的细胞数量明显多于两对照组(P均<0.001);而在空白对照组和阴性对照组之间上述结果均无明显差异。
  6、qRT-PCR检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中NPHS1mRNA、NPHS2mRNA和CD2AP mRNA表达明显减少(P分别<0.05、<0.001、<0.001),ACTN4mRNA表达明显增多(与空白对照组相比,P<0.001,与阴性对照组相比,P<0.01);Western Blot检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中Nephrin、Podocin和CD2AP表达明显减少(P分别<0.05、<0.001、<0.001),α-actinin-4表达明显增多(与空白对照组相比,P<0.01;与阴性对照组相比,P<0.05);细胞免疫荧光检测结果显示NUP160shRNA稳定转染组中Nephrin、Podocin和CD2AP荧光强度明显高于两对照组(与空白对照组相比,P分别<0.05、<0.001、<0.01;与阴性对照组相比,P分别<0.05、<0.001、<0.05),α-actinin-4荧光强度明显低于两对照组(P均<0.001);而在空白对照组和阴性对照组之间上述结果均无明显差异。NUP160shRNA稳定转染组中Nephrin、Podocin和CD2AP主要分布在细胞核周围,而两对照组Nephrin、Podocin同时分布于核周和胞膜,CD2AP同时分布于核周、胞质和胞膜。NUP160shRNA稳定转染组、空白对照组和阴性对照组α-actinin-4的分布无明显差异,均呈细丝状均匀分布于足细胞胞质内,同时亦呈放射性分布于足细胞足突中。
  研究结论:
  NUP160基因沉默损伤小鼠足细胞,表现为抑制小鼠足细胞增殖、促进小鼠足细胞凋亡、诱导小鼠足细胞的自噬、增加小鼠足细胞迁移、影响足细胞相关分子Nephrin、Podocin、CD2AP和α-actinin-4的表达及Nephrin、Podocin和CD2AP在足细胞中的分布。
[博士论文] 熊叶
内科学(呼吸内科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究将探究LPS诱导的ALI小鼠模型炎症修复过程中,Nogo-B扮演着什么角色,是否并且如何参与到炎症修复过程。据我们所知,该内容尚无人报道。
  目的:
  明确Nogo-B在ALI小鼠模型炎症修复期的作用,明确Nogo-B在Treg细胞急性肺损伤保护过程中的地位,以期能寻找ARDS炎症修复期的关键蛋白靶点,为ARDS的救治寻找新的思路。
  方法:
  本研究通过LPS气管滴注的方法构建ALI小鼠模型,采用迪夫快速染色法对BAL细胞BAL进行分类计数,HE染色观察肺部病理变化,获得ALI小鼠模型从发病第1天至第10天的病理生理发展特点与自然病程。通过流式细胞术检测BAL中Treg的数量,明确ALI小鼠模型中BAL Treg细胞数量与炎症修复各阶段间的关系。同时,我们应用实时定量PCR技术检测急性炎症期和炎症修复期ALI小鼠肺组织及BAL细胞Nogo-B的表达水平,并通过免疫荧光证实Nogo-B在Treg细胞中的表达,以期证实Nogo-B在ALI小鼠模型炎症修复期中表达及Treg细胞中的表达变化。
  其次,我们采用CRISPR/Cas9技术构建Nogo-B基因敲除小鼠。分别使用Nogo-B基因敲除小鼠和野生型小鼠复制ALI模型,描绘两组ALI模型小鼠的体重变化。采用迪夫染色对BAL细胞进行分类计数、HE染色观察肺部病理组织改变,以观察两组ALI小鼠的炎症修复期肺部损伤修复进程的差异,进一步明确Noog-B对ALI炎症修复的影响。通过流式细胞术检测两组ALI小鼠BAL中Treg细胞数量变化情况,采用ELISA检测两组ALI小鼠BAL及血清中IL-10、TGFβ及IL-2水平的变化情况。以期观察两组小鼠ALI炎症修复期Treg细胞及抗炎因子。
  再次,我们采用腺病毒在体转染的方法,给与Nogo-B敲除小鼠和野生型小鼠肺部过表达Nogo-B,并通过实时定量PCR及免疫荧光的方法验证在体转染的效果。复制ALI小鼠模型,通过细胞分类计数方法计算不同Nogo-B表达小鼠ALI模型中炎症修复期中性粒细胞数量,通过肺组织HE染色观察不同Nogo-B表达小鼠肺部病理损伤程度,以期明确Nogo-B过表达对ALI小鼠模型的炎症修复进程的影响。使用流式细胞术检测不同Nogo-B表达小鼠BAL中Treg细胞数量,以期明确Nogo-B对ALI炎症修复期肺部Treg细胞数量的作用。
  而后,为明确Nogo-B在Treg对急性肺损伤的保护作用中的地位,我们使用过继回输方法,给Rag-/-小鼠ALI模型分别静脉回输Nogo-/-Treg细胞及WT Treg细胞,观察各组ALI小鼠肺部病理损伤程度,BAL中性粒细胞数量,使用BCA蛋白定量测量各组ALI小鼠BAL中蛋白含量。为明确不同Nogo-B表达的Treg细胞肺部募集水平的差异,我们使用流式细胞术检测以上各组ALI小鼠BAL中Treg细胞的数量。
  最后,为明确Nogo-B影响ALI小鼠模型肺部Treg细胞募集的作用机制,我们使用磁珠分选技术纯化提取Nogo-B敲除的Treg细胞及野生Treg细胞,利用迁移实验、增殖实验验证Nogo-B对Treg细胞迁移、增殖功能的影响。并采用TGF-β刺激分化Nogo-B敲除及野生初始型T细胞为Treg细胞,观察Nogo-B对初始型T细胞分化的影响。采用ELISA方法,检测激活的Nogo-B敲除Treg细胞及野生Treg细胞分泌IL-10的能力,以明确Nogo-B对Treg细胞分泌IL-10的影响。
  结果:
  一、ALI小鼠模型炎症修复期的特点和Nogo-B的表达变化
  根据ALI小鼠模型BAL细胞学分类和肺组织病理变化,我们明确在LPS诱导后第4至7天机体处于炎症修复期,第7天后为纤维化形成期。Treg细胞在第4天数量显著升高,到第7天达到高峰,明确Treg参与了炎症修复过。实时荧光定量PCR结果和免疫荧光结果显示ALI小鼠肺组织和肺泡灌洗液细胞中Nogo-B的表达在炎症修复期显著升高,其变化趋势与Treg数量变化趋势一致。Treg细胞免疫荧光证实其表达Nog o-B蛋白。
  二、敲除Nogo-B基因后急性肺损伤炎症修复受损
  我们采用CRISPR/Cas9技术构建C57BL/6背景Nogo-B-/-小鼠,并成功验证Nogo-B-/-小鼠Nogo-B基因和蛋白表达缺失,提示Nogo-B敲除小鼠构建成功。ALI小鼠体重显示,Nogo-B-/-小鼠与WT小鼠在LPS诱导后第3天,体重处于最低谷,第4天体重开始恢复,第7天WT小鼠体重恢复至原水平而Nogo-B-/-小鼠仍处于第4天水平。与WT小鼠相比,Nogo-B-/-小鼠ALI模型炎症修复期BAL总细胞数和中性粒细胞数较高,肺部病理损伤较重,表明Nogo-B敲除后,ALI小鼠炎症修复能力较差。Nogo-B-/-ALI小鼠炎症修复期肺部Treg细胞数量较WT ALI小鼠低,BAL及血清中IL-10水平、IL-2水平较WT ALI小鼠低。表明Nogo-B敲除后,Treg细胞的肺部募集能力较差,肺部抗炎因子及Treg细胞增殖相关因子水平下降。
  三、过表达Nogo-B促进急性肺损伤的炎症修复
  我们采用重组腺病毒气道滴注的方式过表达Nogo-B,并使用实时定量PCR验证该方法能够在小鼠肺部过成功表达Nogo-B。Nogo-B过表达的ALI小鼠的炎症修复期肺部病理损伤较对照组低,BAL中性粒细胞数较对照组低,表明Nogo-B过表达能够恢复Nogo-B-/-敲除小鼠ALI模型炎症的修复,促进ALI小鼠肺部炎症修复。Nogo-B过表达小鼠ALI模型肺部Treg数量较对照组高,证明过表达Nogo-B能够促进Treg细胞的肺部募集。
  四、Nogo-B在Treg细胞对ALI肺保护作用中的地位
  相比于WT Treg细胞,过继回输Nogo-B-/-Treg细胞无法修复Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期肺部病理损伤,无法降低Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期BAL中性粒细胞数量,无法降低Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期BAL蛋白总量,提示Nogo-/-Treg细胞对ALI炎症修复能力受损,反证Nogo-B在Treg细胞对ALI肺部的促进作用。相比于WT Treg细胞,过继回输Nogo-B-/-Treg细胞的Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期Treg细胞数量下降,表明Nogo-B敲除的Treg细胞肺部募集能力受损。
  五、Nogo-B促进Treg细胞的增殖及分泌IL-10的能力
  采用磁珠分选技术,成功提取纯度为95%作用的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。对比LPS刺激后WT Treg细胞与Nogo-B-/-Treg细胞迁移能力,结果显示两组细胞迁移能力无差异;对比TGF-β刺激下WT初始型T细胞与Nogo-B-/-初始型细胞分化为Treg细胞的能力,结果显示两组细胞分化能力无差异;对比CD3、CD28及IL-2刺激下WT Treg细胞与Nogo-B-/-Treg细胞增殖能力,结果显示无论细胞浓度为多少,WT Treg细胞增殖能力强于Nogo-/-Treg细胞。对比CD3、CD28及IL-2刺激下WT Treg细胞与Nogo-B-/-Treg细胞分泌IL-10的能力,结果显示WT Treg细胞分泌IL-10的强于Nogo-/-Treg细胞。
  结论:
  一、LPS气管内滴注诱导的ALI小鼠模型炎症修复期位于LPS诱导后第4天至第7天,该期间肺部Treg细胞数量显著升高,Nogo-B的表达在炎症修复期升高,其在炎症修复期间的变化趋势与Treg细胞变化趋势一致。表明Nogo-B可能参与了ALI模型的炎症修复过程,且可能与Treg细胞相关。
  二、敲除Nogo-B基因使ALI小鼠肺部炎症损伤加重,炎症修复能力下降,肺部Treg细胞数量减少,证实Nogo-B参与ALI炎症修复期的修复过程和Treg细胞的肺部募集。
  三、过表达Nogo-B可以使ALI小鼠肺部病理损伤得到修复,减少肺部炎症细胞数量,增加肺部Treg数量,证实Nogo-B促进ALI小鼠的炎症修复,促进Treg细胞的肺部募集。
  四、过继回输Noog-B基因敲除的Treg细胞无法修复Rag-/-小鼠ALI的炎症损伤,无法使Treg细胞募集至肺部,证明Nogo-B对Treg细胞的肺部保护作用有着重要作用。
  五、Nogo-B基因敲除的Treg细胞增殖能力及分泌IL-10的能力下降。
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