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[硕士论文] 程仕强
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着健康观念变化和医学模式转变,中医药越来越显示出其独特的优势和不可替代的作用。红景天作为中医药应用历史悠久,被人们称为“雪域人参”。红景天苷是红景天根部的主要活性成分,具有多种药理功能,其在抵抗炎症和脂肪代谢中发挥重要作用,但其中机制尚不明确。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,可通过极化发挥抗炎或促炎的作用,同时巨噬细胞内的脂肪代谢与巨噬细胞的功能有着紧密的联系。已有研究证明,脂肪量和肥胖相关基因(FTO)能够抑制促炎细胞因子表达。为了更好了解巨噬细胞的功能和探索红景天苷的潜在药用功能,本研究探讨了红景天苷对巨噬细胞极化以及巨噬细胞内脂肪代谢重要调节分子的影响。
  本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究模型,用红景天苷(100μM)预处理1h后,以LPS(1μg/mL)或IL-4(20ng/mL)诱导巨噬细胞分别向M1与M2方向极化,通过RT-qPCR方法检测M1型极化标志基因iNOS、IL-6、IL-1β和M2型极化的标志基因ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平。结果显示iNOS、IL-6、IL-1βmRNA相对表达水平较LPS单独处理组显著下调,而ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平与IL-4单独处理组相比发生上调,说明红景天苷能够抑制巨噬细胞M1型极化和促进巨噬细胞M2型极化。通过Western blot方法检测Akt蛋白S473位点磷酸化水平,红景天苷能够抑制LPS诱导Akt S473位点的磷酸化水平,红景天苷可以通过影响巨噬细胞的Akt信号通路来调控巨噬细胞极化。使用红景天苷预处理后检测Poly(I:C)(5μg/mL)刺激巨噬细胞诱导的炎症关键基因iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,结果表明:iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平显著降低,说明红景天苷可能对病毒感染引起的炎症也具有保护作用。在巨噬细胞中超表达FTO,红景天苷预处理后,加入LPS刺激,检测促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平。结果显示IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平显著降低,说明超表达FTO能够抑制LPS引起的炎症因子的表达进而影响巨噬细胞的抗炎作用。为了更进一步研究红景天苷对巨噬细胞脂质代谢的影响,红景天苷预处理细胞,再加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO的mRNA表达水平。结果显示,FTO的mRNA表达水平降低,红景天苷对巨噬细胞炎症中的FTO有调控作用。使用红景天苷预处理,加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO/SREBP1c/CIDEc信号通路中脂肪合成的重要调节因子SREBP1c和促进脂滴合成的关键蛋白CIDEc的mRNA表达水平。结果显示,红景天苷能够抑制脂肪积累过程中关键基因SREBP1c和CIDEc的mRNA水平的表达,从而可能降低巨噬细胞中的脂质积累。
  总之,我们结果表明红景天苷可以调控巨噬细胞极化以及影响巨噬细胞内脂质代谢相关重要调节分子的表达,从而调控机体的炎症反应。
[硕士论文] 鞠志远
食品加工与安全 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:近年来大米蛋白改善慢性病的功效逐渐获得研究证实,如抗糖尿病,抗高血压,抗动脉粥样硬化(AS)等。球蛋白是大米蛋白中最主要的生物活性蛋白,大米球蛋白中的绝大部分为α-球蛋白。实验室前期研究证实了大米α-球蛋白(100mg/kg体重/天)的抗AS作用,但其在体内经胃肠道消化后能够被吸收并发挥功效的关键肽段尚不明确。在大米α-球蛋白的抗AS机制研究中,本实验室前期研究已排除了调节脂质代谢紊乱的途径,是否通过另一个主要途径,即血管细胞保护作用发挥功效仍有待于进一步研究。因此,本论文从大米α-球蛋白肽段的制备及其血管细胞保护作用开展研究,旨在进一步揭示大米α-球蛋白的抗AS作用机制。
  首先,利用G-15葡聚糖凝胶色谱和半制备高效液相色谱分离纯化大米α-球蛋白体外消化产物中可吸收组分,得到11个主要组分峰;经液相一串联质谱测定氨基酸序列,二级质谱结果通过比对Uniprot数据库,鉴定出5条目标肽段(YYGGEGSSSEQG、GEQQQQPGM、YGEGSSEEG、AAGALPS、SESEM),并利用固相合成技术获得纯度达到97%的5个目标肽段。由动物实验验证目标肽的可吸收性,以10mg/kg体重/天的剂量灌胃金黄地鼠,4小时后取血,考察其血清中目标肽的存在,离子阱质谱结果显示,血清中可检测到全部5条目标肽,证实目标肽段均可直接被机体吸收。
  其次,研究了5个目标肽对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。通过研究不同处理浓度和时间的TNF-α对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤程度,确定了10ng/mL的TNF-α处理6小时来构建内皮细胞损伤模型。在此基础上运用50μg/mL的目标肽预处理细胞18小时,测定了细胞的氧化应激和炎症反应。结果显示肽可以显著缓解细胞损伤引起的活性下降,降低细胞凋亡率,并有效调节炎症因子(NO,iNOS)及细胞粘附因子的水平(ICAM-1,VCAM-1),且对氧化应激因子(MDA,GSH-Px和SOD)水平有改善作用。进一步分析了核因子-κB(NF-κB)的核转运,以及上下游信号因子(IKKα、IκBα、Bcl-2、Bax、p-p38)的表达水平,结果显示肽通过抑制p65和p38信号通路调节黏附分子表达和抑制内皮细胞凋亡。细胞活力实验和平板划痕实验结果表明,肽YYGGEGSSSEQG、SESEM可有效抑制血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖和迁移。同时,目标肽表现出可下调血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的功效,这可能是其抑制VSMC增值迁移的关键原因。
  最后,为进一步验证大米α-球蛋白肽基于血管细胞保护的抗AS功效,选取目标肽YYGGEGSSSEQG、SESEM(10mg/kg体重/天)灌胃载脂蛋白E基因敲除(Ap oE-/-)小鼠三个月。主动脉染色切片结果显示,这2条目标肽均可显著减小ApoE-/-小鼠主动脉的AS斑块面积;血清检测结果表明,目标肽可显著降低ApoE-/-小鼠血清GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶水平以及VCAM-1水平,但对血清和肝脏的脂质水平没有明显作用。
  利用分离鉴定及生物合成法获得纯化的α-球蛋白肽段,经体内、体外实验,证实其通过修复TNF-α引起的HUVEC损伤、抑制VSMC增殖和迁移的血管细胞保护作用,以及由此所发挥的抗AS机制。
[硕士论文] 杨倩
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本课题从蕲春蕲艾(Artemisia argyi)根茎部分离纯化得到一株内生真菌命名为HCH285,之后进行菌种鉴定、bostrycin方法学构建,同时对该HCH285内生菌代谢产物和bostrycin进行安全性和活性分析,主要结果如下:
  1.HCH285菌种鉴定。利用微生物学与分子生物学两种方法对HCH285内生真菌进行鉴定。微生物形态学观察发现菌落呈圆形,生长初期为白色绒状毛且生长蓬松,后期逐渐成红色且菌落背面的红色产物也清晰可见。HCH285菌丝体为无色有隔菌丝。它产单个、球形或椭圆形、黑色光滑的分生孢子。此外通过分子生物学技术对其ITS序列测定确定该菌株属于黑孢霉属球黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)。
  2.HCH285内生菌产bostrycin分离制备方法建立。利用多种化学试剂对HCH285内生菌代谢产物提取,确定乙酸乙酯为最佳萃取试剂,以半制备液相进行化合物分离,优化卷线孢菌素bostrycin的HPLC制备方法,使用高效分析型液相检测分离纯度,其分离制备方法为:柱温∶30℃,进样体积∶700μL,流速∶3mL/min,流动相比例:甲醇∶0.3%甲酸=50∶50(v/v),检测时间∶30min,紫外检测∶02nm;采用400MHz核磁共振波谱仪进行结构鉴定确定为卷线孢菌素bostrycin。
  3.Bostrycin活性分析。Bostrycin抗氧化活性分析证明,对三种自由基抗性顺序由大到小为O2->DPPH->OH-。它的抗菌活性表明有较好的抗菌作用,对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌较好。CCK-8法体外抗癌活性研究表明对U251,B10F16癌细胞的半致死浓度分别为4.30μM和6.05μM。
  4.Bostrycin及HCH285菌代谢色素的安全性分析。引入秀丽隐杆线虫(C.elegans)为生测材料,以食品级红曲红色素为对照,研究对C.elegans各生理指标的影响。试验表明HCH285菌产色素对C.elegans的急性与慢性毒性、摄食与运动能力、生长发育状态、卵块孵化率,均没有明显抑制作用且与食品级红曲红色素作用效果一致,综合各指标显示500μg/mL内为安全剂量。以相同方法和指标,分析bostrycin对C.elegans作用,确定剂量在10μg/mL内无毒副作用。
[博士论文] 聂荣祖
食品科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文以柿单宁主要特征结构单元表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及其A型连接的二聚体(A型EGCG二聚体)为研究对象,旨在阐明A型EGCG二聚体具备较强抗淀粉样聚集活性的原因。首先,我们通过Thioflavin T(ThT)荧光、1-anilinonaphthalene-8-sulfonic(ANS)荧光、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色光谱和透射电子显微镜等手段系统证实了A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更强的抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成及解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的效果,并探究了A型EGCG二聚体发挥抑制作用的关键阶段。进一步通过构建PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维神经细胞毒性的抑制作用和调节机制。在此基础上,以Aβ40淀粉样多肽为模型,通过ESI-MS、核磁共振、分子对接等研究手段探索EGCG和A型EGCG二聚体与Aβ40淀粉样多肽的结合方式和相互作用位点。主要研究结果如下:
  1.EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维形成抑制作用的比较研究
  ThT荧光实验结果表明,牛胰岛素蛋白在pH2.0的含20%乙酸溶液中孵育8h可形成成熟的牛胰岛素淀粉样纤维。加入EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维的形成均可发挥显著的抑制作用,且抑制作用随着多酚浓度增大而增强。相较于EGCG单体,A型EGCG二聚体效果更好,当其浓度达到0.35mM时,可完全阻止牛胰岛素淀粉样纤维的形成。透射电子显微镜观察结果与ThT荧光实验结果相符。加入0.70mM的A型EGCG二聚体后,在透射电子显微镜中观察不到淀粉样纤维状结构,但有部分无定型聚集体形成。此外,采用动态光散射检测发现A型EGCG二聚体可保护一部分牛胰岛素蛋白继续以单体形式存在,同时生成了粒径约为295nm的无定型聚集体。ANS荧光、FTIR和圆二色光谱的研究结果表明,A型EGCG二聚体可较好地保护牛胰岛素蛋白的原始构象,阻止蛋白二级结构的改变及内部疏水性氨基酸的暴露。因此,我们推测与牛胰岛素蛋白单体结合并抑制蛋白结构改变是A型EGCG二聚体发挥抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成作用的机制之一。为了研究A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键时期,在牛胰岛素蛋白孵育过程的不同时期加入0.70mM的A型EGCG二聚体,从结果中可以看出,在0h和2h时加入0.70mMA型EGCG二聚体可完全抑制牛胰岛素蛋白疏水性氨基酸的暴露及牛胰岛素淀粉样纤维化聚集进程,并阻止原纤维的形成,促进无定型聚集体的形成,这表明A型EGCG二聚体不仅能够与牛胰岛素蛋白单体结合,还可与成核寡聚体结合,并破坏其原有结构,从而达到使其丧失继续形成原纤维的能力。然而,在4h时加入A型EGCG二聚体仅能部分抑制牛胰岛素淀粉样纤维的形成。因此,以上研究结果证实,牛胰岛素淀粉样纤维形成过程中的延滞期是A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键阶段。
  2.EGCG和A型EGCG二聚体对成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚作用的比较研究
  ThT荧光和ANS荧光检测结果表明A型EGCG二聚体可显著减少牛胰岛素淀粉样纤维疏水性氨基酸的暴露,且A型EGCG二聚体的解聚效果强于EGCG单体。透射电子显微镜的观察结果可进一步证实A型EGCG二聚体具有更强的解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的能力。通过SDS-PAGE电泳和Bradford法分别分析成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚产物分子量分布和上清液中可溶性蛋白含量变化,可以看到牛胰岛素淀粉样纤维解聚后形成了大量的分子量为10kDa到250kDa的聚集体,且A型EGCG二聚体加入后生成的可溶性蛋白浓度为加入EGCG时的3.68倍,这表明A型EGCG二聚体不仅对已形成的牛胰岛素淀粉样纤维具有更好的解聚效果,还能促进可溶性牛胰岛素寡聚体的大量形成。
  3.EGCG和A型EGCG二聚体对由牛胰岛素淀粉样纤维诱导形成的神经细胞毒性的抑制作用及机制
  选用PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性的抑制作用。MTT实验结果表明EGCG和A型EGCG二聚体可显著抑制牛胰岛素淀粉样纤维诱导产生的细胞毒性。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维引起的损伤。实验结果表明,相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞膜完整性,降低由牛胰岛素淀粉样纤维诱导的胞内过量Ca2+、活性氧(ROS)和一氧化氮(N0)浓度,阻止线粒体膜电位下降,提高胞内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化防御酶活性,抑制细胞内凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(Endo G)等凋亡相关蛋白的过量表达。因此,根据以上结果,我们推测清除细胞内过量的活性氧,并提高抗氧化防御酶活性是A型EGCG二聚体较好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性损伤的分子机制。
  4.以Aβ40淀粉样多肽为模型研究A型EGCG二聚体较强的淀粉样聚集抑制作用机理
  ThT荧光实验结果表明A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更显著的抑制Aβ40淀粉样纤维形成的能力。30μM的A型EGCG二聚体可完全抑制Aβ40淀粉样多肽疏水性氨基酸残基的暴露和Aβ40淀粉样纤维化聚集进程。透射电子显微镜的观察结果可证实上述结论,30μMA型EGCG二聚体可促使无定型聚集体的形成,同时完全阻止Aβ40淀粉样纤维形成。未修饰蛋白光催化交联法和MTT法的检测结果均证实A型EGCG二聚体可较好地抑制Aβ40寡聚体的形成及其诱导的神经细胞毒性。随后,我们采用荧光淬灭、ESI-MS、核磁共振和分子对接等研究手段检测多酚与Aβ40多肽之间的相互作用机制,结果表明EGCG与A型EGCG二聚体均可与Aβ40多肽主要通过疏水相互作用结合形成非共价复合物。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可与更多具有强烈聚集倾向的氨基酸残基结合,并与Aβ40多肽之间形成更多的非共价相互作用。最后,构效关系的研究结果表明多酚化学结构中的没食子酰基基团重要性强于羟基。
[硕士论文] 陈鹤炯
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:银杏黄酮是银杏叶中的主要活性成分。大量研究表明,占银杏叶中黄酮化合物比例较少的苷元型黄酮比其糖苷衍生物更具生物活性。目前银杏黄酮水解方法较大程度上限制了水解工艺的工业化,因此寻找新型催化剂也是银杏黄酮水解研究的一个新出路。本文对比了HZSM-5、Hβ和HY三种分子筛水解银杏黄酮的效果,筛选出合适的催化剂优化得到适宜的工艺条件。另外,本文使用HZSM-5分子筛为催化剂对银杏黄酮的水解过程进行动力学分析,为HZSM-5分子筛水解银杏黄酮的工业化推广提供理论支持;最后讨论溶剂萃取法和碱提取酸沉淀法在银杏黄酮苷元纯化上的应用。
  1.通过正交实验得到HZSM-5分子筛催化水解银杏黄酮的最佳工艺条件为:反应温度为140℃,反应时间为6h,银杏叶提取物(GBE)浓度为1.0mg·mL-1,催化剂用量为1.25g,溶剂为纯甲醇;Hβ分子筛催化水解银杏黄酮的最佳工艺条件为:反应温度为150℃,反应时间为8h,GBE浓度为0.8mg·mL-1,催化剂用量为0.50g,溶剂为95%的甲醇水溶液;通过多次实验认为HY分子筛不适合用于银杏黄酮的水解中。
  2.使用HZSM-5分子筛为催化剂,分析了银杏黄酮的水解过程,发现三种糖苷的水解过程均较好的符合一级反应动力学方程,r2基本全部大于0.95,并得到了三种糖苷的水解活化能。
  3.本文选择溶剂萃取法和碱提取酸沉淀法对黄酮苷元进行提纯。对比了石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇等五种有机溶剂的纯化效果,结果乙酸乙酯对黄酮苷元的纯化效果最好。通过单因素实验分析了碱提取酸沉淀法的纯化效果,得出实验范围内的最佳工艺条件为提取时使用氢氧化钠溶液调节pH为9,沉淀时使用盐酸调节pH为2,使黄酮苷元含量从17.13%上升到68.83%,苷元回收率为62.93%。
[硕士论文] 赵文龙
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:我国是世界上银杏叶的最大产地,银杏资源十分丰富。银杏叶中的银杏黄酮具有抗衰老、防止血管堵塞、降血压等功效,因此被广泛利用到药品、保健品等领域。目前市场产品主要是银杏黄酮含量为24%的银杏叶提取物,市场竞争激烈;为了提高产品的附加值,满足高端市场的需求,重要措施之一是通过优化提取精制工艺,增大提取物中银杏黄酮的含量。本文从原料银杏叶出发,研究提取精制银杏黄酮的方法,主要研究内容如下:
  1)本文建立了分光光度法和高效液相色谱法两种方法来测定提取物中银杏黄酮的含量。通过单因素实验对银杏黄酮提取过程的影响因素进行分析,考察了热回流提取法、超声辅助提取及水析过程对其提取率的影响,并通过正交实验得到了银杏黄酮提取过程最优的工艺参数为温度70℃、乙醇浓度70%、料液比为1∶15、提取时间30min、水析比为1∶5,此时提取率为95.3%,水析之后,银杏黄酮含量为4.5%,两个过程的总收率为92.7%。
  2)本文分别对AB-8大孔吸附树脂和聚酰胺树脂精制银杏黄酮过程进行了研究,采用静态实验考察了树脂的吸附特性,绘制了吸附动力学曲线及吸附等温线并进行了拟合;采用树脂的梯度洗脱实验确定了精制过程的工艺参数,并考察了上样浓度、上样流速的影响,绘制了渗透曲线和解吸曲线。AB-8大孔吸附树脂精制银杏黄酮的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂柱,先用浓度为20%的乙醇洗脱后再用80%的乙醇洗脱,即可得到含量为35.1%的银杏黄酮提取物,其收率为82.7%;聚酰胺树脂的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于聚酰胺树脂柱,先用10%的乙醇洗脱后再用60%的乙醇洗脱,即可得到含量为56.8%的银杏黄酮提取物,其收率为79.7%。
  3)本文对大孔吸附树脂与聚酰胺树脂联用纯化银杏黄酮进行了研究,考察了树脂联用顺序对产品的影响,使用正交实验确定了最佳工艺参数,并对树脂的重复使用稳定性进行了研究。树脂联用纯化银杏黄酮的最佳工艺参数为:使用乙醇水溶液作为洗脱液,先经AB-8树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为15%,第二次洗脱浓度为70%;后经聚酰胺树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为10%,第二次洗脱浓度为60%,即可得到含量为73.6%的银杏黄酮提取物,收率为64.0%。
[硕士论文] 付三
中药学 湖北中医药大学 2018(学位年度)
摘要:背景:灯盏花素是传统中药灯盏细辛黄酮类有效部位,收载于2015年版《中国药典》一部,其主要成分为灯盏乙素,含量高于90%,由其制作的中成药制剂广泛应用于临床治疗心脑血管疾病,疗效显著,国内外市场十分畅销。目前药典收录的灯盏花素提取纯化工艺采用了大量酸碱处理,会对生态环境造成严重污染。因此对灯盏花素提取纯化工艺进行改革研究,控制其产业化制备对生态环境造成的污染具有重要意义。此外,灯盏乙素能通过调节小胶质细胞的活化发挥抗炎作用,但其作用机制未阐明。因此探讨灯盏乙素抑制小胶质细胞活化的作用机制,可为脑缺血再灌注后损伤治疗策略提供理论依据。
  目的:改革灯盏花素提取纯化工艺,减少酸碱用量,减轻环境污染;探讨其抑制小胶质细胞活化的机制,为其在脑血管方面疾病的治疗作用提供理论基础。
  方法:取灯盏细辛粗粉,按照2015版《中国药典》所示方法,乙醇回流提取,提取液浓缩至1g/mL的含药量。用2mol/L NaOH调节浓缩药液pH至7.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;用5%HCl调节上清液pH至4.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;将上清液稀释至0.42g/mL的含药量,通过D101大孔树脂柱,2BV去离子水洗脱除杂,继续用3BV40%乙醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液回收乙醇并浓缩至3g/mL的含药量,用5%HCl调pH至2.5,静置,离心。沉淀用适量无水乙醇、去离子水、丙酮反复洗涤,干燥、粉碎后得到粗品。粗品经适量乙醇重结晶,丙酮洗涤,烘干,即得到灯盏花素提取物。使用液相质谱联用仪对所得样品分析鉴定。
  将灯盏乙素作用于LPS诱导活化的BV-2细胞,采用CCK-8法检测灯盏乙素对BV-2细胞存活率的影响。灯盏乙素(10-40μg/mL)预处理BV-2细胞1h,然后加入LPS(1μg/mL)诱导细胞活化。分别采用ELISA法和Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO释放量的影响。提取总RNA,采用实时荧光定量PCR检测灯盏乙素对LPS诱导BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS及COX-2mRNA表达的影响。采用原位免疫荧光染色法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB核转移的影响。采用Western blot技术检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB、MAPK、PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。
  结果:所得灯盏花素提取物经液质联用仪(HPLC-MS)分析,分别鉴定为:灯盏乙素,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷,野黄芩素。其中灯盏乙素含量为94.28%,其转移率为15.6%。
  CCK-8结果表明灯盏乙素(10-40μg/mL)对正常或者LPS诱导的BV-2细胞活力无明显抑制作用。ELISA、NO试剂盒及实时荧光定量PCR检测结果显示:LPS组与对照组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著升高;灯盏乙素(10-40μg/mL)组与LPS组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著降低。免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,LPS组可观察到NF-κB由细胞质向细胞核的转移,灯盏乙素组与LPS组相比,NF-κB由细胞质向细胞核的转移能明显被抑制。Western blot结果显示:LPS组与对照组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、PI3K、AKT、p38、JNK及ERK蛋白的磷酸化水平显著升高,总蛋白水平无明显变化,IκB总蛋白水平显著下降;灯盏乙素组与LPS组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、AKT、p38、JNK蛋白的磷酸化水平及Ikkβ总蛋白水平显著下降,IκB总蛋白水平显著升高,p65、Ikkα、p38、JNK、ERK、PI3K总蛋白水平及PI3K、ERK蛋白的磷酸化水平无明显变化。
  结论:本研究在《中国药典》收载灯盏花素制备工艺的基础上,对其进行了提取纯化工艺改革研究,取得可靠的技术参数,为其产业化制备工艺改革避免大量酸碱使用提供了实验依据,对于保护生态环境具有重要意义。此外其抑制神经炎症作用机制研究表明,灯盏乙素能通过抑制NF-κB通路的激活,抑制AKT,p38,JNK蛋白的磷酸化来调控相关mRNA的表达,抑制炎症因子的释放,从而抑制小胶质细胞的激活,起到神经保护作用。
[硕士论文] 赵树琪
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察褐藻多酚Eckol的抗肿瘤作用,并探讨其可能的作用机制,为Eckol在肿瘤防治中的应用提供实验依据。
  方法:
  1、Eckol的抗肿瘤作用研究:分别建立移植型S180腹水瘤及肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给予生理盐水或Eckol(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)7天。S180腹水瘤小鼠模型造模后继续给药15天,每天记录小鼠活动状态,记录小鼠生存天数。S180肉瘤荷瘤小鼠模型造模后继续给药10天,每天记录小鼠体重,记录小鼠生长曲线,最后一次给药1h后,处死小鼠,分离脾脏和胸腺,计算脾指数和胸腺指数;剥取肉瘤组织,称重;HE染色观察肿瘤组织病理变化;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡;以Western blot法测定瘤组织EGFR、Bcl-2、Caspase-3的表达水平。
  2、Eckol对S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能的影响:建立移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给药7天,造模后继续给药10天。取小鼠外周血血清,ELISA法检测IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平;以碳粒廓清法了解小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能;取外周血,流式细胞术测定小鼠外周血T细胞亚群分布;分离小鼠脾脏,磨碎后过滤、种板,ConA诱导脾细胞转化,MTT法检测Eckol对脾细胞转化的影响;免疫组化法测定CD11c阳性细胞在肿瘤组织中的分布,了解肿瘤组织树突状细胞浸润情况;从小鼠骨髓中获得小鼠骨髓来源的单核细胞,用含IL-4和GM-CSF20ng/ml的RPMI1640培养基培养7天,诱导分化为树突状细胞。收集细胞,流式三标法(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)检测髓源性树突状细胞表型。
  3、Eckol对Reg3A诱导人胰腺癌SW1990细胞过度增殖的影响:体外培养SW1990细胞,Eckol(0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml)处理细胞48h,加入50ng/ml的外源性Reg3A蛋白共处理24h后,MTT法检测细胞存活率。选取Eckol(5、10、20μg/ml)三个浓度组,Eckol处理细胞48h后,50ng/ml外源性Reg3A蛋白共处理24h,流式细胞术测定细胞周期;软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Real Time PCR法检测JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA表达;Western blot法检测JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、NF-κB、Cyclin D1蛋白水平表达。
  结果:
  1、Eckol的抗肿瘤效应:Eckol体内干预可延长移植型S180腹水瘤荷瘤小鼠生存天数;移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型中,Eckol呈剂量依赖性地降低肉瘤重量,升高脾指数,且不明显改变动物生存曲线。肿瘤组织HE染色结果显示,Eckol处理组中,肉瘤组织微血管减少,坏死增加,核固缩明显,癌巢周围发现单核细胞浸润。TUNEL染色结果显示,Eckol处理组肿瘤细胞凋亡增加。肿瘤组织内凋亡蛋白Caspase-3表达上升,抑凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白EGFR表达下降。提示Eckol体内抗肿瘤效应明显。
  2、Eckol对移植型S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能具有显著调节作用:ELISA结果显示,Eckol处理组S180肉瘤荷瘤小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ显著升高,提示Eckol能够调节Th1/Th2平衡,促进Th1介导的细胞免疫;此外,Eckol提高荷瘤小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能,促进脾淋巴细胞转化,调节外周血T细胞亚群比例。免疫组化及流式结果显示,Eckol能够促进肿瘤组织树突状细胞的浸润,且影响树突状细胞表型,促进髓源性树突状细胞成熟。提示,Eckol体内抗肿瘤效应极可能与其对荷瘤小鼠的免疫功能的调节作用相关。
  3、Eckol对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖的抑制作用:MTT法显示,5-20μg/ml Eckol对SW1990细胞增殖没有明显的体外抑制作用,但Eckol+Reg3A与Reg3A单独作用相比,细胞存活率下降。细胞周期检测发现,与Reg3A单独作用相比,Eckol+Reg3A组S期和G2/M期细胞减少,G0/G1期细胞增多。软琼脂克隆形成实验结果显示,Eckol+Reg3A组的克隆数比Reg3A组克隆数明显减少。Real Time PCR和Western blot结果发现,Reg3A可以上调JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达水平,而Eckol可浓度依赖性地抑制这些上调作用。提示,Eckol体外对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖具有抑制作用,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
  结论:
  1、Eckol具有显著抗肿瘤效应,其体内抗肿瘤效应的发挥可能与其调节荷瘤小鼠免疫功能密切相关。
  2、Eckol体外可抑制胰腺炎症相关介质Reg3A蛋白诱导的胰腺癌SW1990细胞过度增殖,提示Eckol对伴随炎症的胰腺癌的恶性进展具有潜在的抑制效应,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
[硕士论文] 薛贤
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是发病率最高的单基因遗传性肾病,多在成年以后起病,主要累及肾脏,患者会逐步出现肾功能下降,50%的患者会在60岁左右进入终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD),目前是ESRD的第四位病因。该病目前尚无特异性治疗药物。中国传统的中草药雷公藤具有抗炎、抑制免疫、抗肿瘤等药理作用,其在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、血液系统肿瘤及实体肿瘤均有不少应用。ADPKD是一种类肿瘤性疾病,其囊肿细胞无限增殖,2007年首次有研究者将雷公藤提取物雷公藤内酯应用于PKD小鼠模型,证实其可对PKD小鼠的囊肿生长起到抑制作用,后续有研究者将雷公藤内酯应用于不同生长阶段的小鼠,均发现雷公藤内酯对囊肿生长有抑制作用。2014年一项小样本的临床研究证实了雷公藤多苷应用于合并蛋白尿的ADPKD患者的有效性和安全性,从而提示雷公藤多苷可能是潜在的一种ADPKD治疗药物。因此,本研究试图将雷公藤多苷用于治疗ADPKD患者,以探索其治疗ADPKD的有效性和安全性。
  方法:收集2014年7月至2017年11月符合入组条件的ADPKD患者共58例,其中满足2年随访时间截点的患者共41例,随机分配至雷公藤多苷组和安慰剂组,雷公藤多苷组20例,安慰剂组21例。雷公藤多苷组给予患者雷公藤多苷1mg/Kg/d口服,分三次饭后服用;安慰剂组给予同等剂量的安慰剂,相同的给药方法。采集病史,每6个月行相关实验室指标的检查(血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂、尿蛋白、尿肌酐及尿蛋白肌酐比),利用磁共振成像技术(MRI)行双侧肾脏平扫,并利用手动测量分割法完成肾脏体积的测算。通过比较两组之间主要疗效指标肾脏总体积(total kidney volume,TKV)、次要疗效指标估计肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)的变化来评估雷公藤多苷治疗ADPKD的疗效,通过两组之间血常规、肝功能、血脂等指标的变化及不良事件的发生来评估雷公藤多苷治疗ADPKD的安全性。
  结果:20例雷公藤多苷组患者中,剔除病例3人,脱落病例2人,21例安慰剂组患者中,剔除病例1人,脱落病例4人,故全分析集(full analysis set,FAS)和符合方案集(per protocol set,PPS)分别为37人和31人,安全分析集(safety set,SS)与FAS人数相同,为37人。在FAS中比较两组患者基线,两组患者在年龄、身高、体重、性别构成、是否合并有高血压病史、是否服用ACEI/ARB类药物、有无多囊肾病家族史,在肝功能、肾功能、血白细胞、血中性粒细胞比例、血红蛋白、血脂、尿蛋白谱均无统计学差异。雷公藤多苷组的基线血小板明显高于安慰剂组[(232.41±29.89)×109/L vs(204.40±45.49)×109/L,P=0.037],基线TKV明显高于安慰剂组(1876.83±763.44ml vs1296.18±589.97ml,P=0.016),htTKV也明显高于安慰剂组(1127.52±475.29ml/mvs759.14±342.80ml/m,P=0.013)。用t检验比较两组TKV及eGFR的首末变化率,两组之间无统计学差异。进一步用协方差分析校正基线血小板、基线TKV以及基线htTKV不一致给TKV变化率及eGFR变化率的影响,以基线血小板和基线TKV为协变量时,在PPS中发现基线血小板对于TKV变化率有影响,基线血小板水平与TKV增长呈负相关,但并未发现两组之间的TKV变化率存在差异;以基线血小板和基线htTKV为协变量时,在FAS即发现了血小板对于TKV变化率的影响,但未发现组间存在差异,在PPS则进一步证实了血小板越低,TKV增长越快,同时发现了雷公藤多苷组和安慰剂组存在差异,雷公藤多苷组的校正TKV变化率明显高低于安慰剂组(13.22±3.08%vs22.47±2.97%,P=0.049),此过程未发现基线TKV、基线htTKV对于TKV变化率有影响。FAS及PPS中基线血小板、基线TKV以及基线htTKV对于eGFR变化率无显著影响,校正基线差异后,两组之间的eGFR变化率无统计学差异。雷公藤多苷组发生的主要不良事件有感染、白细胞减少、月经紊乱等,与安慰剂组无统计学差异,血常规、肝功能、血脂等的首末变化值在两组之间无统计学差异。
  结论:雷公藤多苷有潜在的抑制ADPKD患者囊肿进展的作用,对肾功能无显著影响,用于ADPKD患者的治疗安全性良好。血小板减少可能与ADPKD患者囊肿体积增大相关,但有待于大样本研究证实。
[博士论文] 贾丹
中药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:中药是中华民族的瑰宝,其中的天然活性成分及代谢产物是新药创制的重要来源。然而,天然活性成分结构中通常含有多个活性中心,往往作用于多个靶点,通过许多物理或功能上紧密相联的分子或通路网络而不是某个孤立蛋白发挥作用,具有多活性中心、多靶点协同作用发挥药效的特点,不适于单靶点药物药效机制研究模式。因此,中药活性成分多靶点协同作用的药效机制研究已成为中药现代化道路上的一个重大“瓶颈”。本研究采用新型靶标鉴定技术联合多组学分析策略:第一:筛选出大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的体内抗肝癌活性成分——千层纸素A,探究其抗肿瘤作用靶点及药效机制;第二:鉴定中药一类新药丹参素钠注射剂活性成分丹参素钠的结合靶标蛋白,探究其心血管保护药效机制。
  1.全二维HepG2细胞膜色谱筛选大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的体内抗肝癌活性成分
  细胞膜色谱(CMC)是一种表征药物与膜受体间相互作用的生物亲和色谱技术,广泛用于中药等复杂体系中活性成分的筛选。在本研究中,建立了一种在线全二维HepG2细胞膜色谱/富集柱/高效液相色谱/飞行时间质谱模型,快速筛选大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的活性成分,并利用MATLAB软件编写的一个程序,有效地消除了血清中基质效应的干扰。从黄芩水提液中筛选到黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A、黄芩新素及半枝莲种素6种活性成分,同时从黄芩水提液和含药血清中筛选到汉黄芩素、千层纸素A及黄芩新素3种活性成分。细胞增殖实验表明从体内含药血清中筛选到汉黄芩素及千层纸素A能够显著抑制HepG2细胞的增殖且呈现浓度依赖性,其IC50值分别为69.83及16.66μM,并且促进肿瘤细胞的调亡,可作为抗肝癌前体药物。本研究首次鉴定出黄芩大鼠含药血清中的体内抗肝癌活性成分汉黄芩素、千层纸素A及黄芩新素,所建立的HepG2细胞膜色谱模型及基质干扰消除策略在体内活性成分筛选中具有独特的优势,同样适用于其他生物样品、生物色谱模型及中药体内活性成分研究。
  2.千层纸素A以转酮醇酶为靶点通过抑制非氧化磷酸戊糖途径和激活p53通路发挥抗肝癌作用
  在前一章研究基础上,针对抗肿瘤活性最强的活性成分千层纸素A,进一步全面探究其体内外抗肝癌活性、作用靶点及潜在药效机制。细胞增殖、凋亡和周期实验结果表明,千层纸素A可显著抑制HepG2细胞增殖、诱导凋亡并且使细胞分裂阻滞在G2/M期;裸鼠异种移植模型表明千层纸素A能够抑制体内肿瘤生长。通过药物亲和反应靶标稳定分析(DARTS),发现千层纸素A特异性结合非氧化磷酸戊糖途径关键酶(Nonoxidative PPP)——转酮醇酶(TKT),KD值为11.2μM,其相互作用通过分子对接、酶活性测定、蛋白表达及TKT干扰后抗肿瘤效应变化进一步证实。此外,靶向代谢物相对定量分析表明千层纸素A抑制TKT催化活性导致核糖-5-磷酸(R5P,肿瘤细胞中核糖核苷酸合成的关键原料)产量下降,进而诱导肿瘤细胞凋亡。HepG2细胞转录组测序结果表明千层纸素A影响缺氧诱导因子。1(HIF-1)信号通路、鞘糖脂生物合成及氨基酸代谢等与非氧化磷酸戊糖途径密切相关的通路,且p53凋亡途径被显著激活,与TKT干扰后的HepG2细胞RT-PCR array分析结果一致。本研究表明,千层纸素A是一种新型TKT抑制剂,通过抑制非氧化磷酸戊糖途径和激活p53信号通路发挥抗肝癌作用。千层纸素A可作为新型TKT或非氧化磷酸戊糖途径抑制剂研发的前体药物。
  3.丹参素钠通过线粒体途径保护HUVEC细胞抗叔丁基过氧化氢诱导的氧化损伤
  丹参素钠是中药丹参中主要水溶性活性成分丹参素的羧酸盐,丹参素钠注射剂已获CFDA批准进入临床Ⅰ期试验,用于冠心病及稳定性心绞痛的治疗。在本研究中,探讨丹参素钠保护人脐静脉内皮细胞(HUVEC)抗叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的氧化损伤药效机制。结果表明,丹参素钠预给药可显著改善t-BHP氧化损伤诱导的HUVEC生长抑制和凋亡。基于超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)的细胞代谢组学分析表明,t-BHP氧化损伤主要上调了色氨酸代谢和苯丙氨酸代谢中的13个代谢产物,与线粒体功能和氧化应激密切相关,50μM丹参素钠预给药可显著逆转这些代谢变化。分子生物学实验表明,丹参素钠预处理可改善t-BHP氧化损伤诱导的乳酸脱氢酶(LDH)、细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和线粒体膜电位(MMP)的升高,并可调节JAK2/STAT3和PI3K/Akt/GSK-3β及线粒体抗氧化途径关键抗氧化酶的表达。结果表明,丹参素钠可能通过线粒体抗氧化通路保护HUVEC抗t-BHP诱导的氧化损伤。
  4.基于蛋白质组芯片及血清代谢组学分析的丹参素钠心梗保护药效机制研究
  丹参素在临床上广泛用于心血管疾病的治疗,但是目前其直接结合靶标蛋白仍不清楚,心脏保护药效机制仍需深入研究。本研究拟考察丹参素钠(SAAS)注射剂对心梗大鼠心肌保护作用,探究其结合靶标蛋白及潜在药效机制。通过左冠状动脉前降支结扎术构建大鼠心肌梗死(MI)模型,探究SAAS对心梗大鼠保护作用。结果表明,SAAS能显著提高MI大鼠心脏功能,降低血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的含量,减轻心梗损伤。采用蛋白质组芯片技术,发现370个蛋白与SAAS特异性结合,这些蛋白显著富集于代谢通路。通过超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)系统,对心梗大鼠血清进行代谢组学分析。从大鼠血清中共鉴定到26种潜在生物标志物,包括各种甘油磷脂(GPLs)和一系列脂肪酸。代谢通路富集分析发现,心梗大鼠磷脂分解代谢、鞘脂代谢和亚油酸代谢增加,色氨酸代谢减弱,甘油磷脂代谢和原代胆汁酸生物合成受损,而SAAS可显著逆转这些代谢变化。因此,SAAS可能通过逆转心梗损伤引起的多种代谢变化发挥心梗保护作用。本研究不仅有助于揭示SAAS的心血管保护药效机制,为其临床应用提供科学依据;此外,由蛋白质组芯片鉴定到的与SAAS特异性结合的370种蛋白可作为其进一步发展的宝贵资源。
  5.基于大鼠心肌蛋白质组学及转录组学分析的丹参素钠心梗保护药效机制研究
  前期研究证实了丹参素钠对左冠状动脉前降支结扎诱导的大鼠心肌梗死(MI)的保护作用,其潜在机制与逆转MI损伤引起多种代谢变化有关。本研究通过对丹参素钠(SAAS)治疗的心肌梗死大鼠心肌组织进行蛋白质组学和转录组学分析,进一步探究丹参素钠心血管保护药效机制。结果表明,在假手术组、心梗模型组、SAAS治疗组之间差异表达的基因和蛋白质是一些重要的转录因子、辅因子、结构分子和受体,主要参与细胞过程、生物过程中的细胞结合、细胞成分和分子功能等生命过程。功能富集分析表明,SAAS主要参与调控肌动蛋白细胞骨架、吞噬、黏着、紧密连接、细胞凋亡、MAPK通路及Wnt信号通路等。SAAS可能通过转录、翻译尤其是代谢调控等多层次生命活动发挥心脏保护作用。本研究不仅为心肌梗死发病机制提供了新的视角,而且从转录和翻译水平阐释了SAAS的心脏保护药效机制,为其临床应用提供科学依据。
  综上所述,本研究主要通过药物亲和反应靶标稳定分析、蛋白质组芯片等新型靶标鉴定技术联合转录组学、蛋白质组学及代谢组学等多组学分析,探究大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的体内抗肝癌活性成分千层纸素A及心血管保护中药一类新药丹参素钠的作用靶标蛋白及药效机制。研究发现,千层纸素A以TKT为靶点,通过抑制非氧化磷酸戊糖途径和激活p53信号通路干扰DNA合成发挥抗肝癌作用,千层纸素A可作为新型TKT抑制剂;丹参素钠通过调控代谢及线粒体抗氧化通路保护HUVEC抗t-BHP诱导的氧化损伤,通过改善大鼠心梗损伤诱导的代谢变化及调控肌动蛋白细胞骨架、吞噬、黏着、紧密连接、细胞凋亡、MAPK通路和Wnt信号通路等,从转录、翻译尤其是代谢等多层次生命活动发挥心脏保护作用,为丹参素钠临床应用提供科学依据。本研究提出的新型靶标鉴定技术联合多组学分析策略,同样适用于其它中药中活性成分药效机制研究。
[博士论文] 陈瑞兵
生药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:板蓝根是十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的根,具有良好的抗病毒活性。中成药板蓝根颗粒被广泛用于治疗风热感冒,咽喉肿痛,病毒性感染以及传染病流行期间的预防。其有效成分是以直铁线莲宁B(clemastanin B)和落叶松脂素-4-O-葡萄糖苷(lariciresinol-4-β-D-glucopyranoside)为代表的木脂素群(lignans)。木脂素是一类由两分子苯丙素(C6-C3单体)通过氧化耦合反应(oxidative coupling reaction;酚类氧化自由基反应,phenoxy radical coupling reaction)聚合而成的衍生物,一般含有多个手性中心,多数木脂素具有旋光性。在植物体内氧化耦合反应常常存在位置选择和立体选择(regio-and stereoselectivity),使得木脂素主要以一种立体构型存在。有效成分直铁线莲宁B和落叶松脂素-4-O-葡萄糖苷是以(+)-落叶松脂素((+)-lariciresinol,(+)-Lar)为母核的糖苷。因此阐明板蓝根体内木脂素生物合成立体选择性的产生机制和生物学意义,对于板蓝根的定向代谢工程具有重要的意义。
  本研究从菘蓝木脂素氧化耦合反应的位置选择性和立体选择性出发,从根中克隆得到两个编码指导蛋白(dirigent protein,DIR)的基因,即IiDIR1和IiDIR2,以及松脂醇还原酶基因(IiPLR1),通过体外酶活实验和过表达毛状根系,通过体内外酶活性实验发现了IiDIR1和IiDIR2在木脂素合成中的位置选择性,还发现IiDIR1、IiDIR2均为(-)-DIR,与IiPLR1共同决定了菘蓝根中落叶松脂素生物合成的立体选择性。进一步筛选得到一个直接调控木脂素代谢转录因子IiAP2/ERF008,通过体外电泳迁移率试验(EMSA),酵母单杂交试验(Y1H)和过表达毛状根系证明其可以通过结合IiDIR1启动子并上调其表达,进一步激活木脂素代谢,从而提高菘蓝毛状根中木脂素的含量。
  本研究首先对菘蓝毛状根转录组数据进行分析,一共筛选得到19条DIR蛋白(IiDIR1~IiDIR19),进一步通过生物信息学分析,时空表达实验和亚细胞定位实验,从19条IiDIR中筛选得到2条潜在参与(-)-松脂醇((-)-pinoresinol,(-)-Pin)生物合成的DIR蛋白,命名为IiDIR1和IiDIR2。
  为了阐明DIR蛋白的体外催化功能,使用毕赤酵母(Pichia pastoris)对IiDIR1和IiDIR2进行真核表达,并通过镍琼脂糖亲和层析技术对蛋白进行纯化,通过蛋白免疫印迹(western blotting)验证了纯化蛋白的特异性,最终得到浓度分别为0.3mg ml-1(IiDIR1),0.5mg ml-1(IiDIR2)的纯化蛋白。体外酶活性实验发现IiDIR1和IiDIR2能够实现氧化耦合反应过程的位置选择和立体选择,指导合成(-)-Pin。综上本研究首发现菘蓝IiDIR1和IiDIR2均为(-)-松脂醇合成指导蛋白((-)-pinoresinol forming DIR,(-)-DIR),而非(+)-松脂醇((+)-pinoresinol,(+)-Pin)合成指导蛋白((+)-pinoresinol forming DIR,(+)-DIR),参与(-)-Pin的合成。
  为了阐明IiDIR1和IiDIR2的体内生物学功能,本研究使用发根农杆菌C58C1和过表达载体(pHB-X-myc)通过叶盘转化法成功构建并获得IiDIR1和IiDIR2过表达的菘蓝毛状根系(IiDIR-OVX和IiDIR2-OVX)。在菘蓝IiDIR-OVX和IiDIR2-OVX毛状根中,木脂素代谢整体上调。在基因水平,包括DIR在内的木脂素代谢途径基因表达量显著上调;在代谢水平,显著提高了毛状根中木脂素和木质素的积累,对木脂素立体选择性产生了影响。因此本研究首次证明IiDIR1和IiDIR2在木脂素生物合成过程中,除了参与氧化耦合反应的位置选择和立体选择外,作为关键酶(key enzyme)还能够激活上调木脂素和木质素的代谢。
  为了阐明松脂醇还原酶1(IiPLR1)对木脂素旋光性形成的影响,使用大肠杆菌(E.coli.)对其进行原核表达和纯化,获得浓度为5μg ml-1的纯化蛋白。体外功能显示IiPLR1能够连续催化两步反应,首先无选择性地催化(+)-Pin和(-)-Pin分别生成(+)-Lar和(-)-落叶松脂素((-)-lariciresinol,(-)-Lar)。然后进一步选择性地催化(-)-Lar生成(+)-开环异落叶松脂素((+)-secoisolariciresinol,(+)-SLar),较弱地催化(+)-Lar生成(-)-开环异落叶松脂素((+)-secoisolariciresinol,(-)-SLar),第二步反应过程中发生了旋光性的改变。
  进一步结合体内和体外酶活性实验首次证明IiDIR1和IiDIR2作为(-)-DIR除了参与氧化耦合反应合成(-)-Pin外,还能够协同IiPLR1,提高反应效率,增加产物含量。尤其是IiDIR2可以选择性地显著提高(+)-SLar的合成。本研究首次证明DIR除了参与松脂醇(pinoresinol,Pin)的生物合成外,还参与到落叶松脂素(lariciresinol,Lar)和开环异落叶松脂素(secoisolariciresinol,SLar)的生物合成中,拓展了对DIR蛋白功能的认识。
  基于木脂素和木质素对植物在逆境环境下的生长具有保护重要作用,对毛状根进行不同生物和非生物胁迫的处理,通过实时定量PCR技术(qPCR)对木脂素途径基因表达水平进行检测,发现IiDIR1和IiDIR2对于非生物盐胁迫NaCl,氧胁迫H2O2以及生物胁迫鞭毛蛋白(flg22)的响应极为强烈。在不同激素处理条件下,IiDIR1和IiDIR2的表达同时处于多种植物激素的调控网络中,受到乙烯(ET),莱莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)的协同或拮抗调控。IiDIR1和IiDIR2均受到ET和MeJA的上调作用,ABA能够抑制IiDIR1的表达,却能促进IiDIR2的表达。在逆境胁迫试验中发现IiDIR1和IiDIR2的过表达毛状根比野生型毛状根具有更多的生物量积累和更快的生长速率。由此本研究暗示IiDIR1和IiDIR2通过木脂素和木质素的代谢,对菘蓝毛状根抵御逆境胁迫具有一定作用。
  为了探究IiDIR1和IiDIR2对激素的响应机制,对IiDIR1和IiDIR2的启动子进行分析,发现IiDIR1的启动子区域具有保守的GCC-box,提示IiDIR1是通过乙烯应答转录因子(AP2/ERF)对外界环境做出响应的。通过转录组数据分析,共得到119条IiAP2/ERF转录因子,通过生物信息学分析方法,进一步定位得到一个潜在调控IiDIR1的转录因子IiAP2/ERF008。qPCR分析证明该转录因子对逆境胁迫和植物激素的响应模式与IiDIR1完全一致。在体外EMSA和Y1H证实BERF008可以稳定高效地结合IiDIR1启动子的GCC-box。在体内,成功构建并获得IiERF008的过表达毛状根系(IiERF008-OVX),在IiERF008-OVX毛状根中,包括IiDIR1在内的木脂素合成基因表达量显著上调,木脂素含量显著提高。结合体内外实验充分说明IiAP2/ERF008能够通过顺式作用元件GCC-box调控IiDIR1的表达水平,进一步调控菘蓝根中木脂素的代谢,从而对植物激素或逆境胁迫做出响应。
  综上所述,本研究对菘蓝木脂素的生物合成和生物学功能进行了详细深入的讨论。发现IiDIR1和IiDIR2能够指导(-)-Pin合成,均为(-)-DIR;还发现IiPLR1能够无选择性地催化(+)-Pin或(-)-Pin产生等量的(+)-Lar或(-)-Lar,进一步选择性地催化(-)-Lar生成(+)-SLar,对(+)-Lar的反应活性很低;在此基础上,发现IiDIR1和IiDIR2能够协同IiPLR1继续参与下游木脂素代谢中Lar和SLar的合成,拓展了对DIR蛋白功能的认识;研究发现IiDIR1和IiDIR2除调节木脂素代谢外,还可以调节木质素代谢,暗示对于增加毛状根生物量和抵御外界胁迫具有重要作用;研究阐明菘蓝IiDIR1和IiDIR2处于多种激素和逆境胁迫的调控网络中,并通过IiAP2/ERF008转录因子的直接调控作用对激素和逆境胁迫做出响应,对于进一步解析菘蓝木脂素的抗逆功能具有借鉴意义;本研究基于IiDIR1、IiDIR2和IiAP2/ERF008的生物学功能,进行了基因过表达毛状根的代谢工程研究,IiDIRI、IiDIR2即使为(-)-DIR,却仍然显著提高了毛状根中有效物质前体(+)-Lar的含量。综上所述IiDIR1、IiDIR2和IiAP2/ERF008是兼具改良菘蓝木脂素含量和逆境抗性的十分有潜力的靶标基因,对于后期开发高活性产物积累的菘蓝优质品种具有重要的理论意义和应用价值。
[硕士论文] 孔周扬
中药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:植物内生真菌是指在生活史中的某一个阶段存在于健康植物组织内部,不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌。
  丹参是双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物,是一种常用的药用植物,具有活血祛瘀,通经止痛,清心除烦,凉血消痈之功效;三尖杉是一种常绿乔木,亚热带特有植物,产于浙江、安徽南部、福建、江西、湖南等省区,具有驱虫,消积,抗癌的功能,用于治疗咳嗽,食积,蛔虫、钩虫病。而次生代谢产物是指某些微生物生长到稳定期前后,以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢物为前体,通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂的化合物。目前大量的研究表明内生真菌次生代谢产物种类丰富、结构新颖、生物活性多样,是一座为人类提供生物活性物质的宝库。本课题组致力于药用植物内生真菌生物多样性、化学多样性和宿主相关性的研究。在前期研究中,课题组从丹参和三尖杉中分别分离并鉴定出了深绿木霉菌,分别编号为D16和S361,其中D16能产生丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA,而在S361次生代谢产物中并没有发现丹参酮类的物质。查阅文献后发现,有报道显示在不同宿主中生长的其它属的同种内生真菌能产生和宿主活性成分类似的次生代谢产物,猜想在D16和S361的次生代谢产物中是否也会出现类似的现象。
  本文对分离自浙江省建德市三尖杉的深绿木霉菌株(Trichoderma atroviride S361)和分离自陕西商洛丹参的深绿木霉菌株(Trichoderma atroviride D16)进行了系统的次生代谢产物及其生物学活性研究。
  采用大米培养基对D16菌株进行发酵培养,采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱等方法对其发酵培养物中的次生代谢产物进行分离纯化,采用各种波谱数据(NMR,MS,IR,CD)以及文献对照等手段进行鉴定,共分离鉴定化合物17个,包括3个新化合物(3个倍半萜类的化合物)和14个已知化合物(包括了5个酯类化合物,2个酸类化合物,1个酚类化合物,1个醇类化合物,1个酮类化合物,3个倍半萜的化合物,1个二萜类化合物)。
  采用大米培养基对S361菌株进行发酵培养,采用硅胶柱色谱、OD柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱仪等方法对其发酵培养物中的次生代谢产物进行分离纯化,采用各种波谱数据(NMR,MS,IR,CD)以及文献对照等手段进行鉴定,共分离鉴定化合物16个,包括4个新化合物(2个酰胺类的化合物,1个倍半萜类的化合物,1个二萜类的化合物)和12个已知化合物(包括了3个内脂类的化合物,1个酚类的化合物,3个生物碱类的化合物,3个倍半萜的化合物,1个二萜类化合物,1个醌类的化合物)。
  在广泛查阅文献后,推测萜类的5个新化合物具有抗炎活性,采用LPS刺激的方式对相关化合物进行了抗炎生物活性测试,发现它们均没有抗炎活性。
[博士论文] 孙筱
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝癌是常见的恶性肿瘤之一,其中来源于肝细胞的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最为常见。肝癌一般是由慢性肝病引起的肝细胞损伤,如慢性肝炎导致的肝组织纤维化、肝硬化,最后导致肝细胞癌。传统的治疗手段有手术、介入、放疗、化疗以及生物免疫治疗等。寻找有效的治疗药物,并对肝病的发病机理和药物的作用机制进行研究,是非常受重视的研究方向之一。
  苦参碱(Matrine)是从豆科属植物苦参的干燥根中分离出来的生物碱,具有广泛的药理学活性,如抗菌消炎、镇痛、免疫调节、抗心律失常、抗肝纤维化、抗肿瘤活性,在临床上可以治疗肝纤维化,慢性乙肝等疾病。苦参碱抗肿瘤活性的机制是多方面的,如抑制肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制肿瘤组织内部微血管的生成,诱导肿瘤细胞分化等,并且具有免疫调节以及降低化疗、放疗带来的毒性等作用。
  M-19是近年来重点研究的一个新型硫代苦参碱衍生物,其药理活性广泛,尤其对多种肿瘤细胞具有较强的抑制活性,其活性远强于苦参碱,但是M-19有与苦参碱一样的缺点,水溶性好,它的稳定性还不如苦参碱,很容易分解。在前期研究的基础之上,以苦参碱和苦参碱衍生物M-19为先导化合物,以槐果碱为起始原料,保留基本药效基团,向结构中引入药物设计中常见的有效结构片段,合成了多个系列的新化合物,并从中筛选到了编号为WM622的高活性、低毒性的新型苦参碱衍生物。
  对化合物WM622进行了深入的药理研究,发现其对HCC-LM3和Hep3B细胞有很好的活性。在体外的细胞实验中,WM622对肝癌细胞的增殖有着显著的抑制作用,能够抑制肿瘤细胞迁移,促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞在G0/G1期。通过计算机辅助的药物设计的手段,对WM622与靶点蛋白的作用进行了计算机模拟对接,推测其与EGFR和PTEN蛋白结合的匹配性较好,并通过实验证实了其对EGFR-AKT/PI3K通路具有抑制作用。在荷瘤小鼠体内,WM622对肿瘤的生长有明显的抑制作用。从而为抗肝癌药物的研究提供了新的机理和研究基础。
  方法:
  1、苦参碱衍生物的合成以及抗肿瘤活性筛选。以苦参碱和苦参碱衍生物M-19为先导化合物,合成了三类新型苦参碱衍生物,并用MTT法测定了0.1mg/mL浓度下各个化合物对不同肝癌细胞系的抑制率,筛选出对肝癌细胞有抑制作用的化合物。检测并计算这一批化合物对肝癌细胞的IC50,筛选出抗肿瘤活性高的化合物和敏感细胞系。
  2、WM622体外抑制肝癌细胞以及肝癌干细胞作用的研究。为了检测WM622对肝癌细胞以及肝癌干细胞的抑制作用,从以下几个方面进行了研究:(1)通过MTT比色法和平板克隆形成实验,检测WM622对肝癌细胞增殖的作用;(2)通过细胞划痕愈合实验和Transwe11小室实验,检测WM622对肝癌细胞迁移的作用;(3)通过Hoechst33258染色以及PI、AV/FITC双染的方法,使用流式细胞术检测WM622处理过的肿瘤细胞中凋亡细胞所占的比例,评价WM622对肝癌细胞凋亡的作用;(4)通过PI染色以及流式细胞术检测WM622处理过的肿瘤细胞中各个周期细胞所占的比例,分析WM622对肝癌细胞周期的影响;(5)通过磁珠分选的方法,获得CD133+细胞系,通过成球实验验证其干性,检测WM622对CD133+和CD133-细胞成球和细胞增殖的影响。
  3、WM622抑制肝癌细胞分子机制的研究。先通过计算机辅助药物设计的方法,寻找WM622可能作用的靶点蛋白和信号通路。然后用Western Blot的方法对结果进行验证,研究WM622在抗癌过程中的具体机制。
  4、WM622体内抗肝癌作用效果的研究。先将HCC-LM3细胞悬液皮下注射于四周龄的BALB/c裸鼠背部,建立BALB/c裸鼠成瘤模型。设置高浓度药物组(34mg/kg)、低浓度药物组(17mg/kg)、5-Fu组(20mg/kg)及空白对照组(PBS),隔一天进行腹腔注射给药。给药10次后采取小鼠肿瘤组织,绘制肿瘤增长曲线和小鼠体重变化曲线。组织切片HE染色的方法观察肿瘤组织结构。通过免疫组织化学染色,以及Western Blot的方法,检测肿瘤组织中相关通路关键蛋白的表达量变化。
  结果:
  1、苦参碱衍生物的合成以及抗肿瘤活性筛选。合成了三类苦参碱衍生物,MTT法检测了各个化合物在0.1mg/mL的浓度下对6种肝癌细胞系的抑制率。分别计算这批化合物对4种肝癌细胞的IC50,从中筛选出了抗肿瘤活性最好的化合物WM622以及敏感细胞系HCC-LM3和Hep3B。
  2、WM622体外抑制肝癌细胞以及肝癌干细胞作用的研究。这部分的研究中,得到以下结论:(1)WM622对肝癌细胞系HCC-LM3和Hep3B的抑制率随着浓度和时间的增加而升高,对正常肝细胞系的毒性低于对肝癌细胞系的毒性,随着WM622浓度的增加,HCC-LM3和Hep3B的平板克隆形成率显著下降;(2)随着WM622浓度的增加,HCC-LM3和Hep3B的划痕实验愈合面积显著减少,Transwell细胞数显著减少;(3)经Hoechst33258染色后,荧光显微镜下观察到凋亡细胞的亮白色呈分散的碎颗粒状或棒状细胞核,随着WM622浓度的增加,凋亡细胞的数目逐渐增多;(4)PI和AV-FITC染色后,流式细胞仪检测到的凋亡细胞所占的比例增多,G1期细胞所占的比例增加,提示WM622能够将细胞周期阻滞在G0/G1期;(5)通过磁珠分选的方法,将肝癌细胞系分为CD133÷细胞和CD133-细胞,CD133+细胞的成球率显著高于CD133-细胞。WM622能够浓度依赖地抑制CD133+细胞的成球和增殖能力。
  3、WM622抑制肝癌细胞分子机制的研究。通过计算机辅助药物设计的方法,推测出了WM622与EGFR、PTEN结合的匹配性较好,并用Western Blot的方法进一步验证了WM622能够抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
  4、WM622体内抗肝癌作用效果的研究。得出,随着WM622给药时间的延长,可以看到肿瘤体积增长幅度越来越小。光镜下观察肿瘤组织的HE染色切片,可见细胞核质比大,胞核深染,组织结构散乱等肿瘤组织的一般形态学特征。通过免疫组织化学和Western Blot的方法,验证了WM622能够抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
  结论:
  在体外,WM622能够剂量和时间依赖地抑制肝癌细胞系HCC-LM3和Hep3B的增殖、迁移,促进肿瘤细胞的凋亡,将肿瘤细胞的周期阻滞在G0/G1期。能够抑制肿瘤干细胞的增殖。在体内,WM622能够剂量依赖地抑制肿瘤的生长。WM622作用的机制是抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
[博士论文] 吴成
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:经导管动脉化疗栓塞术(TACE)是原发性肝癌的主要治疗方法之一,由于术中栓塞剂阻塞及化疗药物等作用,可造成肝脏局部缺血缺氧,致缺血区中性粒细胞、单核细胞、肝脏库弗氏细胞等大量聚集引起炎症反应,多种炎性因子大量生成分泌。炎性因子与肝癌的发生、发展密切相关。其中IL-8、TNF-α与肝癌的进展、血管生成和转移密切相关。TACE术后局部为缺氧环境,可上调缺氧诱导因子(HIF)-1α表达,进一步可通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)升高而促进肿瘤血管生长,进而促进肿瘤复发、转移,VEGF和HIF-1α是缺氧环境中调控血管生成的关键因子,VEGF的高表达可以促进肿瘤生长、增加转移机率。抑制VEGF表达水平是降低肝癌TACE术后复发转移率的重要手段,进而可阻止肿瘤新生血管的形成。在缺氧环境下,VEGF除受HIF-1α调控外,炎性因子亦可以促进VEGF表达。众多研究表明,中药医已经成为恶性肿瘤治疗策略中的重要组成部分,配合TACE术具有良性调节作用,不仅可减轻栓塞综合征,而且可以在降低肝癌复发、转移方面发挥作用。清热解毒法是中医治疗原发性肝癌的主要治疗方法之一,清热解毒中药在肝癌发展的不同阶段均有一定疗效。熊胆粉作为清热解毒类中药,具有抗炎、抗肿瘤的作用。现研究发现,熊胆粉在减少炎性因子分泌、调节肿瘤微环境、抑制肝星状细胞活化、促进T细胞增殖、诱导肝肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖及血管生成等方面均有作用。熊胆粉是否可能下调TACE术后缺氧环境炎性因子分泌,是否可以下调VEGF表达,是否可以抑制缺氧条件下的血管生成,目前尚无相关报道。
  目的:
  探讨熊胆粉对原发性肝癌TACE术后炎性因子及栓塞综合征的影响,并进一步探讨熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞炎性因子及血管生成的影响,为熊胆粉配合TACE术进一步提高TACE术的疗效提供实验依据。
  方法:
  1、熊胆粉对原发性肝癌患者TACE术后血清炎性因子及栓塞综合征的影响
  将符合纳入标准的107例原发性肝癌患者随机分为熊胆粉组(服用熊胆粉胶囊)及对照组(服用安慰剂),均于TACE术前1天开始用药,疗程6天,分别于术前、术后第3天及术后第5天检测并记录患者血清炎性因子、肝功水平及记录临床症状情况。
  2、熊胆粉对CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响
  体外采用CoCl2造成人肝癌细胞SMMC-7721缺氧模型,MTT检测不同浓度熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞增殖的影响,然后用对SMMC-7721肝癌细胞无明显毒性的低、中、高浓度的熊胆粉干预,RT-PCR方法检测缺氧条件下熊胆粉对肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGF表达,同时用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清中IL-8水平、Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,探讨熊胆粉在缺氧条件下对IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响。
  3、熊胆粉对IL-8诱导的血管生成的影响
  在体外实验中,我们用铺基质胶方法将100ng/mL IL-8与内皮细胞注入高浓度的基质胶内,并加入不同浓度的熊胆粉培养,在荧光显微镜下观察血管结节数量、血管长度及面积并拍照,图片采用Image J软件进行处理并统计其血管生成情况。
  在体内实验中,将裸鼠分3组,分别为空白组(裸鼠皮下接种基质胶与内皮细胞)、IL-8组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞与IL-8混合液)、IL-8+熊胆粉组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞、IL-8与0.4mg/mL熊胆粉混合液),将混有IL-8、EA.hy926细胞、熊胆粉的基质胶按分组设计方案接种于裸鼠体内。10天后,将裸鼠皮下基质胶团块剥离,一部分置于EP管中,加入Lysis细胞裂解液并在组织研磨机中研磨,通过BCA法检测蛋白浓度,将所有样品调整至相同蛋白浓度后,将所获得的组织悬液通过贝博血红蛋白检测试剂盒进行血红蛋白浓度的检测;另一部分用于HE染色观察血管生成情况,免疫组化检测CD31、VEGF表达以评估血管生成情况。
  结果:
  1、临床研究发现,原发性肝癌患者TACE术后炎性因子IL-6、CRP、IL-8表达明显上调(P<0.05),术后第5天时熊胆粉组IL-8、TNF-α水平明显低于对照组(P<0.01,P<0.05),提示熊胆粉可以抑制TACE术后炎性因子IL-8、TNF-α表达水平;
  2、原发性肝癌患者TACE术后肝功TBIL、DBIL、ALT、AST水平升高,熊胆粉组AST/ALT比值、AST水平显著低于对照组(P<0.01,P<0.05);熊胆粉组患者的发热持续时间明显短于对照组(P<0.05),提示熊胆粉可以改善TACE术后肝功能损伤,减轻发热症状,减轻栓塞综合征。
  3、RT-PCR方法检测肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,结果发现,CoCl2能显著诱导SMMC-7721细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),而熊胆粉能够明显抑制CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA的表达。进一步采用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清液中IL-8水平,结果与mRNA结果一致。Western blot法检测肝癌细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达,结果也显示熊胆粉可抑制HIF-1α、VEGF蛋白表达,以上均提示熊胆粉具有抑制缺氧条件下IL-8、HIF-1α、VEGF表达的作用。
  4、熊胆粉体外对IL-8诱导的血管生成的影响,结果显示:混有IL-8及内皮细胞的基质胶内血管结节数量、血管长度及面积方面均明显高于空白对照组(P<0.05),提示IL-8能刺激血管的生成;加入不同浓度的熊胆粉干预后,血管结节数量、血管长度及面积三个指标均较IL-8组下降,其中0.2、0.4mg/mL两组与IL-8组差异显著(P<0.05),提示熊胆粉能有效抑制IL-8促血管生成的效应,并且呈一定的剂量依赖性。
  5、熊胆粉对体内血管生成的影响的实验中,HE染色观察发现基质胶团块血管生成在IL-8刺激下明显增加,而熊胆粉能有效抑制该效应;免疫组化检测体内基质胶内CD31、VEGF表达的结果发现,IL-8组CD31、VEGF表达明显高于对照组,而熊胆粉+IL-8组则CD31、VEGF表达均较IL-8组明显减少,检测体内基质胶内血红蛋白浓度发现,在IL-8诱导下,IL-8组基质胶内血管较空白对照组丰富,血红蛋白浓度明显高于空白对照组,差异显著(P<0.05),而熊胆粉+IL-8组则血管不明显,血红蛋白浓度明显低于IL-8组,差异有统计学意义(P<0.05),以上均提示熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成。
  结论:
  1、熊胆粉可以抑制TACE术后IL-8、TNF-α表达水平;降低术后AST水平,减轻TACE术后栓塞综合征;
  2、熊胆粉能够抑制缺氧诱导的肝癌细胞VEGF、IL-8水平升高;
  3、熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成;
  4、熊胆粉可能能够抑制原发性肝癌TACE术后缺氧诱导的血管生成,其机制可能与抑制HIF-1α/IL-8/VEGF相关。
[博士论文] 韩萍
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究分为以下四部分:1.蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的筛选;2.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响;3.酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究;4.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制研究。
  第一章 蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的的筛选
  方法:
  5种蟾皮活性成分酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛配置浓度梯度0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500μM作用于卵巢癌SKOV3细胞72小时,用In cell2000 analyzer统计存活细胞数目,计算细胞存活率。筛选出抑制作用较强的2种成分,进一步作用于人胸水来源的卵巢癌原代细胞72小时,计算细胞存活率。
  结果:
  5种蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞活性作用,在浓度高于20μM时,有明显的量-效关系;72小时测定并计算酯蟾毒配基IC50=48.62μM,蟾毒它灵IC50=86.86μM;其余脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和水溶性成分蟾蜍噻咛抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖活性作用较弱。酯蟾毒配基和蟾毒它灵在浓度高于20μM时,对人胸水来源的卵巢癌原代细胞抑制率均高于50%,能明显抑制人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖。
  结论:
  蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞和人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖,为5种蟾皮有效成分中抑制卵巢癌细胞增殖活性的优势成分。
  第二章 酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响
  方法:
  酯蟾毒配基配置浓度梯度20、100、500μM单独或与顺铂5μM联合作用于卵巢癌SKOV3细胞24、48、72小时,用MTS方法检测细胞增殖情况。流式细胞术和Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡。
  结果:
  1、各浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性降低。酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用,随着酯蟾毒配基浓度增加、作用时间的延长而增强。
  2、当不同浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于空白对照组,酯蟾毒配基组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)及死亡细胞(UL)比例均明显增加,并且这种变化呈现出了剂量依赖性。
  3、酯蟾毒配基给药处理后,随着酯蟾毒配基浓度(20μM、100μM、500μM)的增加,凋亡小体增多。
  4、在不同浓度(20μM、100μM、500μM)酯蟾毒配基和5μM顺铂联合作用72小时后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性发生不同的变化趋势。20μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基20μM组(P<0.001),高于顺铂组(P<0.05);100μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基100μM组(P<0.001),低于顺铂组(P<0.01);500μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性与酯蟾毒配基500μM组比较,无显著性差异(P>0.05),低于顺铂组(P<0.001)。
  5、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于顺铂组,酯蟾毒配基20μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)比例明显减少,晚期凋亡(UR)比例变化不明显。酯蟾毒配基100μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)变化不明显,晚期凋亡(UR)比例有所增加。酯蟾毒配基500μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)比例均明显增加。
  6、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,Hoechst荧光染色法检测到的凋亡变化情况同流式检测结果一致。
  结论:
  酯蟾毒配基能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,具有明显的浓度、时间依赖性。并能促进卵巢癌SKOV3细胞的凋亡。
  酯蟾毒配基20μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性的效果不及单用顺铂;酯蟾毒配基100μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性效果优于单用顺铂和单用酯蟾毒配基。不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用可产生增强或减弱的影响。
  第三章 酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究
  方法:
  卵巢癌细胞SKOV3注射于裸鼠皮下进行移植瘤造模,造模成功后随机分为8组,分别给予低、中、高浓度酯蟾毒配基,低、中、高浓度酯蟾毒配基与顺铂合用进行干预,设置空白对照组和顺铂组,腹腔注射给药,酯蟾毒配基隔日1次,顺铂每周1次,比较各组裸鼠移植瘤体积、瘤重。
  结果:
  各组给药后裸鼠皮下移植瘤的生长均受到抑制。酯蟾毒配基低、中、高剂量组各组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为酯蟾毒配基低剂量组(L)<酯蟾毒配基中剂量组(M)<酯蟾毒配基高剂量组(H),顺铂组(PT)、酯蟾毒配基低、中、高剂量和顺铂合用组四组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为L+PT< PT< M+PT< H+PT。
  结论:
  酯蟾毒配基能抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长,低剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有拮抗减效作用,中、高剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有协同增效作用。
  第四章 机制研究
  方法:
  选择AffymetrixPrimeViewTMHuman Gene Expression Array表达谱芯片,用基因芯片筛查技术分析卵巢癌细胞SKOV3在接受酯蟾毒配基作用、酯蟾毒配基与顺铂联合作用处理后基因表达的变化,利用生物信息学分析差异基因,通过表达模式聚类分析、GO富集分析、KEGG富集分析,寻找有显著差异变化信号通路及关键分子,通过PCR、Western Blot方法检测关键基因的蛋白表达进行结果验证。
  结果:
  1、酯蟾毒配基可能通过调节PI3K/AKT/CREB通路,促进凋亡,抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,是酯蟾毒配基影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用的关键所在。
  2、PCR结果显示酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,AKT1不表达;与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。
  3、Western Blot结果显示,酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组、酯蟾毒配基100μM组中AKT水平均降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平均增高。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中AKT水平增高、Caspase3水平降低,磷酸化CREB水平降低;酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中AKT水平降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平增高。
  结论:
  1、酯蟾毒配基通过PI3K/AKT/CREB通路,上调Caspase3水平,促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡,可能是酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制。
  2、CREB可能是卵巢癌SKOV3细胞的抑癌转录因子。
  3、不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,可能通过PI3K/AKT/CREB通路,调节Caspase3水平,通过凋亡途径对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞的作用产生协同或拮抗影响。
[硕士论文] 张娴
急诊医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胃肠功能障碍对危重症患者的预后起着至关重要的作用。前期基础研究表明大黄,作为一种中药,能够有效保护胃肠道屏障功能,阻止肠道细菌移位,促进肠蠕动,但至今临床研究较少。本研究的目的在于探讨中药大黄对危重症患者胃肠功能障碍的疗效。
  方法:
  根据纳入及排除标准对2015年6月至2017年5月期间进入重症监护室(intensive care unit,ICU)的患者进行筛选,最终共有368位患者进入本次回顾性队列研究。再根据暴露因素(即胃肠功能障碍患者是否接受大黄治疗)将患者分为大黄组和常规治疗组。大黄组接受常规药物治疗+生大黄粉治疗,常规治疗组仅接受常规药物治疗。常规药物治疗方法包括促胃肠动力、抑制胃酸分泌、保护胃粘膜、抗感染、抗炎、保肝、维持循环稳定、维持水电解质平衡等。收集患者进入ICU24小时内及治疗7天后的临床资料,比较两组治疗效果。采用倾向性评分匹配法(propensity score matching,PSM)控制两组间的混杂偏倚。
  结果:
  根据是否使用大黄治疗,入选患者被分为大黄组(219例,59.51%)和常规治疗组(149例,40.49%)。
  基线特征:纳入时与常规治疗组相比,大黄组患者腹胀程度、急性胃肠损伤(Acute gastrointestinal injury,AGI)级别较高(重度腹胀:43.84%vs4.70%;AGIⅢ:43.84%vs4.70%,P<0.05),序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Assessment score,SOFA)评分、急性生理与慢性健康评分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)评分较低(SOFA评分:4.84±3.09vs6.44±3.45;APACHEⅡ评分:12.88±6.14vs14.98±5.77,P<0.05),甘油灌肠剂、米雅、促胃肠动力药使用比例较少(甘油灌肠剂:54.79%vs77.18%;米雅:35.16%vs48.32%;促胃肠动力药:17.35%vs32.21%,P<0.05),其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。为控制两组间的混杂偏倚,采用倾向性评分匹配法,以大黄组为基准组进行匹配,最终68对匹配成功,共136例病例,匹配后两组患者基线特征无统计学差异。
  主要研究结果:匹配前大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为59.82%、39.60%,匹配后大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为77.94%、30.88%,大黄组喂养耐受率均较常规治疗组高,差异有统计学意义(P<0.05)。
  次要研究结果:匹配前后大黄组患者AGI分级改善率、肠鸣音改善率均较常规治疗组高(匹配前:AGI分级改善:75.34%vs29.53%,肠鸣音改善:90.41%vs72.48%;匹配后:AGI分级改善:76.47%vs33.82%,肠鸣音改善:91.18%vs64.71%,P<0.05),SOFA评分、APACHEⅡ评分、住ICU天数、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、内毒素均较常规治疗组低(匹配前:SOFA评分:4.23±3.57vs5.84±3.69,APACHEⅡ评分:11.92±6.55vs14.11±6.30,住ICU天数:12.00(9.00,18.00)vs14.00(9.50,21.00),CRP:23.21(9.00,52.97)vs47.08(24.00,92.86),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.11);匹配后:SOFA评分:4.54±3.61vs5.63±3.79,APACHEⅡ评分:12.56±6.03vs13.74±6.00,住ICU天数:12.00(9.00,18.50)vs13.00(9.50,20.50),CRP:25.39(12.03,67.71)vs53.48(28.19,100.25),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.10),P<0.05),差异有统计学意义。28天死亡率在匹配前后两组患者间差异无统计学意义(匹配前:22.37%vs22.15%;匹配后:30.88%vs23.53%,P>0.05)。两组患者均未发现严重不良反应。
  结论:
  中药大黄能够有效提高危重症患者肠内营养耐受性,缓解胃肠功能障碍,且无严重不良反应,为临床实践中应用大黄治疗胃肠功能障碍提供了循证医学证据。
[硕士论文] 王晓宇
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤,伴随着较高的致死率,BC的治疗引起人们的广泛关注。常规的治疗手段有手术、放疗和化疗,但是会引起各种不良反应,以及后续引发的多药耐药现象(multidrug resistance,MDR),对患者的身体健康和生活质量产生不良影响。中药治疗以其多靶点作用、辨证施治、整体调理等特点在BC的治疗过程中可以发挥重要的辅助作用,目前已经有一些中药单体或复方应用于BC临床治疗,但是仍旧主要依赖于广大医生的临床经验,发挥其抗乳腺癌药效的机制仍不清楚。因此,从中药中快速筛选出其中发挥药效的活性成分,并对其机制进行研究是十分重要的工作。
  细胞膜色谱(cell membrane chromatography,CMC)是从上世纪九十年代开始发展迅速的一种生物亲和色谱技术,以细胞膜和硅胶载体作为固定相,采用色谱分析的方法,可在体外模拟小分子化合物与细胞膜受体的相互作用过程。细胞膜色谱法将成分分离与活性筛选相结合,具有操作方便、快速稳定,灵敏度高等优点,尤其适用于中药等复杂成分体系的活性筛选。
  本课题的主要研究内容分为以下三个部分:
  1、P-gp高低表达的MCF7和MCF7/ADR全二维细胞膜色谱系统的构建
  以MCF7和MCF7/ADR两株细胞为研究对象,用流式细胞术和Western Blot方法验证MCF7细胞膜表面P-gp呈低表达水平,MCF7/ADR细胞株呈高表达水平,且无药培养两周后表达水平并没有发生显著变化。搭建了经APTES修饰的MCF7和MCF7/ADR-C18柱/TOF-MS全二维细胞膜色谱系统,同时构建硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱全二维分析系统作为参比,进行系统的有效性和专属性考察。系统有效性考察结果显示,吉非替尼在硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱上没有保留行为,但是在MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为;相应的,地塞米松在四种色谱柱上均没有表现出任何保留行为,证明该系统有效性良好。系统的专属性考察结果显示,Tariquidar在硅胶色谱柱、经APTES修饰的硅胶色谱柱和MCF7细胞膜色谱柱上没有显著的保留行为,但是MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为,显示该系统有一定的专属性。可以用于筛选中药中抗乳腺癌潜在活性化合物。
  2、基于全二维乳腺癌细胞膜色谱法对中药抗乳腺癌活性成分的筛选
  首先选择了八种有抗乳腺癌作用的中药材作为对象,构建其化学成分库,制备了中药提取液,并用HPLC/TOF-MS系统对中药提取液进行了分离和分析,并且为后续的全二维分析提供第二维分离的优化条件。应用经APTES修饰-MCF7/CMC-C18/TOF-MS和经APTES修饰-MCF7/ADR/CMC-C18/TOF-MS全二维分析系统实现对八种中药中抗乳腺癌潜在活性成分的筛选,结果显示,大黄和黄芩保留成分较多,保留行为较好,因此继续以大黄和黄芩为研究对象,完成了保留成分全二维等高线图谱的绘制和TOF-MS初步鉴定结果表,并用标准品进行了验证。结果显示,大黄提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有14种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有15种保留成分,其中在两株细胞都有保留的成分有10种,并对其中食用大黄苷、大黄酚、丹叶大黄素、大黄素甲醚、云杉鞣酚和大黄素六种成分进行了验证。黄芩提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有15种保留成分,在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有14种保留成分,其中在两种细胞膜色谱柱都有保留的成分有10种,并对其中的汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A、黄芩素和汉黄芩苷五种成分进行了验证。为下一步潜在活性成分的药效验证研究和活性成分与P-gp之间关系研究奠定了良好的基础。
  3、潜在活性成分抗乳腺癌活性及其与P-gp的关系研究
  根据全二维MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱系统对中药大黄和黄芩的筛选结果,选择其中可获得11个化合物为对象。首先对其潜在抗乳腺癌的作用进行体外增殖抑制的药效验证,结果显示,大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对MCF7和MCF7/ADR两株细胞均有一定杀伤作用,且对两株的敏感性不同。进而采用流式细胞术考察它们是否通过细胞凋亡这个途径发挥其杀伤作用。结果显示,丹叶大黄素、云杉鞣酚、汉黄芩素和黄芩素是通过凋亡途径对MCF7细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。丹叶大黄素、汉黄芩素和千层纸素A是通过凋亡途径对MCF7/ADR细胞产生杀伤作用,而其他化合物则不是。之后,为了研究同一个化合物对两株细胞杀伤作用的差异是否与P-gp作用相关,考察了大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素,黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对P-gp酶活的作用,结果显示黄芩苷是P-gp酶活性的抑制剂,而其他6种成分是P-gp酶活性的激动剂。进一步研究黄芩苷和P-gp之间关系,采用流式细胞术和Western blot检测不同浓度的黄芩苷对MCF7/ADR细胞中P-gp表达量的影响,结果显示黄芩苷并没有显著影响P-gp表达。黄芩苷和DOX之间的协同作用,结果显示黄芩苷可以逆转MCF7/ADR细胞对阿霉素的耐药性。
[硕士论文] 樊逸夫
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  长期以来,中医药一直是治疗肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要力量。在国内,中医药被广泛应用于肝癌预防和治疗的全过程,尤其在晚期肝癌中的应用更为常见。多年的中西医结合研究为临床提供了为数不少的成药、验方,其疗效也逐步得到认可。2011年中国卫生部颁布的《原发性肝癌诊疗规范》明确将中医药列入晚期肝癌的系统治疗,并指出中医药“可以改善癌症相关症状和生活质量,可能延长生存期,可以作为肝癌治疗的重要辅助手段”。
  中药解毒颗粒是我科开发的院内制剂,在我科的日常肝癌防治中应用广泛,经过十几年的临床验证,疗效确切。但其作用机制尚不明确。众所周知,中药复方成分复杂,需要煎煮后,经患者口服,并通过肠道吸收代谢后发挥疗效,这就使其有效成分、及后续作用机制的研究变得相当复杂。近年来,肠道菌群与肿瘤相关联的研究备受关注,肠道也是中药吸收代谢的必经之地,因此,本课题想从肠道菌群的角度去探讨口服解毒颗粒所产生的影响。
  此外,免疫治疗是近年来治疗晚期肝癌的重要手段之一。其中,免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade)是当下研究的热门。细胞毒T淋巴细胞抗原-4(lymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)及程序性细胞死亡受体1(programmed cell death protein1,PD-1)是常见的阻断靶点;阻断CTLA-4及PD-1,可以通过影响T细胞功能发挥抗肿瘤作用。有文献报道,肠道菌群可增强上述靶点的抑制剂的作用。因此,本课题以免疫检查点阻断为切入点,探讨解毒颗粒对CTLA-4及PD-1的调节作用。
  目的:
  1、观察解毒颗粒对晚期肝癌患者肠道菌群的影响。2、研究解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4与PD-1表达的调节作用。
  方法:
  1、选取年龄≥18岁、巴塞罗那临床肝癌分期为C期(BCLC-C)的HCC患者,随机分为解毒颗粒组和对照组,每组各10例。解毒颗粒组每日冲服解毒颗粒,早晚各一次;解毒颗粒组服药前留取一次粪便,服解毒颗粒后一个月与两个月各留取一次粪便,共三次。对照组不服用解毒颗粒,共留取三次粪便,每次间隔一个月。解毒颗粒组服药前留取一次静脉血,两个月后再留取一次静脉血,共两次。对照组共留取两次静脉血,间隔两个月。
  2、采用16S多样性测序分析对收集的粪便标本分别进行DNA提取、质量检测、测序,通过各菌属丰度产生的变化,观察解毒颗粒对肠道菌群所产生的影响,并通过SPSS21.0(IBM Corp)软件对数据进行统计学分析。两组细菌丰度治疗前后的变化趋势使用重复测量的多因素方差分析(ANOVA of repeated measurement data);菌属OTU水平的差异分析使用Kruskal-Wallis检验法(Kruskal-Wallistest)。
  3、采用流式细胞术探讨解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4及PD-1表达的影响。
  结果:
  1、解毒颗粒组的患者在服药前所具有的与肠癌、肝癌发病相关的梭菌属Ⅺ(ClostridiumⅪ)及消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceae)在服用解毒颗粒后一个月与两个月均消失不见,而在对照组中,上述两菌治疗前后无明显变化。2、对照组中,可以增强肝癌免疫抑制剂疗效的拟杆菌属细菌(Bacteroides)的占比随时间变化呈明显减少趋势,在各个时间点拟杆菌属细菌的占比差异具有统计学意义(P<0.001)且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.032)。而解毒颗粒组中拟杆菌属细菌的占比随时间变化并不明显。3、在解毒颗粒组中,可产生丁酸从而起到抗结肠癌作用的有益菌罗氏菌属细菌(Roseburia)随着时间变化,其占比呈增加趋势;而在对照组中,罗氏菌属细菌的占比随着时间变化呈减少趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.029)。4、在解毒颗粒组中,与结直肠癌相关的普氏菌属细菌(Prevotella)的占比随时间变化呈减少趋势;而在对照组中,普氏菌属细菌的占比随时间变化呈增加趋势。虽然普氏菌属细菌的占比在两组中的变化趋势比较明显,两组在时间、时间与分组的因素上的差异并无统计学意义。5、在解毒颗粒组中,与结直肠疾病相关的毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae)的占比随时间呈轻微减少趋势;而在对照组中,毛螺旋菌科细菌的占比随时间变化呈增加趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.044)。6、随着时间的变化,解毒颗粒组的物种比起对照组更为相似。7、对照组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度呈增长趋势;而在解毒颗粒组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度较前变化不大或呈减少趋势。两组患者外周血CD4+和CD8+的细胞中PD-1的阳性率及平均荧光强度变化趋势均不明显。
  结论:
  通过观察中药解毒颗粒对BCLC-C肝癌患者肠道菌群的影响,发现解毒颗粒对有益菌拟杆菌属及罗氏菌属细菌有良性促进作用,对有害菌梭菌Ⅺ及消化链球菌科细菌可能有抑制作用,其中拟杆菌属与肝癌的免疫治疗疗效密切有关。还发现解毒颗粒对患者外周血CD4+和CD8+细胞中的免疫抑制蛋白CTLA-4的表达具有一定的抑制作用,该结论有待进一步的大样本实验进行验证。
[硕士论文] 果卉
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:栀子豉汤为张仲景《伤寒论》中的经典复方方剂,由中药材栀子和淡豆豉组成,其临床上可用于治疗失眠、抑郁症、神经性衰弱等心理性亚健康疾病。复方中的栀子为茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis.的干燥果实,淡豆豉为豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的成熟种子经青蒿、桑叶等中药闷至发酵而成的加工制品,作为常用性中药材,在历版中国药典中均有详细记载。目前国内外多以栀子或淡豆豉单味药材的化学成分以及药理药效为基础展开研究,关于栀子豉汤复方药材的化学成分、药效物质以及配伍意义的研究报道甚少。
  首先本课题在细胞层面上对栀子豉汤复方的药理作用进行了研究,考察了不同浓度谷氨酸对于PC12细胞损伤模型存活率的影响,采用MTT法测定细胞存活率,确定了当谷氨酸浓度为3mmol/L时,细胞损伤率达52%,为PC12细胞损伤模型的造模条件。随后考察了系列不同浓度的栀子豉汤对于模型组细胞的保护作用,确定了0.25、0.5和1mg/mL浓度的栀子豉汤对于PC12细胞损伤模型具有明显的保护作用。根据对正常组细胞、谷氨酸模型组细胞以及栀子豉汤给药组细胞分别进行乳酸脱氢酶释放、谷胱甘肽还原酶水平、总超氧化物歧化酶活性、以及活性氧的检测,说明谷氨酸模型组可以增加乳酸脱氢酶的释放量、显著性降低谷胱甘肽还原酶和总超氧化物歧化酶的活力,并增强了细胞内活性氧的水平。而系列浓度栀子豉汤给药组则可以显著性降低乳酸脱氢酶释放量、增加细胞内谷胱甘肽含量、增强细胞内总超氧化物歧化酶活力并明显降低活性氧水平,从而抑制细胞损伤。由此说明栀子豉汤复方对于谷氨酸致PC12细胞的损伤模型具有明显的保护作用,为后续深入的研究栀子豉汤复方的化学成分分析及阐明配伍意义提供有力的实验数据。
  为充分研究栀子豉汤复方中的指标性成分,基于前期工作对栀子的活性成分进行了充分的探讨,因此本课题采用指纹图谱结合化学统计学的方法建立一种淡豆豉药材质量控制的方法,并对淡豆豉中特征性成分进行定性和定量分析。根据淡豆豉药材指纹图谱中相似度评价结果并结合聚类分析确定指纹图谱的色谱峰中对于淡豆豉质量具有明显干预作用的成分,采用离子阱-飞行时间质谱对21种化学成分进行定性分析。通过主成分分析和正交校正的偏最小二乘分析的统计学方法甄别出定性的色谱峰中对淡豆豉质量具有统计学影响意义的化学成分进行定量分析,共定量11种化合物,分别为黄豆苷,黄豆黄苷,染料木苷,大豆苷元,丙二酰黄豆黄苷,乙酰化黄豆苷,乙酰化黄豆黄苷,丙二酰染料木苷,乙酰化染料木苷,染料木素和黄豆黄素。
  为进一步探讨栀子豉汤化学物质基础研究,本课题又比较了栀子豉汤配伍前后化学成分的变化,采用离子阱-飞行时间质谱法分别对栀子豉汤复方以及栀子、淡豆豉两种单味药材进行定性鉴别分析和比较,发现栀子豉汤中缺少西红花苷Ⅲ、京尼平、3,5-二-O-咖啡酰基-4-O-(3-羟基-3甲基)戊二酰基奎宁酸化学成分,同时淡豆豉中含量较少的化学成分包括香豆酸、丙二酰黄豆苷、丙二酰黄豆黄素、丙二酰染料木苷、乙酰化染料木苷也未在栀子豉汤中检测出来,但是复方中定性出Jasminoside A和Jasminoside I,以及未知化合物m/z611.1643和m/z663.3227,并未在单味药材中鉴别得到。此外,考察了栀子豉汤配伍比例对主要活性成分溶出变化的影响,分别对不同配伍条件的栀子豉汤复方中17种特征化学成分进行含量测定。确定栀子与淡豆豉比例为1∶1时,为最佳配伍条件,该条件下栀子豉汤复方中环烯醚萜类、异黄酮类等活性成分溶出为最佳。
[博士论文] 刘德芳
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性风湿免疫疾病,主要表现为反复的滑膜炎,导致多关节肿痛、变形、活动受限,往往演变成残疾,是致残率最高的关节疾病,严重影响了生活质量,是一种终身性疾病。目前RA的具体病因尚不明确。本课题根据湿性重浊粘滞,久湿形成毒,湿毒郁久化热致瘀,阻滞经脉筋肉,结合西方病因学说“体液论”,提出“湿毒入络”可能导致RA的病因学理论。湿毒入络,体液的流动或迁移可能刺激水通道蛋白(AQPs)的异常表达;RA的活动期炎性渗出,滑膜充血水肿,也可能伴随水的异常代谢。已有报道,AQPs在RA的发展过程中发挥着一定的作用,可介导其病理变化过程中的细胞迁移。另外,临床上尚无根治RA的办法,大多只停留在对症治疗,缺乏对因治疗。本课题针对RA的病因病机“湿毒入络”,拟方三黄一龙汤(SYD)联合甲氨蝶呤(MTX)治疗RA湿热痹阻证,从临床和动物实验两方面对RA发病机制和三黄一龙汤或联合MTX的作用机理进行了研究。
  方法:
  本课题的第一部分以RA湿热痹阻证患者的外周血和滑膜液作为研究对象,从细胞因子、AQPs及JAK-STAT通路的信号因子等的表达及调控方面进行了初步研究,主要采用ELISA法检测相关指标。第二部分复制出RA湿毒入络动物模型,以大鼠的外周血、骨关节、肺、脾、肾脏等作为研究对象,从炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK-STAT通路的信号因子及关节病理组织学的变化及调控进行了深入研究,采用了ELISA法、RT-PCR法及病理组织学等检测方法。
  结果:
  一、RA湿热痹阻证患者炎性因子、AQPs及JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿热痹阻证患者炎性因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者活动期关节肿胀指数、压痛指数以及ESR、CRP、DAS28明显升高;采用SYD联合MTX治疗,其关节肿胀指数、压痛指数及ESR、CRP、DAS28能较快较好地改善。(2)RA湿热痹阻证患者外周血TNF-α、IFN-γ较健康对照组显著升高,滑膜液TNF-α、IFN-γ较外周血明显升高。(3)采用SYD联合MTX治疗后TNF-α、IFN-γ显著下降。
  2、RA湿热痹阻证患者AQPs的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者外周血和滑膜液中AQP1、AQP2和AQP3的表达水平较健康者明显降低。(2)外周血中AQP1、AQP2、AQP3表达略高于滑膜液,以AQP1表达最多,AQP3次之,AQP2表达最少。(3)SYD联合MTX可以使RA湿热痹阻证患者低表达的AQP1、AQP2和AQP3上调。
  3、RA湿热痹阻证患者JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1、SOCS-3的表达水平较健康者都降低,其中STAT1表达高于STAT3,PIAS1表达高于PIAS3,SOCS-1与SOCS-3表达相当。(2)RA外周血中STAT1、PIAS1、PIAS3、SOCS-1的表达高于滑膜液,而外周血中STAT3、SOCS-3与滑膜液中基本相当。(3)经SYD联合MTX治疗,RA湿热痹阻证患者外周血STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1都下调,SOCS-3无明显变化。
  二、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATPase、JAK-STAT通路信号因子及关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠显示血小板数、中性粒细胞比率和单核细胞比率较正常组明显升高,淋巴细胞比率较正常组明显降低。SYD及SYD联合MTX能较好地降低中性粒细胞和单核细胞比率,上调淋巴细胞比率。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中IL-6和TNF-α表达水平较正常组都明显降低;骨关节中IL-6和TNF-α表达较正常组都明显升高。SYD及SYD联合MTX都能使外周血低下的IL-6和TNF-α上调,使骨关节中升高的IL-6和TNF-α下调。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血中VEGF表达较正常组无差异,而其骨关节中VEGF表达较正常组明显增多。SYD及SYD联合MTX均能使骨关节中增多的VEGF减少。(4)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组无差异;而其炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组明显减少。SYD联合MTX可促进炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的表达。
  2、RA湿毒入络模型大鼠AQPs、Na+,K+-ATP酶的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3表达较正常组均明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中以AQP2表达最高,其次是AQP3;骨关节中以AQP3表达水平最高,其次是AQP2。(3)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中AQP1mRNA的含量较正常组明显减少,其肾组织AQP1mRNA的含量较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性较正常组明显减退。(5)SYD及SYD联合MTX都能较好地促进RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3的表达,SYD联合MTX还能显著地增强肺组织AQP1mRNA的表达。(6)SYD及SYD联合MTX能显著地提高RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性。
  3、RA湿毒入络模型大鼠JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3表达较正常组明显降低;骨关节中JAK1、JAK3表达较正常组明显升高;JAK2表达较正常组明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中JAK3mRNA的含量较正常组无差异;肾组织中JAK3mRNA的含量较正常组明显增多。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中STAT1表达较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠外周血中STAT3表达较正常组明显降低;骨关节中STAT3表达较正常组无差异。(5)SYD及SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3及骨关节中JAK2的表达上调。(6)SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠骨关节中升高的JAK1、JAK3表达下调。(7)SYD及SYD联合MTX能上调外周血STAT3的表达。(8)SYD及SYD联合MTX能抑制肾组织中JAK3mRNA的表达。
  4、RA湿毒入络模型大鼠关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络证模型大鼠关节组织病理学表现为巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。(2)SYD联合MTX能抑制RA湿毒入络模型大鼠关节纤维组织的增生和淋巴细胞的浸润。
  结论:
  本研究证实了湿毒入络是RA的基本病机。湿毒入络诱导RA发病与AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK等密切相关,表现出外周血、骨关节及肺脾肾脏等组织器官中AQP的亚型AQP1、AQP2、AQP3及AQP1mRNA表达减少,Na+,K+-ATP酶活性减退,骨关节促炎性细胞因子IL-6、TNF-α和血管内皮生长因子(VEGF)产生增多,软组织TGF-β1mRNA减少,信号因子JAK1、JAK3及JAK3mRNA异常表达,关节巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。印证了肺主通调水道、脾主运化功能参与了RA湿毒入络的发生发展过程。证明了三黄一龙汤及三黄一龙汤联合MTX能较好地降低RA的关节肿胀、压痛指数,降低ESR、CRP、DAS28等炎症指标,抑制外周血和骨关节炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和血管内皮生长因子(VEGF)产生,促进TGF-β1mRNA分泌,增强外周血和骨关节AQP1、AQP2、AQP3及肺脏AQP1mRNA的表达,提高脾脏Na+,K+-ATP酶的活性,调控信号因子JAK1、JAK2、JAK3及STAT3等的表达。可作用于多组织器官,多靶点进行调节,增强组织细胞的代谢,缓解关节滑膜炎症,抑制滑膜组织血管新生。这为临床推广应用提供了理论依据。
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