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[博士论文] 田斌
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的疾病,一直对全世界的公共卫生造成极大的威胁,并导致每年约59000死于狂犬病。狂犬病的致病原为狂犬病毒(Rabies virus,RABV),其逃逸宿主中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)天然免疫的机制目前仍未完全清楚。我们之前的研究发现,在小鼠和犬感染模型中,狂犬病毒实验室固定毒株(弱毒株)能够激活天然免疫反应,而野毒株则不能激活。星状胶质细胞是组成血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)的重要元件,其被证实可在中枢神经系统中通过激活天然免疫和调控BBB通透性来限制或清除病原微生物的感染,对中枢神经系统起到重要的保护作用。
  本文研究中,我们重点探索了星状胶质细胞在狂犬病毒感染时发挥的各方面功能。首先,为了验证本研究中所使用的狂犬病毒(DRV-AH08,简称DRV)具有野毒株的特性,我们建立了小鼠感染模型,发现DRV感染的小鼠死亡时间明显早于弱毒株B2c感染的小鼠,且DRV感染小鼠后并未表现出炎症反应和外周免疫细胞入侵中枢神经系统的现象,表明本研究中所使用的野毒株DRV具有野生型狂犬病毒的特性,符合后续实验需求。其次,我们分离、纯化和培养了原代星状胶质细胞(Primary astrocyte),并用DRV和B2c分别对原代星状胶质细胞进行感染,我们发现B2c表现为暂时性感染,而DRV则可以持续的感染星状胶质细胞。我们进一步比较了DRV和B2c感染星状胶质细胞后MAVS通路关键分子的表达水平,结果显示B2c感染后的MAVS通路激活水平显著高于DRV,且这种激活是由于病毒复制转录过程中产生的RNA引起的。因此,我们继续对狂犬病毒两种不同毒株感染星状胶质细胞后dsRNA的产生水平进行了分析,结果表明B2c感染星状胶质细胞后产生的dsRNA水平要明显高于DRV感染组。我们进一步利用MAVS和TLR7基因敲除小鼠进行了体内、体外的感染实验,发现B2c能够持续感染从MAVS基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,但依旧不能感染TLR7基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,验证了MAVS通路是狂犬病毒强弱毒株感染星状胶质细胞后产生差异的关键通路。此外,我们还发现B2c感染星状胶质细胞后产生的与MAVS通路相关的炎症因子要明显高于DRV,与DRV感染相比,狂犬病毒B2c感染星状胶质细胞后能够显著增加体外BBB模型对大分子物质的通透性,且B2c感染的星状胶质细胞培养上清能显著降解紧密连接蛋白ZO-1。
  总之,本研究发现星状胶质细胞在限制狂犬病毒感染中发挥这重要作用,具体表现在它可以通过活化MAVS通路产生IFN和ISG来直接限制狂犬病毒弱毒株的复制,同时可以产生大量的炎症因子促使BBB通透性增加来促进中枢神经系统中的病毒清除;与之相反的,狂犬病毒的野毒株在感染星状胶质细胞后则可通过限制dsRNA的产生来逃避MAVS通路的激活,从而实现持续性感染,不改变BBB的通透性,使病毒逃避被清除。本研究结果为阐明狂犬病毒的野毒株逃逸天然免疫的机制奠定基础,并对狂犬病的临床治疗提供了新的思路。
[硕士论文] 时静
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:艾滋病在世界范围内迅猛传播,严重威胁着人类的健康和社会的发展。人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)具有变异快、耐药性强和难以清除的特点,至今仍无有效的防控手段。因此,基于新型作用机制的抗逆转录病毒治疗靶点的研发迫在眉睫。丝氨酸整合因子Ser5是最新发现的能抑制HIV-1感染性的宿主限制性因子,而HIV-1编码的附属蛋白Nef可以拮抗Ser5的限制作用,但其作用机制尚不明确。本课题将深入探索Nef如何拮抗Ser5,揭示二者相互博弈的分子机理,以期为开发艾滋病的治疗方法提供借鉴。
  首先,为验证Ser5的抗病毒活性可以被Nef拮抗,本研究检测了Ser5对HIV-1感染性的影响,结果发现过表达Ser5时,与HIV-1WT相比,HIV-1ΔNef毒株的感染性降低约20倍;在293T细胞以及HIV-1的靶细胞Jurkat-TAg中,Nef能同时降低病毒粒子、细胞膜表面和整个细胞Ser5的表达;抑制剂实验结果表明Nef能直接降解Ser5,二者具有直接相互作用,并且利用构建的不同Nef突变体初步筛出Nef与Ser5蛋白相互作用的功能区。以上研究表明Nef在细胞中直接降解Ser5,阻止其进入出芽的子代病毒粒子中,从而拮抗Ser5的限制作用。
  另外,为进一步探究Nef降解Ser5的通路,我们首先检测了内吞相关蛋白在Nef下调细胞膜表面Ser5的作用,结果表明细胞表面的Ser5内吞从是由AP-2接头复合物介导,其中AP-2σ2亚基发挥重要作用。为进一步确定细胞内Nef介导的内吞Ser5的去向,我们检测了早期、晚期内吞体和循环内体表面的Marker蛋白Rab5、Rab7和Rab11与Ser5的共定位。结果表明Nef明显促进了Ser5与这些Rab GTP酶家族蛋白的共定位。干扰AP-2、Rab5、Rab7和Rab11会减轻Nef介导的Ser5的降解,相反,过表达这些蛋白则会促进Nef对Ser5的降解。泛素可以介导膜蛋白从晚期内吞体进入到溶酶体,我们发现Ser5本身可以发生泛素化,K48和K63两种泛素连接形式均参与了Nef介导的Ser5的降解。最后,激光共聚焦呈像显示Ser5在Nef的作用下与溶酶体蛋白标志LAMP-1出现了明显共定位,使用溶酶体抑制剂NH-4Cl和bafilomycin A1可以明显阻止Nef对Ser5的降解。以上结果说明Nef拮抗Ser5是通过将其靶向内体-溶酶体途径进行降解来实现的。
  综上所述,我们的研究表明Nef主要通过下调细胞膜上Ser5表达量以及改变细胞内的蛋白转运途径来发挥拮抗作用。进一步研究发现,Nef能够介导Ser5在AP-2接头蛋白复合物的作用下完成内化,随后进入早期内吞体、晚期内吞体,最后在溶酶体中被降解,这表明HIV-1相关蛋白可以通过主动降解细胞内的限制性因子而逃避宿主的天然免疫,揭示这种作用机制将为将来开发特异性疗法提供借鉴。
[硕士论文] 尹馨
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:自2013年H7N9亚型禽流感病毒在我国出现以来,该病毒不仅对我国的养禽业造成了重大的经济损失,而且严重威胁着人类的生命健康。截止到2018年3月2日,H7N9亚型禽流感病毒已经造成了1567人感染,死亡615人。
  为了解2013年以后H7N9亚型禽流感病毒在我国的流行情况及其生物学特性的变化。本研究选取了2013年7月-2017年1月期间分离到的84株H7N9亚型流感病毒,对它们进行了系统的评价。通过遗传演化以及关键分子特征的分析,H7N9病毒的表面基因HA,NA核苷酸的同源性分别为88%-100%和90%-100%,其余6个内部基因PB2,PB1,PA,NP,M和NS基因的核苷酸同源性分别为84.8%-100%,88.6%-100%,86.8%-100%,86.4%-100%,88.5%-100%和87.8%-100%。根据各基因的进化关系,可以将84株病毒划分为23个基因型,且以基因1,2型为主。最为重要的是,对病毒的分子特征进行分析发现,我国已经出现对禽类呈高致病性分子特征(裂解位点PKGKRTA↓R)的H7N9亚型禽流感病毒。
  家禽感染性试验表明,具有高致病性禽流感分子特征的H7N9亚型禽流感代表株A/chicken/Guangdong/SD008/2017(简称CK/SD008)对鸡只呈现高致病性(IVPI=3.0),并在鸡体内高效复制,在鸭的复制感染试验中,低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均对鸭呈现低致病力,但低致病性H7N9病毒对鸭的适应性和在鸭群中的传播能力正逐渐的加强。
  选取代表不同基因型的28株低致病性H7N9病毒进行小鼠感染性试验,显示目前我国流行的低致病性H7N9病毒对小鼠呈现不同的致病力。所有毒株均能在小鼠的鼻甲和肺脏复制,其中15株病毒能引起小鼠不同程度的体重下降。高致病性H7N9亚型禽流感代表株CK/SD008病毒虽也能在小鼠的鼻甲和肺脏高效复制,但同样并不致死小鼠。然而,我们发现CK/SD008病毒在雪貂体内复制的过程中,能够发生PB2基因E627K,D701N的突变,纯化获得的两株具有PB2蛋白627K,701N的突变株,则表现出比2013年人源H7N9病毒更强的对小鼠的致病力。
  以上研究结果对于我们了解2013年以后我国H7N9亚型禽流感病毒的生物学特性变化具有非常重要的意义。为我国H7N9防控措施的制定提供了理论和实验依据,同时,也对人类感染H7N9病毒起到了预警作用。
[硕士论文] 孙君帅
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:联合抗逆转录病毒疗法(Combmation antiretroviral therapy,cART)对静息CD4+T细胞、巨噬细胞等细胞中呈潜伏感染状态的HIV-1病毒很难发挥清除作用,其原因是呈潜伏感染的HIV-1病毒处于转录沉默状态,很难被靶向药物识别。HIV-1潜伏感染的形成与转录因子例如NF-κB、AP-1等的生物学活性密切相关。这些转录因子调控HIV-1前病毒DNA的转录作用受抑制或丧失,是静息CD4+T细胞中病毒转录起始受到抑制的主要原因之一。JunD是激活蛋白-1(Activating protein-1,AP-1)家族的成员之一,与c-Jun、JunB等家族其他成员相类似,其通过结合靶基因的启动子区调控基因转录。已有研究证明,AP-1家族的c-Jun等转录因子可以结合不同HIV-1亚型LTR上的AP-1结合位点,参与对HIV-1前病毒转录的调控。然而,JunD是否可通过结合LTR参与调控HIV-1前病毒转录,并借由此在HIV-1潜伏感染与病毒储存库的形成中发挥作用?尚未见相关研究。
  为回答上述科学问题,本研究基于可支持HIV-1复制的T细胞系Jurkat,采用CRISPR/Cas9技术,构建了敲除JunD细胞系,同时基于慢病毒载体系统,建立了稳定(过)表达JunD细胞系。借助上述细胞系,对JunD参与调控HIV-1前病毒DNA的转录激活作用进行了研究。首先,拯救HIV-1假病毒并分别感染敲除JunD、稳定(过)表达JunD和对照组细胞系,通过荧光素酶检测技术和real-time qPCR对HIV-1前病毒DNA转录水平的变化进行评价。荧光素酶活性检测结果显示,与对照组相比,敲除JunD可下调HIV-1前病毒DNA的转录水平约57.05±7.80%;稳定(过)表达JunD则可上调HIV-1前病毒DNA转录3.50±0.88倍。同时,qPCR结果显示,与对照细胞相比,敲除JunD的细胞系中HIV-1mRNA水平显著下调约85.15±4.90%;而稳定(过)表达JunD的细胞系中HIV-1mRNA水平则显著上调约1.64±0.12倍。此外,使用AP-1特异性抑制剂T5224处理JunD敲除的Jurkat细胞系并进行HIV-1假病毒感染。结果显示,JunD对HIV-1前病毒DNA转录激活的贡献率约占全部AP-1家族成员总体贡献的40.40±8.45%。
  其次,基于预测的LTR上JunD结合基序和报告质粒pGL3-Luc构建的荧光素酶报告系统,证实JunD可通过TGACATC基序与HIV-1LTR结合并激活转录;而对LTR上该基序进行突变后拯救获得的HIV-1假病毒,对Jurkat细胞系的感染水平则明显下降。再次,使用SAHA处理细胞,可基于激活细胞内JNK-JunD信号通路上调JunD磷酸化水平,并可剂量依赖性的显著提高HIV-1前病毒DNA的转录。而该激活作用在JunD敲除细胞系中则受到部分抑制。
  基于以上全部研究数据,本研究首次评价并初步证明了转录因子JunD参与调控HIV-1前病毒DNA的转录激活。该激活作用是通过特异性结合HIV-1的LTR来实现的,且激活强度与内源性JunD的磷酸化水平呈剂量依赖性。本研究发现的JunD参与HIV-1前病毒DNA的转录调控,很可能成为激活潜伏感染的HIV-1转录的新靶点,一方面促进对HIV-1潜伏感染形成机制的深入理解,另一方面,有助于探索激活潜伏感染HIV-1和清除其病毒储存库的新策略。
[硕士论文] 李彬酉
兽医公共卫生与食品安全 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一类特殊的人兽共患和食源性病原菌,它存在于正常的肠道菌群中,但却能够导致机体其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生儿脑膜炎等,严重威胁着人和动物的健康。有效疫苗的缺乏、耐药性的增加和生物被膜的形成给ExPEC防控带来了巨大的困难。
  生物被膜(Biofilm)是细菌的一种特殊生存形式。与浮游菌不同,生物被膜能够抵御机体的免疫清除作用,导致抗生素和消毒剂的作用效果下降,引起机体感染的反复发生。在食品加工设备和食品原料表面的生物被膜给食品安全造成严重危害。因此,研究生物被膜形成机制和控制对策具有重要意义。
  外膜蛋白TolC是构成革兰氏阴性菌外排泵的重要的成分,是细菌对多种抗菌药的抗性的重要原因。本实验室前期研究表明TolC蛋白缺失会造成ExEPC在M9高渗培养基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,转录组学分析发现TolC缺失后会引起Cpx双组份系统周质间隙蛋白CpxP编码基因的上调表达。Cpx双组份系统可响应细菌对高渗信号的识别,激活后能够抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系统可能在tolC缺失后影响ExPEC生物被膜形成中发挥作用。本研究通过对ΔtolC菌株中Cpx双组份系统感应蛋白CpxA和效应蛋白CpxR进行突变,探究其在ΔtolC菌株影响生物被膜形成中的作用。主要研究内容和结果如下:
  1.基因缺失菌株的构建
  设计引物以ExEPC PPECC42基因组为模板扩增cpxA上下游同源臂,并通过Overlap PCR方法连接,将同源臂插入自杀性载体pRE112,转化大肠杆菌x7213感受态细胞构建x7213-pRE-ΔcpxA。并以此为供体菌,分别以ExEPC PPECC42野生株及ΔtolC株为受体菌进行同源重组,利用Cm和SacB筛选得到ΔcpxA基因缺失株和ΔtolCΔcpxA双基因缺失株。利用同样方法,构建ΔcpxR基因缺失株和ΔtolCΔcpxR双基因缺失株。
  2.回补菌株和CpxA磷酸化位点定点突变菌株的构建
  以PPECC42基因组为模板,设计引物扩增cpxA基因全长,并插入pHSG396质粒,构建pHSG-cpxA表达载体,电转化至ΔtolCΔcpxA菌株中,构建回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA。运用同样的方法构建出Cm-R-ΔtolCΔcpxR。
  通过预测和翻译分析,找出CpxA磷酸化位点对应的核酸序列位点,设计点突变引物以pHSG-cpxA质粒为模板扩增出突变的质粒,测序鉴定后电转化ΔtolCΔcpxA菌株中,以构建CpxA磷酸化位点突变菌株M-A-ΔtolCcpxA。
  3.实验菌株的部分生物学特性研究
  首先测定试验菌株的生长情况,在M9和1/2M9培养基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失对ExPEC的生长速率无影响,试验菌株在8h后可以达到稳定期。
  其次使用7种抗菌药测定了试验菌株的MIC,结果表明ΔtolC和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR菌株对氯霉素和环丙沙星的敏感性显著升高,而cpxA和cpxR单缺失对这7种抗菌药的敏感性并未发生明显变化。
  4.试验菌株生物被膜形成能力分析
  使用结晶紫染色法测定试验菌株生物被膜形成能力,发现在M9高渗培养基中与WT相比ΔtolC菌株生物被膜形成能力显著下降;双基因缺失株ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR与WT相当;回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA和Cm-R-ΔtolCΔcpxR生物被膜形成能力恢复到ΔtolC的水平;M-A-ΔtolCΔcpxA生物被膜形成能力与WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培养基中均无差异。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培养基中试验菌株的生物被膜形成能力与M9中类似。
  5.扫描电子显微镜观察生物被膜细菌微观形态
  使用扫描电镜观察试验菌株生物被膜细菌微观形态发现在1/2M9+0.06mol/LNaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高渗培养基中ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈现与WT相似大量黏附于玻片表面,且菌体之间存在大量黏连,但ΔtolC菌株在玻片上黏附较少,细菌菌体之间黏连情况也较少。
  6.Curli菌毛合成能力分析
  刚果红平板试验表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培养基中,ΔcpxA和ΔcpxR单基因缺失突变株和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR双基因缺失株能够形成与野生型菌株WT类似的rdar菌落形态,而Cm-A-ΔtolCΔcpxA、Cm-R-ΔtolCΔcpxR的菌落形态与ΔtolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA则可以形成与WT类似的菌落。在1/2M9-CR平板上试验菌株的菌落形态均与WT相似。这表明Cpx双组份系统确实在高渗条件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的过程中发挥了作用,而且是通过抑制Curli菌毛合成而影响的。
[硕士论文] 徐海峰
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:H5亚型禽流感病毒大多数都是高致病性的病原,一旦发生感染可造成家禽的大规模死亡,使养殖户蒙受巨大的损失,同时H5亚型禽流感病毒也能感染人,甚至造成人员死亡。我国鸡群中存在的H5亚型禽流感病毒,按照HA基因的亲缘关系划分,主要是Clade2.3.2、Clade7.2和Clade2.3.4.4分支的病毒。禽流感病毒一直不断的发生基因变异,2015年零星发现Clade2.3.2分支出现新的小分支Clade2.3.2.1e,2016年在我国多个省份大范围监测到Clade2.3.2.1e分支,H5亚型不同分支之间抗原差异较大,并且随着时间的推移,差异性越来越大,原来以单抗为基础的检测方法逐渐出现更大的偏差和漏检现象,因此,需要不断的更新单抗来修订。为此,本研究用H5亚型高致病性禽流感Clade7.2、Clade2.3.4.4分支和C1ade2.3.2.1e分支的疫苗株,纯化后作为免疫原,结合单抗制备技术制备和筛选覆盖面较广的H5亚型禽流感单抗,进一步建立了以单抗为基础的免疫胶体金试纸条和渗透卡检测方法。
  本研究利用将Clade7.2分支疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7),Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(HSNl)(Re-10)作为免疫原,混合免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫之后,无菌取其脾细胞,将其与骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下进行细胞融合,经过间接ELISA方法及HI方法筛选得到6株能稳定分泌抗血凝素蛋白HA的单抗杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能与当前流行的分支反应,具有较好的广谱性。
  选用两株反应性较好的单抗2A10和2C8,用20nm大小的胶体金颗粒对2A10抗体进行标记,10000转离心纯化,得到金标抗体,以1∶8倍稀释喷涂于试纸条加样孔附近的玻璃纤维上;2C8以1.5mg/mL的浓度喷涂于检测线;羊抗鼠二抗以1mg/mL的浓度喷涂于质控线,组装成胶体金试纸条。利用免疫层析技术(GICA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现该胶体金试纸条能检出我国流行的H5亚型禽流感病毒,广谱性较好,对其他亚型不反应,特异性较好,最小检出的病毒量为24。为了进一步提高它的敏感性,我们将2C8单抗和羊抗鼠二抗点到渗透卡中,制备斑点金免疫渗滤卡,利用斑点金免疫渗滤法(DIGFA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现其最小检出的病毒量为22,敏感性得到提高。
  总之,本研究通过杂交瘤技术筛选出6株1B10、2A10、2C8、H2B1、3E6和4G9抗HA单抗;以单抗为基础材料,初步建立H5亚型禽流感病毒胶体金试纸条检测方法和H5亚型禽流感病毒斑点金免疫渗滤卡检测方法,渗透卡比胶体金试纸条灵敏性有所提高。
[硕士论文] 赵青青
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:流感病毒是引起人类流行性感冒的病原体。近年来随着流感病毒的流行,新的变异株不断产生,宿主范围不断扩大,病毒的致病性和传播能力也有不断增强的趋势,对公共卫生安全的危害日趋严重。流感病毒结构简单,基因组较小,可以通过移码及可变剪接等方式表达多种蛋白,但在宿主体内,仍需要借助宿主的蛋白质合成及运输系统、能量系统和可变剪接系统等完成自身的复制。另一方面,流感病毒入侵宿主后,可以被宿主的免疫系统识别,宿主免疫相关蛋白可以通过与病毒蛋白的相互作用,限制流感病毒的复制。由此可见流感病毒与宿主的相互作用是一个非常复杂的过程,深入研究宿主蛋白与流感病毒蛋白的相互作用,对于理解流感病毒的复制机制和致病机理,从而实现流感的有效防控至关重要。
  流感病毒M2蛋白是一个多功能的蛋白分子,它的离子通道活性可以在病毒复制早期介导病毒脱壳从而使核糖核蛋白复合体(vRNP)具备入核能力,也可以在反式高尔基体中协助HA蛋白成熟。另外,M2蛋白在病毒复制后期促进子代病毒粒子出芽释放。鉴于M2蛋白在流感病毒复制周期中具有重要作用,本实验室前期利用酵母双杂交系统筛选与M2蛋白相互作用的宿主因子,其中之一为Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing proteinα(SGTA)。本研究通过酵母回交验证表明SGTA蛋白与M2蛋白可以在酵母系统中发生相互作用,免疫共沉淀实验证实M2蛋白与SGTA在293T细胞中存在互作,进一步研究发现SGTA蛋白C端91-313位氨基酸是与M2蛋白互作的关键区域。激光共聚焦实验结果显示外源转染的SGTA蛋白和M2蛋白主要共定位于细胞质内。过表达SGTA蛋白可以促进流感病毒复制,而siRNA下调SGTA蛋白表达或CRISPR-Cas9敲除SGTA后则显著抑制流感病毒复制,由此可见,SGTA蛋白对流感病毒复制发挥正调控作用。在此基础上,我们发现siRNA干扰下调表达SGTA后不影响病毒NP蛋白进入细胞核,表明SGTA蛋白不影响流感病毒早期复制。重要的是,我们发现SGTA蛋白可以增加M2蛋白的稳定性,随着SGTA蛋白转染量的增加M2蛋白表达呈递增趋势。本研究部分阐明了宿主蛋白SGTA通过与流感病毒M2蛋白互作正调控流感病毒复制的机制,丰富了流感病毒与宿主相互作用的网络。
[硕士论文] 宋甲宝
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:布鲁氏菌病是由布鲁氏菌感染引发的重要人兽共患病,给畜牧业发展和人畜健康带来极大危害。马耳他种布鲁氏菌作为一种兼性胞内寄生菌,进化出多种逃避宿主免疫策略,可在宿主细胞内建立持久的感染。
  MicroRNA是一类长约18~25个核苷酸的非编码小分子RNA,主要在细胞转录后水平调控基因表达,在宿主体内发挥重要调控作用。本实验室前期将马耳他种布鲁氏菌强毒株M28和疫苗株M5-90感染BALB/c小鼠,获得强弱毒感染后不同时间的microRNA表达谱,初步研究发现microRNA-363-5p(miRNA-363-5p)参与布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡。
  为了筛选更多对布鲁氏菌复制和细胞凋亡有影响的microRNAs,利用巨噬细胞过表达或抑制microRNA表达,然后感染布鲁氏菌。通过细菌分离计数和细胞生长状态初步筛选microRNA。结果显示,过表达miRNA-29c-5p,胞内分菌数显著低于对照组,过表达miRNA-335-5p和miRNA-329-3p,胞内分菌数显著高于对照组(均p<0.05);过表达miRNA-676-3p、miRNA-674-5p和miRNA-18b-5p,巨噬细胞生长缓慢并脱落。结果表明,miRNA-29c-5p、miRNA-335-5p和miRNA-329-3p显著影响布鲁氏菌胞内复制;miRNA-676-3p、miRNA-674-5p和miRNA-18b-5p可能参与布鲁氏菌诱导宿主细胞凋亡,需进一步证明。
  本研究在前期工作基础上,利用双荧光素酶基因报告系统证明和Western-blot验证miRNA-363-5p对靶基因表达调控作用。荧光干扰结果显示,重组Prkacb、Lgf1、Pdpk1、Pik3cg、Cycs、Wnt7a和Sema6a的pmirGLO质粒与miRNA-363-5p mimic共转染后可显著降低萤火虫荧光素酶在293细胞的表达(p<0.001)。将靶基因种子序列突变后,萤火虫荧光素酶的表达量可恢复;Western blot验证结果显示,转染miRNA-363-5p后,巨噬细胞中Prkacb、Cycs和Sema6a的表达量显著降低(p<0.001)。结果表明,Prkacb、Cycs和Sema6a为miRNA-363-5p的靶基因。
  为研究miRNA-363-5p对马耳他种布鲁氏菌M28致病力及体内复制的影响,利用BALB/c小鼠为模型,尾静脉注射miRNA-363-5p的模拟物和抑制物,并感染布鲁氏菌。然后测定小鼠脾重及脾脏分菌数。结果显示,过表达miRNA-363-5p对小鼠脾重和脾脏分菌数均无显著影响。但抑制miRNA-363-5p表达小鼠脾脏含菌量显著高于对照组(p<0.01)。结果表明,抑制miRNA-363-5p的表达可显著促进布鲁氏菌在小鼠体内的复制。
  另外,为了探索OmpR(EnvZ/OmpR二元调控系统元件)基因对布鲁氏菌有何功能。利用同源重组,构建了M28OmpR基因缺失株(M28ΔOmpR)。菌落生长实验显示:M28ΔOmpR生长速度显著低于亲本株M28(p<0.001),回补株M28ΔOmpR-com可恢复菌落生长速度。巨噬细胞感染实验显示:M28ΔOmpR与M28相比,细菌分离数显著降低100倍(p<0.001),回补株M28ΔOmpR-com可恢复其在巨噬细胞中复制能力。小鼠感染实验显示:感染1周后,M28ΔOmpR比M28接种小鼠脾重显著降低(p<0.001);第4周,细菌分离数显著降低0.8Log10(p<0.001)。结果表明,OmpR基因缺失显著抑制马耳他布鲁氏菌体外生长,显著降低其在巨噬细胞和小鼠体内的复制能力,相关机制仍需进一步研究。
  综上所述,miRNA-29c-5p、miRNA-335-5p和miRNA-329-3p影响布鲁氏菌胞内的复制;miRNA-363-5p通过作用于靶基因Prkacb、Cycs和Sema6a参与细胞凋亡;抑制miRNA-363-5p表达有利于布鲁氏菌在小鼠体内复制;OmpR基因缺失抑制马耳他布鲁氏菌体外生长,显著降低其在巨噬细胞和小鼠体内的复制能力。
  本研究为探宄布鲁氏菌的致病机制和布鲁氏菌与宿主作用奠定了基础,为寻找布鲁氏菌病的诊疗方法提供新的思路。
[硕士论文] 高荣
生物学(微生物学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)主要通过血液途径感染肝脏,引起急性及慢性病毒性肝炎。目前全球约有1.7~2亿人感染HCV,中国健康人群HCV抗体阳性率为0.7%~3.1%。大多数HCV感染易演变为慢性感染,部分HCV慢性感染可进展为肝硬化及肝细胞癌。HCV感染已成为危害健康的严重问题。聚乙二醇α干扰素(pegylated interferon-α,PEG-IFN-α)联合利巴韦林(ribavirin,RBV)是目前抗HCV感染的经典治疗方案,但由于IFN严重的毒副作用、不同HCV基因型敏感性不同、干扰素抵抗等多种因素限制了其疗效及使用范围。近年来,随着对HCV不断深入的研究,抗HCV治疗方面取得较大成果,如抗HCV的小分子药物蛋白酶抑制剂——直接抗病毒药物(direct-acting antiviral agents,DAAs)的临床应用,相较于联合疗法持续性病毒学应答(sustained virological response,SVR)明显提高。但由于HCV基因型多、易变异且DAA治疗费用昂贵等应用受限,且近期有报道DAAs可能会增加肝细胞癌的发病率及术后复发。因此,对HCV感染相关宿主因子的探索及靶向抗HCV治疗仍是目前HCV研究的热点。
  HCV是单股正链RNA病毒,为黄病毒属成员,多个宿主因子被报道参与包括入侵、复制、组装和释放等在内的复制周期。microRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA。大量研究表明,miRNAs可参与调控细胞分化、增殖、凋亡、代谢、细胞周期等多个环节,并与炎症性、感染性、代谢性疾病及肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关,其主要生物学功能是通过与其靶标分子的3'-UTR结合来抑制翻译或降解mRNA,进而调控基因表达。多种miRNAs已被证实在HCV诱导的肝癌(HCV-HCC)的发生发展中具有重要的作用。miRNAs在HCV的复制、诊断、治疗中同样扮演重要角色。例如,研究发现miR-122及miR-141具有促进HCV复制的作用,miR-122的小分子互补拮抗剂Miravirsen(SPC3649)目前已进入Ⅲ期临床试验阶段。
  细胞因子信号转导抑制分子3(SOCS3)是SOCS家族的重要分子之一,大量研究表明SOCS3在多种疾病的发生发展中具有重要作用。现有研究发现SOCS3可以负性调节多种细胞因子和激素(包括IL-6、IL-10、IFN-α、LPS、瘦素、胰岛素等)产生的信号传导,从而在炎症、感染及肿瘤等多种疾病的发生发展中发挥重要作用。SOCS3在病毒感染中的作用主要与其可负性调节酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录激活(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路有关,而JAK-STATs通路是Ⅰ型和Ⅱ型IFN发挥抗病毒作用的信号通路。SOCS3的表达与HCV在细胞内的复制程度密切相关。已有研究表明,HCV患者肝样本中SOCS3蛋白表达增加,而高水平SOCS3表达与HCV患者IFN治疗抵抗相关。同时,肝细胞SOCS3水平可反应HCV感染IFN治疗的效果。SOCS3基因的多态性与宿主对抗病毒治疗的反应相关。已有报道表明SOCS3是HCV在体内复制中重要的宿主因子之一,近年来的研究表明多种miRNA可通过调节SOCS3的表达而影响多种疾病的发生发展,但鲜有靶向SOCS3的miRNAs对HCV复制及IFN抗HCV作用的影响。基于SOCS3在HCV复制中的重要作用,本课题探讨了靶向SOCS3的miRNAs对HCV复制及IFN抗HCV作用的影响。
  本研究中,首先通过SOCS3的siRNA验证了SOCS3在细胞水平对HCV复制的影响:将si-SOCS3及si-NC转染Huh7细胞,相较于si-NC,si-SOCS3除可抑制HCV在细胞内的复制,IFN-α还可进一步增强si-SOCS3对HCV复制的抑制作用。进而,以mimicNC(mNC)作为阳性对照,通过转染miRNA mimic模拟miRNA在细胞内的过表达,证实了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p对SOCS3具有明显的抑制作用。进一步的实验中,构建含有SOCS33'-UTR(WT)及miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p与SOCS33'-UTR结合位点突变的质粒,利用双荧光素酶报告基因验证了SOCS3是miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p的靶标分子。在此基础上,通过利用HCVcc感染,在细胞模型上证实了miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p在抑制HCV复制的同时也抑制了SOCS3的表达。而在用IFN-α处理后,miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p对HCV复制的抑制作用进一步加强。以往的研究已证实SOCS3是JAK-STATs通路重要的负性调节因子之一,而IFN-α抗HCV的作用正是通过作用于JAK-STATs通路,IFN-α上调该通路下游p-STAT1的表达发挥其抗HCV的作用。因此,分别转染si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic、miR-30c-5p mimic及对照,结果发现,相较于对照,si-SOCS3、miR-185-5p mimic、miR-19b-3p mimic及miR-30c-5p mimic均可明显上调p-STAT1的表达,从而进一步证实了IFN-α增强靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p抑制HCV复制的作用是通过共同加强JAK-STATs通路作用而实现的。
  基于上述发现,靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p可在细胞模型中抑制HCV复制,其作用是通过互补结合SOCS3mRNA的3'-UTR抑制了SOCS3蛋白的表达。这一抑制作用解除或削弱了SOCS3对JAK-STAT通路的负性调节作用,明显上调了p-STAT1的表达,而p-STAT1是IFN-α发挥抗HCV效应的中介因子之一。因此,靶向SOCS3的miR-185-5p、miR-19b-3p及miR-30c-5p表现出抑制HCV复制及协同IFN-α抗HCV的作用。该研究有助于将SOCS3作为对IFN治疗反应的标志物提供更多的证据,同时为研发基于SOCS3的潜在疗法奠定基础,为拓宽IFN治疗HCV感染提供更多依据。
[硕士论文] 徐媛
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  曲霉菌(Aspergillus)是一类广泛分布于自然界的丝状真菌,约300余种,其中大多数曲霉菌种仅无性阶段被描述,属于半知菌;少数菌种如烟曲霉已同时发现并描述无性及有性阶段,被归入子囊菌。曲霉菌常见于湿润的土壤、发霉腐烂的面包、谷类等,其中少数菌种可感染人类导致严重疾病。近年来,由于免疫抑制人群数量的增多,侵袭性曲霉感染的发病率呈上升趋势,尤其是易于累及造血干细胞、实体器官移植后及接受免疫抑制剂治疗的患者,其早期诊断困难,死亡率长期居高不下。
  烟曲霉是临床最主要的致病曲霉菌种,近年来发现其对唑类药物耐药率不断上升,且非烟曲霉感染引起的侵袭性曲霉菌病也不断增加。值得注意的是,曲霉菌各菌种对抗真菌药物的敏感性有显著不同。目前临床上传统的曲霉菌鉴定模式,不能及时准确的将菌株鉴定至种的水平,这常常制约临床采取恰当的治疗方案。目前中国绝大多数地区,包括上海等医疗中心城市,有关的曲霉菌临床分离菌株的遗传多态性及体外对抗真菌药物敏感性监测等研究工作还很不够,尤其缺乏系统地持续性监测调查。因此,本研究随机选取了上海地区2家三级甲等医科大学附属医院,对分离自深部体液样本的曲霉菌株进行了持续2年的分离、培养及保藏,并应用最新的分子标记技术及药敏监测操作规范,对相关曲霉菌临床分离株的种群遗传多态性以及药物敏感性进行研究,为提高上海乃及中国的曲霉病临床诊治水平提供有价值的参考依据及研究基础。
  目的:
  第一,通过多基因测序及序列分析等分子标记技术对相关曲霉菌株进行分子鉴定及遗传多样性分析,明确相关曲霉菌株的种群构成及种内遗传变异特征;第二,通过体外药敏试验调查相关菌株对现有抗真菌药物敏感性特征,为临床合理用药提供科学参考;第三,对筛选出的曲霉菌耐药烟曲霉菌株,检测其唑类耐药突变位点,初步分析其耐药的演化分子机制。
  方法:
  第一部分对分离自上海地区两家教学医院住院患者的深部体液样本的相关菌株,采用核酸扩增技术分别对ribosomal internal transcribed spacer region(ITS)、β-tubulin和calmodulin三个基因片段进行扩增测序,与NCBI数据库进行BLAST比对后初步鉴定至种水平;分别利用上述三个基因及联用其序列,利用MEGA7.0软件,采用K2+G模型和K2+G+I模型,利用最大似然法构建系统发育树,将每一菌株鉴定至种的水平,并比较ITS,β-tubulin和calmodulin三个单基因片段序列对鉴定曲霉菌属的优劣。
  第二部分利用最新的肉汤微量稀释法(CLSI M38-A2方案),对相关曲霉菌临床分离株进行9种临床一线抗真菌药物的体外敏感性试验,并筛选出耐药菌株。
  第三部分将药敏试验中筛选出的对唑类耐药烟曲霉进行cyp51A基因的扩增及测序,与唑类敏感烟曲霉菌株(GenBank accession no.AF338659)进行序列比对,确定其耐药突变位点。
  结果:
  第一部分本研究中收集的菌株菌种构成包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)共9种曲霉菌,其中以烟曲霉(54.6%;59/108)为主。相关菌株主要分离自呼吸系统标本(90.7%;98/108),且烟曲霉(58.2%;57/98)为呼吸系统的最主要致病曲霉菌;然而在来自非呼吸系统标本的曲霉菌株中,非烟曲霉菌(75%;6/8)多于烟曲霉(25%;2/8)。
  第二部分在本研究中应用的棘白菌素类、唑类和多烯类等9种抗真菌药物中,棘白菌素类药物对相关曲霉菌菌株的抗菌活性最高(MEC500.03μg/ml;MEC900.25μg/ml),其次为唑类(MIC500.5μg/ml;MIC902μg/ml)及多烯类(MIC501μg/ml;MIC902μg/ml)。其中棘白菌素类药物中以阿尼芬净的敏感性最高(MEC500.03μg/ml;MEC900.03μg/ml);唑类药物中以泊沙康唑的敏感性最高(MIC500.25μg/ml;MIC900.5μg/ml)。另外,发现相当比例的菌株(34.3%的MIC值≥2μg/ml)对两性霉素B敏感性下降,值得警惕及后续相关研究进一步监测。
  第三部分本次研究中发现烟曲霉的唑类耐药率约6.8%,且首次在上海地区发现存在TR46/Y121F/T289A突变位点的烟曲霉菌株;同时,还发现了2株对唑类耐药的烟曲霉菌株同时存在F46Y,G89G,M172V,N248T,D255E的突变位点。
  结论:
  本研究中收集自2所教学医院的曲霉菌临床分离菌株种类主要包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、聚多曲霉、溜曲霉、构巢曲霉和土曲霉这8个菌种,烟曲霉仍是优势致病曲霉菌种。体外抗真菌药敏试验提示,棘白菌素类药物对本次研究收集的曲霉菌株的抗菌活性最高,其次为唑类、多烯类。烟曲霉菌株对唑类耐药率有所上升,且相关耐药突变位点存在丰富的多样性,且首次在上海地区发现含TR46/Y121F/T289A突变位点的交叉耐药烟曲霉菌株,提示相关耐药菌株存在多种起源及演化途径,值得真菌病学、医学真菌学及流行病学等领域的学者警惕,未来在上海地区就烟曲霉临床与环境分离菌株对唑类药物的耐药趋势进行系统的、长期的监测研究对于临床侵袭性曲霉病的诊治是非常必要的。
[博士论文] 李朋
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:布鲁菌是人畜共患布鲁菌病的病原菌,主要引起动物流产和人的波状热。布鲁菌的毒力主要体现在入侵吞噬细胞并在胞内存活和复制的能力。布鲁菌侵入宿主细胞后通过表达一系列的毒力相关因子来完成胞内存活和复制过程,脂多糖(LPS)和Ⅳ型分泌系统(T4SS)是布鲁菌最为关键的两个毒力相关因子。根据LPS的完整性,将布鲁菌分为光滑型(S型)和粗糙型(R型)。R型布鲁菌能够诱导巨噬细胞死亡,并且该过程依赖于T4SS。然而,R型布鲁菌致死巨噬细胞的分子机制还不清楚。本研究利用Luciferase报告基因、Western blotting、qPCR等方法对其进行了探究,并且利用Label-free蛋白组学技术对T4SS关键效应蛋白进行筛选鉴定。
  本研究中,为确定T4SS在R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,我们利用FITC-Annexin V/propidium iodide双荧光染色法和检测乳酸脱氢酶释放量两种方法对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123感染巨噬细胞后的细胞毒性分别进行定性和定量检测。结果显示,R型布鲁菌ΔrfbE诱导巨噬细胞死亡依赖于T4SS。
  为探究T4SS在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建T4SS分泌蛋白BPE123和VceC的融合Luciferase报告菌株对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123的T4SS分泌水平进行检测,结果表明ΔrfbE融合蛋白BPE123-Luc或Luc-VceC的分泌水平明显高于S2308。进一步对S2308和ΔrfbE的T4SS表达差异分别用qPCR和Western blotting进行检测,结果显示,在TSB、酸性和营养匮乏条件下,R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS表达量显著高于S型布鲁菌S2308。T4SS启动子virB的Luciferase报告菌株的检测结果表明,ΔrfbE的virB启动子活性显著高于S2308。上述试验结果表明,T4SS的表达和分泌能力在R型布鲁菌中显著高于S型布鲁菌。
  为探究R型布鲁菌ΔrfbET4SS上调表达的原因,我们利用qPCR分析了T4SS的调控相关基因的转录水平。结果显示,与S2308相比,ΔrfbE的VjbR上调表达,MdrA和BlxR下调表达。为确定VjbR、MdrA和BlxR在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建了ΔrfbE的VjbR缺失株以及MdrA和BlxR的过表达菌株,并对这些菌株的细胞毒性进行了定性和定量检测。结果表明,ΔrfbE缺失VjbR后不再具有细胞毒性;ΔrfbE过表达BlxR后细胞毒性显著降低;但ΔrfbE过表达MdrA后细胞毒性仍然很强。为研究VjbR和BlxR对T4SS的调控作用,我们利用qPCR分析了ΔrfbEΔvjbR和ΔrfbE(pBlxR)菌株的virB4的表达水平。结果显示,VjbR对ΔrfbE的T4SS过表达起到了关键的作用,而BlxR只起到了一定的作用。R型布鲁菌激活巨噬细胞凋亡或焦亡与细胞内质网压力应激IRE1α信号通路相关,为探究R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS分泌上调对内质网应激的影响,利用Western blotting鉴定了S2308和ΔrfbE感染巨噬细胞后IRE1α磷酸化(p-IRE1α)水平。结果显示,与S2308相比,ΔrfbE引起更强烈内质网应激。运用p-IRE1α专性抑制剂4μ8c处理细胞后检测ΔrfbE对巨噬细胞毒性。结果显示,抑制p-IRE1α后ΔrfbE对巨噬细胞的毒性显著降低。该系列结果表明,R型布鲁菌通过VjbR上调和BlxR下调表达协同调控T4SS的转录并激活IRE1α信号通路致死巨噬细胞。
  我们对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB12进行了差异分泌蛋白质组学分析,以期筛选到致死巨噬细胞中起到关键作用的T4SS效应蛋白。将三个菌株在RPMI-1640营养缺乏培养基中诱导8h制备分泌蛋白样品,发现R型布鲁菌的蛋白分泌量明显高于S型布鲁菌。质谱分析共鉴定肽段数9020个,蛋白质组数1131个。GO分析发现,差异蛋白主要参与细胞过程和代谢过程等重要的生物学过程,集中分布在细胞和细胞组分,具有催化活性和结合活性的分子功能。KEGG分析发现,差异蛋白主要位于氨基酸的生物合成、双组份系统、碳代谢、嘌呤代谢、核糖体、NOD样受体信号通路、细菌分泌系统等重要通路。运用细菌的定向缺失和过表达技术分析了差异分泌蛋白对S型和R型布鲁菌细胞毒性的影响,结果显示,OmpW蛋白(BAB1_1579)和假定蛋白(BAB11185)与布鲁菌的细胞毒性密切相关。同时,我们发现R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞与其T4SS的组分无关,而是T4SS分泌的某些效应蛋白起到了关键作用。
  综上所述,本研究揭示了R型布鲁菌ΔrfbE通过上调表达VjbR和virB操纵子的转录而导致T4SS的过表达并分泌过量的T4SS效应蛋白,在VceC、OmpW蛋白(BAB1_1579)和假定蛋白(BAB1_1185)等多种分泌蛋白的作用下过激活p-IRE1α引起内质网压力应激最终导致巨噬细胞死亡。本研究为粗糙布鲁菌诱导巨噬细胞死亡的分子机制提供了新的见解。
[硕士论文] 赵吴静
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:近年来,细菌耐药性已成为全球热议的话题,尤以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)耐药菌株的出现,引起了全世界研究者的关注,它的出现使得人和动物的临床治疗愈来愈难,且造成了巨大的经济损失。目前,预防和治疗金黄色葡萄球菌感染较为有效的药物仍是抗生素,然而由于抗生素大量不合理的使用出现了愈来愈多的耐药菌及耐药基因,给临床的治疗带来了巨大的困扰和挑战。为了解我国部分地区乳源金黄色葡萄球菌的流行病学特点及其耐药现状和耐药基因携带情况,本研究对分离自广东省和甘肃省某规模化奶牛场奶样的81株金黄色葡萄球菌进行了药敏试验、耐药基因鉴定及分子特征研究。结果如下:
  金黄色葡萄球菌分离鉴定。对分离自广东省和甘肃省某规模化奶牛场临床乳房炎奶样中的细菌进行增菌纯化培养后,利用细菌16S rRNA通用引物并结合金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc及VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统对分离菌进行种属鉴定,共分离鉴定出81株金黄色葡萄球菌,其中广东省57株,甘肃省24株。
  对81株金黄色葡萄球菌进行了药物的药敏试验及耐药基因分析。通过测定MIC和药敏纸片试验发现81株金黄色葡萄球菌对14种抗生素的耐药率由高到低依次是:氟苯尼考(80.2%)、青霉素(66.7%)、环丙沙星(33.3%)、红霉素(32.1%)、卡那霉素(25.9%)、氨苄西林(25.9%)、克林霉素24.7%、头孢噻呋(6.2%)、苯唑西林(4.9%)、庆大霉素(2.5%)、头孢唑林(2.5%)、万古霉素(0)、四环素(0)、利奈唑胺(0)。其中对3种药物具有耐药性的菌株共有16株、对4种药物具有耐药性的菌株共有5株、对5种药物具有耐药性的菌株共有7株、对6种药物具有耐药性的菌株共有6株、对7种药物具有耐药性的菌株共有1株、对8种药物具有耐药性的菌株共有1株、对9种药物具有耐药性的菌株共有2株、对10种药物具有耐药性的菌株共有2株。菌株对抗菌药物呈多重耐药现象。
  14种耐药基因检测结果显示共有MRSA20株(24.7%),MSSA61株(75.3%);检出率由高到低依次是:aac(6)/aph(2'')(100%)、femA(100%)、ermB(100%)、vanB(100%)、tetM(100%)、floR(80.2%)、ermC(77.8%)、fexA(50.6%)、mecA(24.7%)、tetA(0)、tetC(0)、nor(0)、vanA(0)、vanC(0),所有菌株均携带了至少5种以上的耐药基因。
  对81株金黄色葡萄球菌进行了分子特征研究。对所有菌株采用spa及MLST方法进行分型,共发现14种ST型20种spa型;对20株MRSA进行SCCmec分型,分为5种SCCmec型,其中有4株MRSA菌株被鉴定为ST9-SCCmecⅣb-t899型为相对优势型别,有9株MRSA菌株分别被鉴定为ST398-SCCmecⅠ-t034、ST398-SCCmecⅣc-t034、ST398-SCCmecⅤ-t034、ST1-SCCmecⅠ-t114、ST2632-SCCmecⅢ-t091、ST398-SCCmecⅢ-t8617、ST398-SCCmecⅢ-t034、ST692-SCCmecⅢ-t2247、ST188-SCCmecⅢ-t189型,另有7株SCCmecⅢ型MRSA未获得MLST及spa分型。
  结合上述MLST及spa分型结果发现MRSA的优势型别为ST9-t899,MSSA的优势型别为ST398-t034,广东省主要优势型别为ST9-t899,甘肃省主要优势型别为ST398-t034。且本研究中共检出PVL基因阳性菌株1株,携带率为1.2%,为MSSA,MLST及spa分型为ST1289-t16824,分离自甘肃地区。
[硕士论文] 晏亮
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文从以下两部分进行了阐述:
  第一部分:外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布和体外药敏分析
  外阴阴道念珠菌病(VVC)是女性的常见病,病原菌包括最常见的白念珠菌以及光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌等。许多药敏研究报道了VVC念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性降低,然而新疆地区VVC致病菌的菌种分布以及体外药敏的信息很少,因此本研究对新疆地区236株VVC念珠菌进行了菌种鉴定,并依照M27-A3方法检测了其对11种抗真菌药物(包括棘白菌素类以及新三唑类药物)的体外敏感性。
  结果显示236株VVC念珠菌由207株白念珠菌、18株光滑念珠菌、9株克柔念珠菌、1株近平滑念珠菌、1株热带念珠菌构成。
  新疆VVC白念珠菌分离株对棘白菌素类体外敏感性好,对卡泊芬净敏感性劣于另外两种棘白菌素类;对两性霉素B、5-氟胞嘧啶敏感性好;对氟康唑敏感性较好,但对伊曲康唑、伏立康唑敏感性差,且对伏立康唑耐药率高于其他报道;对新三唑类药物的敏感性好,但MIC值明显低于IFI念珠菌分离株;部分菌株对三唑类药物出现交叉耐药现象。新疆VVC光滑念珠菌分离株和克柔念珠菌分离株对卡泊芬净敏感性差,但对米卡芬净、阿尼芬净敏感性好;对两性霉素B、5-氟胞嘧啶体外敏感性好;对氟康唑、伊曲康唑敏感性差,对新三唑类药物的敏感性好;伏立康唑对光滑念珠菌分离株MIC50/90为0.5/1 ug/ml,克柔念珠菌分离株对伏立康唑敏感性好。唯一的近平滑念珠菌对11种抗真菌药物均敏感,但唯一的热带念珠菌对卡泊芬净、伊曲康唑剂量依赖,对氟康唑、伏立康唑耐药,对其余7种抗真菌药物敏感。
  第二部分:Candida Africana的分子鉴定
  Candida africana是白念复合体中的一个新物种,其能形成芽管但不能形成厚膜孢子,不能利用N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖、海藻糖和DL-乳酸作为唯一的碳源,实验室普通的鉴定手段难以将其从白念复合体中区分开来。Candida africana易感染/定植女性阴道粘膜,全球各地都有分离出该物种的报道,但目前对这一新物种的流行病学、遗传学分布及特征等信息了解尚少。本研究收集了来自新疆和上海的VVC菌株,运用HWP1基因扩增测序方法成功鉴定出4株Candida africana分离株,并对其进行多位点序列分型分析,发现3株属于亚洲特有的ST型—ST型782,另1株属于新的ST型(提交MLST数据库后被命名为ST型3432)。这4株Candidaafricana分离株对11抗真菌药物均具有良好的体外敏感性。
[硕士论文] 荆雅玮
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:布鲁菌病是一种重要的人畜共患传染病,由布鲁菌入侵机体引起。人感染该病后主要表现为发热、关节痛、全身乏力,多汗等症状。而动物感染该病后主要表现为母畜流产、子宫炎、关节炎和睾丸炎等症状。该病不但对养殖业造成重大经济损失,同时也严重威胁食品安全和公共卫生。
  密度感应(Qurom Sensing,QS)是细菌通过自身产生小分子自诱导物(Autoinducer,AI)来协调群体行为的过程。QS系统的AI信号分子主要分为3类:第1类主要是革兰氏阴性菌使用的酰基高丝氨酸内酯类化合物类(Acyl-homoserme lactone,AHL),又称为AI-1,第2类主要是革兰氏阳性菌使用的寡肽类信号分子,第3类是4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD)类衍生物,又称为AI-2(Automducer-2,AI-2)。与前2类信号分子具有种属特异性不同的是,AI-2可用于细菌种群间的信息交流,因而被称为细菌交流的“通用语言”。
  AI-2来源于细菌的pfs/luxS型甲硫氨酸代谢通路(Activated methionine cycle,AMC)。此外,细菌中还存在sahH型甲硫氨酸代谢通路,该通路则是在S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,SahH)作用下,通过一步反应催化底物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)生成同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY),该过程不产生信号分子AI-2。
  那么布鲁菌采用何种甲硫氨酸代谢通路,是否产生AI-2信号分子?为了回答上述问题,本研究首先开展了对布鲁菌的AI-2信号分子检测。
  1.布鲁菌信号分子AI-2的检测及其检测方法优化
  运用哈维弧菌BB170(V harveyi BB170)生物发光法检测信号分子AI-2,是目前应用最为广泛的方法,该方法具有简便、快捷等优点,但该方法易受检测条件影响。因此,本研究首先开展检测方法的优化,通过对哈维弧菌BB170生长曲线、待测菌株培养上清采集的最佳时间、不同培养基及抗生素等影响因素的分析,确定运用V harveyi BB170生物发光法检测AI-2的最优条件。
  本研究结果表明,BB170检测细菌AI-2信号分子的的最优条件是:用MB培养基将哈维弧菌BB170培养至OD600=20,待测菌株培养至对数生长中期后采集上清培养物,用于AI-2信号分子检测,将待检菌株培养上清与BB170共同培养4-6h时后,再进行AI-2活性检测,所得数据最佳。
  本研究中,对布鲁菌在不同生长时期的培养上清进行的AI-2检测结果表明,布鲁菌不产生AI-2信号分子,表明其采用sah型甲硫氨酸代谢通路。
  2.sahH基因的克隆表达,蛋白纯化及体外活性验证
  为了进一步探讨SahH在甲硫氨酸代谢通路中的催化活性及功能,本研究构建了pET28a-sahH表达载体,转化BL21宿主菌后,经28C诱导表达后,可在上清中大量表达SahH重组蛋白。对SahH重组蛋白的纯化条件研究表明,用浓度为100mM-150mM咪唑进行洗脱,纯化效果最好,
  为了进一步研究SahH催化活性,将终浓度为1mg/mL的SahH与1mM的底物SAH共同作用,检测结果表明,SahH能催化底物产生浓度为1002μM的同型半胱氨酸,对反应产物的AI-2活性检测结果表明,无AI-2活性。同时运用本实验室前期构建的禽致病性大肠杆菌的pET28a-luxS与pET28a-pfs原核表达载体,分别表达APEC-LuxS和APEC-Pfs重组蛋白作为阳性对照,结果表明,同样条件下,阳性对照组能催化产生2869μM的同型半胱氨酸,反应产物的AI-2活性检测结果表明具有AI-2活性。
  为了研究影响SahH催化活性的因素,分别对SahH的浓度、反应温度、热稳定性和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的影响进行研究,结果表明,在底物SAH浓度为1mM时,随着SahH的浓度由1mg/mL增加至4mg/mL,其催化产物同型半胱氨酸的浓度由266增加至1503μM(465%),表明SahH催化底物SAH具有浓度依赖性,而添加外源性NAD+之后,其催化产物同型半胱氨酸由1002μM下降至212μM(788%),表明添加外源性NAD+对SahH的催化活性有明显抑制作用;热稳定性结果研究表明,SahH酶在60℃作用10mm,其催化活性失活。
  3.蛋白修饰及催化活性位点对SahH催化活性的影响
  为了进一步研究蛋白修饰及催化活性位点对SahH催化活性的影响,运用上述建立的反应体系,对影响SahH活性的蛋白修饰及关键催化活性位点进行分析。
  (1)成功构建了含有sahH和NAD+激酶基因(NAD+kmase gene,NADk)的双表达载体pETDuet-sahH-NADk和只含有SahH基因的表达载体pETDuet-sahH。对含有上述质粒的重组菌进行诱导表达,成功表达出SahH。对SahH进行体外催化反应,结果表明,当NADk与sahH进行共表达时,可使8ahH催化底物形成产物同型半胱氨酸的浓度由单表达的186μM提高至504μM(1709%),
  (2)质谱结果表明,SahH中仅在第444位丝氨酸存在磷酸化位点。成功构建该位点突变的突变质粒pETDuet-sahH-M444,并对突变后的重组表达蛋白SahH进行催化活性分析,结果表明.突变后,其催化形成产物同型半胱氨酸浓度由1002μM下降至218μM(7824%);
  (3)对鉴定的影响SahH构象的关键位点第337位和338位氨基酸分别进行单突变和双突变,成功构建单突变质粒pETDuet-sahH-M337和pETDuet-sahH-M338及双突变株pETDuet-sahH-M337-338。对各突变重组蛋白SahH进行体外催化反应。结果表明,突变之后,点突变的SahH催化SAH产生同型半胱氨酸的浓度由1002μM分别下降至16μM、138μM和45μM。
  通过本研究的开展,建立了Vharveyi BB170检测信号分子AI-2的最适方法,并运用其检测布鲁菌的AI-2活性,结果表明布鲁菌不产AI-2信号分子,采用sahH型甲硫氨酸代谢通路。通过对影响SahH催化反应条件的优化,建立了其最适反应体系,并在此基础上鉴定了SahH的催化活性位点。本研究将为进一步开展SahH功能研究奠定基础。
[硕士论文] 周陈陈
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:流感病毒是一种重要的人兽共患病病原,对人类和动物健康构成重大威胁。禽类是流感病毒的自然宿主,目前从禽类宿主中分离的流感病毒根据表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同,分为16种不同的HA亚型和9种不同的NA亚型。其中,H4亚型AIV在世界范围内广泛存在。已有研究发现H4亚型AIV可以直接感染哺乳动物并且具备一定的在哺乳动物间水平传播的能力,对人类健康构成潜在威胁。H7N9流感病毒自2013年首次报道感染人以来,已严重危害公共卫生安全。而且,随着流行病学监测和遗传进化研究的深入,发现H7N9病毒进化复杂,出现了与2013年感染人病毒不同进化谱系的新的鸭源H7N9病毒,对人类健康构成新的潜在威胁。
  疫苗免疫是防控流感流行和暴发的最有效手段。为了应对H4以及新出现的鸭源H7N9亚型AIV对人类健康的潜在威胁,我们进行了H4和鸭源H7N9病毒HA蛋白表达纯化及其免疫保护效力研究。以A/Duck/Jiangxi/S21055/2012(H4N2)及A/Duck/Fujiar/S4170/2014(H7N9)AIV HA基因为模板,将其分别克隆到昆虫细胞表达载体pFastBac1中,构建重组质粒pFBacH4HA及pFBacH7HA,转化DH10Bac感受态细胞提取重组Bacmid-H4HA和Bacmid-H7HA,PCR鉴定阳性后转染SF9昆虫细胞。重组Bacmid表达、装配,形成重组杆状病毒,利用此病毒感染High Five细胞,大量表达HA蛋白。经免疫荧光、SDS-PAGE以及Western-blot分析表明H7-HA及H4-HA蛋白正确表达旦纯度达90%以上,血凝试验表明纯化蛋白具有良好的生物活性。
  为了评价纯化获得的H4和H7N9病毒HA蛋白的免疫保护效力,我们进行了SPF鸡免疫及攻毒保护试验。初次免疫后2周加强免疫一次,实验结果显示,H4-HA和H7-HA蛋白单次免疫后4周,SPF鸡血清中HI抗体滴度为2-3log2;二免后2周SPF鸡血清中H4亚型HI抗体滴度未见明显上升,而H7亚型HI抗体滴度达到5-6log2。SPF鸡加强免疫后2周进行攻毒保护实验,结果表明,H4-HA蛋白免疫后与非免疫对照相比虽然不能阻止排毒,但病毒排泄期缩短。与此对比,H7-HA蛋白免疫后与非免疫组比较,在攻毒后的整个观察期所有免疫鸡均未排毒,产生100%免疫保护作用。上述研究结果表明,本研究表达纯化的H4和鸭源H7N9病毒HA蛋白的免疫原性具有一定差异,其中鸭源H7N9病毒的HA蛋白免疫原性良好,免疫SPF鸡后可以提供良好保护,从而为防控H7N9病毒的亚单位疫苗研发提供了良好的技术储备,而且本研究也为研制H4亚型AIV亚单位疫苗提供了必要的参考数据。
[博士论文] 钱伟
预防兽医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染人会诱发宿主的天然免疫应答,通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)等模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)介导的信号通路,诱导Ⅰ型干扰素和其他细胞因子的产生,刺激下游干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表达,从而发挥抗病毒作用。IAV在与宿主的共同进化过程中,发展出多种免疫逃避机制以躲避宿主的免疫应答。非结构蛋白NS1(Non-structural protein1,NS1)是流感病毒免疫逃避最重要的蛋白,可通过结合病毒dsRNA、靶向RIG-I及E3泛素酶TRIM25和Riplet、抑制抗病毒ISGs活性和宿主细胞mRNA的加工等方式抑制宿主的IFN应答。近年来,在NS1拮抗宿主免疫应答机制方面取得众多进展,但是仍有许多问题没有准确答案,值得深入研究。
  本研究将H5N1/HM流感病毒NS1蛋白的功能结构域进行分段,探讨其N端RNA结合结构域(RNA-binding domain,RBD)和C端效应结构域(Effector domain,ED)在拮抗RIG-I信号通路中发挥的作用,内容如下:
  1.H5N1NS1蛋白的C端效应结构域抑制RIG-I介导的IFN-β产生
  将NS1截短为N端的1-73aa和1-125aa以及C端的74-225aa和126-225aa,在不同刺激条件下,考察截短体对IFN-β启动子活性的影响。在RIG-I或RIG-I(N)刺激下,NS1/74-225和NS1/126-225与全长NS1显著抑制IFN-β启动子活性,而NS1/1-73和NSl/1-125没有抑制作用;但是在病毒或dsRNA刺激下,所有截短体都抑制IFN-β启动子的激活,说明NS1-RBD抑制IFN依赖于RNA,而NS1-ED能以RNA结合非依赖的方式抑制IFN应答。随后通过检测NS1/126-225对RIG-I(N)介导的IRF3磷酸化、IRF3二聚体的形成和IRF3入核以及对IFN-β分泌的影响,进一步确认了C端效应区NS1/126-225抑制IFN-β产生的效应。
  2.NS1/126-225靶向TRAF3阻碍MAVS-TRAF3复合物的形成
  我们推测NS1/126-225可能作用于RIG-I信号通路的某个环节,通过IFN-β启动子报告基因实验、荧光定量PCR和ELISA实验证明了NS1/126-225抑制IFN-β产生位于MAVS和TBK1之间。Co-IP实验表明,NS1/126-225与TRAF3存在相互作用,NS1也能结合TRAF3,并在H5N1/HM病毒感染的A549细胞、HEK293T细胞和鼠原代巨噬细胞中验证了NSI与内源性的TRAF3存在相互作用,但是这种相互作用具有毒株特异性。在TRAF3敲低的细胞中,NS1/126-225对RIG-I(N)介导的IRF3磷酸化和IFN-β转录的抑制作用丧失,进一步证明TRAF3是NS1/126-225抑制IFN产生必需的。更深的分子细节是NS1/126-225与TRAF3的TRAF domain结合,阻碍TRAF3-MAVS复合物的形成。此外,NS1/126-225还能促进SeV感染早期MAVS对IKKε的招募,最终抑制RIG-I信号通路激活和细胞抗病毒应答。
  3.NS1/126-225抑制TRAF3的K63泛素化
  本研究还发现NS1/126-225能抑制TRAF3的K63泛素化。因其本身没有调节蛋白泛素化修饰改变的能力,NS1/126-225可能通过招募去泛素酶来切割TRAF3上的K63泛素链或抑制E3泛素酶结合到TRAF3。DDX3是一种RNA解旋酶,能促进TRAF3的K63泛素化并且能与NS1发生相互作用。在沉默DDX3后,NS1/126-225仍然抑制TRAF3的泛素化,但是病毒感染下对TRAF3泛素化的抑制作用不显著,说明NS1利用DDX3抑制了TRAF3的K63泛素化。
  4.NS1突变的病毒HM-Mut诱导高水平的IFN-β产生
  NS1缺失126-225位氨基酸的突变病毒HM-Mut与野生型病毒相比在A549细胞的复制能力显著下降,诱导IFN-β和ISGs的能力则显著增强。此外,我们发现PR8病毒编码的NS1N端截短体tNS1能与TRAF3相互作用,抑制IFN-β和ISG表达。沉默TRAF3后,突变病毒PR8/M79.81I拮抗IFN的能力以及复制能力与野生型病毒没有显著差异,这一结果很好的补充了本研究的结论。
  本研究首次阐明NS1蛋白的C端效应结构域(ED)逃避宿主天然免疫应答的机制,为流感病毒与宿主先天免疫的相互作用提供了新见解,同时为抗病毒药物的开发提供一个潜在的目标。
[博士论文] ZESHAN HABIB
预防兽医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:由结核分枝杆菌感染引起的结核病是21世纪一种重要的传染病。耐药性结核杆菌的出现对有效预防及控制全球范围内的结核疫情带来了极大的挑战。全球三分之一的人口处于潜伏感染说明该病的再次爆发流行且具有传染性。多重耐药/广泛耐药/全耐药新型结核分枝杆菌的出现使得结核病广泛的影响人和牲畜。劣质药物,药物滥用和不当的防控措施是造成耐药性菌株出现及耐药菌株散播的主要原因。另外结核分枝杆菌在不同压力条件下的良好适应性给新型抗结核药物的开发以及对该病的有效控制带来了很大的困难。结核分枝杆菌通过特定基因转录水平的变化诱导多种调控网络从而对抗不良压力造成的伤害。很多关于适应性基因网络在细菌耐药性产生机制中的作用仍然知之甚少。
  本研究中,我们用亚致死量卡那霉素处理细菌,研究结核杆菌对该压力的基因适应性反应。简单来说,将亚致死浓度的卡那霉素(0.4微克/毫升)连续处理结核杆菌45天,每三天传代一次,最后提取RNA利用下一代测序技术检测基因转录水平的变化。对差异表达倍数5以上的基因分析发现,与对照组相比药物处理组细菌有98个基因上调表达,198个基因下调表达。利用K值进一步分析这些基因发现5个差异表达基因与亚致死浓度卡那霉素处理条件下细菌的适应性相关。这些基因包括Ra1750(硫转运蛋白),Ra3893(核酶活性调节蛋白),Ra2492,Ra3160,Ra3161(假定蛋白)。本研究结果显示这些基因可能与结核分枝杆菌在亚致死量卡那霉素条件下的适应性相关。
  为了研究药物耐药基因的关键调控因子,在结核分枝杆菌中我们通过对因单核苷酸多态性引起的耐药相关基因的结核病数据进行点突变分析(SNP)和耐药性突变(DRM)数据库的Cytoscape应用,构建了蛋白质-DNA相互作用(PDI)和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,确定了30个候选的药物耐药调控基因。对这些调控基因的鉴定可以帮助我们探索它们之间的相互作用,并建立新药开发的以及新的治疗方法。我们同时扩增了这些基因,通过同源重组在一个载体中克隆,并电转至结核分枝杆菌。通过该网络获得的耐药性候选基因属于不同的功能类别,包括调节功能、中间代谢、信息通路、保守假定蛋白、细胞壁和细胞程序以及相关的毒力。这些基因单独地被扩增,在每个载体被克隆并且电转化至结核分枝杆菌。每个结核菌株携带一个候选基因,同时构建了一个表达报告基因eGFP的结核分枝杆菌的空白对照。为了探究这些基因对结核分枝杆菌生长的影响,我们设计了实验,通过测量了这些表达不同基因的结核菌株的吸光度(OD)来反映该菌株的生长情况。同时用一线抗结核药物异烟肼和利福平对这些结核分枝杆菌进行抗生素筛选,以确定其在调节耐药性影响方面的作用,与对照相比。一个有趣的发现是某些菌株异烟肼的MIC从0.2μg/变化到200μg/ml,而使用利福平处理时没有观察到MIC的变化。我们的结果进一步表明,结核杆菌的耐药性是由一个紧密的基因互作网络进行一系列复杂的调控造成的,并且一个基因表达水平上的变化会不同程度的影响不同药物处理下结核分枝杆菌的耐药性。
  此外,研究人员一般仅将药物处理下上调表达的基因认为是疫苗以及药物开发的重要靶点。在这里,我们的研究的独特之处是同时深度研究了上下调节基因,以揭示在亚致死浓度卡那霉素处理下这些基因相互作用的网络的潜在途径。结核分枝杆菌的适应和耐药性病理生理学仍然是药物开发以及控制其疾病的主要挑战。我们的发现可能有助于发现这些潜在的靶点,以促进应对耐药性的新药的开发。
[硕士论文] 刘德婧
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是菌体短小,直杆状或弯曲弧状的革兰阴性弧菌属细菌,兼性厌氧,具有嗜盐性。创伤弧菌是常见的海洋致病菌,常常寄生于软体动物和贝壳动物,可通过进食染毒食物或伤口接触感染,病例多发生于临海的国家和地区。创伤弧菌感染致死率高,引发的死亡占弧菌感染致死人数的82%。创伤弧菌的感染发展迅速,最快接触后4小时即可出现症状,如果3天内没有得到抗生素治疗,死亡率可达100%。中国现行的创伤弧菌检测方法基于增菌培养,一般需要2-3天才能得到精确到种的结果。显然,基于培养的检测手段无法满足快速检测创伤弧菌的需求。因此发展一种快速、准确的新检测方法用于创伤弧菌的临床诊断和食品安全监控迫在眉睫。
  近年来,研究者们开始尝试将核酸适配体应用于微生物检验检测领域。开发了许多基于核酸适配体的生物传感器平台,在分析诊断、食品安全等领域得到广泛应用。核酸适配体是单链的DNA或RNA,核苷酸单链构象的多态性意味着即使长度一致的核苷酸链也会具有不同的三级结构,因此适配体也被称为化学抗体。利用这一特性,通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术,将长度相同,序列随机排布的ssDNA或ssRNA文库与靶细菌孵育,不断富集、筛选和扩增与靶细菌结合的序列,即可筛选得到与靶标微生物特异性结合的核酸适配体。适配体可以批量合成,添加各种化学基团修饰,与阻抗生物传感器、流式细胞仪、胶体金检测仪等生物传感器联用,实现微生物的鉴别诊断。
  本研究通过以菌体为靶标的SELEX技术筛选,获得两条与创伤弧菌特异性结合的核酸适配体,V8和V13。两条核酸适配体的亲和力均达到nM级别,去除引物区后,核酸适配体的随机区域依旧保持了它们的高特异性和高亲和力,在实际应用中更短的核苷酸序列也意味着更低的生产成本。核酸适配体可以与处于不同生长状态的创伤弧菌结合:对数生长早期、对数生长晚期、静止期和活的非可培养状态下的创伤弧菌与核酸适配体孵育后均显示了相似的荧光信号。激光共聚焦显微镜观察可以发现,与其他种属的细菌共同孵育,核酸适配体可以特异性地识别出创伤弧菌。此外,在处理过的血浆中和牡蛎浸出液中,V8依然能够保持构象稳定,与创伤弧菌结合不受影响。核酸适配体不仅可以检出创伤弧菌菌株ATCC27562,也可以检出其他来源分离得到的创伤弧菌菌株。
  验证了流式细胞仪联合核酸适配体V8直接对液体样本进行创伤弧菌检测的可行性。该检测方法检测性能良好,理论检测限为:29.7CFU/mL,可靠检测限为100CFU/mL。线性范围为:500-500,000CFU/mL。用蛋白酶K作用创伤弧菌20min可得到细菌碎片,与核酸适配体V8结合后,荧光信号值比正常创伤弧菌高3倍,理论检测限降至7.804CFU/mL,可靠检测限为28CFU/mL。整个检测过程缩短至1h以内,与基于培养的检测方法相比显著降低。
  综上,通过以菌体为靶标的SELEX技术,筛选到了特异性强,高亲和力的创伤弧菌核酸适配体。核酸适配体与流式细胞技术结合,不但大大降低了检测限,提高了检测速度,更是摆脱了以培养为基础的检测路线,使得活的非可培养状态下的创伤弧菌的检测更加便捷,准确。基于创伤弧菌核酸适配体的传感器可以提高临床检验检测和食品安全监控部门的工作效率,具有巨大的应用潜力。
[硕士论文] 王海岩
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:诺如病毒(Norovirus,NoV)属于杯状病毒科(Caliciviridae),诺如病毒属,病毒直径约27~40nm,基因组由单股正链RNA构成,全长约7.5~7.7kb,含有3个开放阅读框(Open reading frame,ORF1~3),两端是5'和3'非翻译区(Untranslated region,UTR),3'末端有多聚腺苷酸尾(Poly A)。其中ORF1编码一个多聚蛋白,ORF2和ORF3分别编码主要结构蛋白(VP1)和次要结构蛋白(VP2)。结构蛋白VP1由2个主要的相邻区域组成,壳区(Shelldomain,S区)和突出区(Protruding domain,P区)。P区可进一步分为P1和P2两个亚区,后者位于VP1的最外层,高度变异,包含潜在的抗原中和位点和受体组织血型抗原(Histoblood group antigens,HBGAs)识别位点。基于VP1衣壳蛋白区基因序列,NoV可分为7个基因群(Genogroup,GⅠ~GⅦ),40多个基因型,其中GⅠ(9个基因型)、GⅡ(22个基因型)和GⅣ(2个基因型)群可感染人,GⅢ、GⅤ和GⅥ群分别感染牛、鼠和狗。
  NoV主要通过粪口途径传播,传染性极强,与病人、污染的食物、水或者环境密切接触都可能感染NoV。NoV感染发病以急性胃肠炎(Acute gastroenteritis,AGE)症状为主,最常见症状是腹泻和呕吐,其次为恶心、腹痛、头痛、发热、畏寒和肌肉酸痛等。尽管NoV感染主要表现为自限性疾病,但在婴幼儿、老年人、免疫抑制和免疫缺陷的人群中仍会发展成重症,甚至死亡。同时,由于受到人体免疫系统驱使和病毒自身基因组的进化,NoV会不断的发生变异,这就导致每隔2~3年,自然环境中流行的NoV优势毒株会被新的变异株所取代,进而引起AGE的大流行。
  目前,NoV已成为全球AGE散发和暴发事件的重要病毒性致病原,给世界各国带来沉重疾病负担并造成严重经济损失。我国NoV感染也十分普遍,近几年,NoV曾在我国多个省、市出现暴发流行。然而,由于我国一直将AGE列入丙类传染病进行报告管理,同时缺乏NoV实验室监测网络,导致我国NoV分子流行病数据较为缺乏,阻碍了对NoV在人群中流行的时间动态变化特征及其遗传进化规律的研究。本研究借助于食源性疾病主动监测网络,在山东省选取4所哨点医院,开展对食源性AGE病例中NoV病原学监测,以摸清山东省部分地区AGE病例中NoV主要基因型的分布,并探索其优势基因型的分子进化和遗传进化规律。
  目的:
  (1)通过哨点监测,了解山东省部分地区食源性AGE病例中NoV感染状况及流行病学特征,掌握当地NoV流行病学本底资料。
  (2)摸清AGE病例中NoV主要基因型的分布,探索其优势基因型的遗传进化规律。
  方法:
  (1)标本收集:2016年1~l2月,分别在山东省4家食源性疾病主动监测哨点医院(济南市儿童医院、烟台毓璜顶医院、莱州市人民医院、临沂市人民医院)采集AGE病例粪便标本,同时收集其人口学资料和流行病学资料。
  (2)标本处理和核酸提取:使用PBS制备10%至20%的粪便悬液,并提取病毒核酸。
  (3)病毒检测和序列测定:采用荧光定量Real-time RT-PCR检测标本中NoV GⅠ群、NoV GⅡ群、轮状病毒、星状病毒、札如病毒和肠道腺病毒,并采用传统RT-PCR扩增阳性标本中NoV GⅠ和GⅡ群RdRp和衣壳蛋白区部分基因片段,琼脂糖凝胶电泳后对阳性产物进行序列测定。
  (4)序列分析:采用BioEdit7.0.5.3软件对本研究获取的NoV序列和GenBank数据库下载参考序列进行多重比对和同源性分析,同时采用MEGA7软件构建基于邻位法(Neighbor-Joining method)和Kimura2-parameter模型的系统进化树。
  (5)统计分析:采用SPSS20软件对个案数据进行分析,统计方法采用卡方检验,显著性检验水平取0.05。
  结果:
  (1)收集的671份AGE病例粪便标本中共有70份检出NoV,总的检出率为10.43%。其中GⅠ群6份,约占8.57%,NoV GⅡ群有64份,约占91.43%,未见NoV GⅠ群和GⅡ群混合感染现象。轮状病毒、星状病毒、札如病毒和肠道腺病毒的检出率则分别为5.81%、2.24%、1.79%和12.37%。
  (2)NoV在男女病例中均有检出,总的检出率分别为10.12%和10.73%(x2=0.016,p=0.898)。其中NoV GⅠ群在男、女病例中检出率分别为0.87%和0.95%(x=0.000,p=1.000);NoV GⅡ群在男、女病例中检出率分别为9.25%和9.78%(x2=0.054,p=0.816)。
  (3)各年龄段病例均有NoV检出,其中≤5岁和16~30岁年龄组内NoV检出率最高(14.22%和12.50%),31~45岁年龄组检出率最低(2.97%),不同年龄组NoV检出率差异无统计学意义(x2=10.697,p=0.058)。此外,NoVGⅠ群只在16~45岁年龄区间内检出,NoV GⅡ群则在各年龄组内都有检出。
  (4)NoV在每个月份病例中均有检出,检出率最高出现在2月(14.49%),最低出现在3月(5.13%),检出人数和检出率在冬春季(1、2、11和12月)较高,其他月份则相对较低。
  (5)NoV阳性病例腹泻类型全为水样稀便,腹泻次数最多达10次/天,平均5.77±2.22次/天。除腹泻外,NoV阳性病例中最常见的临床症状为腹痛(44.93%,31/69)、呕吐(44.93%,31/69)和发热(5.80%,4/69)。除腹痛症状外,呕吐、发热在NoV阳性和阴性病例中发生率均无统计学差异。
  (6)经测序定型,所获NoV序列共属于6个基因型,分别为NoV GⅠ群的GⅠ.3和GⅠ.5,NoV GⅡ群的GⅡ.3、GⅡ.4和GⅡ.6和GⅡ.17。GⅠ群优势型别为GⅠ.3;NoV GⅡ群各基因型中GⅡ.17和GⅡ.4占比最高,分别为53.49%(23/43)和32.56%(14/43)。进化分析显示本次研究中GⅡ.17全为Kawasaki2014变异株,GⅡ.4全为Sydney2012变异株。
  结论:
  (1)NoV是山东省部分地区(济南、临沂和烟台)食源性AGE病例的重要致病病原,且NoV GⅡ群流行强度高于GⅠ群。
  (2)NoV在监测地区呈现冬春季高发趋势,但在不同性别和不同年龄段人群中流行强度并无显著差异。
  (3)水样稀便、腹痛和呕吐是NoV阳性腹泻病例主要临床症状,其中水样稀便是NoV所致腹泻患者重要特征。
  (4)监测地区存在多个NoV基因型共循环现象,其中GⅠ群优势型别为GⅠ.3,GⅡ群优势型别为GⅡ.17和GⅡ.4。同时当地流行的GⅡ.17均为Kawasaki2014变异株,GⅡ.4均为Sydney2012变异株。
[博士论文] 郝莹莹
临床检验诊断学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.了解CREC药物敏感性,进行菌株的表型筛选及同源性分析。
  2.研究我院产NDM菌株在CREC中流行情况及耐药基因的可传播性。
  3.研究大肠埃希菌毒力因子与系统性进化分型、耐药基因的相关性。
  4.建立使用飞行时间质谱技术快速检测产碳青霉烯酶菌株的方法。
  方法:
  1.菌株收集收集山东省立医院2015年1月至12月,临床分离的CREC菌株(患者来自全省各个地区),保存有菌种的共23株。另外,收集碳青霉烯类敏感的大肠埃希菌20株,作为质谱检测产碳青霉烯酶菌株的阴性对照。采用梅里埃VITEK Compact和梅里埃基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对菌种进行确认。
  2.表型筛选与药敏试验对CREC菌株进行表型筛选实验,包括改良Hodge试验(MHT)、ETP-EDTA双纸片协同试验、ETP-EDTA复合纸片试验、改良碳青霉烯酶失活试验(mCIM)。对确认为CREC的菌株进行微量肉汤稀释法和E-test法药物敏感性实验,敏感性判断标准为(Clinical and Laboratory StandardsInstitute, CLSI M100-S26)。
  3.同源性分析对CREC菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)试验和多位点序列分析(MLST),分析菌株的同源性。PFGE:将菌体基因组DNA包埋于小胶块内,进行胶块内细胞裂解、XbaⅠ酶切、脉冲场凝胶电泳,使用Bionumerics软件对电泳指纹图谱进行比对,分析菌株的同源性,研究菌株克隆传播的情况。MLST:煮沸法提取菌株基因组DNA,扩增七个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA),测序后将序列信息录入MLST网站(http://www.MLST.net/),获得相应的等位基因号码,再根据7个等位基因的组合,获得菌株ST型。采用eBURST软件对菌株进行聚类同源性分析,MEGA6软件对菌株的系统性进化进行分析。
  4.耐药基因检测对23株CREC菌株进行了耐药基因PCR扩增和测序,了解NDM及其他耐药基因在CREC中的流行情况,对于碳青霉烯类耐药基因扩增阴性菌株,提取细菌外膜总蛋白,进行SDS-PFGE蛋白电泳,分析膜孔蛋白缺失情况。
  5传播机制检测对20株产NDM的CREC菌株进行了质粒接合转移实验和电转化试验检验耐药基因是否可以通过质粒在菌株间水平传播,并对接合子进行了肉汤稀释法和E-test法药物敏感性试验来分析质粒的耐药性。
  6.系统性进化分群与毒力因子检测按照Clermont建立的方法,通过PCR扩增(ChuA、YjaA、TspE4C2)将CREC菌株进行系统性进化分群。同时进行多重PCR扩增常见肠外感染大肠埃希菌毒力因子(PAI、papA、fimH、kpsMTⅢ、papEF等共31个基因),采用SPSS软件,对菌株MLST分型、ESBLs基因型、NDM型与致病因子的相关性进行Fisher's精确检验。
  7.质谱检测采用CHCA作为小分子量参照物,对梅里埃微生物鉴定质谱仪VITEK MS进行定标。厄他培南作为底物,与临床菌株作用后检测厄他培南质谱峰图改变,建立质谱快速检测碳青霉烯酶产酶菌株的方法学,并对其特异性和敏感性进行评价。
  结果:
  1.2015年全院共分离出大肠埃希菌1575株,其中碳青霉烯类耐药大肠埃希菌38株(约占2.4%),分别来自尿液47.2%(20/38)、痰18.9%(7/38)、创面分泌物11.3%(4/38)、腹腔标本15.79%(6/38)、血液3.8%(1/38)。CREC主要来自泌尿外科26.3%(10/38),15.8%(6/38)来自儿科,15.8%(6/38)来自ICU。保存有菌株的有23株(其中一株来自同一患者的不同感染部位)。22位患者中有7位明确使用过碳青霉烯类抗菌药物,除了一位患者以外都有过侵入性操作(放置引流管、气管切开、静脉置管、留置导尿管等)。
  2.所有菌株均对头孢菌素类、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁、氟喹诺酮类全部耐药,并且耐药水平较高,MIC值均≥128μg/ml;23株菌株中仅一株对氨曲南敏感。但所有菌株对替加环素、多粘菌素B均为敏感。对阿米卡星的敏感性也较高,23株中仅4株耐药,庆大霉素耐药率为47.82%(11/23)。值得关注的是,磷霉素耐药率为30.43%(7/23)。
  3.23株菌株中共有20株NDM基因阳性,CTX-M和TEM为最常见的ESBLs基因,对扩增的片段测序以确定具体CTX-M基因亚型和TEM基因亚型。19株TEM阳性菌株全部为TEM-1型。最常见的CTX-M亚型为CTX-M-14,共13株;其次为CTX-M-15,共检出6株,CTX-M-55共检出6株。其中16株携带两种以上ESBLs基因,6株携带两种CTX-M亚型基因。4株阿米卡星耐药菌株均由16S rRNA甲基化引起。23株临床菌株全部对喹诺酮类药物耐药,18株喹诺酮耐药基因阳性,9株为qnrB基因,8株为qnrS基因,7株为qnrS和aac(6')-Ib-c同时阳性,其余5株可能为其他机制导致的喹诺酮类耐药。7株磷霉素耐药菌株全部由fosA3基因引起。
  4.按Tenover标准,采用相似度80%为cut-off值,23株CRE可以分为11个亚群,其中一个亚群中3株菌相似度大于90%,提示存在克隆菌株流行。
  5.23株临床分离的CREC中含有1-6个质粒不等,15株携带50 kb大小左右的质粒,11株同时携带80 kb、50 kb左右两个质粒(其中7株为ST167,2株为ST410,1株为ST5229,1株为ST405)。质粒接合转移试验共获得携带碳青霉烯耐药基因质粒接合子17株。产碳青霉烯酶的菌株中3株菌不能通过质粒接合转移试验获得对碳青霉烯类耐药的接合子,或者通过电转化试验获得转化子。对本实验中接合子对喹诺酮类全部为敏感,证明喹诺酮类耐药基因与NDM耐药基因不在同一个质粒上。
  6.23株临床菌株没有检出高致病力B2群,但3株属于致病力较强的D群(3株均为ST405型),16株属于B1群(7株为ST167型,3株为ST410型,2株为ST617型,ST361、ST5229、ST744各有一株),4株属于A群(3株为ST167型,1株为ST617型)。A群和B1群ST167菌株的PFGE指纹图谱有所不同,可能为不同来源菌株。产NDM-1菌株比产NDM-5菌株中papGⅢ携带率高。ST617与ST405比ST167携带papGⅢ的比例高,有更强的粘刚、定植的能力。
  7.厄他培南作为底物,采用飞行时间质谱技术检测NDM型碳青霉烯酶产酶株CREC特异性和敏感性均为100%。
  结论:
  1.我院CREC发生率约为2.4%,与全国CREC检出率基本一致。泌尿外科、儿科、ICU是CREC流行主要科室;尿液、腹腔标本(胆汁、腹水)、痰是耐药菌的主要来源。侵入性操作、使用过头孢菌素或碳青霉烯类药物是耐药菌发生的高危险因素。CREC菌株通常是多重耐药菌,但对替加环素、多粘菌素B全部敏感,阿米卡星也有较好的敏感性。本实验筛选出一株菌株磷霉素耐药基因与NDM基因在同一个可传播质粒上。磷霉素作为CREC选择性治疗药物时要慎重,这类泛耐药菌株的传播将给临床治疗带来更大的挑战,应加强筛查和控制。
  2.NDM是我院引起CREC的主要因素,最常见的NDM亚型为NDM-5,约占52%(12/23),其次为NDM-1(6/23),这区别于国内其他地区以NDM-1为主的流行情况。ST167是我院CREC主要流行株,也是NDM-5的主要携带者。另外检出ST617、ST405、ST410等6种ST型。除了NDM基因,CREC通常还携带喹诺酮、氨基糖苷等多种耐药基因。TEM-1和CTX-M-14是我院最主要ESBLs基因型,其次为CTX-M-15。大部分菌株同时携带两种以上ESBLs基因,对β-内酰胺类药物有较强的水解能力。
  3.我院既存在耐药菌株的克隆传播,又存在耐药质粒的水平传播,质粒水平传播过程中存在耐药基因的整合。IncX3型质粒是携带NDM基因的主要载体,也有少量IncFⅡ、ncFⅡr型质粒的检出。大部分质粒为50 kb大小,其余70-130kb大小不等。具有可兼容其他质粒的特点,容易在菌株间水平传播,且该质粒能够在临床菌株中稳定存在。以往认为,CREC较少引起暴发、流行,关注度比较低。但本实验证实,IncX3质粒容易传播,可能造成CREC发生率升高,甚至流行,应加强携带这类质粒菌株的筛查和监控。
  4.我院CREC未检出高致病性B2群菌株,但检出相对高毒力的D群菌株3株,本研究第一次报道了我国携带NDM的D群大肠埃希菌ST405菌株。粘多糖、P菌毛、M菌毛、铁转运蛋白在大肠埃希菌粘附、定植和致病力增强中起了重要作用。
  5.厄他培南作为底物,采用飞行时间质谱技术检测产碳青霉烯酶菌株具有较好的敏感性和特异性,在临床开展应用具有良好的前景。
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