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[硕士论文] 乔君
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中的作用。
  方法:1.分别在SHR大鼠及其野生型对照WKY大鼠4、6、10、30周龄测量体重和血压;并采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1浓度;采用RT-PCR法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA表达水平;采用组织免疫化学染色法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平;采用Masson染色法检测肾脏纤维化水平。2.将SHR大鼠随机分为IL-6单克隆抗体阻断组(SHR-B组)和0.01M PBS对照组(SHR-C组),IL-6单克隆抗体阻断组大鼠腹腔注射IL-6单克隆抗体10μg/d,对照组大鼠腹腔注射等体积0.01M PBS,持续14d。分别于4、6、30周龄动态检测上述各项指标变化。
  结果:1.SHR大鼠体重低于同期WKY大鼠,10、30周龄时两者差异存在显著性(P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠收缩压显著高于WKY大鼠(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1亦显著高于同期WKY大鼠,两者相比具有差异性(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORg、TGF-β1mRNA表达水平均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与WKY大鼠相比,SHR大鼠肾脏纤维化程度明显升高,在10、30周龄两者差异具有显著性(P<0.05)。2.与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠收缩压在30周龄时显著降低(P<0.05);在6、30周龄时,与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠血浆中IL-17和TGF-β1均显著降低(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA相对表达均显著低于SHR-C大鼠(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值亦显著低于同期SHR-C组(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与SHR-C组大鼠相比,SHR-B组大鼠肾脏纤维化程度有所降低,在30周龄时两者差异具有显著性(P<0.05)。
  结论:IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中发挥重要作用;高血压形成初期,通过阻断IL-6-IL-17-CD13信号调控轴可以减轻或延缓高血压及肾脏损害进程。
[博士论文] 刘莹
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:近年来,埃博拉病毒(EBOV)导致的疫情对全世界人类的安全带来巨大威胁。2014年西非爆发的埃博拉疫情造成了大量死亡,引起了全世界的关注。由于没有针对EBOV的特定药物和治疗,因此,疫苗被认为是控制该流行病最有希望和最有效的方法,开发有效且安全的埃博拉疫苗对于公共安全十分重要。EBOV的糖蛋白GP是病毒粒子上唯一的表面蛋白,负责调节与宿主细胞的吸附和融合,因此成为埃博拉疫苗研究的主要目标蛋白。GP的基因通过基因编辑,不仅编码结构蛋白GP,还编码分泌型糖蛋白(sGP),且占GP基因编码产物的70%。
  目前,疫苗的接种方式主要为肌肉注射(M),使用该种免疫方式的疫苗多为溶液,需要在冷藏或冷冻的条件下保存以保持疫苗的稳定性。最近的几十年,微针(MN)作为一种新的疫苗接种技术被广泛应用与皮内免疫研究中。皮肤是人体最大的免疫器官,其真皮层富含大量的树突状细胞、朗格汉斯细胞等多种免疫细胞,且丰富表达这两种抗原递呈细胞受体,可与包括单核细胞、巨噬细胞在内的其他免疫活性细胞结合,这使得皮肤成为免疫的理想部位。
  本研究针对EBOV GP进行亚单位疫苗的研究。在对GP及sGP进行三维结构的预测和比对后,发现sGP与GP氨基酸序列相同部分形成的空间结构高度相似,因此sGP或可作为GP的替代物。使用牛痘病毒真核表达系统成功表达EBOV GP与sGP,作为亚单位疫苗,分别使用MN与IM进行免疫,评价抗体水平。研究结果表明,MN免疫EBOV GP后刺激产生的抗体水平更高,约是IM免疫产生抗体水平的2倍,其中MN免疫产生抗体的中和抗体效价为900,而IM免疫产生的中和抗体效价为300;此外,MN免疫产生的抗体维持的时间更长,加强免疫后16周,MN免疫产生的抗体水平下降约30%,同抗原使用IM免疫,抗体水平下降约60%。使用sGP作为GP的替代抗原研究中,MN免疫较IM免疫仍然能够刺激产生更高水平的抗体,但产生的中和抗体效价无明显区别。
  为了进一步提高EBOV GP及sGP的免疫原性,我们首次在疫苗配方中加入佐剂Matrix-M并使用MN免疫。研究结果表明,Matrix-M可以显著提高MN和IM免疫GP或sGP亚单位疫苗所诱导的抗体反应,中和抗体效价显著增高,IgG水平约是无佐剂组的5倍,且可以诱导IgG2a的产生,多元化IgG亚型,平衡IgG1/IgG2a的比例。对免疫后小鼠进行致死性EBOV的攻毒试验,结果显示,无论抗原为GP或sGP,免疫方式为MN或IM,Matrix-M作为抗原成分的加入均可对小鼠提供100%的保护率,且小鼠无明显体重下降和临床症状。在无佐剂加入的攻毒试验中,使用MN免疫GP亚单位疫苗后,可对感染致死性EBOV的小鼠提供80%的保护,而IM免疫组的5只小鼠中只有1只存活。综上所述,使用MN免疫GP亚单位疫苗能够有效保护EBOV感染,佐剂Matrix-M的加入,使sGP成为GP有效的替代抗原成为可能。本研究为埃博拉疫苗的开发提供了新的实验及理论基础。
[硕士论文] 樊莹莹
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种重要的人畜共患肠道原虫,它们通常是经过粪-口途径直接进入人或动物的宿主体内,伴随着卵囊的摄取,最终引起人和动物的隐孢子虫病和贾第虫病,并伴随着宿主的腹泻;最近的流行病学研究表明,在隐孢子虫病和贾第虫病中,人畜共患之间的传播起着重要的作用;牛,尤其是乳牛,是作为隐孢子虫病和贾第虫病在人和动物之间传播的重要来源。然而,在一些地区,例如中国湖北省,关于人和犊牛的隐孢子虫和贾第虫的流行病学的数据(比如优势虫种和基因型)却仍是一片空白。为此,本文针对这些问题开展了如下的研究:
  在第1章中,对这两种原生寄生虫的背景知识、关键的物种、生活史、传播途径、病原体的发病机制、诊断及其防控进行详细的介绍;并总结了已有的物种和基因型。通过对分子流行病学调查的总结,提供了对隐孢子虫和贾第虫病防控的研究方向。
  在第2章中,对湖北省武汉市腹泻儿童的隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查进行了首次报道。在2016年6月至2016年8月,对武汉市儿童医院和武汉大学人民医院门诊部的腹泻儿童新鲜粪便样品共计500份进行了隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查,基于SSU基因,tpi基因和ITS基因位点采用Nested-PCR方法对所有样品进行扩增,序列比对结果经遗传进化分析,鉴定出隐孢子虫为C.meleagridis,贾第虫为assemblage A型,微孢子虫的基因型为D型。值得一提的是,在隐孢子虫中,发现了C.meleagridis是该地区的优势虫种,而该虫种主要的宿主是在鸟类中,该发现也为后续对该地区人和鸟之间病原的传播研究奠定了基础。
  在第3章中,进一步对湖北省犊牛进行了隐孢子虫和贾第虫的分子流行病学调查。在2016年9月至2016年12月,对湖北省北部、东部和西部地区的5个奶牛场和1个肉牛场的1-12周龄的断奶前和断奶后的犊牛进行了采样,旨在探索隐孢子虫和贾第虫的优势虫种和基因型。共鉴定出3种隐孢子虫,分别为C.bovis,C.andersoni和C.ryanae;在贾第虫中,确立了贾第虫的assemblage E型;在该研究中,并针对人畜共患之间的传播问题进行了讨论。
  在第4章中,对目前所取得的成果进行了综合性的讨论,并提供了对未来研究的视角和方向;本论文对隐孢子虫和贾第虫在中国湖北省的分子流行病学的调查提供了数据参考;获得的数据提示我们,仍需开展更多的流行病学调查和采集更多的样品进行遗传多样性分析,以便更好的了解这些病原体在中国的传播。
[硕士论文] 宋林栋
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
  本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。
  (1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
  将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
  (2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
  通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。
  (3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
  将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
  (4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
  使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
  本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
[硕士论文] 伍享
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
  1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
  2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[硕士论文] 吴欣瞳
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:
  1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响
  利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。
  2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响
  采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。
  3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
  4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响
  通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。
  5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。
  6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响
  利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。
[博士论文] 刘永相
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:固有免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线,宿主的模式识别受体能够对病原相关分子模式进行识别,进而激活固有免疫系统,最终释放干扰素和炎症因子等一系列细胞因子通过抗病毒或参与炎症反应等发挥作用。Ⅰ型干扰素可以通过JAK/STAT通路激活数以百计的干扰素刺激基因(ISGs)转录表达,从而发挥抗病毒作用。而病毒也进化出了许多对抗宿主抗病毒反应的策略,尤其是对抗宿主的固有免疫系统。因此研究固有抗病毒免疫和病毒对固有免疫系统的抑制,对于基础研究和临床应用都有很大的意义。
  猫杯状病毒(FCV)是杯状病毒科,水疮性病毒属(Vesivirus)成员,感染猫后可引起上呼吸道疾病和急性口腔炎溃疡,病情严重的,可引起感染猫的死亡。同病毒科的人诺如病毒是引起急性胃肠炎和腹泻最重要的病原之一。目前还没有对抗人诺如病毒的有效药物和疫苗,主要原因是一直以来人诺如病毒的体外培养技术都不成熟。此外杯状病毒与宿主免疫系统的相互作用研究相对较少,FCV体外培养技术比较成熟,是目前研究人诺如病毒最好的模式病毒之一,研究FCV与固有免疫系统的关系对整个杯状病毒科的研究都有很重要的意义。
  本研究首先应用蛋白质组学技术筛选FCV感染CRFK细胞前后的差异表达蛋白,共筛选到差异蛋白429个,其中229个蛋白表达量升高,有200个蛋白表达量降低;与固有免疫相关的蛋白有IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等,且这些蛋白表达量都发生了不同程度的下调;其中IFNAR1为Ⅰ型干扰素受体组分,IRF1为Ⅰ型干扰素信号通路重要调控分子,该发现为FCV抑制Ⅰ型干扰素通路研究奠定基础。
  其次,通过IFN-α抗病毒试验,发现IFN-α不能够抑制FCV复制,Western blot和流式细胞术结果表明FCV感染后下调了IFNAR1在细胞表面的表达量,qRT-PCR、半定量PCR和Northern blot结果表明FCV感染后IFNAR1的mRNA表达量减少,最终发现FCV非结构蛋白PP和p30可以抑制共转染质粒的表达,且PP和p30转染后可以使IFNAR1的mRNA表达量降低。
  此外,克隆了猫源IRF1(Fe-IRF1),瞬时转染Fe-IRF1后可以显著抑制FCV的复制。双荧光素酶试验结果表明Fe-IRF1通过激活Ⅰ型干扰素通路发挥抗病毒作用;Western blot结果表明FCV感染可以下调IRF1蛋白表达量;qRT-PCR结果表明FCV感染可以下调IRF1的mRNA表达量。
  总之,本研究应用差异蛋白质组学方法,筛选到FCV感染后下调表达的固有免疫相关蛋白IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等;FCV感染后可以通过下调IFNAR1的mRNA表达,阻断Ⅰ型干扰素通路发挥作用,FCV感染后同时可以下调IRF1的mRNA水平,抑制Ⅰ型干扰素通路发挥作用。最终FCV可以通过两种方式抑制Ⅰ型干扰素信号通路的抗病毒作用。
[博士论文] 程艳洁
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20-23个核苷酸之间的、基因组编码的、进化保守的非蛋白编码RNA,通过靶向mRNA的3'UTR影响靶基因的表达,进而发挥重要的调控作用。近年来,大量的研究结果显示,miRNAs在肝脏的生理病理进程中均发挥重要作用。研究结果显示:PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性;miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。主要成果如下:
  1、PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性。
  某些增塑剂、降血脂药、农用化学品和环境污染物等化合物均是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators,PPs)。适当剂量的PPs引起过氧化物酶体的数量和大小适度增加。但是,高剂量的PPs则会导致不同程度的有害作用。长期向小鼠和大鼠施用PPs会导致其肝肿大,并最终导致肝癌的发生。核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PARA)被证明在这个过程中发挥重要作用。但是,生物体降低过量PPs产生的危害的生物适应性机制尚不清楚。
  研究发现:(1)高剂量PPARA激动剂诱导miR-181a2表达;(2)进一步研究发现,Hsa-miR-181a2启动子区域含有预测的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE),且PPARA直接结合于该元件上;(3)高剂量PPARA激动剂引起ROS、DNA断裂、凋亡等细胞毒性;(4)外源表达miR-181a-5p显著降低PARA过度激活引起的细胞毒性。
  结论:miR-181a2和PPARA之间的反馈环路调节在PPARA被过度激活的情况下促进了生物系统的平衡。这一平衡机制的发现有助于建立更有意义的人体风险评估,并为药物的合理设计提供理论基础。
  2、miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。
  各种慢性肝脏损伤,包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝炎均能引起肝脏纤维化,肝纤维化往往导致肝功能受损,并最终导致肝功能衰竭。肝纤维化的一个典型特征是肌成纤维细胞产生的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的堆积。尽管肝纤维化在慢性疾病中引起明显的发病率和死亡率,但是关于对介导肝纤维化的特定分子的认识并不充分,这在一定程度上妨碍了抗纤维化治疗的设计。据报道,在转基因小鼠肝纤维化过程中肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)占肌成纤维细胞群总量的90%。一直以来,HSCs的激活被认为是肝纤维化过程中的核心事件。作为对传统机制的补充,近年来的研究成果显示,肝星形细胞的EMT在肝纤维化过程中发挥重要作用。在大鼠中,上调肝细胞核因子4a(Hepatocyte nuclear factor4a,HNF4α)可通过抑制激活的星形细胞EMT减轻肝纤维化。有研究报道,HSCs激活后,miR-126的表达发生极显著变化。但其在HSCs中的具体功能及作用机制则未见报道。
  在此,以人源的肝脏星形细胞LX2、肝细胞LO2和大鼠肝脏星形细胞系HSC-T6为主要细胞模型,获得主要研究结果如下:(1)外源表达miR-126-5p诱导了肝脏星形细胞的激活和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT);(2)EMT相关转录因子ZEB1的mRNA水平和蛋白水平在外源表达miR-126-5p后均显著升高;(3)进一步的研究显示,miR-126-5p直接靶向糖原合酶激酶3B(Glycogen synthase kinase-3,GSK3B的3'UTR抑制GSK3B的蛋白水平,并通过Wnt/B-catenin信号通路调控ZEB1的表达;(4)外源表达miR-126-5p和GSK3B抵消了单独表达miR-126-5p对EMT的促进作用。
  结论:miR-126-5p直接参与到肝星形细胞的激活和上皮-间质转化过程,证明了miR-126-5p通过直接靶向GSK3B,进而打开Wnt/B-catenin信号通路,这在诱导肝脏星形细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用,提示miR-126-5p可能在将来作为一个抗纤维化的分子靶标。
[硕士论文] 陈凯
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可以感染几乎所有的温血动物,引起严重的弓形虫病症,造成新生儿流产、死胎等。弱毒活疫苗对控制弓形虫的传播有潜在价值,但报道甚少。MORN基因家族因参与速殖子细胞骨架的形成过程而发挥重要作用,是作为研制抗弓形虫弱毒活疫苗的理想候选基因。本研究的目的在于构建弓形虫MORN1与MORN2基因缺失株,阐明MORN基因家族成员的在弓形虫中的生物学功能,评价它们作为弱毒活疫苗的免疫保护力,探究其作为弱毒活疫苗的潜在价值。
  首先,为研究MORN2基因的生物学功能是否与弓形虫的毒力相关,我们利用CRISPR/Cas9技术,对弓形虫Ⅰ型RH虫株的MORN2基因进行了敲除。利用同源重组,在基因缺失处插入乙胺嘧啶药物抗性的片段DHFR。通过单克隆筛选以及PCR鉴定,成功获得MORN2基因缺失株。对该缺失株进行体外噬斑试验和体内毒力试验后,发现MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和对小鼠感染的毒力。因此我们认为MORN2基因的缺失不影响弓形虫RH虫株的毒力,其缺失株不具备成为弱毒疫苗的可能性。
  然后,为了研究△MORN1弱毒株作为弱毒疫苗的潜在可能性,我们又构建了△MORN1缺失株,评价了该缺失株对小鼠的毒力影响。进而以△MORN1缺失株腹腔接种昆明鼠,并在免疫后28d和70d检测相应的体液免疫和细胞免疫指标变化情况。在免疫70d后进行攻虫实验,对免疫的小鼠通过腹腔注射的方式,分别感染RH、PYS及TgC7三种不同虫株的速殖子103个(急性感染)或通过口服的万式感染PRU包囊20个(慢性感染),检测小鼠的存活时间和包囊减少率。结果表明,经△MORN1缺失株免疫的小鼠血清中抗体水平显著升高,脾细胞产生的细胞因子水平显著升高。在急性感染试验中,免疫鼠够较好地抵御RH、PYS及TgC7三种虫株的感染。在慢性感染试验中,对PRU包囊造成的慢性感染有较好的保护作用,能够有效减少小鼠脑中包囊数量。为了探究△MORN1缺失株对弓形虫垂直传播(先天性感染)的阻断效果,分别在母鼠怀孕第12天和第18天时,口服感染PRU虫株的包囊10个或者腹腔注射RH虫株速殖子200个,观察并记录仔鼠存活数和体重变化。结果显示经△MORN1缺失株免疫的母鼠能够明显地提高仔鼠的存活率及体重,同时减少仔鼠脑中包囊数量。△MORN1缺失株能够对小鼠的急性感染、慢性感染及先天性感染具有保护作用,因此有望成为防控弓形虫病的弱毒疫苗。
  综上所述,本研究通过构建弓形虫Ⅰ型RH虫株的△MORN1与△MORN2缺失株,阐明了MORN1与MORN2基因的生物学功能,进而研究了△MORN1作为弱毒疫苗的潜在价值,发现△MORN1缺失株是理想的弱毒疫苗,为弓形虫疫苗的研制与弓形虫防控奠定了基础。
[硕士论文] 柴淑梅
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病,在我国日本血吸虫病流行区钉螺分布面积仍较大,部分流行区仍存在一定数量的血吸虫病传染源,血吸虫病流行与传播的客观因素以及疫情反复与回升的风险因素依然存在。目前唯一大规模使用的治疗药物吡喹酮不能解决重复感染的问题,新药和疫苗的研制仍是该病研究的重点。东方田鼠是迄今为止发现的唯一一种具有天然抗日本血吸虫病特性的哺乳动物,其抗病机制研究可为血吸虫防控技术研究提供新方向。
  本文应用胸主动脉灌注和组织培养法比较了东方田鼠和BALB/c鼠感染日本血吸虫尾蚴后1d,3d,8d,12d和15d的感染部位皮肤、肺脏和肝脏等处的童虫回收情况,结果两种宿主感染尾蚴后不同时间点虫体总回收率差异较大,东方田鼠为15.04%,7.05%,8.33%,0.48%,0.72%,均低于小鼠的39.24%,38.56%,46.17%,19.02%,43%。结果表明东方田鼠体内日本血吸虫童虫消亡主要发生感染后的皮肤期和肝期。表观病理观察表明,东方田鼠肝脏在感染后10d可见明显的白色异物性包囊,感染后14d该类包囊依然存在,至感染后21d异物性包囊消失,小鼠则始终未见该类异物性包囊出现。组织病理观察表明,东方田鼠感染后10-14d肝血管内可见寄生虫栓子,周围炎细胞浸润,形成嗜酸性脓肿,肝细胞多发灶性坏死,小鼠肝脏病变不明显。血常规分析结果表明,东方田鼠在感染后1-16d白细胞显著升高,白细胞5种分类结果显示主要是中性粒细胞升高。血清生化分析显示,血清白蛋白ALB、HDL-C在感染后升高。东方田鼠血清补体活性CH50为512U/mL,应用RT-PCR和ELISA检测了东方田鼠和BALB/c鼠的补体相关分子C3,C9,CD59和DAF的表达水平,结果小鼠各指标变化不明显,东方田鼠感染后8dC3,C9和CD59转录水平显著升高,DAF感染后12d转录水平显著升高。
  体外杀虫试验结果显示,东方田鼠正常血清和灭活补体血清孵育的日本血吸虫童虫死亡率分别为85.50%±7.15%和60.99%±8.61%,差异显著(p<0.001),扫描电镜观察到二者孵育的童虫体表完整性存在差异,表明东方田鼠补体对日本血吸虫童虫具有显著杀伤效果。利用C1qBP蛋白抑制东方田鼠C1q的血清孵育童虫死亡率显著低于正常血清(P<0.001),而用50℃热灭活东方田鼠血清补体B因子孵育的童虫死亡率没有显著变化,结果表明补体经典途径可能在东方田鼠对童虫杀伤中发挥了重要作用。在体内抑制试验中,注射CVF和PBS对照组的东方田鼠在感染后8d的虫体回收率分别为23.20%和8.54%,15d为1.18%和0.42%,结果表明利用CVF抑制补体后童虫回收率显著提高。
  筛选设计了3条东方田鼠C5基因特异的RNA干扰靶序列,构建了相应的重组RNA干扰慢病毒。LV2重组慢病毒在体外培养的东方田鼠腹腔巨噬细胞中诱导了C5基因转录下降25.76%,为进行东方田鼠RNA干扰活体试验提供了基础。
  综上所述,东方田鼠体内日本血吸虫童虫消亡主要发生感染后皮肤期和肝期,补体在抗感染中发挥了重要作用,经典途径是补体杀伤童虫的重要机制,研究结果为阐明东方田鼠补体抗日本血吸虫特性中的作用和机制提供数据。
[博士论文] 吕权真
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着临床上癌症治疗、器官移植中免疫抑制剂的使用以及艾滋病等疾病导致的免疫受损患者的增多,真菌感染的发病率也在不断攀升。院内血源性感染中真菌感染已经上升至第4位。即便在现有的抗真菌药物治疗下,系统性真菌感染导致的死亡率仍高达40%-70%。现有的抗真菌治疗手段有限,而唑类药物作为常用抗真菌药物出现了严重的耐药现象。在经过唑类药物长期治疗的患者中,分离的白念珠菌对唑类药物的耐药率高达40%。因此,阐明唑类药物的耐药机制,寻找新的抗真菌治疗的手段是临床抗真菌感染急需解决的问题。
  白念珠菌对于唑类药物的耐药机制研究已经取得了一些进展,主要是关于唑类合成通路以及外排泵相关基因的突变和高表达导致的耐药问题。阐明白念珠菌对于靶向于麦角甾醇合成的唑类药物的耐药机制,解决唑类耐药问题,需要彻底阐明白念珠菌麦角甾醇合成通路的调控网络。已有的研究表明,白念珠菌甾醇合成通路主要通过转录因子Upc2p调控相关甾醇合成酶的表达。但在酿酒酵母中,甾醇合成的调控不仅局限于转录水平还包括翻译后调控等方式,但这种翻译后调控的方式在白念珠菌中很少有文献报道,仍需要进一步研究。本文选取了与酿酒酵母中调控羟甲基戊二酰乙酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶稳定性的NSG2同源基因ORF19.273基因作为研究对象,研究其对于甾醇合成通路和唑类药物敏感性的影响。首先,通过HIS1-ARG4-LEU2营养筛选策略和融合PCR的方法构建了白念珠菌ORF19.273(NSG2)敲除菌和回复菌。初步考察ORF19.273缺失菌的表型发现,ORF19.273基因对于白念珠菌增殖速率、菌丝和被膜形成并无影响。而通过药物敏感性考察,发现ORF19.273敲除菌对于唑类药物敏感性升高,但对于唑类药物上游的抗真菌药物洛伐他汀、特比萘酚以及下游的抗真菌药物丁苯吗啉敏感性没有差异,对于两性霉素B耐受。对于洛伐他汀药物敏感性无差异提示ORF19.273和酿酒酵母中NSG2基因功能并不完全一致。透射电镜分析结果显示ORF19.273缺失菌细胞膜会出现轻微缺损,而在氟康唑作用下,ORF19.273缺失菌细胞膜损伤更为严重。除此之外,ORF19.273缺失后细胞膜通透性发生变化,对于不能透过细胞膜的碘化丙啶(PI)通透性增加,说明ORF19.273基因缺失后,白念珠菌细胞膜结构和功能均出现损伤。在白念珠菌中,麦角甾醇合成是影响唑类药物敏感性和细胞膜完整性的重要物质。通过气质联用(GC-MS)分析亲本菌和ORF19.273缺失菌以及回复菌中甾醇的百分比发现,ORF19.273敲除后,含有14α-甲基的甾醇obtusifoliol和14α-methylfecosterol在胞内累积,在氟康唑作用后,亲本菌中累积的主要是lanosterol,而ORF19.273缺失菌中累积的主要是含有14α-methylfecosterol、obtusifoliol、eburicol,这说明ORF19.273基因可以调控白念珠菌中各类甾醇的平衡,而在文献报道中,白念珠菌甾醇分布平衡是维持其对于唑类药物耐受的重要机制。因此,认为ORF19.273主要通过降低细胞内含有14α-甲基甾醇的比例维持白念珠菌对于唑类药物的耐受。体内结果与体外研究一致,在小鼠系统性白念珠菌感染模型中,ORF19.273基因缺失菌感染组在氟康唑治疗后,小鼠肾脏荷菌量和死亡率明显低于亲本菌感染组。本部分研究证实ORF19.273基因通过调控obtusifoliol和14α-methylfecosterol的水平,维持白念珠菌细胞膜完整性和白念珠菌对于唑类药物的耐受。
  除了化学药物治疗外,免疫治疗真菌感染领域也研究较为广泛。白念珠菌作为机会性致病真菌,其致病性与机体免疫系统的状态有着密切关系。近几年,文献已经报道了多种有效的抗真菌感染的单克隆抗体、减毒活疫苗以及重组蛋白疫苗,但关于疫苗的作用机制研究还相对较少。通过研究不同疫苗的作用机制和免疫系统清除真菌的关键环节可以为开发新的抗真菌治疗手段提供思路。本研究中发现白念珠菌转录因子FLO8缺失菌作为基因改造的白念珠菌弱毒株可以激活野生型小鼠的免疫保护作用。尾静脉注射flo8△活菌预免后,小鼠对于侵袭性白念珠菌感染、金黄色葡萄球菌感染以及肺部的烟曲霉菌感染和铜绿假单胞菌感染均能产生较好的免疫保护效果。通过长期预免策略,发现flo8△活菌可以刺激机体产生高水平的与白念珠菌结合的抗体,flo8△活菌预免的血清可以增强巨噬细胞对于白念珠菌的调理杀伤能力。在短期预免保护策略中发现flo8△活菌的保护作用不仅仅依赖于抗体,更依赖于其刺激产生的抗炎因子IL-10,IL-10可以降低正常毒力菌株SC5314二次感染时造成的急性炎症损伤,减少单核细胞和中性粒细胞的募集。同时IL-10可以保护胸腺在白念珠菌感染过程中不发生萎缩,通过上调抗凋亡基因BCL-2和BCL-XL的表达抵御白念珠菌感染引起的CD4+CD8+细胞凋亡。通过分析FLO8基因缺失菌细胞壁成分的变化,发现FLO8基因缺失菌表面的甘露聚糖,尤其是血清诱导后的甘露聚糖刺激巨噬细胞产生IL-10的水平升高。小鼠腹腔注射FLO8缺失菌甘露聚糖后,二次感染SC5314时,小鼠肾脏荷菌量降低,生存率升高,这说明FLO8表面的甘露聚糖是FLO8基因缺失菌诱导免疫保护效应的基础。在体外刺激巨噬细胞时,还发现FLO8缺失菌经过血清诱导后,可以特异性刺激巨噬细胞产生NO。标准菌株SC5314则需要在Pam3CSK4协同下刺激巨噬细胞产生NO,说明FLO8缺失后白念珠菌表面刺激NO产生的抗原增多,后来经过分离提取确定是白念珠菌氯仿甲醇提取物中的正丁醇部分能够刺激巨噬细胞产生NO。但体内研究发现,NO并不参与FLO8基因缺失菌诱导的免疫保护效应。综上所述,FLO8基因缺失菌主要通过表面的甘露聚糖刺激CARD9介导的IL-10的生成保护二次感染后小鼠的胸腺并提高小鼠的生存率。这种免疫保护机制可以为后续疫苗的开发以及抗真菌治疗提供新的理论指导。
[硕士论文] 孟欣
化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肝硬化是肝脏疾病引起死亡的主要病症,而肝纤维化是肝硬化的重要过程。此过程可逆,通过治疗肝纤维化成为预防和治疗肝硬化的重要手段。肝纤维化的重要特征为细胞外基质的增殖与沉淀,主要来源是肝星状细胞活化增值及上皮细胞间质转型等形成肌成纤维细胞。α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白为肝星状细胞活化增值及上皮细胞间质转型的主要生物指标,可以通过检测两者的表达水平来检验肝纤维化的发生。木犀草素(Lut)作为一种天然黄酮类化合物可以有效降低肝组织中的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA水平,抑制肝星状细胞的活化和胶原的合成,有效缓解肝纤维化程度。近期研究发现核糖体蛋白S5(RPS5)可以通过抑制肝星状细胞的活化,参与苦参碱及其衍生物治疗肝纤维化的过程,推测RPS5为治疗肝纤维化的靶蛋白。然而Lut治疗肝纤维化机制是否也与RPS5有关目前尚不清楚。本课题组前期研究发现,体外表达His6-Tag-RPS5与Lut有一定的结合,但是结合位点尚不明确。
  本论文主要研究了RPS5在Lut治疗肝纤维化过程中的作用,并通过体外表达纯化RPS5及其突变体、研究它们与Lut的结合来探索Lut-RPS5的结合区域及结合位点,从分子结构角度初步探讨RPS5参与Lut抗纤维化的作用机制。首先采用RPS5siRNA(small interference RNA)干扰肝星状细胞内RPS5mRNA表达水平,通过RNA抽提、反转录PCR与荧光实时定量PCR(Real-time PCR)等方法检测出干扰RPS5表达后,α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平明显增加,而加入Lut则可反转这一现象,表明RPS5参与了Lut治疗肝纤维化的过程;然后通过克隆RPS5片段与pET-28a载体连接,构建重组质粒pET-28a-RPS5,转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,并对表达条件进行探索和优化,使RPS在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达,通过离子交换层析柱分离、复性,凝胶过滤柱纯化,得到纯度高达95%的RPS5蛋白;再利用DS3.5分子模拟软件模拟RPS5与Lut的结合,分析可能的结合区域及结合位点,通过表达、纯化可能结合位点的蛋白突变体,用OCTET、Biacore检测Lut与RPS5、蛋白突变体的结合常数,初步确定区域Ⅰ(MET76~LYS85、ARG159)和区域Ⅱ(ARG60~GLN65、ARG145)为可能的结合区域,其中Lys63、Arg81、Lys85、Lys193及Arg145为可能的结合位点。
  通过上述研究,我们从分子生物学方面表明核糖体RPS5蛋白参与了Lut治疗肝纤维化过程;构建了RPS5原核表达体系,得到纯度的RPS5蛋白;通过计算机模拟,结合蛋白质定点突变和OCTET、Biacore技术,初步确定了RPS5与木犀草素的可能结合区域和可能结合位点,这为进一步阐明Lut抗肝纤维化的作用机制,对以RPS5为靶分子、以Lut为母体,设计新型抗肝纤维化药物具有重要意义。
[硕士论文] 高阳
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是最严重的心房电活动紊乱,也是临床上最常见的心律失常。关于AF的具体发生机制尚未完全明确,这严重制约着临床上AF治疗的有效性及安全性。大量研究表明,心房肌细胞内钙稳态异常,特别是钙泄漏是AF发生、发展的重要机制之一。而钙稳态主要受到心肌细胞肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)上雷尼丁受体(Ryanodine receptor2,RyR2)的调控。RYR2作为最主要的钙释放通道,在心肌的舒张期应保持理想的关闭状态。如舒张期RyR2异常开放,会引起肌浆网的钙泄漏(Ca2+leak)增多,Ca+通过胞膜上的钠钙交换体(NCX)外排,产生异常的净内向阳离子移动,进而导致心肌细胞延迟后除极(Delayed afterdepolarization,DAD)。一旦达到心肌细胞兴奋的阈值,即可诱发自发性的动作电位(action potential,AP);如多处心肌细胞同步出现自发AP等异位电触发活动,在业已存在心房扩大或纤维化等心房重构基质的基础上,则可引发AF。晚近研究发现,RyR2的稳定性受到亲联蛋白(Junctophilin,JPH)-2(JPH2)的调控,JPH2可通过和RyR2结合对影响RyR2的稳定性。近来研究发现,快速心房搏动导致心肌细胞内钙浓度增加,可激活Calpain-Ⅰ,而且其激活程度随AF持续时间的延长而逐渐增高,因此推测,高频率心房搏动可导致心房肌细胞内Ca+超载,进而可能激活Calpain-Ⅰ,降解JPH2蛋白,导致钙泄漏增多,最终引发AF的发生。本研究拟通过临床及动物研究明确在AF发生中Calpain-Ⅰ与JPH2蛋白水平的相关关系。
  研究目的:
  1、明确Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生的相关性;
  2、明确快速心房起搏通过诱导Calpain-Ⅰ/JPH2表达变化,影响钙稳态,导致房颤的发生。
  研究方法:
  (一)房颤患者左心房Calpain-Ⅰ与JPH2的表达变化研究
  1、研究对象
  选取在海军军医大学附属长征医院心脏外科行瓣膜手术的患者64例,所有患者签署手术知情同意书及剩余标本使用知情同意书。
  2、研究分组
  根据患者病史及术前心电图将患者分为两组:房颤组(AF组,n=32)和窦性心律组(SR组,n=32)。
  3、标本及临床资料采集
  收集手术中切除的左心房(LAA)及所有入院患者的一般临床资料。
  4、分子生物学指标检测
  (1)采用组织块酶消化及荧光染色的方法,评价心房肌细胞胞内钙离子浓度;
  (2)利用试剂盒检测不同分组心房肌组织Calpain-Ⅰ酶活;
  (3)性采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2mRNA表达水平:
  (4)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;
  (二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究
  1、兔AF模型的建立与鉴定
  (1)研究对象:成年新西兰大白兔,体重约2.0-2.5kg;
  (2)模型制备及实验分组:开胸将刺激电极缝合与左心耳表面,用阈上刺激连续刺激,观察刺激有效后关胸。手术组依据实验要求分为RAP组和RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组,RAP组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时予以腹腔注射二甲基亚砜制剂(DMSO,MDL28170的溶剂),连续给药4w。RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时腹腔注射带有MDL28170(Calpain-Ⅰ特异性抑制剂)的溶液,连续给药4w。假手术组仅进行开关胸操作,在术后1w后开始腹腔注射DMSO,连续给药4w;
  (3)模型鉴定:利用遥测系统记录兔AF发生情况及持续时程(>5min为持续性AF,<5min并且能够自行终止者为非持续性AF或阵发性AF)。
  2、标本采集
  术后5周处死实验动物,部分用于分离心肌细胞,部分用于分子生物学指标检测。
  3、分子生物学研究
  (1)利用试剂盒检测不同分组Calpain-Ⅰ酶活性;
  (2)采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2mRNA表达水平;
  (3)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;
  (4)采用Langendorff灌流及荧光染色法,评价心房肌细胞内钙离子浓度:
  (三)统计学方法
  所有数据采用SPSS21.0进行统计分析,P<0.05表示差异存在统计学意义。
  研究结果:
  (一)房颤患者左心房Calpain-Ⅰ与JPH2的表达变化研究
  1、AF组与SR组患者一般临床资料无明显差异(P>0.05);但AF患者LAD明显大于SR组患者(53.97±8.37vs41.81±8.18,尸<0.05)。
  2、AF组心肌细胞内钙离子相关的荧光强度明显高于SR组,且AF组细胞内平均荧光强度明显高于SR组(20.56±1.98vs8.92±1.26,P<0.01)。
  3、以SR的OD值为基准,AF组Calpain-Ⅰ酶活性明显高于SR组(P<0.05)。
  4、以SR组的mRNA表达量为基准,AF组患者左心房肌组织中JPH2mRNA的表达水平与SR组差异无统计学意义(P>0.05)。
  5、AF组JPH2蛋白表达较SR组明显下调(0.53±0.14vs0.82±0.27,P<0.01);但AF组Calpain-Ⅰ蛋白表达较SR组显著上调(0.89±0.09vs0.46±0.09,P=0.015)。
  6、AF组左心房肌Calpain-Ⅰ与JPH2蛋白水平呈现明显负相关(P<0.01)。
  (二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究
  1、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的房颤发生率(P<0.01)。
  2、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的酶活性增加(P<0.01)。
  3、Calpain-Ⅰ抑制剂对JPH2mRNA表达水平无影响(P>0.05)。
  4、Calpain-Ⅰ抑制剂可抑制RAP导致的JPH2蛋白降解(P<0.05)。
  5、房颤兔心房肌中JPH2与Calpain-Ⅰ蛋白水平呈现负相关(P<0.01)。
  6、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的心肌细胞内钙离子浓度增加(P<0.01)。
  研究结论:
  (一)Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生密切相关;
  (二)Calpain-Ⅰ可通过降解JPH2蛋白,影响心房肌细胞内钙稳态,诱发房颤的发生。
[硕士论文] 奂剑波
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:海难或海战时落水人员浸泡于海水中,发生海水浸泡性体温过低症的概率较大。马岛海战中,阿根廷“贝尔格拉诺将军号”巡洋舰遭英潜艇鱼雷攻击后迅速沉没,舰员落水和失踪达320人,大多数舰员落水后因低温海水浸泡而死亡[1]。目前对海水浸泡体温过低症致伤机制与救治的认识尚不完全清楚,即使采用及时的救治措施,重症低温伤员救治成功率仍然低于50%[2,3]。由于海上搜救伤员的难度较大,如处于战争时期,落水人员的救治通常需要等待较长时间[4]。在20℃以上海水中,落水人员的生存时间明显延长。既往体温过低症动物模型通常在短时间内致伤,并不能很好反映长时程海水浸泡导致的慢性体温过低症的病理生理改变。
  及时恰当的复温是海水浸泡性体温过低症早期救治的关键措施。既往国内外研究大多关注急性重度体温过低症伤员的主动体内复温措施,如CRRT或者ECMO等[4]。体表复温由于其可能产生“复温性休克”或者“后降效应”等在救治实践中应用尚存在争议[7,8]。而在长时程海水浸泡导致的慢性体温过低症的救治中,如果伤员的意识清醒,海战环境下,无高级的复温设备,无专业的医务人员时,紧急采用温水浴复温等体表复温对海水浸泡性体温过低症伤员进行救治的利与弊难以把握,与被动复温相比对机体的影响仍不清楚。另外,海水浸泡性体温过低症肺损伤相关并发症发生率最高,其死亡率高达66.7%[9],如不正确及时处理可能对体温过低症最终救治成功率产生影响。血清酶学指标改变如肝功、肾功、心肌酶等可反映机体重要脏器的病理生理状态,体温过低症时其变化也较大。观察复温措施对于肺脏病理损伤和重要血清酶学的影响可一定程度上评估该复温方法的有效性。
  为了对长时程海水浸泡导致的体温过低症的病理生理改变有更深刻的认识,并为后续研究打下基础,建立了长时程海水浸泡导致的体温过低症SD大鼠模型,并对其进行重要脏器病理学改变进行横断面的观察研究,发现该模型中肺脏是重要的低温致伤靶器官,并发现了低温性胸水,且血清酶学改变明显。在此基础上采用温水浴和被动复温两种不同方法对大鼠进行复温,比较复温前后体温过低症大鼠肺脏损伤程度及血清酶学等指标的变化,以此初步评价温水浴复温在紧急状态下对长时程海水浸泡性体温过低症复温的效果。
  第一部分:长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型的建立
  目的:建立长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型。
  方法:成年雄性SD大鼠20只,随机均分为正常对照组和低温实验组,每组10只。正常对照组不做处理,低温实验组采用自制大鼠水浴固定器在20℃人工海水中浸泡24h,观察大鼠生命体征变化,实验结束后检测各部位体温,常见血液学指标及重要脏器病理学改变。
  结果:低温实验组大鼠低温海水浸泡过程中,心率、呼吸、意识等与正常对照组相比明显下降,浸泡结束后核心温度接近20℃。血液学指标明显异常,病理学提示重要脏器均出现不同程度损伤。肺脏病理损伤较为严重,出现肺泡结构破坏、肺泡及间质出血、炎性细胞浸润等改变。
  结论:长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型建立成功,肺脏为重要的损伤靶器官,可用于后续相关研究。
  第二部分:温水浴复温对长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠肺损伤及血清酶学的影响
  目的:比较温水浴复温与被动复温,长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠复温前后肺脏病理及血清酶学变化,初步评估温水浴复温在长时程海水浸泡体温过低症救治中的效果。
  方法:100只雄性SD大鼠随机均分为正常对照组(不做任何处理),低温实验组(20℃海水浸泡24h),被动复温组1、2、3、4(20℃海水浸泡24h+被动复温,分别在复温后0h、3h、6h、12h处死),温水浴复温组1、2、3、4(20℃海水浸泡24h+温水浴复温,分别在复温后0h、3h、6h、12h处死),每组10只。主要检测肺脏病理学及血清肝功、肾功、心肌酶等指标改变。
  结果:温水浴复温与被动复温对长时程海水浸泡体温过低症大鼠肺损伤及血液学异常均有恢复作用。与被动复温组相比,温水浴复温组大鼠在复温后6h、12h,肺脏病理损伤恢复更好,P<0.05;在复温后6h实际碳酸氢盐恢复更好,P<0.05;在复温后0h肝功能指标升高更少,复温后3h、6h恢复更好,P<0.05;在复温后0h肾功能指标升高更少,复温后3h、6h、12h恢复更好,P<0.05;在复温后0h心肌酶指标升高更少,复温后3h、6h恢复更好,P<0.05。
  结论:与被动复温相比,温水浴复温对长时程海水浸泡体温过低症大鼠肺损伤及血液学异常的修复作用更明显。温水浴复温在海战中长时程海水浸泡导致的体温过低症伤员的紧急复温中效果优于被动复温。
[硕士论文] 朱邦晖
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由肺内或肺外因素引起的,以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征。ARDS在烧伤创伤等重症ICU患者中发生率高,死亡率高,救治难度大,是临床面临的普遍难题,也是临床和基础研究的热点话题。
  基础研究发现,ARDS发病机制是全身失衡的炎症反应介导的肺实质性损伤,其中炎症因子尤其是炎症因子的级联放大效应发挥了重要作用。ARDS发生过程中产生的炎症因子,部分可成为独立损伤因素,参与ARDS的发生发展。
  CD74是细胞膜上一种由232个氨基酸组成的单次跨膜受体蛋白,膜上CD74能够和巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)相互结合参与ARDS的发生发展。膜上CD74蛋白分为三段结构,其中1-46位氨基酸位于细胞膜内,47-72位氨基酸是跨膜序列,73-232位氨基酸位于细胞膜外被称为膜外段。
  可溶型CD74分子(soluble CD74,sCD74)是CD74分子的细胞膜外段。2014年耶鲁大学的Richard Bucala教授团队在自身免疫性肝病中首次报道了sCD74的存在,初步证实了sCD74在免疫疾病中的重要作用。Kim团队也发现了非存活的烧伤患者的血清中,sCD74在烧伤后12h时含量较低,但24h后开始逐渐升高。
  我们实验团队前期对sCD74做了部分研究,发现在ARDS小鼠模型中,小鼠外周血清和肺泡灌洗液中均存在sCD74,并且sCD74的含量和ARDS的严重程度成正相关。此外,小鼠肺泡灌洗液中sCD74含量和炎症因子TNF-α、IL-6含量呈正向回归关系。在临床研究中发现,ARDS患者早期血清中sCD74水平显著升高,并且升高的sCD74和ARDS患者不良预后密切相关。
  这些结果均提示sCD74可能参与ARDS发生和进展过程。那么其在ARDS过程中究竟扮演什么样的角色?是否和其他炎症因子一样作为独立损伤因素加重肺损伤?目前还没有相关文献报道。因此本课题分别在体内和体外证实了sCD74能促进小鼠肺组织和肺相关细胞的炎症反应,并初步探讨了其可能的机制,证实sCD74是通过激活炎症经典信号通路NF-κB来促进炎症反应的。
  第一部分:sCD74气道滴入诱发小鼠炎症反应(体内实验)
  研究目的:在动物水平探究sCD74是否促进小鼠肺组织发生炎症反应
  研究方法:通过气道滴入方式探究sCD74对小鼠肺组织的影响,根据sCD74刺激作用时间的不同分为2h、6h、8h、12h、24h组,根据sCD74刺激剂量不同分为0.01、0.1、0.5、1、2mg/kg等浓度梯度,同时加入Ig-Fc蛋白作为实验对照,在指定时间内收取小鼠外周血清、肺组织、肺泡灌洗液等标本。采用RT-PCR法检测肺组织炎症基因相对表达量;通过ELISA法检测肺泡灌洗液中炎症因子的含量;通过BCA蛋白定量法检测肺泡灌洗液中总蛋白含量;通过肺干湿比探究肺水肿程度;通过HE染色了解肺大体损伤情况;通过ELISA法检测外周血清中炎症因子含量。
  研究结果:肺组织炎症基因TNF-α、MIP-2和IL-6在0.5mg/kgsCD74气道滴入2h后分别增高2.1、3.4和2.8倍,之后炎症基因逐渐降至正常对照水平。肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α、MIP-2含量随时间变化先增高后下降,8h是炎症因子分泌的高峰点,分别为560pg/ml和107pg/ml。在浓度效应上,炎症基因相对表达量和炎症因子含量和气道滴入浓度存在依赖关系。sCD74和Ig-Fc蛋白相比在促进炎症基因的高表达和炎症因子的分泌方面都有统计学差异。气道滴入sCD74后小鼠肺泡灌洗液中总蛋白含量、肺组织干湿比和外周血清炎症因子和对照组相比均无统计学差异,肺HE染色显示无明显损伤。
  研究结论:气道滴入sCD74能够引起小鼠肺局部的炎症基因高表达和相应的炎症因子的分泌,但对于肺整体的炎性损伤作用和全身炎症反应影响较小。
  第二部分:sCD74诱导肺相关细胞发生炎症反应(体外实验)
  研究目的:在细胞水平探究sCD74是否促进肺相关细胞产生炎症反应
  研究方法:分别选用RAW264.7作为肺巨噬细胞代表,A549作为肺上皮细胞代表,HUVEC作为肺血管内皮细胞代表,在三种细胞系中探究sCD74的生物学作用。根据sCD74和细胞共孵育时间不同分为2h、8h、12h、24h组,根据和细胞共孵育sCD74浓度的不同分为10、100、1000ng/ml组,在相应的时间内收集细胞和细胞上清。采用RT-PCR法分析细胞中炎症基因的相对表达量,采用ELISA法检测细胞上清中炎症因子的分泌情况。
  研究结果:1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞,在2h时炎症基因TNF-a、MIP-2和IL-6相对表达量增高最明显,分别增高4.0、11.8、2.6倍,之后炎症基因逐渐降至正常对照水平。巨噬细胞上清液中炎症因子TNF-a和MIP-2含量随着刺激时间的延长和刺激浓度的增高而增加。sCD74能够在8h时刺激A549和HUVEC细胞炎症基因TNF-a和IL-6高表达,但对炎症因子的分泌无影响。
  研究结论:sCD74能够促进肺相关细胞炎症基因表达增加,同时也能刺激巨噬细胞分泌炎症因子增多。
  第三部分:sCD74调控肺炎症反应机制的探究
  研究目的:1.探究sCD74促进炎症反应的信号通路。2.sCD74细胞膜受体的初步探究。
  研究方法:1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞0、10、30min后分别提取胞质和胞核蛋白,采用Western Blotting检测胞质中IκB、phosphate-IκB、P65、phosphate-P65和胞核中phosphate-P65蛋白表达情况。采用BAY11-7082预处理巨噬细胞30min后,再重复上述实验,检测检测上述信号通路蛋白表达的变化。采用BAY11-7082预处理巨噬细胞30min后,1000ng/ml sCD74刺激巨噬细胞24h,用ELISA法检测细胞上清中炎症因子分泌的变化。在A549、HUVEC、HEK293、Jurkat、RBL和RAW264.7等细胞系中,采用流式细胞技术分析hsCD74和它们细胞膜的结合情况。
  研究结果:sCD74刺激巨噬细胞后,细胞质中phosphate-IκB、phosphate-P65和细胞核中phosphate-P65蛋白含量明显增多。NF-κB通路抑制剂处理后上述增高的通路蛋白又明显降低。BAY11-7082预处理巨噬细胞能够有效抑制sCD74分泌炎症因子。hsCD74能够以剂量依赖的方式和多种人源性细胞(A549、HUVEC、HEK293、Jurkat)膜结合,hsCD74不能和大鼠源性(RBL)和小鼠源性(RAW264.7)细胞膜结合。
  研究结论:sCD74能通过激活NF-κB通路促进肺炎症反应的发生。hsCD74能够和多种人源性细胞细胞膜结合。
[硕士论文] 傅维佳
内科学(传染病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:随着HBsAg定量检测技术的发展,临床研究发现HBsAg定量水平在抗病毒治疗过程中有重要的意义。但是HBsAg不仅来源于Dane颗粒(含有完整病毒核酸的感染颗粒),还有更多来源于管状或球形颗粒(非感染性的病毒空壳),所以HBsAg水平与抗病毒治疗并不完全平行,且目前缺乏大样本的临床研究,尚未形成标准化的评价体系。本研究旨在通过回顾性研究,观察核苷(酸)类药物长期治疗的CHB患者其基线HBsAg、HBeAg及HBVDNA定量水平及治疗过程中的动态变化,分析这些指标在CHB患者治疗过程中的临床意义。
  方法:回顾分析从2012年1月至2016年12月期间在第二军医大学附属长海医院感染科就诊及随访的4000例初治慢性乙肝患者,收集相关的临床病例资料,分析指标包括HBsAg、HBeAg、HBVDNA、年龄、性别,共筛选出其中资料齐全的940例样本进行分析。
  结果:1.HBeAg阳性CHB患者(439例)年龄小于HBeAg阴性组(501例),基线HBsAg,HBVDNA定量水平大于HBeAg阴性组。2.HBeAg阳性组中,基线HBsAg与HBeAg,HBVDNA呈正相关,基线HBeAg与HBVDNA呈较弱的正相关。3.HBeAg阴性组中,基线HBsAg与年龄成显著的负相关,与HBVDNA不相关。4.HBeAg阳性组中,经过长期抗病毒治疗,HBsAg,HBeAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到SR。经过4年抗病毒治疗,达到SR者138例,其中ETV组35,LDT组75,LDT+ADV组11,ETV+ADV组9,LAM+ADV组8例。5.HBeAg阴性组中,经过4年抗病毒治疗,全部达到VR,HBsAg,HBVDNA定量水平均有明显下降。没有发现对疗效有预测价值的因素。
  结论:HBeAg阳性CHB患者,抗病毒治疗初始6个月HBsAg定量水平下降速率越高,基线HBsAg,HBeAg定量水平越低时越有可能达到血清学应答。HBeAg阴性组中,没有发现对应答有预测价值的因素。
[硕士论文] 周桑
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:通常认为哺乳动物缺乏心脏再生能力,因心梗等原因导致心肌损伤时可出现心力衰竭及一系列并发症,甚至发展至难治性心衰。对于难治性心衰患者,仅有心脏移植治疗可得到较好的预后,心脏供体的来源稀少及经济负担的沉重限制了心脏移植的应用,急性失代偿期心衰患者的1年内死亡率高达30%。2009年Bergmann依据大气层C14浓度的变化,证明了人的心肌细胞存在一定程度的再生能力,但再生的速率极低,成人心肌细胞的年再生速率约为0.5-1%,无法在心肌细胞大量损伤(如心肌梗死)后补充足够的心肌细胞。
  如何促进人体内心脏再生速率,找到心脏再生的关键调控点成为了心脏再生领域研究热点。而microRNAs及其靶基因在心脏再生信号通路及信号网络中的广泛参与使其成为了较好的切入点和潜在的药物作用靶点。Beauchemin报道miR-101a通过靶基因cfos调节心脏再生过程,Yin等人通过微阵列分析发现miR-133在斑马鱼心脏再生期间表达下降,而抑制miR-133的表达可通过上调细胞连接蛋白cx43促进心脏再生。另外Hosoda等发现miR-499可通过缝隙连接在细胞间传输,调节心脏祖细胞向成熟心肌细胞的分化。研究者报道miR-1受MyoD和Mef2的直接调控,既可降低Notch蛋白的表达,又可抑制靶基因Hand的表达,而Notch信号和Hand均是心脏再生重要的参与者,而Notch信号的调控者除了miR-1外,还有miR-34、miR-124、miR-19a、MicroRNA-21-5p、miR-100、miR-126等。另外有研究者发现心脏部分切除引起的心肌细胞缺氧状态是心脏再生的启动信号,而非心脏部分切除本身,而缺氧的直接效应分子缺氧诱导因子HIFs可作用于JAK-STAT通路,JAK阻断剂可使microRNA(miR-1、miR-133、miR-208、miR-499)介导的小鼠成纤维细胞向心肌样细胞转化的效率大大提高。但是目前心脏再生领域的研究仍未成功逆转心衰,寻找心脏再生的关键靶点需要更多的研究。
  本研究意在通过观察斑马鱼和出生7天之内的乳鼠和心脏再生时microRNA表达谱的变化,通过初步的筛选和验证,选出斑马鱼心脏再生和出生7天内乳鼠心脏再生过程中的变化明显的microRNA及其关键靶基因并研究该microRNA及其靶基因在心脏再生中的作用。
  第一部分 斑马鱼心脏再生模型的建立
  目的:建立稳定、可靠的斑马鱼心脏再生研究平台,探讨斑马鱼麻醉过程中三卡因浓度对其心脏手术后生存率的影响。
  方法:以经典实验方法中的三卡因(MS-222)浓度150mg/L为对照,分别用浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、200mg/L的MS-222麻醉液麻醉,将麻醉好的鱼体倒置在斑马鱼固定海绵内,显微镜下使用维纳斯剪分离胸部组织暴露斑马鱼心脏,在心尖切除其心室的20%左右,观察斑马鱼术后行为及术后生存率的差异。
  结果:斑马鱼心脏切除面积的大小和斑马鱼术前麻醉深浅等影响着斑马鱼心脏部分切除术后生存率的高低,实验中首先根据术前麻醉时斑马鱼的入麻行为及术后行为定义了斑马鱼的麻醉分级。随着MS-222浓度的提高,斑马鱼表现为入麻时间的逐渐减少、苏醒时间的逐渐增加。MS-222麻醉斑马鱼成鱼的有效浓度为40~160mg/L,在此浓度范围内,鱼体能够在3min内达到可施行手术操作的麻醉状态(Ⅱ或Ⅲ期),10min内可苏醒恢复;在有效浓度范围内,随着浓度的增大,斑马鱼的术后存活率逐渐下降;在经典麻醉浓度下,斑马鱼术后存活率为68.33%,当MS-222浓度为40mg/L时斑马鱼的术后存活率最高(98.3%),MS-222浓度为200mg/L时斑马鱼的术后存活率最低(63.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:成功构建斑马鱼心脏再生模型,并对切除面积,斑马鱼鱼龄等参数进行了优化,当MS-222浓度为40mg/L,心室切除面积为20%时,斑马鱼入麻及苏醒较为平稳,术后斑马鱼复苏时间较短,且保持了较高的术后生存率。在实验操作或者生产应用时推荐MS-222麻醉药液最佳麻醉浓度为40mg/L,所对应的麻醉时间约为15分钟左右。
  第二部分 MicroRNA在斑马鱼心脏再生中的表达谱分析及验证
  目的:筛选并验证在斑马鱼心脏再生中表达差异明显的microRNA。
  方法:将斑马鱼分为手术组与假手术组,分别进行心脏部分切除术和假手术(仅打开胸腔),术后第10d提取RNA进行microRNA的高通量测序,包含心脏假手术组和心脏部分切除后10d组各-3本(每个样本6鱼)。根据高通量测序结果,分别针对变化明显的microRNA对斑马鱼心脏部分切除后第3、7、10、15、60d心脏RNA进行定量PCR检测。选择变化最为明显的microRNA并通过生物信息学检索和文献分析,预测该microRNA的靶基因,建立乳鼠原代心肌细胞的培养方法,利用缺氧诱导心肌细胞增殖,通过RT-PCR验证高通量测序结果及靶基因预测结果。选择变化明显的靶基因,通过荧光素酶报告基因实验验证microRNA与预测靶基因的相关关系。
  结果:完成斑马鱼心脏再生模型中microRNA表达谱的高通量测序,对比心脏再生组与对照组之间,明显上调的microRNA有:microRNA-21-5p,microRNA-2188-5p,microRNA-19-5p,microRNA-199-3p,microRNA-731-5p,microRNA-222b-3p。明显下调的microRNA有:microRNA-301c-5p,microRNA-100-2-3p,microRNA-92b-3p。RT-PCR验证结果提示microRNA-301c-5p下调最为明显(0.29倍,第3d)和microRNA-21-5p上调最为明显(8.57倍,第7d)。同时通过生信分析,利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNA四个数据库的重合结果及文献检索,选择了Dnm11、Arhgap24、Cacybp、Alx1、per2、pitx2、Pja2等为mo-microRNA-21-5p的预测靶基因。建立乳鼠心肌细胞的原代培养方法,通过低氧诱导心肌细胞增殖,重新验证高通量测序结果及靶基因预测结果,发现MicroRNA-21-5p水平的上调与Alx1和pja2的下调具有时间相关性。通过双荧光素酶报告基因实验证实microRNA-21-5p在离体体系中能够调控Alx1和Pja2的表达。
  结论:在斑马鱼心脏再生中及低氧诱导乳鼠原代心肌细胞再生过程中microRNA-21-5p上调明显,同时microRNA-21-5p水平的上调与其预测靶基因Alx1和Pja2的下调具有时间相关性。双荧光素酶报告基因实验证实microRNA-21-5p在离体体系中能够调控Alx1和Pja2的表达。
  第三部分 microRNA-21-5p及Pja2在乳鼠心脏再生中的作用和机制
  目的:建立稳定的乳鼠原代心肌细胞培养体系,探讨过表达及敲低microRNA-21-5p和Pja2对于乳鼠心脏再生过程的影响。
  方法:设计并合成microRNA-21-5p的mimic和inhibitor、Pja2和Alx1的siRNA,转染乳鼠原代心肌细胞并验证其过表达和沉默效率,以EDU作为心肌细胞增殖指标,通过免疫荧光实验检测乳鼠心肌细胞增殖水平的变化。根据实验结果,合成microRNA-21-5p敲低腺病毒及Pja2过表达腺病毒进一步验证。
  结果:乳鼠原代心肌细胞转染mir21-5p inhibitor后,mir21-5p表达水平降低同时Pja2表达水平升高,;转染mir21-5p mimic后,mir21-5p表达水平升高同时Pja2表达水平降低;转染Pja2siRNA后,Pja2表达水平明显降低,但mir21-5p表达水平无明显差异。免疫荧光显示microRNA-21-5p mimic过表达microRNA-21-5p使心肌细胞增殖率增加了45.3%(P<0.05);microRNA-21-5p inhibitor使心肌细胞增殖率降低了44.5%(P<0.05);siRNA沉默Pja2使心肌细胞增殖率增加了64.73%(P<0.05);siRNA沉默Alx1对心肌细胞增殖率没有显著影响,microRNA-21-5p敲低腺病毒感染心肌细胞使心肌细胞增殖率降低了53.2%(P<0.05),Pja2过表达腺病毒感染心肌细胞使心肌细胞增殖率下降了76.5%(P<0.05)。MicroRNA-21-5p对心肌再生的促进作用可能是通过抑制Pja2表达实现的,而Alx1虽受microRNA-21-5p的调控,但并不参与心脏再生过程。
  结论:在乳鼠心肌细胞增殖过程中,microRNA21-5p可调控Pja2的表达,并促进心肌细胞增殖水平;而直接敲低Pja2对心肌细胞再生也有明显促进作用,但对microRNA21-5p的表达没有明显影响。下调microRNA-21-5p可使乳鼠心肌细胞增殖水平明显降低,microRNA-21-5p对乳鼠心脏再生的调节作用可能是通过抑制Pja2的表达实现的。抑制Pja2表达对心脏再生明显的促进作用提示Pja2可成为新的药物作用靶点。
[硕士论文] 郑仕清
外科学(烧伤外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在过去的三十年中,糖尿病在全世界范围内已成为一种新型“流行病”,目前我国的糖尿病患者已超过1亿,居全球第一位。对于糖尿病患者而言,任何创面均有可能发展形成严重感染的慢性创面,甚至造成截肢,严重影响愈合及患者生存质量。在控制血糖的前提下,对于创面彻底清创、避免感染,促进创面愈合是糖尿病创面主要的治疗方式。但是传统方法存在治疗时间长、次数多、复发率高的问题,临床对于新型有效的治疗方法需求极大。
  羊膜位于胎盘最内层,厚度约为8-12um,不含神经及血管。研究表明羊膜具有促进细胞迁移及扩增、免疫源性低、减轻炎症、含有大量的生长因子和细胞因子等特点。自1910年羊膜首次作为敷料用以创面治疗以来,随着保存技术的发展,使羊膜在眼科疾病、烧伤救治、整形修复、口腔疾病及神经外科等领域都有广泛的应用。羊膜上皮层是由单层立方上皮细胞构成,称之为羊膜上皮细胞。多项研究表明,人羊膜上皮细胞表达多种干细胞标志物,并具有向三个胚层分化的能力,而且能够分泌多种生长因子。同时因其来源广泛和便于分离,无免疫源性和致瘤性,使羊膜上皮细胞成为移植和再生医学潜在的细胞来源。羊膜上皮细胞在组织修复中的应用已有诸多报道,目前羊膜上皮细胞已在肝、神经、肺、心肌甚至肿瘤治疗中都有一定的优势,但是尚少有羊膜上皮细胞应用于糖尿病创面的研究。因此在本课题中,我们通过提取培养羊膜上皮细胞,应用于糖尿病创面中以观察其对于创面愈合的作用并对其机制进行初步探索。
  第一部分 人羊膜上皮细胞体外分离培养鉴定及生物学特性检测
  目的:分离培养人原代羊膜上皮细胞并检测鉴定。
  方法:收集剖宫产胎盘分离羊膜,通过酶消化法提取羊膜上皮细胞体外培养。流式细胞计数检测羊膜上皮细胞表型,免疫荧光法及RT-PCR法检测羊膜上皮细胞干性标志物,最后对其进行三胚层诱导检测其分化潜能。
  结果:体外人羊膜上皮细胞镜下观察可见细胞成鹅卵石样成团生长,核圆,居中,细胞呈多边形,边界清楚,轮廓分明。通过流式细胞仪检测显示培养细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,但是不表达CD45、CD34。通过免疫荧光检测发现,羊膜上皮细胞表达SSEA-3、SSEA-4、OCT4。RT-PCR结果显示羊膜上皮细胞表达OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因。诱导分化实验证明羊膜上皮细胞具有向三胚层分化潜能。
  结论:采用酶消化法成功分离培养羊膜上皮细胞,其可以表达多种干细胞标志物,并能够向三胚层分化,在组织修复中具有很大的潜力。
  第二部分 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合作用的研究
  目的:研究羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合的作用。
  方法:将原代提取的羊膜上皮细胞局部注射糖尿病创面,观察创面愈合情况。收集创面标本行病理学以观察创面愈合情况;行CD31免疫组化检测创面血管化;行CD68、iNOS、CD206免疫荧光检测巨噬细胞极化;行促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和促进愈合因子(VEGF、TGF-β1、IGF-1)的ELISA检测炎症反应的改变。通过标记羊膜上皮细胞,观察羊膜上皮细胞在创面的转归情况。
  结果:(1)与空白组相比,羊膜上皮细胞组在创面笫10、14天创面愈合率明显升高(P<0.01)。(2)通过病理检测显示创面第10天羊膜上皮细胞组新生肉芽组织厚度较PBS组明显增加(P<0.01);CD31免疫组化显示创面羊膜上皮细胞组创面新生毛细血管密度较PBS组明显增多(P<0.01);羊膜上皮细胞组创面M1型巨噬细胞密度明显低于PBS组(P<0.01),M2型巨噬细胞密度明显增对高(P<0.05),M1/M2比例也明显降低(P<0.01);羊膜上皮细胞组创面组织中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表达量明显高于PBS组的表达量(P<0.01),而IL-1β、IL-6、TNF-α表达量明显较空白组低(P<0.01)。(3)羊膜上皮细胞植入创面第5天,可观察到创面有大量羊膜上皮细胞存活;在创面第10天,可观察到创面少量羊膜上皮细胞存活。
  结论:羊膜上皮细胞通过调控巨噬细胞极化、减轻创面炎症反应、促进创面血管新生以促进糖尿病创面愈合;同时其在创面存留时间较短,旁分泌作用可能在促进糖尿病创面愈合过程中起主要作用。
  第三部分 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合机制的初步探讨
  目的:探索羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合作用的机制
  方法:(1)体外分离培养巨噬细胞,通过IFN-γ、TNF-α刺激模拟创面M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化情况,观察羊膜上皮细胞条件培养基对于巨噬细胞极化的作用,同时收集细胞行RT-PCR检测其基因表达,实验分组为:含10%胎牛血清的DMEM培养基+IFN-γTNF-α阳性对照组,含10%胎牛血清的DMEM培养基+羊膜上皮细胞条件培养基+IFN-γTNF-α组,含10%胎牛血清的DMEM培养基空白对照组。(2)体外培养人脐静脉内皮细胞,通过CCK-8试剂盒、Transwell小室以及成管试验来观察羊膜上皮细胞条件培养对于人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响,实验设计分为3组:含10%胎牛血清的DMEM培养基阳性对照组,羊膜上皮细胞条件培养基组,高糖DMEM阴性对照组。
  结果:(1)应用羊膜上皮细胞条件培养基对于TNF-α和IFN-γ刺激的巨噬细胞可以减少细胞周围的细短树突状突起;羊膜上皮细胞条件培养基处理组巨噬细胞CD206(M2型巨噬细胞标志物)的表达量较空白对照组(P<0.01)和阳性对照组明显升高(P<0.01);而iNOS(M1型巨噬细胞标志物)的表达量较空白组(P<0.05)和阳性对照组明显降低(P<0.01)。(2)CCK-8试剂盒检测人脐静脉内皮细胞的增殖活性显示,应用羊膜上皮细胞条件培养基处理组较阴性对照组能够明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖(P<0.01);Transwell小室检测迁移能力结果表明羊膜上皮细胞条件培养基处理组细胞个数较阴性对照组明显增多(P<0.01);通过成管实验检测细胞成管能力,结果显示羊膜上皮细胞条件培养基处理组成管个数较阴性对照组明显增多(P<0.01)。
  结论:羊膜上皮细胞可以明显提高人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力,还可以逆转巨噬细胞向M1型转化,同时可以促进M1型巨噬细胞向M2型细胞转化,并以此促进糖尿病创面的愈合。
[硕士论文] 丁涛
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:糖尿病肾病是终末期肾脏病的主要病因之一,是心血管疾病的独立危险因素,目前缺少积极有效的治疗手段。二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)作为重要的二氢黄酮类化合物,具有显著的抗氧化、抗炎和抗纤维化生物活性,其对糖尿病肾病的作用尚无研究。
  目的:
  本研究目的在于通过体内外实验探讨二氢槲皮素对糖尿病肾病肾脏保护作用及机制。
  方法:
  利用高脂饮食/链脲佐菌素腹腔注射大鼠构建糖尿病肾病动物模型:采用ELISA法检测尿微量白蛋白和空腹血清胰岛素水平;运用生化试剂盒测定血清肌酐、血清葡萄糖、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平;肾脏组织切片进行苏木精-伊红和过碘酸希夫染色评价肾脏病理损害;利用免疫组化检测肾脏炎性因子IL-1β表达,从而探讨二氢槲皮素对糖尿病肾病大鼠的治疗作用。利用高浓度葡萄糖刺激大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1和人近端肾小管上皮细胞HK2构建糖尿病肾病细胞模型:采用MTT法测定细胞增殖;采用DCFH-DA法和激光共聚焦显微镜检测细胞内和线粒体活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成;利用免疫印迹法检测NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β、Fibronectin和CollagenⅣ等蛋白表达,从而研究二氢槲皮素对糖尿病肾病肾脏细胞的作用及机制。
  结果:
  1.高脂饮食/链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠表现24h尿微量白蛋白水平、血清肌酐、空腹血清葡萄糖、空腹血清胰岛素水平、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平明显升高,胰岛素敏感性指数明显降低,肾组织病理学损害明显,肾小球系膜细胞增生和系膜基质增多,肾小球IL-1β表达水平增加。给予高剂量的二氢槲皮素(100mg/kg/day)治疗12周后,糖尿病肾病大鼠的24h尿微量白蛋白水平降低,血清肌酐、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平明显下降,肾组织病理学损害减轻,肾小球系膜细胞增生和系膜基质扩张减轻,肾小球IL-1β表达水平较前降低,而胰岛素水平及胰岛素敏感性指数无明显变化。
  2.HBZY-1和HK2细胞经高浓度葡萄糖刺激后,细胞增殖明显,细胞内和线粒体ROS生成增多,NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β和肾纤维化相关细胞外基质蛋白Fibronectin和CollagenⅣ过表达。给予二氢槲皮素处理后,细胞增殖显著被抑制,ROS生成减弱,NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β、Fibronectin和CollagenⅣ等蛋白表达较前下调。
  结论:
  二氢槲皮素能够通过减轻尿微量白蛋白排泄、改善脂质代谢紊乱、减轻肾脏组织病理损害和肾脏炎性因子分泌等发挥肾脏保护作用,其可能的机制是抑制细胞增殖、降低ROS的生成、抑制NLRP3炎性小体的激活和抑制肾脏纤维化。
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