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[博士论文] 崔红凯
影像医学与核医学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:背景和目的:
  脑动脉瘤是临床上最常见的脑血管病之一,发病率位居第三位。目前,颅内动脉瘤的研究方向是血管重建术,以真正达到动脉瘤的解剖治愈,Pipeline低网隙支架和Willis覆膜支架是基于血管重建技术所取得的重大临床成果。但由于是金属支架,需要永久且易致管腔再狭窄,这已成为血管内治疗领域函待解决的世界性难题和限制支架植入术继续发展的“瓶颈”。可降解支架被认为是血管内治疗领域继球囊扩张血管成形、金属裸支架、药物洗脱支架后的第4次革新,镁合金支架是目前可降解支架的研发热点。可降解镁合金支架植入后可为血管重塑提供支撑作用,之后自行逐渐降解,对血管无长期刺激作用,患者也无需终身服用抗血小板药物,是理想的血管内支架,未来可能取代传统的金属支架。鉴于此,本研究将分为三个部分对镁合金支架进行研究:
  第一部分 兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型制作的改进
  目的:
  对兔颈总动脉侧壁动脉瘤模型进行改进,以评价其模型的成功率及术后颈总动脉的通畅率。
  方法:
  40只新西兰大白兔随机分为两组:左颈总动脉结扎组(A组,n=20)与不结扎组(B组,n=20)。初次与一月后颈部3.0T MRA检查时测量兔子体重、右颈总动脉及双侧椎动脉中段直径。采用间断式外翻缝合法用6-0显微缝线将静脉囊与颈总动脉吻合,建立侧壁型动脉瘤,血管造影检查在2周后进行。
  结果:
  A组中20只新西兰大白兔皆顺畅行左侧CCA结扎。17只兔右CCA一月后查MRA示增粗,而双侧椎动脉未见明显增粗;B组在一月后MRA检查示右侧颈总动脉及双侧椎动脉均略增粗。A组兔子的右颈总动脉中段直径与双侧椎动脉中段直径在初次MRA检查时与B组比较均无显著统计学差异(P>0.05),但A组兔子的右颈总动脉中段直径与双侧椎动脉中段直径在1月后的MRA检查时均大于B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。建立兔颈部囊状动脉瘤模型35只(A组17只,B组18只),术后均健康成活。术后2周血管造影示A组所有囊状动脉瘤均清晰显示,右颈总动脉畅通。4个动脉瘤腔内有少许血栓形成。B组有14只显示囊状侧壁动脉瘤,4只发生了自发性右颈总动脉彻底闭塞,10只有明显的血栓形成,且其中5只伴有动脉瘤远端的颈总动脉变细。A组中动脉瘤模型的成功率大于B组(P<0.05),且A组中动脉瘤中血栓的发生率及自发性右颈总动脉闭塞率均明显低于B组,也具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型制作的改进能明显提高动脉瘤模型的成功率并降低自发性颈总动脉的闭塞率及动脉瘤内血栓的形成。
  第二部分 镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型的可行性和可降解性研究
  目的:
  活体评价可降解镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁动脉瘤模型的可行性和可降解性能。
  方法:
  8只右颈总动脉侧壁动脉瘤模型随机分为两组:可降解镁合金覆膜支架植入组(A组,n=4)与Willis覆膜支架植入组(B组,n=4)。覆膜支架在DSA下植入。所有的兔子随访至术后12月。可降解镁合金覆膜支架治疗兔CCA侧壁动脉瘤模型的可行性和长期疗效通过血管造影随访来观察;活体可降解镁合金覆膜支架的可降解性能通过MRA和钼靶来研究。右颈总动脉支架植入处血管直径通过放置的标尺或在Photoshop8.0上测量。支架植入处的右颈总动脉分为近段、中部和远段,各段直径由三人分别独立测量,最终取三人的平均值。
  结果:
  所有的支架均放植成功,没有与手术相关的并发症发生。随访结果显示所有的颈总动脉侧壁动脉瘤均完全闭塞,无内瘘产生。A组可降解镁合金覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显大于即刻植入时的血管直径,差异具有显著性意义(P<0.05)。而可降解镁合金覆膜支架植入处的血管直径在6个月与12个月的血管造影比较无显著性差异(P>0.05)。B组Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显小于即刻植入时的血管直径,差异具有显著性意义(P<0.05)。而Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月与12个月的血管造影比较无显著性差异(P>0.05)。另外,A组支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访时比较均大于B组,差异具有显著性(P<0.05)。
  磁共振下镁合金支架植入处的血管形态在支架植入后1天呈信号缺失,就像严重的血管狭窄,在支架植入后5-6周,随着镁合金支架表面的镍降解,血管的形态基本上恢复正常。在钼靶下镁合金支架随着时间的延长而逐渐降解。镁合金支架的形态结构从完整清晰到逐渐断裂、解体,最后变得模糊不清。而Willis支架始终保持植入时的原有形态。
  结论:
  可降解镁合金覆膜支架治疗兔CCA侧壁型动脉瘤模型是可行性的。可降解镁合金覆膜支架放置处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显较植入时增大,说明可降解镁合金覆膜支架在镁合金裸支架降解后不影响植入处血管的生长;而Willis覆膜支架恰恰相反,Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显较植入时变细,且时间越长植入处的血管直径越细。另外,在钼靶下是可以活体观察镁合金支架降解的。
  第三部分 镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型的血管内超声研究
  目的:
  利用血管内超声(Intravascular Ultrasound,IVUS)评价可降解解镁合覆膜支架植入后植入段血管及管腔的变化和血管重构情况。
  方法:
  8只右颈总动脉侧壁动脉瘤模型随机分为两组:可降解镁合金覆膜支架植入组(A组,n=4)与Willis覆膜支架植入组(B组,n=4)。覆膜支架在DSA下植入。所有的兔子随访至覆膜支架植入后12月。在可降解镁合金和Willis覆膜支架植入后即刻、6和12个月行血管内超声检查。用血管内超声来定量分析支架植入处的平均血管面积、支架面积、血管管腔面积,并计算血管管腔狭窄率。重构指数等于支架植入处的血管面积与近远端参考血管面积的平均值之比。
  结果:
  所有的兔子完成了即刻、6和12个月随访时的血管内超声检查。与即刻支架植入相比较,A组可降解镁合金覆膜支架植入处的平均血管面积、平均支架面积与平均血管管腔面积在6个月和12个月随访血管造影时较即刻植入时明显增大,差异具有显著性意义(P<0.05)。尽管,B组Willis覆膜支架植入处的颈总动脉平均血管面积在6个月和12个月随访血管造影时较即刻植入时明显增大,差异具有显著性(P<0.05),但B组支架植入处的平均血管管腔面积在6个月和12个月随访血管造影时与即刻支架植入时比较明显缩小,差异具有显著性意义(P<0.05)。另外,尽管A组的血管管腔面积在即刻植入时小于B组(P<0.05),但在6个月和12个月随访血管内超声上,A组支架植入段的血管管腔面积要明显大于B组,差异具有显著性(P<0.05)。血管内超声显示A组所有镁合金覆膜支架植入段的颈总动脉血管管腔表现为无重构,重构指数intermediate remodeling(IR)为1.024±0.018(范围:1.01-1.05,95%可信区间:0.994-1.053);而B组所有Willis覆膜支架植入段的颈总动脉血管管腔表现为负重构,重构指数0.62±0.083(范围:0.58-0.74,95%可信区间:0.487-0.752)。
  结论:
  可降解镁合金覆膜支架在镁合金裸支架降解后植入处的血管管腔可以随着血管生长而生长;而Willis覆膜支架植入处的血管管腔由于支架的束缚而随着时间的延长而逐渐变小。A组所有镁合金覆膜支架植入段的颈总动脉血管表现为无重构,而B组所有Willis覆膜支架植入段的颈总动脉血管表现为负重构。
[博士论文] 葛安乐
生物医学工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:秀丽隐杆线虫作为一种重要的模式生物,主要用于研究遗传、发育、神经、行为生理学等的基本机制。尽管线虫具有多样化的行为模型、简单的神经系统、短暂的生命周期和强大的遗传工具的可用性等独特优势,但一直缺乏自动化操纵系统和集成化定量分析研究方法。微流控芯片因具有良好的透明度、生物相容性和高通量等优点,尤其是其微通道与线虫的尺寸完美匹配,近年来逐渐发展成为线虫研究中重要的技术平台。“线虫芯片”已经成功用于线虫表型和发育时期筛选、神经系统成像、行为学、显微手术和显微注射等。目前,微流控芯片在线虫培养、发育和成像等方面也显示出巨大的潜力。本文针对线虫的培养和刺激设计了一系列新型微流控芯片,主要研究内容如下:
  1、设计可生成指数浓度梯度的芯片,用于研究线虫的寿命和发育过程。该芯片能够在通道网络中自动形成连续稀释的具有四个数量级的细菌食物补充物,同时,能够实现线虫的长期培养以及线虫的固定与实时成像监测。该芯片能够以高通量的方式来评估细菌浓度对线虫寿命的影响;通过芯片平台,我们考察了线虫的生长与细胞内DAF-16核定位如何响应不同浓度的细菌食物,研究了食物限制对线虫寿命的影响机制。
  2、提出一种快速、可靠的微流控芯片方法用于定量分析线虫的趋流性行为。在液体环境下,线虫对流体方向的感知十分重要,趋流性在线虫生命周期中的作用举足轻重,使它们能够在环境中导航,并维持它们的位置。为了研究线虫对不同流速的选择性,本文构建了包含六个螺旋样微通道芯片,用于产生六个不同的流速。利用该芯片,成功地对线虫的流速偏好性进行定量分析,并结合突变体,分析其潜在的作用机理。
  3、发展了一种用于线虫固定和电刺激肠细胞的芯片,研究线虫肠细胞对电刺激的响应及钙信号转导机理。该芯片系统利用可编程的电磁阀来精确控制刺激时间,能够对线虫特定肠部进行精确刺激从而诱发钙信号。通过使用该装置,发现线虫肠部细胞钙信号可以通过持续或瞬时电刺激来启动。此外,芯片内线虫会因高电压的刺激而破裂,导致体内的组织暴露出来,该技术可用于线虫解剖学以及体外标记。
  4、探索了一种新型光流控芯片,应用于线虫光遗传分析。线虫的神经系统由302个神经元构成。然而,对神经回路的功能组成在很大程度上是未知的。近年来,光遗传学成功应用于推断神经元的功能。本文构建了光流控芯片系统,利用3D打印技术打印出与光纤结合的通道,以LED激光作为光源,通过光纤对芯片内表达光敏感蛋白ChR-2的神经元进行光激活,并同步利用显微镜光学系统对传递到下游神经元的神经信号以及相应的行为变化进行功能成像。因此,该便携式芯片装置可以实现线虫光刺激与神经元动态响应、行为反应观测的同步化,可用于研究线虫神经回路的发生与功能组成,具有种简单、快速、成本低等优势。
  综上所述,本文以线虫为对象,结合微流控芯片,建立可以用于线虫培养和刺激的技术平台,设计出可用于研究线虫食物限制、趋流性、电刺激、光遗传分析的微流控芯片。本文建立的多种微流控芯片有望被广泛用于线虫发育、遗传、神经和行为学的研究。
[硕士论文] 秦闫燕
免疫学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:手足口病是由多种微小RNA肠道病毒引起的急性传染病,多发生于三岁以下儿童,其表现主要是轻度流感样症状和手、足、口腔等部位的皮疹和疱疹,通常具有自限性,但传染性极强,常常在幼儿园和托儿所流行。一般预后良好,但是个别重症患者可出现严重的神经系统并发症,甚至死亡。
  引起手足口病的病原体属于微小RNA病毒科肠道病毒属,主要包括:柯萨奇病毒 A组4、5、7、9、10、16型;柯萨奇病毒 B组2、5型;埃可病毒以及肠道病毒71(EV71)型,其中CA16和EV71为主要病原体。自1969年首次从美国一名患有脑膜炎的手足口病患儿中分离出EV71型病毒以来,手足口病在世界各国出现多次爆发和流行,尤其是亚太地区,中国大陆2008年到2012年报道有7,200,092例手足口病患者,死亡2457例。2008年台湾报道387例由EV71导致的重症病例,其中14例死亡。
  目前肠道病毒感染除了脊髓灰质炎病毒有疫苗外,其余肠道病毒感染包括EV71病毒感染并没有特殊的治疗药物,其中一个很重要的原因就是缺少稳定的动物模型来有效地评估疫苗。目前最常用的模型有猿猴模型和乳鼠模型,猿猴模型虽然早期被认为是较好的动物模型,但是由于价格昂贵,并且缺乏心力衰竭和肺水肿的表现,而这些表现常常是人类手足口病重要的死亡原因,所以限制了其应用。乳鼠模型由于价格低廉,制备简单,神经系统感染表现与人类疾病相似,因此适用于了解EV71致病机制、评价疫苗效价。现阶段,我国手足口病爆发流行的病毒株亚型主要是C4亚型,而在以往的研究中,大多数动物模型对C4亚型的EV71病毒株不敏感,导致感染后不能出现典型的手足口病的症状,尤其是神经系统感染症状。
  本研究对来自江苏省疾病预防控制中心4株EV71临床分离株进行了小鼠攻毒实验,筛选出1株能引起小鼠后肢瘫痪的临床毒株。对该株进行了细胞培养、传代、克隆,建立了稳定的G03 EV71病毒株,并对该毒株进行了全基因序列的测定和分析,结果表明该病毒株为C4亚型的EV71病毒株。用分离的G03 EV71病毒株通过颅内途径感染1日龄ICR小鼠制备动物模型,每天观察动物的临床表现,了解EV71感染的规律和致病特点,同时定期处死动物,采集各器官组织进行动物体内病毒半定量分析、病理形态学观察、免疫组织化学分析及利用Western blot鉴定病毒蛋白的表达等。
  病理学观察发现,在感染G03后小鼠的心肌、肺组织、骨骼肌、小肠、脑组织等器官出现特定的病理变化,比如出血、炎症细胞浸润等。免疫组化显示感染后所取小鼠的上述五种组织都有EV71病毒特异性分布。Western blot分析发现EV71 VP1蛋白在小鼠五种组织都有表达,以上结果都显示成功建立了EV71感染小鼠模型,为下一步体内干预实验研究奠定了良好的基础。
  综上所述,本研究通过筛选EV71临床敏感株实验,筛选出合适的临床毒株,并对其进行了培养,同时利用此毒株建立了一日龄乳鼠模型,也建立了相应的检测方法,为EV71发病机制、病毒疫苗的研制等研究提供了实验工具。
[博士论文] 张纬
病理与病理生理学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分应用CRISPR/Cas9技术构建C3基因敲除猪模型
  研究背景:
  补体系统是免疫系统中重要的组成部分,它包含了30多种可溶性蛋白和膜蛋白,其活化过程为一系列的级联酶解反应。补体系统参与机体的特异性和非特异性免疫机制,主要生理作用为:溶解细胞、细菌和病毒的细胞毒作用;调理作用;引起炎症反应;清除免疫复合物和凋亡细胞。它主要包含了三条途径:经典途径、旁路激活途径和甘露糖结合凝集素途径。补体蛋白C3是三条途径的交汇点,它主要由肝脏细胞合成,除此之外,还由巨噬细胞、树突细胞、白细胞、近端肾小管上皮细胞、成纤维细胞、子宫上皮细胞、肺细胞和激活的T细胞等合成,表明C3在机体中发挥着重要的作用。据文献报道,C3与很多疾病相关,如肾小球疾病、溶血性尿毒综合症、胃癌以及风湿性关节炎等。目前为止,C3基因缺失的小鼠、豚鼠等啮齿类动物模型已有报道,但是这些动物模型由于它们的生理学和表观遗传学与人类有很大差异而受限制,大动物C3基因缺失模型却没有报道过。而猪在解剖结构及生理、免疫特性上与人类比较相近,且用猪作为动物模型不存在伦理上的障碍。
  最近,CRISPR/Cas9基因编辑技术大大提高了基因编辑效率,并且广泛应用于小鼠、兔子、山羊和猪等动物身上。在本实验中,我们运用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术构建C3基因敲除猪模型。
  研究目的:
  构建C3基因敲除、补体缺失的免疫缺陷猪模型。
  研究方法:
  1.从基因库里找到猪的C3基因,根据CRISPR/Cas9的构建原则,在第26个外显子上设计两个CRISPR/Cas9打靶位点,然后进行质粒构建。选择一个效率高的质粒进行核转染,筛选单克隆细胞,并进行测序鉴定。
  2.用双等位基因敲除的C3单克隆细胞作为体细胞核移植的供体,以去核的卵母细胞作为受体,借助体细胞核移植的方法获得重构囊胚,在体外培养至桑椹胚期移植到同期发情的代孕母猪子宫内,最终获得C3基因敲除小猪。
  3.将获得的新生克隆小猪的耳部组织提取基因组进行靶点位置PCR扩增,然后用PCR产物连接T载体送测序的方式进行基因型鉴定;采用Western Blot、ELISA和免疫组织化学的方法检测C3蛋白表达情况;用脂质体免疫测定法检测血清中补体活性(CH50);用补体依赖性的毒性试验方法检测C3敲除小猪血清对人293T细胞的杀伤力。
  实验结果:
  1.根据猪的C3基因序列,设计并构建2个CRISPR/Cas9打靶质粒,然后进行转染猪原代成纤维细胞,最终得到C3双等位基因敲除的细胞系。借助体细胞核移植技术,进行两批克隆实验。第一批共移植受体猪6头,怀孕1头且自然生产6头新生小猪。第二批移植受体猪共3头,其中怀孕2头,一头自然生产10头新生猪仔,取耳部组织培养原代成纤维细胞;另外一头自然分娩出3头新生猪仔,两批克隆总共生产了19头克隆小猪。
  2.两批克隆出生的小猪基因型鉴定结果均为C3基因靶点位置双等位基因敲突变,且都与相应的供体细胞基因型相对应;Western Blot和ELISA试验结果显示,克隆小猪的血清中几乎没有C3蛋白的表达;免疫组织化学的试验结果显示,C3敲除小猪的肝脏、脾脏、肾脏和肺组织等均没有C3蛋白的表达;通过检测血清中CH50的值,结果显示克隆小猪体内没有检测出补体活性;补体依赖性细胞毒性试验结果表明,C3敲除小猪的血清对人293T细胞没有杀伤作用,相反,野生型小猪血清对人的293T细胞有很大的杀伤作用。
  结论:
  利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,结合体细胞核移植(SCNT)技术可以成功获得健康的C3双等位基因敲除、补体系统缺失的免疫缺陷猪模型。我们是世界首例C3基因敲除猪模型。我们的结果不仅再次证实了CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效构建猪的基因缺陷模型,而且还为进一步研究补体系统在人机体的作用打下了基础。
  第二部分稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立
  研究背景:
  人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)是具有自我更新和多向分化潜能的多能性干细胞,它可在体外诱导分化形成多种细胞和组织。1998年,人胚胎干细胞的建立、研究和应用是干细胞研究领域的一项革命性进展。遗传修饰揭示了hESCs重要的生物学特性,对hESCs自我复制、定向分化、体内动态追踪具有重要的作用。但由于hESCs培养困难,缺乏有效的转染方法,外源基因表达困难等,制约了hESCs的遗传修饰研究。
  Nucleo fector技术直接将DNA转染到细胞核内,大大提高了转染效率。早在2005年,有人利用该技术转染hESCs效率高达20%-65%。转染细胞时因启动子的敏感性,转染后药物筛选过程中易使基因沉默,Jennifer等使用EF1a启动子驱动胚胎干细胞表达红色荧光蛋白,成功获得了能够稳定表达红色荧光蛋白连续传10代的胚胎干细胞。
  胚胎干细胞被分为原始态多能性(na(i)ve)和始发态多能性(primed),来源于小鼠内细胞团(inner cell mass,ICM)的干细胞被认为是na(i)ve状态,来源于上胚层的干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs)被认为是primed状态。研究发现,人胚胎干细胞与上胚层干细胞比较相似,因此也被认为是primed状态。始发态多能性是一种更易进行分化的状态,它不具有发育的全能性。胚胎干细胞的研究可以使人们更好的理解胚胎发育过程及其分子机制,更重要的是胚胎干细胞的临床应用将成为器官再生、基因治疗等的有效工具。
  基于以上的研究,我们利用核转染技术将带有pEF1alpha启动子的红色荧光蛋白质粒转染进入胚胎干细胞内以获得稳定表达的细胞系。并对该细胞系进行多能性功能的分析,为再生医学和疾病模型提供重要的材料。
  研究目的:
  建立稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系,并对该细胞系进行诱导分化的研究。
  研究方法:
  1.用核转染的方法将红色荧光表达质粒pEF1α-DsRed-Express2转染进入胚胎干细胞内,并用G418药物筛选单克隆;
  2.用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和RT-PCR方法检测转染红色荧光蛋白的胚胎干细胞(RFP-hESCs)多能性基因的表达;
  3.在体外对RFP-hESCs进行诱导分化鉴定其分化潜能;
  4.Primed状态的RFP-hESCs向Na(i)ve状态逆转诱导。
  实验结果:
  1.成功获得了稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系;并且经过鉴定RFP-hESCs仍然具有干细胞的特性,并且Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达与hESCs为出现明显差异;
  2.将RFP-hESCs诱导分化生成类胚体,并且有三胚层特异性基因的表达;进一步诱导分化生成定型内胚层细胞,qRT-PCR结果显示,定型内胚层细胞特异性基因有表达,干细胞特异性因子几乎不表达;
  3.得到Na(i)ve-like的细胞,但是该细胞不能继续传代。
  结论:
  成功建立稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系,并且没有影响该细胞系的干细胞特性,能够继续诱导分化生成其他类型的细胞,可用于后续实验的研究。
[硕士论文] 邓兰
内科学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究紫外线照射对成人原代肝细胞活率及膜电位的影响,通过混合淋巴细胞-肝细胞培养,探讨紫外线照射降低成人原代肝细胞的免疫原性的可行性及稳定性。
  方法:收集我院肝胆外科切除肝组织手术标本,诊断为肝脏良性病变(肝血管瘤、肝内胆管结石等),采用灌注法获得肝细胞;将实验肝细胞分为5个组,1个对照组(0 J/m2)及4个不同照射强度组(分别为200、350、550和750J/m2)。紫外灯功率固定,照射强度由照射时间调控,5组照射强度所对应的照射时间分别为0、2、4、6和8分钟。各组分别于处理后培养的第1、3、5天进行相关检测:台盼蓝拒染法和CCK-8法检测细胞活率;荧光显微镜和多功能酶标仪检测细胞膜电位变化;通过混合淋巴细胞-肝细胞培养(MLHC)检测受体T细胞增值情况;收集实验组和处理组的培养上清液,离心后全自动生化分析仪检测白蛋白、LDH的分泌量。
  结果:⑴改良的两步胶原酶灌注获得的肝细胞透亮,呈圆形或球形,胞质均匀,肝细胞总数可达109个以上,活率大于90%。⑵UVB照射新鲜分离的肝细胞,在照射强度相同的条件下,随着照射后培养时间的延长,成人原代肝细胞活率呈现下降趋势。照射后第1天活率最好,随着培养时间的延长,活率下降,到第五天,活率下降1/2;在照射后培养时间相同的情况下,随着照射强度的增加,肝细胞活率呈先上升后降低。照射2min后的肝细胞活率最高,较未照射组高,但差异不明显,活率明显高于4min、6min组,是照射8min组的2倍。⑶不同的UVB照射强度和UVB照射后不同培养时间之间,成人原代肝细胞的膜电位均有明显差异。UVB照射2min组的膜电位在照射后的各个时间点均比UVB照射肝细胞0min、4min、6min、8min组的膜电位高。⑷肝细胞在接受不同强度紫外线照射后,与淋巴细胞混合培养,照射后的肝细胞免疫原性下降,表现为共培养的淋巴细胞增值能力下降。2min组与对照组无明显区别,但明显低于4min、6min、8min组。⑸检测不同照射强度、培养时间的白蛋白、LDH分泌量,接受2min紫外线照射的肝细胞分泌功能最好,随着照射强度的增大和培养时间的延长,肝细胞合成和分泌功能下降。
  结论:混合淋巴细胞-肝细胞培养可以用来检测受体淋巴细胞对供体肝细胞反应的指标,照射2min时共培养的T细胞增值能力最低,提示此时肝细胞的免疫原性最小。
[硕士论文] 刘博
内科学(消化系病) 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:乙型肝炎病毒(hepatitisB virus,HBV)感染是影响人类健康的重要问题,据WHO报道,全球约20亿人曾感染HBV,其中2.4亿人为慢性HBV感染者。我国作为乙肝的高流行区,2006年全国乙型肝炎流行病学调查显示我国一般人群HBsAg携带率为7.18%,乙肝病毒携带者约有9000万人。慢性HBV感染可伴有肝纤维化发生,进而可发展为肝硬化、肝癌。目前尚没有特异的药物可以根治乙肝,动物模型对于了解HBV感染的病理生理学、病毒复制的相关机制以及该过程中发生的肝细胞损伤、肝纤维化,药物疗效评价等有重要意义。肝纤维化的动物模型主要有化学法、胆总管结扎、免疫法、尾静脉注射转基因质粒等,但这些模型无法模拟HBV感染的自然史。HBV具有严格的宿主特异性,故目前尚缺乏合适的HBV动物模型。AAV8作为一种嗜肝性病毒,其本身不具有致病性,可作为病毒载体携带HBV进入大鼠肝脏,本研究通过对大鼠注射rAAV8-1.3HBV,观察HBV在大鼠体内的复制以及引起的肝脏病变,旨在探索建立一种新型HBV感染动物模型,为进一步研究HBV复制、致病机制、肝纤维化进展等提供可能。
  方法:本研究分别对0日龄乳鼠于0、2、4周腹腔注射rAAV8-1.3HBV以及对6周龄成年大鼠尾静脉注射rAAV8-1.3HBV建模。注射rAAV8-1.3HBV后于多个时间节点进行尾静脉采血100~200ul,分离血清,检测大鼠血清中HBsAg、HBeAg、ALT及HBVDNA。12周末处死大鼠,取肝脏。做病理切片,行HE染色及Masson染色,免疫组化检测HBsAg、HBcAg、TGF-β1、α-SMA表达情况,评估肝脏损伤及纤维化情况。
  结果:乳鼠腹腔注射rAAV8-1.3HBV2周后血中HBsAg和HBeAg均为强阳性,感染率100%,除1只大鼠偏低外,HBsAg平均2686.31±804.39 IU/ml,HBeAg平均63.60±31.60 NCU/ml,4周时HBsAg和HBeAg较前呈下降趋势,8周和12周时仍有部分大鼠HBsAg和HBeAg保持阳性。对照组HBsAg、HBeAg12周内均为阴性。4周时实验组血中HBVDNA为1.39×105~1.06×107 IU/ml,随时间延长,至12周时血中仍可检测到较高拷贝的HBVDNA,表现为4.79×102~3.31×105IU/ml。肝脏中HBVDNA高于血清中HBVDNA。成年大鼠尾静脉注射rAAV8-1.3HBV后3天血中即可检测出HBsAg阳性,1周时HBsAg较前明显上升,2周后开始下降,至12周基本变为阴性。HBeAg结果与HBsAg表现不同,在注射后3天,rAAV8-1.3HBV组大鼠血中均未检测到HBeAg,第2周时,HBeAg均为阳性,并保持稳定至12周。
  对照组HBsAg、HBeAg12周内均为阴性。注射rAAV8-1.3HBV8h后,血中可检测到极高拷贝数的HBVDNA,数值在3.47×1010~4.5×1010 IU/ml之间,24h时血中HBVDNA仍维持在1010数量级,从3天开始血中HBVDNA较前下降,但此时血中HBVDNA仍可保持很高的拷贝数,4周时血中HBVDNA为2.20×103~1.12×105 IU/ml,之后维持稳定至12周时。病理可见肝脏充血,部分肝细胞水肿,体积变大,排列紊乱,肝窦受压变窄,可见嗜酸性变及散在点状坏死,汇管区略增厚,可见淋巴细胞浸润。免疫组化可见HBsAg、HBcAg阳性肝细胞,α-SMA、TGF-β1明显阳性,提示肝星状细胞活化,纤维化发生。
  结论:通过注射rAAV8-1.3HBV,HBV可在大鼠肝脏中持续复制并表达,并可引起肝脏损伤及纤维化的发生,该模型有助于了解HBV感染的病理生理学、病毒复制以及研究该过程中发生的肝细胞损伤、肝纤维化的相关机制。
[硕士论文] 刘伟
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:在对胸腺的功能研究中,一直把胸腺当作一个免疫“特赦”器官看待,抗原和大分子不能进入胸腺从而避免了胸腺内发生免疫反应。根据中枢耐受理论,如果在胸腺内植入外界抗原,那么该抗原将会被发育中的T细胞识别并对阳性选择和阴性选择产生影响进而形成耐受。根据我们先前的研究发现,当把肿瘤细胞注射到胸腺后,并没有诱导形成肿瘤细胞的耐受,肿瘤细胞最终会被清除。并且流式分析显示,在注射人肺癌细胞A549后,胸腺内CD4+、CD8+T细胞的数量增加。那么这些增多的淋巴细胞会不会是来自于外周呢?在给免疫缺陷小鼠移植T细胞的实验中发现,异体的成熟T细胞可以进入胸腺,但正常小鼠的外周成熟T细胞是否也具有这种现象还不确定。
  因此针对以上问题,我们选用正常小鼠作为实验对象,首先在其脾脏中注射CFDA SE荧光染料,通过流式检测胸腺内是否含有表达CFDA SE荧光信号的细胞,检测外周T细胞能迁回胸腺;其次我们在外周免疫过人肺癌细胞A549抗原的小鼠和未免疫小鼠的胸腺中分别注射等量的A549细胞,通过石蜡切片和流式细胞术分析对比胸腺内发生的免疫反应、抗原细胞在胸腺内的状态以及T细胞亚群含量的变化,并对发生于胸腺的应答反应做进一步探究。
  通过以上实验,我们得到以下结果:
  1.胸腺内可以检测到CFDA SE阳性细胞,并且这些细胞绝大多数呈CD3阳性;
  2.石蜡切片结果显示,免疫小鼠的胸腺内发生的免疫反应较未免疫小鼠更加剧烈,胸腺在相对较短的时间内即可恢复正常;
  3.流式分析结果显示,与未免疫小鼠相比,A549细胞在免疫小鼠胸腺内的存活时间缩短;
  4.胸腺微创注射后第5天,外周免疫小鼠和未免疫小鼠与未进行胸腺微创注射的小鼠相比,胸腺中CD4+和CD8+T细胞的数量都明显增加,但免疫小鼠的胸腺中CD8+/CD4+的比值较未免疫小鼠显著升高,而未免疫小鼠与未进行胸腺微创注射的小鼠之间无明显差异。
  通过以上结果,我们得出以下结论:
  1.正常小鼠的胸腺内存在来自外周的T细胞。这种回迁现象不仅发生于免疫缺陷小鼠,也发生于正常小鼠。
  2.用抗原外周免疫后,当胸腺内再次出现相同抗原时,胸腺内会发生更加及时、剧烈的免疫反应。
  根据以上结论,我们推测外周免疫后一部分记忆T细胞进入胸腺,当再次遇到相应抗原时,记忆T细胞迅速增殖并对抗原产生记忆性杀伤。外周成熟T细胞回归胸腺可能是机体保护胸腺免于抗原感染的一种正常机制,防止机体形成对外来抗原的耐受。
[硕士论文] 刘超
重症医学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:背景:随着人口老龄化日趋严重,老年人群中脓毒症患者在逐年增加,发病率及死亡率也随着年龄的升高显著上升。尽管做了大量的临床试验和基础研究,但目前仍没有有效治疗老年严重脓毒症患者的方法。临床与基础研究的分歧主要在于用于基础研究的试验动物过于年轻不能真实反映老年脓毒症患者的特点。近年来,利用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)制备的亚急性衰老模型已应用于多种老年性疾病的研究当中并且取得了良好的效果,但关于其相关的老年脓毒症模型研究较少。因此,利用D-gal诱导的衰老大鼠建立脓毒症模型将为老年脓毒症的基础与临床研究提供新的思路。
  目的:1、观察D-gal诱导的衰老大鼠脓毒症模型死亡率、炎症细胞因子、器官功能及生命体征的变化;2、探讨在老年脓毒症研究中的应用价值。
  方法:本研究由两部分组成。第一部分采用D-gal皮下注射的方法建立大鼠衰老模型,将12周雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠分为低剂量(low-dose)诱导组(LD-galgroup,诱导剂量125mg/kg/d)、高剂量(high-dose)诱导组(H D-galgroup,诱导剂量500mg/kg/d)和对照组(controlgroup,皮下注射同等剂量0.9%NaCl),6周后测量血清丙二醇(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量并观察肾功能及生命体征变化。第二部分采用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法在已建立的大鼠衰老模型的基础上建立脓毒症模型。实验分组同前,观察各组间CLP术后12h及24h死亡率、炎症因子、肾功能、MicroRNA-155及生命体征的变化。
  结果:1、D-半乳糖皮下注射6周后,大鼠血清MDA含量升高SOD活性下降(HD-galvs.control, P<0.01 for MDA and SOD;L D-gal vs.control, P<0.01 for MDA and SOD;HD-gal vs.L D-gal,P=0.017 for MDA,P=0.034 for SOD);2、CLP术后1周的死亡率分别是73.3%(HD-gal)、40%(L D-gal)和33.3%(control);3、与对照组相比,高剂量诱导组在CLP术后的血清肌酐、尿素氮、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、白介素-6、白介素-10、肿瘤坏死因子-α以及MicroRNA-155水平明显升高(P<0.05);4、根据肾损伤RIFLE分级,CLP术后24小时发生严重急性肾损伤(RIFLE-F)的可能分别是80%(HD-gal)、43%(L D-gal)和43%(control);5、高剂量诱导组在CLP术后更易出现心率、收缩压和体温的降低。
  结论:与青年SD大鼠脓毒症模型相比,在高剂量D-gal诱导的衰老大鼠上建立的脓毒症模型死亡率高,这可能与炎症反应的增加和严重的急性肾损伤相关。并且高剂量诱导组更易出现严重的感染性休克和低体温。因此,使用高剂量D-gal诱导的衰老大鼠脓毒症模型进行临床前研究可以为老年患者的脓毒症治疗提供更有价值的信息。
[硕士论文] 尹郭伟
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:干扰素(IFN)诱导蛋白在干扰素生物学功能的发挥中起着至关重要的作用,p204是干扰素诱导蛋白p200家族(IFI200)鼠类蛋白成员,该蛋白能与多种蛋白相互作用,并通过这些相互作用发挥抑制细胞增殖、阻断细胞周期、促进细胞分化及感应外源双链DNA入侵等重要作用。
  本论文用D-半乳糖注射法对遗传背景相同的全身性p204基因敲除型(K0)小鼠和野生型(WT)小鼠进行卵巢早衰模型的构建,观察小鼠造模过程中的健康状况。造模八周后组织切片染色观察卵巢卵泡的发育的状况。采用酶联免疫吸附法检测血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(HL)水平。采用real-timePCR技术对卵巢组织c-myc、Bc卜2、Bax、CYP17A1、CYP19A1等基因表达水平进行检测与分析。采用免疫组化法检测Bc卜2、CYP17A1、CYP19A1蛋白在小鼠卵巢组织的表达和分布情况。
  实验结果表明,在造模过程中,KO小鼠的体重及卵巢重量均显著下降(p<0.01),而WT小鼠变化不显著,说明p204敲除使小鼠对D-半乳糖代谢紊乱导致的生理功能变化的影响更大。通过对卵巢组织的切片及染色观察发现KO小鼠卵巢闭锁卵泡和黄体增多,颗粒细胞排列稀疏,说明p204敲除对小鼠卵巢卵泡的发育产生了一定影响。对小鼠血清激素水平检测发现KO小鼠睾酮(T)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)水平均显著升高(p<0.01)。说明p204基因敲除后使小鼠体内的激素水平发生改变,导致卵泡发育功能下降,致使卵巢损伤。对小鼠卵巢相关基因检测中,发现KO小鼠凋亡相关基因bax、原癌基因c-myc表达水平均显著升高(p<0.01),说明p204敲除对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡产生影响,加速了卵巢早衰。还发现KO小鼠中性激素合成相关基因CYP17A1表达水平显著升高(p<0.01),CYP19A1基因表达水平均显著降低(p<0.01),说明p204敲除使小鼠体内性激素尤其是雄激素表达水平发生改变,导致小鼠卵泡发育发生障碍,形成卵巢早衰。免疫组化结果显示缺失p204导致小鼠卵巢内Bcl-2、CYP17A1、CYP19A1蛋白的表达和分布发生改变,加速卵巢早衰形成。
  以上结果表明p204在小鼠卵巢卵泡发育中可能通过调控颗粒细胞增殖和凋亡的过程从而抵制卵巢早衰的形成。本论文为初步探究p204在小鼠POF卵泡发育中的作用,为进一步阐明卵巢早衰卵泡发育障碍的发病机制和预防早衰奠定基础,具有重要的理论意义和临床价值。
  本研究的创新点在于:1)使用D-半乳糖注射法对C57品系p204基因全身性敲除小鼠构建卵巢早衰模型。2)发现缺失p204对小鼠卵巢组织产生损伤加速卵巢早衰。
[博士论文] 吴仕峰
外科学(骨外) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  急性脊髓损伤在临床上通常表现为发病急、危害大,具有治疗费用昂贵与转归预后不佳的特点,在脊柱外伤尤其是脊柱骨折患者中具有较高的发生率。自进入工业时代和交通业时代以来,脊髓损伤的发病率呈现出连续上升的势头。在医学发展的历史进程中,现代医学在诸多方面均取得了令人瞩目的成就,攻克了医学领域一系列的许多难题,但迄今为止,对脊髓损伤的治疗没有太多的临床手段和突破性的医疗技术,不论在脊髓损伤的治疗和并发症预防上都存在很大的短板,距离患者期望的完全治愈和彻底康复的良好愿景还相差甚远。脊髓损伤的病理过程是相当复杂的,涉及一系列的作用机理和基础理论。近几十年来,大量的实验研究者进行了无数的基础与临床实验研究,在基础研究和临床诊疗等方面做出了巨大的努力,目的就在于能够找到脊髓损伤发生后的明确机制,从而根据不同的原理分类采取针对性的措施进行治疗,最终来达到临床治愈的效果。
  脊髓损伤后的神经再生是目前生物医学领域研究的热点,同时也是临床一线医生所面临和被困扰的难点,脊髓损伤后必将出现原发性损伤和继发性损伤并存的现状。针对上述两种损伤的神经功能修复主要存在两大难点,第一,如何替代脊髓损伤区域变性坏死的神经元,恢复原有的神经元数量。第二,如何预防和抑制损伤区域疤痕的形成,提供一个适宜神经元再生的微环境。
  近二十年来,经过广大研究者的不懈努力,脊髓损伤的修复再生研究取得了较大的进展,目前研究最多的就是种子细胞移植,也是已经尝试应用于临床治疗的措施手段。嗅鞘细胞同时具有星形细胞和许旺氏细胞的特性,能够穿行于外周神经和中枢神经,具有促进神经元轴突再生和神经元再髓鞘化的作用。在大量的实验研究和部分临床治疗中均证实嗅鞘细胞具有一定程度修复脊髓损伤的作用,也是目前脊髓损伤实验研究最多的种子细胞之一。
  嗅鞘细胞之所以能够成为目前最佳的移植细胞是与其自身独特的生物学特性密不可分的。嗅鞘细胞可以生成和分泌脑源性神经生长因子、骨形态发生蛋白、神经细胞粘附因子、层粘连蛋白、血小板源性生长因子和低亲和力神经生长因子受体等。嗅鞘细胞通过上述生物学特性在修复脊髓时具有改善受损区域脊髓内部微环境,抑制有害因子产生,减少局部炎症反应的作用。同时嗅鞘细胞启动髓鞘形成和轴突再生的修复程序,引导受损神经轴突修复再生,重新建立神经联系,恢复原有的神经功能。此外,嗅鞘细胞还可以通过抑制胶质细胞的增生,减少损伤处瘢痕的形成,阻碍脊髓内部空洞的出现,为脊髓损伤的修复和重建提供基础,从而有利于新生轴突重新穿越损伤区域,建立神经传导的途径,恢复原有的神经功能。
  脊髓损伤的康复治疗与患者的康复效果和预后密切相关,早期临床康复介入治疗是提高脊髓损伤患者预后的一个重要临床治疗手段。合理的物理治疗措施会显著提高患者的脊髓功能恢复程度,是提升脊髓损伤临床功能分级水平的治疗方法,并且已经得到研究证实。物理治疗根据种类的不同,其各自的治疗效果和临床用途也各不相同,物理治疗的共同效果主要表现为加快局部血液循环,改善局部条件,减少炎症因子释放,起到减轻组织水肿,减轻炎症反应,缓解疼痛的效果。除此以外。每种物理治疗还具有自身各自独特的作用,比如可以引起肌肉收缩,体液电离和极化,局部温度升高等。在目前的物理治疗中电刺激具有改善局部微循环,促进神经营养因子表达和促进移植细胞存活等作用。因此,在损伤初期通过电刺激治疗可以实现减轻脊髓损伤的继发性损害,利于神经元的存活和神经轴突的生长,在后期则可以减少脊髓损伤并发症的发生,提高患者生存率和生活质量,降低临床的致残率与死亡率。借助物理治疗的手段来治疗脊髓损伤在康复医学领域是预防和治疗继发性损伤所采取的最早措施,通过电疗和电刺激来改善损伤局部微环境的变化,加速神经元的修复,改善中枢神经的功能恢复。
  脊髓损伤的修复机制是错综复杂的,修复所需的干预措施也涉及许多方面,单一的治疗手段肯定不是最佳的选择,采用适当的联合手段发挥协同作用来提高修复效果,对修复脊髓损伤来讲更具有必要性,因此本实验应用嗅鞘细胞移植联合物理治疗修复脊髓损伤,探讨不同治疗方式的修复效果,观察损伤区域神经元的凋亡情况。
  目的:
  1、探讨能够满足脊髓损伤实验研究所需动物模型的制备。
  2、选择合适的嗅鞘细胞制备方法,确保满足移植所需的嗅鞘细胞。
  3、探讨物理治疗对脊髓损伤的修复作用。
  4、探讨嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的修复作用。
  5、探讨嗅鞘细胞联合物理治疗对脊髓损伤的修复作用,观察嗅鞘细胞和物理治疗的在治疗过程中的协同效果。
  方法:
  1、应用虹膜刀予以彻底离断大鼠脊髓,离断水平在胸10部位,制备完全离断的脊髓损伤动物模型。
  2、对培养的嗅鞘细胞在移植前采用改良Nash差速贴壁法和阿糖胞苷化学抑制法联合纯化,观察细胞的纯度。
  3、对原代培养的嗅鞘细胞和传代培养的细胞固定后进行p75免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察对细胞进行鉴定。
  4、将60只成年S-D大鼠模型随机分为四组,分别为嗅鞘细胞移植组、物理治疗组、嗅鞘细胞联合物理治疗组和对照组。
  5、在动物造模后次日,每日给予低频直流电刺激,每次作用15分钟,每日进行两次,观察物理治疗的修复效果。
  6、在动物造模后1周,脊髓损伤处及其远近端分别用微量注射器注射移植细胞,观察细胞移植后的脊髓功能的改善情况。
  7、在细胞移植和物理治疗后分别通过BBB功能评分、H-E染色、嗜银染色、辣根过氧化物酶染色、体感诱发电位等方法观察脊髓损伤的修复程度。借助免疫荧光染色、Western-blot免疫印迹和Tunel染色来进一步观察损伤区域移植细胞存活和脊髓神经细胞凋亡的情况。
  结果:
  1、采用脊髓离断法造模既能保证实验动物的存活率,也能达到模拟临床的效果,符合脊髓完全离断的标准,可以作为脊髓损伤动物模型的制备方法。
  2、采用改良Nash差速贴壁法和阿糖胞苷化学抑制法纯化的细胞纯度可达95%,符合细胞移植的要求。
  3、原代培养和传代培养的嗅鞘细胞p75免疫荧光鉴定均为阳性,细胞的生物学性质没有变化。
  4、在细胞移植和物理治疗后,各组实验动物的BBB功能评分根据得分高低最高为嗅鞘细胞联合物理治疗组,其余依次为嗅鞘细胞移植组、物理治疗组、对照组,各组间数值均具有统计学意义(p<0.05)。H-E染色显示嗅鞘细胞联合物理治疗组脊髓结构较其余各组清晰,神经纤维更具有方向性,存在散在分布的大小不一的空洞,其余各组均显示脊髓黑白质界限不清,结构紊乱,神经纤维中断扭曲,走行没有方向性,损伤区域存在大量的脊髓空洞。嗜银染色结果表明嗅鞘细胞联合物理治疗组神经纤维数量最多,与其余各组相比具有统计学差异(p<0.05)。对照组神经纤维数量极少,走向毫无方向性,神经纤维全部中断,没有连续性。辣根过氧化物酶染色显示鞘细胞联合物理治疗组神经元的数目最多,多于其他各组,结果具有统计学意义(p<0.05),嗅鞘细胞组、物理治疗组和对照组组间也具有统计学差异(p<0.05)。诱发电位检测表明各组动物在细胞移植后1周时均可检测到波形,嗅鞘细胞联合物理治疗组的诱发电位潜伏期低于其他各组。在移植后2周时,各组检测的潜伏期无明显统计学差异。在移植后4周时,嗅鞘细胞联合物理治疗组的潜伏期最短,与其他各组相比结果具有统计学差异(p<0.05)。在细胞移植后6周和8周时,各组的潜伏期由短至长依次为嗅鞘细胞联合物理治疗组、嗅鞘细胞移植组和物理治疗组、对照组,各组间比较均具有统计学意义(p<0.05)。各组动物在细胞移植后1周时开始出现波形,可以检测到波幅,在移植后2周时各组动物检测到的波幅均较小,各组间比较没有差异。在移植后4周时嗅鞘细胞联合物理治疗组动物波形的波幅最高,超出其余各组波幅,差异具有统计学意义(p<0.05),在移植后6周和8周时各组的波幅继续升高,由高到低依次为嗅鞘细胞联合物理治疗组、嗅鞘细胞移植组和物理治疗组、对照组,各组间波幅差异具有统计学意义(p<0.05)。
  5、免疫荧光染色显示嗅鞘细胞联合物理治疗组和嗅鞘细胞移植组均有嗅鞘细胞在体内存活,但前者的细胞数量多于后者,二者相比具有统计学意义(p<0.05)。Western-blot免疫印迹检测显示Bax、Bcl-2和Caspase-3、Caspase-9蛋白表达结果为:嗅鞘细胞联合物理治疗组Bcl-2蛋白明显升高(p<0.05),caspase-9和caspase-3的表达减少(p<0.05),而Bax均变化不大。Tunel染色表明嗅鞘细胞联合物理治疗组神经元细胞凋亡的数量最少,具有统计学意义(p<0.05)。
  结论:
  1、完全离断脊髓损伤动物模型制备简单,重复性高,效果可靠,适宜用来进行脊髓损伤动物实验研究。
  2、实验制备获取的嗅鞘细胞的纯度、数量及生物学特性能够满足移植需要,可以做为修复脊髓损伤的种子细胞。
  3、嗅鞘细胞移植和物理治疗均具有一定程度的脊髓损伤修复作用,并且嗅鞘细胞移植联合物理治疗的修复效果最好,功能改善程度最高,优于单一手段的修复作用,但是远未达到完全修复的程度。
  4、嗅鞘细胞移植联合物理治疗能够最大程度的减少神经元的凋亡,继而保留损伤区域的脊髓功能。
[硕士论文] 侯琨
耳鼻咽喉科学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4),中文名称细胞毒T淋巴细胞相关抗原4,作为白细胞分化抗原的一种,又名CD152,是T细胞表面上的一种跨膜受体,与CD28共同竞争享有B7分子配体,当CTLA-4与B7分子结合后,可以导致T细胞表达无反应性,进而表达免疫反应的负调节。CTLA-4Ig主要是由CTLA-4分子细胞外功能区域和人自身免疫球蛋白IgG1的恒定区进行结合的一种融合蛋白,是一种经典的、研究功能明确的免疫抑制分子,CTLA-4Ig可以导致T细胞正常免疫反应受限,从而导致免疫功能降低。为了研究CTLA-4Ig在内耳发育及表达情况,我们与第三军医大学合作,以体细胞核移植方法构建人源性hCTLA-4Ig转基因巴马香猪,角蛋白(K14)作为启动子,靶向表达,从而避免了因全身性表达CTLA-4Ig导致的动物在胚胎发育期死亡。本次研究通过对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪种群中个体的转基因鉴定、听力学功能表型的分析和多种内耳形态学方法的研究,对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳聋做了初步研究。本次研究包括如下三个部分。
  第一部分 hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳聋动物模型基因型鉴定及蛋白分布表达
  首先,为了明确本研究的科学性,我们应首先确保我们通过体细胞移植获得的封闭家系种群后代的基因型,确保其基因稳定遗传,可靠。此外还还需明确CLTA-4基因是否在正常巴马香猪发育过程中表达,及CTLA-4Ig是否在内耳表达。我们采用了PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)方法进行阳性巴马香猪的鉴定以及用于种群繁衍的筛选。其中,在PCR结果中,因巴马香猪转基因猪个体表达了326bp的目的条带,而正常野生型巴马香猪未见明显目的条带表达,说明转基因克隆猪家系稳定。
  第二部分 hCTLA-4Ig转基因巴马香猪听力学功能检测
  为了研究CTLA-4Ig在内耳表达中的作用,我们首先通过对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪的听力学功能情况进行研究,在本次研究中,我们对hCTLA-4Ig转基因巴马香猪封闭种群20只转基因克隆猪进行了听力学筛查,采用了听觉脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值检测,并在相同检测条件下测试了20只正常野生型巴马香猪ABR阈值,进行统计学配对分析,发现hCTLA-4Ig转基因巴马香猪组ABR阈值与野生型巴马香猪组ABR阈值之间具有明显的统计学差异(P<0.05)。通过听力学功能的检测,我们发现hCTLA-4Ig转基因巴马香猪出现了不同程度的感音神经性耳聋,从而说明hCTLA-4Ig转基因巴马香猪家系出现了听力损失。
  第三部分 hCTLA-4Ig转基因巴马香猪内耳形态学观察
  在明确了解hCTLA-4Ig转基因巴马香猪听力学表型特征后,我们通过对内耳进行形态学变化研究,进一步从形态学和病理学角度判断hCTLA-4Ig转基因巴马香猪异常特征。首先我们通过取材后直接在显微镜下比较观察,hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳蜗大小体积、耳蜗回数、听小骨等发育未见与野生型巴马香猪无明显差异。
  耳蜗标本经过火棉胶包埋后,采用连续切片,经过HE染色后观察,发现hCTLA-4Ig转基因巴马香猪耳蜗形态存在异常,出现corti's器结构异常,前庭膜塌陷,中阶狭窄等。其中耳蜗标本制备后进行扫描电镜观察,纤毛多数成病理改变,毛细胞脱落。
  在免疫荧光结果中,我们可以发现,hCTLA-4Ig在转基因猪的耳蜗内有表达,多集中在血管纹、螺旋神经节部位,而在正常野生型巴马香猪耳蜗表达情况较低。
  通过对如上方法的形态学分析,我们可以看出,hCTLA-4Ig转基因巴马香猪的耳蜗具有病理改变,而这些病理改变是由于基因异常引起的,从而说明CTLA-4Ig突变与耳聋相关。
[硕士论文] 王剑锋
神经病学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景和目的
  黑质致密部多巴胺能神经元变性死亡所导致的体内多巴胺(DA)及其代谢产物含量减少是导致帕金森病的主要原因,其减少程度与多巴胺能神经元丧失程度成正相关。络氨酸羟化酶(TH)为DA合成限速酶,研究证明PD患者及PD动物模型TH含量明显降低,因此,通过干预提高TH含量及活性已成为减缓PD进展的重要治疗策略。
  瞬时受体电位香草醛亚型1(TRPV1)是一种非选择性阳离子通道,可被辣椒素选择性激活。传统上,TRPV1被认为涉及广泛的疾病领域,包括疼痛(炎症,内脏,癌症和神经病),炎症性肠病,间质性膀胱炎,尿失禁,气道疾病,胰腺炎和偏头痛,其涉及到的机制包括炎症,免疫,凋亡,氧化应激等诸多方面。最新研究表明TRPV1不仅在感觉神经元高度表达,而且高表达于其他功能脑区,并参与神经元损伤的细胞过程。此外,深入研究发现TRPV1可降低氧化应激以及脑梗死的相关标志物,提高运动和认知功能。提示其可能在神经退行性疾病的发生发展中发挥作用。本研究通过使用6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病大鼠模型来探讨TRPV1的神经保护作用,为其可能作为新的药物治疗靶点提供理论依据。
  研究方法
  随机选取108只雄性健康Wistar大鼠,体重控制为220g-250g,由山东大学动物实验中心提供。将其随机分为正常对照组(20只)、假手术组(右侧脑前内侧束立体定向注射生理盐水,20只),6-OHDA组(右侧脑前内侧束立体定向注射6-OHDA,40只),6-OHDA+辣椒素组(即干预组,注射6-OHDA后每天每只给予辣椒素1mg/kg腹腔注射,连续注射7d,辣椒素剂量为1mg/kg,40只)。对大鼠分别进行行为学检测(包括旋转试验与旷场试验)、蛋白质印迹检测黑质及纹状体TH及TRPV1表达水平、免疫组织化学检测黑质TH+神经元、测定大鼠脑内CAT、SOD、MDA含量。
  所有实验数据均使用GraphPad Prism5.0软件处理。计量资料以均数±标准差(x±s)进行统计描述;采用t检验进行两组间均数比较,p<0.05为差异具有统计学意义。
  研究结果
  1.行为学结果示与6-OHDA组相比,干预组大鼠诱发旋转圈数明显减少(n=10,p<0.01),大鼠1分钟内行走距离明显增多,平均速度明显增快,中央格停留时间显著减少,且差别均具有统计学意义(n=10,p<0.05)。
  2.免疫印迹结果示干预组大鼠黑质及纹状体TRPV1及TH蛋白表达水平较其余三组明显增高,差异均具有统计学意义(n=6,p<0.01)。
  3.组化结果示与6-OHDA组相比,干预组黑质TH+神经元数目明显增多,此外干预组大鼠黑质致密部TH阳性神经元树突明显增多,轴突长度增加。
  4.与6-OHDA组相比,干预组右脑CAT、SOD水平均明显增高,MDA水平明显降低,差异均有统计学意义(t=2.977,p=0.0139; t=2.787,p=0.0192; t=2.563,p=0.0282),左脑6-OHDA组与干预组相比CAT、SOD、MDA水平差异无统计学意义(p>0.05)。
  结论
  辣椒素可激活TRPV1蛋白,调节氧化应激水平,对PD大鼠多巴胺能神经元起神经保护作用,改善其运动功能,缓解PD病情。
[博士论文] 文静
临床中药学 成都中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨艾片(左旋龙脑)、天然冰片(右旋龙脑)、冰片(合成龙脑)、苏合香、安息香五味开窍药的神经血管单元(NVU)保护作用及其相关机制,以阐释开窍药开窍醒神功效的科学内涵;同时比较五味开窍药的药效强弱,为临床组方选药提供参考。
  方法:①采用线栓法制备永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)大鼠模型,记录各组大鼠从麻醉到苏醒的时间,并参照 Longa评分法对大鼠神经功能损伤进行评分。②采用干湿重法测定pMCAO模型大鼠脑含水量、脑指数及脑水肿率。③采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法对pMCAO模型大鼠脑组织进行染色观察脑组织梗死情况,并测计算脑梗死率。④采用苏木精-伊红(HE)染色法观察pMCAO模型大鼠缺血半暗带脑组织细胞形态,并计算神经元变性细胞指数(DCI)。⑤采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定pMCAO模型大鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。⑥采用实时定量荧光 PCR(RT-PCR)法、免疫印迹法(WB)法、免疫组织化学法测定pMCAO大鼠模型缺血半暗带脑组织中Wnt3a、β连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、大肠腺瘤样息肉蛋白(APC)、紧密连接蛋白5(Claudin-5)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA及蛋白的表达。⑦采用透射电镜观察 pMCAO大鼠缺血半暗带脑组织中神经元以及血脑屏障超微结构。
  结果:①三种冰片能显著延长模型大鼠麻醉后苏醒时间(P<0.01),苏合香与安息香对苏醒时间无明显影响;艾片与安息香能显著降低模型大鼠术后24 h的神经行为评分(P<0.05),天然冰片与冰片有降低行为评分的趋势。②艾片、冰片、苏合香、安息香能显著降低模型大鼠缺血侧脑含水量、Δ含水量、Δ脑指数(P<0.01);艾片、冰片、安息香能显著降低模型大鼠脑水肿率(P<0.01)。③TTC染色结果显示,造模后脑组织可见明显的苍白梗死区,开窍药对脑梗死有不同程度的改善作用,艾片、冰片、苏合香、安息香能显著降低模型大鼠脑梗死率(P<0.01)。④HE染色结果显示,造模后大鼠缺血半暗带脑组织出现明显病理学变化,表现为神经组织坏死、液化,形成筛网状病灶,与周围组织有较明显分界,五味开窍药可不同程度改善脑组织病理学变化。艾片、冰片、苏合香、安息香可显著降低模型大鼠缺血脑组织神经细胞 DCI(P<0.01)。⑤五味开窍药均能显著升高模型大鼠血清中VEGF的含量,显著降低模型大鼠血清中TNF-α的含量(P<0.05或P<0.01),对NGF及IL-1β无明显影响。⑥总体来看,开窍药有升高pMCAO模型大鼠缺血半暗带脑组织中Wnt3a蛋白、β-catenin mRNA、Dsh1 mRNA、GSK-3βmRNA与蛋白、Claudin5 mRNA与蛋白、Bax mRNA与蛋白、Bcl-2 mRNA与蛋白表达的作用趋势,有降低Wnt3a mRNA、β-catenin蛋白、LEF1 mRNA、APC mRNA与蛋白、Caspase-3 mRNA与蛋白表达以及Bax与Bcl-2表达比值的作用趋势。⑦透射电镜结果显示,模型组大鼠缺血半暗带脑组织神经元的细胞核溶解、双层核膜结构不连贯、细胞浆内细胞器溶解消失,胞浆呈空泡状,毛细血管壁层次增厚,内皮细胞、基底膜和胶质细胞之间的突起之间的间隙增宽,而五味开窍药能不同程度改善模型大鼠脑组织神经元和BBB的超微结构。
  结论:五味开窍药有促进pMCAO模型大鼠神经功能恢复、降低脑含水量及脑梗死率、减轻神经细胞损伤的作用,可能是开窍药发挥“开窍醒神”功效的主要药效学基础。五味开窍药的药效作用强弱依次为艾片>冰片>安息香>苏合香>天然冰片,提示临床在选用开窍药组方治疗脑缺血相关疾病时首推艾片。
  开窍药通过调节 Wnt/β-catenin信号通路、抑制细胞凋亡、促进微血管新生以及保护BBB而保护神经血管单元,这可能是其综合表达“开窍醒神”的主要生物学机制。五味开窍药的NVU保护机制聚类不同可能与开窍药的寒热药性差异有关。冰片、天然冰片的抑制细胞凋亡可能与其寒凉药性有关,而苏合香与安息香的促微血管新生及保护BBB可能与其温热药性有关。
  本研究以NVU为切入点探讨开窍药的脑保护作用及机制,研究思路具有中医药整体观特色,研究借助了RT-PCR、免疫印迹及免疫组化等分子生物学手段,并结合了透射电镜等光学成像技术,研究手段具有集成创新,研究结果提示艾片改善脑缺血药效最优,为临床有效合理使用开窍药提供了参考。
[硕士论文] 李文霞
动物学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:
  无菌动物(Germfree animals,GF)指无可检出一切生命体的动物,进一步说,是指用现有的检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。无菌动物具备以下几大特点:首先无菌动物可彻底排除背景微生物的干扰,无菌动物背景清晰,不携带任何活的微生物及寄生虫,用于构建菌群、菌株移植模型,可以彻底排除背景微生物的干扰;其次人体是由自身细胞和微生物细胞共同构成的“超级生物体”,无菌动物对于解析菌群宏基因组功能不可或缺。利用无菌动物技术“转入”(菌群移植)或“敲除”(无菌化)菌群,对于解析特定菌群宏基因组对疾病的影响尤为重要,犹如利用基因工程动物技术转入或敲除某一基因,对于解析该基因对疾病的贡献一样重要。
  随着高通量测序技术的发展,越来越多的科学家发现肠道菌群与诸多疾病发生存在必要关联,利用无菌小鼠制备菌群移植模型、悉生动物模型等能够更好地解析菌与人的关系,所以各研究单位对无菌小鼠的需求量出现逐年上升趋势,但国内现有的商品化无菌小鼠远远满足不了市场的需求。目前影响无菌小鼠培育进度的技术难点在于获得原代小鼠难、繁殖率低、无菌小鼠营养需求不详等因素。无菌小鼠的培育主要采用生物净化法,即剖腹产手术全子宫摘除,将仔鼠通过人工喂养的方式获得。能否成功喂养出无菌小鼠的关键在于有无适合无菌小鼠生长发育的营养配方饲料,包括哺乳期生长发育所需的奶制品以及生长繁殖期所需的饲料。而目前关于无菌小鼠营养需求相关研究相对较少,国际上针对无菌小鼠哺乳期及离乳后生长繁殖阶段均没有标准饲料,这极大地影响了大规模发展无菌小鼠培育工作进度。同时无菌小鼠为适应无菌环境,其生物学特性发生了巨大变化。因不能发酵食物中的多糖,盲肠变得膨大;为摄取更多的营养物资,其肠壁更薄、绒毛更长;无菌小鼠的免疫系统因缺乏微生物抗原刺激处于低发育水平;同时无菌动物基础代谢率更高、不易积累脂肪;其应激反应、行为学特征等均有异于常规动物。正常小鼠肠道菌群能够合成身体新陈代谢所需的B族维生素和维生素K,一般不会缺乏,而无菌小鼠肠道没有细菌,普通小鼠饲料里B族维生素和维生素K的含量满足不了无菌小鼠正常的生长繁殖需要,加之无菌小鼠饲料经高剂量辐照灭菌之后,部分营养成分损失严重。所以依据其生物学特征及生活环境提示无菌小鼠的营养需求异于普通小鼠,普通小鼠的饲料不适用于无菌小鼠的喂养。
  为了解决上述问题,本课题结合正常仔鼠哺乳期及生长繁殖阶段的生理生化指标及营养需求,最终配制出适合无菌小鼠哺乳期生长的人工配方奶和适合繁殖阶段生长的强化饲料,同时接种正常婴儿肠道菌群建立菌群移植模型,通过16s rDNA高通量测序分析,进一步验证了强化饲料与菌群移植模型的关系。
  方法:
  (1)依据小鼠鼠奶营养成分,对比婴儿奶粉组、人工配方奶组及正常对照组哺乳期KM小鼠张耳、睁眼、长毛等生长特性,统计离乳率,同时持续采集哺乳期乳鼠体重、尾长生长情况,对比小肠组织切片,运用统计学分析软件GraphPad Prism6.0分析小鼠血常规结果及血气理化指标,从而评价婴儿奶粉组、人工配方奶组及正常对照组组间差异。
  (2)依据实验动物小鼠纯化饲料标准AIN-93G,参照对比辐照消毒前后饲料中营养成分的损失程度,结合无菌小鼠体内不能合成维生素B族及维生素K的特点,配制成强化饲料。运用统计学分析软件SPSS19.0分析普通饲料组(实验1组)、强化饲料组(实验2组)及正常对照组生长阶段体重变化情况,性成熟后连续交配3次,统计分析小鼠受孕率、产仔及离乳数,随机抽取各组5只小鼠,对比其凝血四项指标及心脏组织切片,从而评价普通饲料组(实验1组)、强化饲料组(实验2组)及正常对照组的组间差异。
  (3)接种正常婴儿肠道菌群建立菌群移植模型小鼠,分别饲喂与宿主相同的婴儿奶粉和强化饲料,对菌群定植14天及28天的小鼠粪便进行16s rDNA高通量测序分析菌群相似度。
  结果:
  (1)婴儿奶粉组人工喂养137只乳鼠,离乳0只,人工配方奶组人工喂养124只乳鼠,成功离乳72只,离乳率58%。婴儿奶粉组与正常对照组体重尾长差异明显(P<0.01),人工配方奶饲喂无菌KM仔鼠其体重、尾长增长与正常对照组基本一致(P>0.05),红细胞计数、白细胞计数、血小板计数均无显著性差异(P>0.05),血液酸碱度无显著性差异(P>0.05),氧分压有显著性差异(P<0.05)。由此可见,人工配方奶能够基本满足无菌小鼠哺乳期的生长需求。
  (2)普通饲料组(实验1组)与正常对照组比较其3-6周龄体重增长存在显著性差异(P<0.05),而强化饲料组(实验2组)与正常对照组无明显差异(P>0.05)。到达性成熟后,普通饲料组(实验1组)受孕率、产仔离乳数存在显著性差异(P<0.05),强化饲料组(实验2组)与正常对照比其受孕率、产仔离乳数无统计学意义(P>0.05),强化饲料组(实验2组)凝血四项值无明显差异(P>0.05),普通饲料组(实验1组)小鼠心脏组织切片有少量出血点,提示该组小鼠出现病理性出血,普通饲料不能用于无菌KM小鼠喂养,而通过营养改良后的强化饲料能基本满足无菌KM小鼠生长繁殖需求。
  (3)菌群定植14天时,奶粉组婴儿肠道菌群模型小鼠在“目”水平,肠道菌梭菌目(Clostridiales)与杆菌目(Enterobacteriales)与婴儿粪便的梭菌目(Clostridiales)与杆菌目(Enterobacteriales)丰度相似。菌群定植28天时,婴儿肠道菌群模型小鼠饲料组与奶粉组肠道微生物菌落差异不明显,强化饲料适用于模型动物。
  结论:
  (1)人工配方奶能够基本满足无菌小鼠哺乳期生长的营养需求。
  (3)强化饲料的营养成分能基本满足无菌小鼠生长繁殖的营养需求。
  (3)强化饲料能够维持菌群移植模型小鼠的菌群多样性结构,适用于菌群移植模型。
[硕士论文] 万龙飞
临床医学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  ⑴在胚胎鼠跖骨血管生成实验基础上,引入外源性的内皮祖细胞(EPCs),建立一种新型体外血管生成模型。研究者可通过此实验模型直接观察EPCs对胚胎鼠跖骨血管生成的影响,并借助于此实验模型可以更好地筛选或反应不同实验目标对EPCs活性的促进或抑制作用。⑵探讨EPCs联合胚胎鼠跖骨血管形成实验模型中加入的EPCs的最适数量、模型的最适共培养时间。
  方法:
  ①分离、培养及扩增来源于6-8周龄的C57BL/6小鼠骨髓的内皮祖细胞(EPCs);②从孕17.5天C57BL/6小鼠中分离提取胚胎鼠,无菌条件下将胚胎鼠跖骨取出;③分别将数量为5×103、1×104、5×104、1×105的EPCs与胚胎鼠跖骨进行时间分别为12天、14天、16天的联合培养,并设空白对照组;④CD31对胚胎鼠跖骨周围芽生管样结构进行免疫染色;⑤用Image-Pro Plus6.0对免疫染色阳性结果图像区域进行量化;⑥SPSS17.0分析处理数据并进行统计学分析。
  结果:
  ⑴利用全骨髓贴壁法结合差时贴壁法可有效分离和扩增EPCs细胞。⑵EPCs联合胚胎鼠跖骨血管生成实验模型的最适共培养时间为14天。⑶EPCs联合胚胎鼠跖骨血管生成实验模型中加入的EPCs相对最适数量为5×104。
  结论:
  构建了EPCs联合胚胎鼠跖骨血管生成实验模型,并实现对EPCs活性进行定量检测。
[硕士论文] 王谷洋
肿瘤学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨应用DNA条形码标准序列对广西和云南树鼩群体进行分类鉴定的可行性,为树鼩种群的分类鉴别提供一个标准化的分子分类模式,也为后续建立高感染率的树鼩肝炎模型和培育优良品系提供可靠的遗传背景信息。
  方法:提取广西隆安和云南昆明树鼩种群共43只动物的全血基因组DNA,采用CO1基因作为条形码标记基因进行PCR扩增、产物纯化测序,结合Genbank数据库中下载的树鼩序列片段(海南亚种和普通树鼩),并通过MEGA等多种生物学软件来统计这4个树鼩种群的遗传学指标,如序列的长度、碱基组成、单倍型、保守位点、变异位点、简约信息位点、碱基替换、转换数与颠换数等,计算树鼩种群的种内遗传距离和种群之间的遗传距离,构建树鼩种群系统发育树进一步验证树鼩群体间的遗传差异。
  结果:1、PCR扩增和测序获得长度为638bp的CO1基因序列,无碱基插入或缺失,A、T、C、G四种碱基的平均含量分别占比为25.1%、29.3%、27.1%、18.5%,碱基A+T的平均含量明显高于碱基C+G的平均含量,有明显的A+T碱基偏倚现象,符合脊椎动物mtDNA碱基组成的特点。
  2、本实验树鼩种群归属于10个单倍型,其中隆安种群、昆明种群及海南亚种占9个单倍型,所有序列检测到保守位点470个,变异位点共168个,简约信息位点97个,碱基对转换数为31,颠换数为7,表明我国树鼩种群分化较多,种群资源丰富,具有遗传多样性。
  3、本研究的3个树鼩种群(隆安树鼩、昆明树鼩和海南亚种)种内遗传距离范围为0.00%-0.79%,中缅树鼩3个种群间的遗传距离在9.71%-13.59%之间,而它们与普通树鼩之间的遗传距离范围为20.43%-24.11%,种内遗传距离与种间遗传距离没有重叠区,存在明显的条形码间隔,表明DNA条形码能很好的鉴别不同地理类群的树鼩。
  4、系统发育树显示树鼩种群个体聚集趋势明显,同种不同个体分支长度较短,不同种群之间分支较长,同种不同个体都是先聚集到本种群的分支中,再与其它树鼩种群的支系聚集,证实了广西隆安树鼩与云南昆明树鼩是中缅树鼩的两个不同亚种群。
  结论:基于线粒体CO1基因的DNA条形码技术能有效用于树鼩种群的分类鉴定,本研究通过分析条形码在广西隆安树鼩和云南昆明树鼩的遗传差异证实了这两个群体为中缅树鼩的两个不同亚种群。
[硕士论文] 何林熹
中医诊断学 成都中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:采用持续15天慢性束缚法复合慢性疼痛刺激法建立失眠肝郁化火证大鼠模型,从动物宏观表征、生物学指标、“以方测证”三个方面进行模型检验。
  方法:筛选健康SD大鼠30只,随机分为空白组、模型组和治疗组,每组10只。模型组和治疗组大鼠采用慢性束缚法(限制性制动)复合慢性疼痛刺激法(夹尾刺激)连续造模15天。在造模及其行为学检测结束后,治疗组采用龙胆泻肝汤合朱砂安神丸连续灌胃治疗5天,模型组以等量纯净水灌胃。观察大鼠一般情况、体重及摄食量,检测大鼠24小时自发活动量,进行高架十字迷宫实验、旷场实验和鼠尾悬挂实验,检测蓝斑核NET平均光密度值和血浆NE含量。
  结果:
  ①一般情况:造模前各组大鼠睡眠良好,活动正常,反应敏捷,目光有神,目周及口唇呈粉红色,爪甲光滑,皮毛光亮色白,精神状态良好,抓取时反抗较剧;持续造模5天后,模型大鼠开始出现精神紧张,对外界反应敏感,毛发微有凌乱,束缚反抗剧烈但反应仍灵活;持续造模10天后,模型大鼠攻击性增强,易激惹,束缚时剧烈挣扎,耳尖微有干焦表现,鼻尖处黏膜及爪甲颜色暗红;持续造模15天后,模型大鼠精神高度紧张,稍有声响即成防御姿势,目光焦灼,毛发凌乱,缺乏光泽,相互撕咬及攻击次数明显增加,束缚及抓取时挣扎剧烈,叫声尖锐,具有攻击性,耳部轮廓处干焦,鼻尖黏膜及四肢指尖发红,大便微有稀溏。
  ②体重增加量:持续造模5天后,各组体重增加量的差异无统计学意义(P>0.05);持续造模10天后,与空白组相比较模型大鼠在此5天内的体重增加量明显减少(P<0.01),模型组与治疗组之间的差异无统计学意义(P>0.05);持续造模15天后,与空白组相比较模型鼠在此5天内的体重增加量明显降低(P<0.01),模型组与治疗组之间的差异无统计学意义(P>0.05);治疗结束后,与空白组相比较模型组大鼠在5天治疗期内的体重增加量明显降低(P<0.01),治疗组大鼠体重增加量明显提高(P<0.01),接近空白组水平(P>0.05)。
  ③摄食量:持续造模5天后,各组大鼠摄食量差异无统计学意义(P>0.05);持续造模10天后,与空白组相比较模型大鼠摄食量明显减少(P<0.01),模型组与治疗组之间的差异无统计学意义(P>0.05);持续造模15天后,与空白组相比较模型大鼠摄食量明显减少(P<0.01),模型组与治疗组之间的差异无统计学意义(P>0.05);治疗结束后,与空白组相比较模型组大鼠摄食量明显减少(P<0.01),治疗组大鼠摄食量明显提高(P<0.01),接近空白组水平(P>0.05)。
  ④24小时自发活动量:持续造模15天后,模型大鼠白天活动量明显增多(P<0.01),模型组与治疗组之间的差异无统计学意义(P>0.05),模型大鼠夜晚活动量略有减小,但组间差异无统计学意义(P>0.05);治疗结束后,模型组大鼠白天活动量明显增多(P<0.01),夜晚活动量呈下降趋势(P>0.05),治疗组大鼠白天活动量明显降低(P<0.05),接近空白组水平(P>0.05),夜晚活动量有所上升(P>0.05)。
  ⑤高架十字迷宫实验:持续造模15天后,模型大鼠高架十字迷宫实验 OE%值、OT%值明显降低(OE%:P<0.01;OT%:P<0.05),模型组与治疗组之间的差异无统计学意义(P>0.05);治疗结束后,模型组大鼠高架十字迷宫实验 OE%、OT%值明显降低(OE%:P<0.01;OT%:P<0.05),治疗组大鼠高架十字迷宫实验 OE%、OT%值明显升高(P<0.05),接近空白组水平(P>0.05)。
  ⑥旷场实验:持续造模15天,模型大鼠旷场实验中央格得分、垂直评分、修饰次数及粪便粒数均显著升高( P<0.05),模型组与治疗组之间的差异无统计学意义(P>0.05);治疗结束后,模型组大鼠中央格得分、垂直得分、修饰次数及粪便粒数均明显增多(P<0.05),治疗组大鼠中央格得分、垂直评分、修饰次数及粪便粒数均明显降低,( P<0.05),接近空白组水平(P>0.05)。
  ⑦鼠尾悬挂实验:持续造模15天,模型大鼠的鼠尾悬挂静止时间呈增长趋势,但三组大鼠的组间差异无统计学意义(P>0.05);治疗结束后,三组大鼠鼠尾悬挂静止时间的组间差异无统计学意义(P>0.05)。
  ⑧血浆NE含量:与空白组比较,模型组大鼠血浆NE含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,治疗组大鼠血浆NE含量明显降低(P<0.01),接近空白组水平(P>0.05)。
  ⑨蓝斑核NET平均光密度值:与空白组比较,模型组大鼠蓝斑核NET平均光密度值明显升高(P<0.01);与模型组比较,治疗组大鼠蓝斑核NET平均光密度值明显降低(P<0.05),接近空白组水平(P>0.05)。
  结论:
  ①宏观表征评价和生物学指标评价显示,持续15天慢性束缚(限制性制动)复合慢性疼痛刺激(夹尾刺激)造模法可以建立失眠肝郁化火证大鼠模型;
  ②采用龙胆泻肝汤合朱砂安神丸灌胃治疗,“以方测证”显示持续15天慢性束缚(限制性制动)复合慢性疼痛刺激(夹尾刺激)造模法可以建立失眠肝郁化火证大鼠模型。
[博士论文] 崔益强
人体解剖与组织胚胎学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:当前医学及生命科学研究中,动物模型是不可或缺的组成部分。生命科学研究中每一种模式动物研究的突破,为遗传学、分子生物学、发育生物学等研究领域带来了突破式的进展。随着科学研究的不断深入,人类对复杂生命现象的不断探索,以及人类面临的重大疾病(癌症,艾滋病,心脑血管疾病,神经性疾病等)的威胁,低等的动物模型已无法满足复杂的科学研究以及模拟人类重大疾病的需求。非人灵长类动物作为人类的近亲,具有与人类相似的免疫系统、神经系统以及代谢系统,是最理想的甚至是唯一的模型动物。许多灵长类动物的研究成果可直接应用于人类疾病的预测、预防、诊断和治疗,而这些方面一直是人类健康领域关注的焦点。目前,非人灵长类动物模型构建一直受到编辑效率低、操作困难等限制,这些困难成为制约非人灵长类动物模型研究的瓶颈。
  近年来,基因编辑技术领域发展迅速,新型基因编辑工具不断被开发,尤其是CRISPR/Cas9基因编辑系统的出现,使基因编辑技术进入了新的时代。目前基因工程定点基因编辑工具中,可设计目标序列的定点核酸内切酶主要有三种,即:ZFN(锌指核酸酶),TALEN(转录激活子样效应因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9)系统。其中CRISPR/Cas9系统,以其设计构建方便,敲除效率高,应用范围广等优势,被广泛应用于基因编辑研究中。因此,对CRISPR/Cas9技术的改造优化,并将其运用于构建非人灵长类动物基因编辑模型是生命科学所迫切需要的研究内容。
  本文综合运用CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对Nr0b1,Pparg-γ,Rag1三个基因共设计5个sgRNA,其中Nr0b1与早期性腺发育相关,Pparg-γ与脂肪代谢相关,Rag1与免疫系统相关。通过对食蟹猴受精卵一细胞时期显微注射Cas9 mRNA与sgRNA的混合体系,移植入代孕猴,成功构建定点基因敲除猴。通过对流产猴配子的基因鉴定,确认CRISPR/Cas9引入的基因编辑可以传递于配子,提示该基因编辑可以传递给子代。接着,针对食蟹猴Oct4(Pou5f1)基因3'UTR区设计sgRNA,并构建同源重组质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm,通过对食蟹猴受精卵显微注射Cas9 mRNA、sgRNA与供体质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm混合体系,移植入代孕猴,利用细胞同源重组修复机制,将外源hrGFP定点插入目的基因Oct4的3'UTR区,成功获得定点基因敲入食蟹猴。
  在研究基因缺陷导致的疾病中,除基因缺失而直接影响基因表达以外,大数据的筛查结果显示,许多单核苷酸改变的多态性或突变位点,或者短的碱基插入删除(Indel)也与多种疾病关联。为了很好地模拟人类疾病的这类遗传学改变,以及模拟该类致病突变位点的修复。本文利用单拷贝BFP基因的293T细胞系作为研究工具,优化ssODN的设计方法。针对BFP与GFP差异位点附近设计不同的ssODN和sgRNA,利用重组后细胞荧光的比例来判断重组效率。通过综合比较不同的设计的ssODN,以及ssODN与sgRNA的不同位置组合,发现利用互补链ssODN并且突变位点位于切口位置3'方向时,重组率相对较高。随后,利用CRISPR/Cas9系统,结合单链寡核苷酸供体(ssODN)进行小鼠胚胎共注射,利用ssODN作为同源重组模板,进行同源重组修复,成功构建了Usp42,Cep41,Fbxo47三个定点突变小鼠模型,为非人灵长类动物模型基于ssODN的基因编辑奠定了基础。
  本研究将CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于非人灵长类动物——食蟹猴,结合显微注射技术,成功构建出定点基因编辑食蟹猴。通过对阳性流产猴配子的基因鉴定,提示CRISPR/Cas9技术产生的基因编辑在食蟹猴中可以传递给子代。利用CRISPR/Cas9技术结合同源重组技术,获得了定点基因敲入食蟹猴。并利用细胞系和小鼠模型进一步优化了以ssODN作为同源重组模板进行点突变模型构建中的设计方案,根据ssODN与sgRNA相对位置的不同设计分组实验,发现ssODN的设计以及与sgRNA相对位置与重组效率有关,为进一步在灵长类模型的应用奠定了很好的基础。
[硕士论文] 李林鹏
临床医学(外科学) 南华大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过“股静脉缩窄、属支置管并注入凝血酶”的方法,构建犬深静脉血栓形成慢性期模型。动态研究观察血栓的演变过程,为深静脉血栓形成慢性期的研究提供一种可选择的动物模型。
  方法:9只成年杂种犬,任选一侧后肢为实验侧,模拟临床髂静脉受压,通过可吸收羊肠线将该侧股静脉管腔面积缩窄90%;另一侧作为对照。于缩窄股静脉的远心端属支静脉插入1根导管,注射凝血酶300U,并阻断血流1h,留置该导管作为静脉造影通路。观察犬术后后肢一般情况、静脉侧支、凝血功能、D-二聚体指标的变化。在术后1、7、14、21、28d行静脉顺行造影了解血栓及侧支情况。并做病理学检查。
  结果:9只犬中有8只完成造模,模型成功率为88.9%。造模后均出现跛行、后肢皮温升高、皮肤青紫、静脉曲张等症状。术后14 d犬实验侧髌骨上8 cm的腿围达到最大值(p<0.05),整个过程无后肢坏死情况。犬的D-二聚体、纤维蛋白原检测:术后1、7、14、21、28d均高于术前(p<0.05),且术后14d明显高于术后1、7、21、28d(p<0.05)。犬的凝血酶原时间:术前高于术后1、7、14、21、28d(p<0.05),术后14d明显低于术后1、7、21、28d(p<0.05)。与对照侧比较,术后静脉造影显示静脉血栓形成;并且术后14d静脉造影显示静脉侧支十分丰富。HE染色:术后1d血栓显示淡红色无结构分支状或不规则珊瑚状的血小板小梁及充满小梁纤维蛋白网眼的血细胞,血小板小梁边缘附着较多中性粒细胞。术后28d血栓显示脉壁与血栓分界不清,静脉内膜增生,内膜充满了由纤维组织、炎性细胞及新生毛细血管构成的肉芽组织;血栓呈机化、再通状态。
  结论:运用“股静脉缩窄、属支置管并注入凝血酶”的方法构建深静脉血栓慢性期模型具有可靠、稳定、良好可重复性等优点;置入的静脉导管通畅率高。该模型可用于深静脉血栓形成慢性期的临床治疗及影像诊断等方面的研究。
[硕士论文] 石振庆
生物工程 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)是指由外部因素作用于头部导致的中枢神经系统缺损性疾病,具有高发病率、高致死率和高致残率等特点,给社会和家庭带来沉重负担,寻找积极有效的治疗方法是目前亟待解决的问题。干细胞替代疗法给 TBI治疗提供了新的策略和希望,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)来源于人脐带沃顿胶组织,具有无伦理学争议,来源广泛,多向分化潜能、低免疫原性等特点,是组织工程良好的种子细胞。然而移植后成活率低、数量不足等问题仍然制约着干细胞移植的应用。因此,提供适合移植干细胞生长与存活的微环境对于提高干细胞生物学活性和治疗效果至关重要。
  藻酸盐(sodium alginate,SA)水凝胶组织工程支架具有三维网络结构,与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)具有天然相似性,可为细胞生长提供立体支撑,且为细胞的气体交换、营养输送及其新陈代谢产物的排出提供良好的传输通道。透明质酸(hyaluronan,HA)作为天然细胞外基质的主要成分之一,可与干细胞表面特异性受体结合,促进干细胞的增殖、粘附,帮助信号传导,调控细胞分化。因此,本课题通过构建SA/HA组织工程支架,联合hUC-MSCs研究对创伤性脑损伤模型鼠的治疗作用。
  目的
  本实验利用组织工程技术体外构建SA/HA复合功能支架,并对其物化性能等进行表征,对包载hUC-MSCs的SA/HA水凝胶支架进行生物学评价,以提供更适合hUC-MSCs生存的微环境;在体内实验中,探究hUC-MSCs联合SA/HA水凝胶支架对 TBI大鼠的神经修复作用及其可能的作用机制,以期为干细胞移植治疗TBI提供新的策略和方法。
  方法
  1体外实验研究SA/HA水凝胶支架与hUC-MSCs相容性评价
  通过内部凝胶法制备4组不同配比的藻酸盐水凝胶,分别为1%-0.8、1%-0.5、0.5%-0.5、0.5%-0.2;扫描电子显微镜(SEM)进行水凝胶形貌表征;试管倾斜法检测不同配比的凝胶时间;冷冻干燥及称重法测定不同配比的含水率及降解性能;流变仪检测不同配比的弹性模量;流式细胞仪检测 hUC-MSCs的表面标记物;通过添加一定比例的透明质酸,SA与HA浓度比分别为4:1(S4H1)、2:1(S2H1),构建不同配比SA/HA水凝胶支架,包载hUC-MSCs,共分三组,分别为单独 SA组、S4H1组、S2H1组;通过激光共聚焦显微镜观察 hUC-MSCs在水凝胶中三维分布;Live-Dead染色法检测干细胞在不同分组中的存活;CCK-8检测不同分组中干细胞的增殖情况。
  2体内实验研究SA/HA水凝胶支架联合hUC-MSCs对TBI大鼠的神经修复作用
  采用落体撞击法(Feeney's weight-drop)构建大鼠创伤性脑损伤模型,随机分为NaCl组、scaffold组、hUC-MSCs组和scaffold+ hUC-MSCs组。CV染色观察大鼠脑缺损情况;mNSS评分评估大鼠运动功能恢复;Morris水迷宫法检测大鼠的学习记忆能力;取出大鼠脑组织,做冰冻切片;免疫组化检测脑内hUC-MSCs的存活和迁移;免疫荧光检测神经元标记物β-III Tubulin和细胞增殖Ki67的阳性表达;提取损伤侧脑组织蛋白和RNA,Western Blot、qRT-PCR检测组织神经分化相关蛋白和基因(NSE、NEUN、MAP2)的表达,神经营养因子 BDNF、NGF、NT3的表达变化,细胞凋亡相关蛋白Bcl2的表达。
  结果
  1、通过内部凝胶法制备的藻酸盐水凝胶外观呈半透明状,外形可根据所用模具的不同任意塑性;通过SEM表征结果显示,水凝胶内部呈三维多孔网络结构。凝胶时间、含水率、降解率随着SA浓度、f值的减小而呈上升趋势,弹性模量随着 SA浓度、f值的减小而下降。通过添加适当比例透明质酸,检测hUC-MSCs在水凝胶中的活性发现,与SA组相比,S4H1、S2H1组中细胞存活率提高(P<0.05)、细胞增殖能力上升(P<0.05),且与HA浓度呈正相关。
  2、通过落体撞击法成功构建大鼠脑创伤模型;mNSS评分评估发现,治疗组运动功能恢复显著(P<0.05);hUC-MSCs组和scaffold+hUC-MSCs组均能改善大鼠学习记忆能力,且联合组效果更加显著(P<0.05);hUC-MSCs联合支架可减少干细胞于病灶部位的流失,显著增加损伤部位移植的细胞数目(P<0.05);治疗组中β-III Tubulin和Ki67表达增加;损伤侧脑组织中,NSE、NEUN、MAP2、BDNF、Bcl2蛋白表达上升(P<0.05),NEUN、MAP2、BDNF、NGF、NT3基因表达水平提高(P<0.05),且联合组效果更加明显。
  结论
  1、内部凝胶法可制备任意塑形的可注射性藻酸盐水凝胶,通过调整海藻酸钠浓度、f值的配比,可调控水凝胶的理化性质。
  2、藻酸盐水凝胶支架可为hUC-MSCs生长提供三维立体支撑,添加透明质酸后,藻酸盐/透明质酸复合水凝胶可增加细胞活性,提高细胞增殖能力,为hUC-MSCs提供良好的生存微环境。
  3、与单独hUC-MSCs治疗组相比,SA/HA水凝胶联合hUC-MSCs移植可明显改善 TBI大鼠的运动功能和学习记忆能力,减少病灶部位干细胞的流失,提高损伤部位神经细胞的再生和神经营养因子的表达,从而改善 hUC-MSCs移殖对TBI大鼠的神经修复作用。
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