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[博士论文] 宋晓雯
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:DNA甲基化胞嘧啶作为一种重要的表观遗传修饰,广泛存在于绝大多数真核生物中,可参与调节多种重要的生物学过程,包括胚胎发育,X染色体失活,基因印迹,基因选择性拼接及癌症发生等等。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,利用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序技术(BS-seq),越来越多物种单碱基分辨率全基因组甲基化图谱得到破译,了解甲基化胞嘧啶位点在生物体基因组的具体分布规律及特点将有助于进一步探究其生物学功能。赤拟谷盗作为一种重要的模式生物,其全基因组序列已于2008年获得破译,由于其具备高效RNAi效率,被广泛用于生命科学研究的各个领域,是研究基因功能的良好材料。由于赤拟谷盗基因组仅含有两种甲基化转移酶DNMT1,DNMT2,缺失从头甲基化转移酶DNMT3,因此关于其基因组是否含有甲基化胞嘧啶位点,至今尚未定论,那么赤拟谷盗基因组是否含有甲基化胞嘧啶位点?若有,其具体分布规律及特点是怎样的?它的具体形成机制及作用机制是什么?最重要的是,它在赤拟谷盗正常生命发育过程中发挥怎样的生物学功能?针对以上问题,本研究首先利用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序技术(BS-seq),获得了赤拟谷盗不同生命发育时期单碱基分辨率全基因组甲基化图谱,证实了甲基化胞嘧啶位点的存在,分析了其在基因组具体分布规律,同时结合RNA-seq,探究赤拟谷盗甲基化位点对基因表达调控作用。随后鉴定赤拟谷盗体内甲基化转移酶,利用RNAi技术,电泳凝胶迁移率实验及BSP技术,阐明赤拟谷盗甲基化胞嘧啶位点具体形成机制及其生物学功能,最后鉴定赤拟谷盗甲基DNA结合蛋白,利用RNAi,体外重组蛋白表达及电泳凝胶迁移率实验探究了赤拟谷盗DNA甲基化发挥作用的具体机制。
  研究结果表明赤拟谷盗不同生命发育时期包括卵,幼虫,蛹及成虫,均含有甲基化胞嘧啶位点,但数量较少,约占基因组胞嘧啶位点总数0.1%-0.2%,且随着生命发育的成熟,基因组甲基化水平呈上升趋势。赤拟谷盗基因组中含有两种类型甲基化胞嘧啶位点:大量的非CpG甲基化位点及少量的对称分布的CpG甲基化位点。非CpG甲基化位点在基因组中占主导地位,其中又以CpA甲基化位点居多,集中分布在基因间区,内含子区域,重复子序列远离基因主体区域分布,基因主体区域非CpG位点甲基化水平对于基因表达起负调控作用。而少量的对称分布CpG甲基化位点,其分布规律遵循真核生物甲基化组一般特点,甲基化CpG位点集中分布在基因主体区域,对基因表达起正调控作用。赤拟谷盗不同发育时期甲基化图谱高度相关,仅存在少量不同甲基化区域(DMR),对DMR区域基因进行功能注释,结果显示与生殖,发育,转录等相关众多的关键基因均存在于DMR区域,暗示赤拟谷盗DNA甲基化对于其生命周期转换起着十分重要的调控作用。
  赤拟谷盗这种新颖的甲基化分布形式是如何建立的呢?本研究随后鉴定并克隆赤拟谷盗甲基化转移酶基因并探究其具体作用机制,结果发现赤拟谷盗体内含有两种甲基化转移酶基因Tcdnmt1,Tcdnmt2,Tcdnmt1含有两种选择性拼接本,Tcdnmt1a,Tcdnmt1b,缺失从头甲基化转移酶基因dnmt3,保守功能结构域分析结果表明Tcdnmt1a含有与其他物种一致功能结构域包括N端调节结构域及C端催化结构域,而Tcdnmt1b缺失了C端催化结构域,该功能域主要负责催化甲基化胞嘧啶位点的形成,这一区域缺失暗示TcDNMT1b可能丧失催化甲基化胞嘧啶形成的能力。Tcdnmt2含有与其他物种一致保守功能结构域,暗示其可能具备与其他物种一致保守的生物学功能。与此相一致,甲基化转移酶体外催化活力检测实验发现,TcDNMT1a,TcDNMT1b均能够特异性结合CpG位点,但仅有TcDNMT1a能够特异性催化半甲基化CpG位点的甲基化,说明其具备维持甲基化转移酶功能,而TcDNMT1b丧失了催化甲基化CpG位点形成的能力。TcDNMT2不能结合DNA底物,暗示其不能参与赤拟谷盗DNA甲基化形成,可能负责基因组tRNA甲基化,当然这有待于进一步探究。利用RNAi技术,敲减甲基化转移酶基因在体内表达,发现Tcdnmt1a缺失造成赤拟谷盗变态发育缺陷及胚胎致死,而Tcdnmt1b,Tcdnmt2缺失对赤拟谷盗正常生命发育无明显影响,暗示DNA甲基化对于赤拟谷盗变态发育及早期胚胎发育具有十分重要的调控作用,此外,Tcdnmt1a敲减后,赤拟谷盗体内CpG甲基化位点甲基化水平发生明显降低,而Tcdnmt1b,Tcdnmt2敲减后对此无影响,体内证据进一步支持赤拟谷盗TcDNMT1a负责CpG位点的甲基化。而对于其体内广泛存在的非CpG甲基化位点,可能存在一种新颖甲基化转移酶负责该类型甲基化位点的形成。
  赤拟谷盗这种新颖的甲基化分布形式是如何发挥生物学功能的呢?甲基DNA结合蛋白作为表观遗传系统重要调控因子,其能够特异性结合CpG甲基化位点,同时结合下游组蛋白复合物,通过改变染色质构像,基因印迹,激活或者抑制基因表达,从而将DNA甲基化编码遗传信息转化为相应的生物学功能。本研究鉴定赤拟谷盗编码甲基DNA结合蛋白基因Tcmbd2/3,该基因与人类mbd2,mbd3高度同源,保守功能结构域分析结果表明,该蛋白含有MBD_a,MBD_c功能结构域,这两个功能结构域主要负责与核小体重塑及组蛋白脱乙酰化酶复合物(NuRD)互作,而缺失部分甲基DNA结合功能域(MBD),这一功能域主要负责与甲基化CpG位点结合,该区域缺失,暗示TcMBD2/3丧失结合甲基化CpG位点的能力,利用RNAi技术敲减该基因在赤拟谷盗体内表达发现,Tcmbd2/3缺失造成了一系列致死表型,包括中期幼虫蜕皮停滞,晚期幼虫变态失败,蛹形态异常,不能羽化为成虫,最有趣发现是Tcmbd2/3缺失成虫表现出严重神经缺陷包括自主运动能力逐渐丧失,下降的食量及体重等等,此外,Tcmbd2/3缺失雌虫丧失了产卵能力。利用电泳凝胶迁移率实验检测TcMBD2/3蛋白对CpG及非CpG甲基化位点结合能力,结果发现,TcMBD2/3与两者均无结合,说明赤拟谷盗仅存少量的对称分布CpG甲基化位点不需要通过TcMBD2/3发挥生物学功能,而大量非CpG甲基化位点可能通过其他蛋白因子发挥生物学功能,这有待于进一步研究。
  本研究首次鉴定赤拟谷盗不同生命发育时期单碱基分辨率全基因组甲基化图谱,证实赤拟谷盗基因组甲基化胞嘧啶位点的存在,并阐明其具体分布规律及特点,同时鉴定其体内甲基化转移酶及甲基DNA结合蛋白,通过探究其具体生物学功能,揭示了赤拟谷盗甲基化胞嘧啶位点形成机制,作用机制及生物学功能。
[硕士论文] 李贝贝
农业昆虫与害虫防治 河南农业大学 2018(学位年度)
摘要:DNA甲基化(DNA methylation)是一种广泛的表观遗传修饰,对于调控生物体的表型可塑性(phenotypic plasticity)方面发挥了重要的功能。飞蝗Locusta migratoria具有典型的多型性特征,表现出依赖密度变化的群居型和散居型,是研究表型可塑性的表观遗传机制的理想模型。欧洲熊蜂Bombus terrestris是一种具有重要经济价值和生态价值的社会性昆虫,具有典型的级型分化特征,工蜂之间也存在生殖可塑性。在本研究中,以飞蝗和欧洲熊蜂作为研究材料,利用生物信息学和分子生物学方法,鉴定了DNA甲基化相关酶基因并分析了这些基因的表达模式,进一步利用CRISPR/Cas9系统构建了飞蝗中甲基转移酶DNMT1的突变体品系。
  鉴定了飞蝗中两个甲基转移酶(DNMT1和DNMT3)以及一个去甲基化酶(TET2)基因,并分析了它们在飞蝗不同发育阶段和成虫不同组织中的表达模式。结果发现,DNMT1和TET2基因在飞蝗的卵期具有较高的表达量;DNMT1在飞蝗成虫的卵巢和精巢中表现出较高的相对表达水平;DNMT3在成虫中表现出性别特异的表达模式;TET2在飞蝗成虫触角和脑组织中呈高表达水平。此外,利用CRISPR/Cas9系统构建了飞蝗DNMT1突变品系,为研究飞蝗DNA甲基化的功能以及两型转变的表观遗传机制奠定了基础。
  在欧洲熊蜂B.terrestris中,系统地鉴定了DNA甲基化相关酶基因,发现它和其他社会性昆虫相似,具有完整的DNA甲基化相关酶系统。并发现欧洲熊蜂中DNA甲基化相关酶基因表现出级型特异的表达模式,但这些基因在有王工蜂和无王工蜂中的相对表达水平没有明显差异。这些结果表明DNA甲基化可能对于欧洲熊蜂的级型分化具有重要调控功能,为揭示社会性昆虫表型可塑性以及社会性进化提供了重要参考。
[硕士论文] 刘霞
农业昆虫与害虫防治 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:蝇蛹俑小蜂Spalangia endius Walker又名东方实蝇蛹俑小蜂,隶属膜翅目的金小蜂科 Pteromalidae。该蜂是一种重要的蛹期单寄生蜂,能寄生多种双翅目昆虫。本文以瓜实蝇Bactrocera cucurbitae为寄主,研究了不同温度以及在最适宜温度下的不同寄主对蝇蛹俑小蜂生长发育和繁殖的影响。同时研究了蝇蛹俑小蜂的卵巢的发育,外生殖器及其感器,以及求偶行为、交配行为和产卵行为。主要研究结果如下:
  1、通过观察蝇蛹俑小蜂卵巢发育情况。结果表明,蝇蛹俑小蜂属于卵育型(Syno vige ny)寄生蜂。蝇蛹俑小蜂内生殖系统由1对卵巢、1对侧输卵管、中输卵管、受精囊、受精囊腺等组成,羽化后卵巢迅速发育,卵巢指数从0.34mm2增大到0.48mm2,卵粒数从37.67增加到42.67。雌蜂发育4 d后,卵巢逐渐萎缩,卵巢指数、卵粒数减少。本研究得出2日龄雌蜂繁殖力最强。
  2、为分析蝇蛹俑小蜂成虫的产卵器和交配器上,与交配行为和产卵行为相关的感受器类型,采用扫描电镜对蝇蛹俑小蜂成虫产卵器与交配器的结构进行观察。蝇蛹俑小蜂雄蜂的交配器上发现4种感器:火山形感器(VS)、浅凹状感器(SD)、栓锥形感器(SS)、钟形感器(CAS);蝇蛹俑小蜂的产卵器上发现5种感器:刺形感器(CS)、火山形感器(VS)、浅凹状感器(SD)、毛形感器1(TS1)、毛形感器2(TS2)。
  3、在26℃,相对湿度60%-70%的实验室条件下,研究了蝇蛹俑小蜂的求偶、交配与产卵行为。蝇蛹俑小蜂求偶、交配过程大致分为5个阶段:寻找和追逐,定位雌蜂,求偶,交尾,休息或继续求偶;交配后开始产卵,产卵过程大致分为定位寄主和寄主检验、产卵器穿刺和产卵、产卵结束和梳理。
  4、研究了不同温度(16,20,24,26,28和32℃)对蝇蛹俑小蜂生长发育和繁殖的影响。结果表明,蝇蛹俑小蜂的发育历期从32℃的22.9d到16℃的109.45d。蝇蛹俑小蜂完成一代的发育起点温度和有效积温分别为5.24℃和417.03DD。在16℃时雌雄蜂寿命最长,分别为46.9d和38d,32℃时的雌雄蜂寿命最短,分别为9.4d和8.4d。26℃的产卵量最大,在26℃和28℃下的内禀增长率较大,分别为0.1389和0.1408。在24℃和26℃时的净生殖率较大,分别为35.38和31.75。可以认为蝇蛹俑小蜂生长发育与繁殖的最适温度为26℃,综合发育历期以及成虫寿命,可以认为蝇蛹俑小蜂生长发育与繁殖的最适温度为26℃。
  5、考察了三种不同寄主对蝇蛹俑小蜂生长发育的影响。结果表明:用橘小实蝇蛹繁殖蝇蛹俑小蜂时,发育历期最长为30.9d。在三种实蝇中,瓜实蝇繁殖的卵期最长,为1.49d;南瓜实蝇繁殖的幼虫期最长,为10.81d;橘小实蝇繁殖的蛹期最长,为9.69d。三种蛹繁殖的蝇蛹俑小蜂雌雄蜂成虫寿命和子代雌性比差异不显著,雌蜂都在12.1d以上,雄蜂都在11d以上,子代雌性比都达到了0.68以上。在3种实蝇上都是羽化当天可产卵,第二天均为产卵高峰。蝇蛹俑小蜂在瓜实蝇、橘小实蝇、南瓜实蝇的内禀增长率分别为0.1454,0.1273和0.1513,在南瓜实蝇蛹上的净生殖率最大,为37.96,其次是瓜实蝇蛹,为32.25,最小的为橘小实蝇蛹,只有23。周限增长率瓜实蝇和南瓜实蝇差异不显著,分别为1.1565和1.1634,橘小实蝇略小,为1.1358。三种实蝇的世代平均历期差异不显著,均为24d。
[硕士论文] 莫文洲
农业昆虫与害虫防治 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:尼泊尔果蝇(D.nepalensis)和三黄果蝇(Drosophila trilutea)是takahashii物种亚群中的两个近缘种。它们除了翅斑上有区别外,外部形态及雄性外生殖器等特征没有区别,D.nepalensis具有翅斑,而D.trilutea不具翅斑。为了解这两个近缘种的物种分化程度,尤其是翅斑在性选择中所扮演的角色,本论文基于杂交和回交实验了解了杂交后代的可育性、翅斑大小和性比;以配偶选择实验判断性选择在两个物种中的存在情况;录制大量求偶视频,观察并分析这两个近缘种的求偶行为及其行为要素;分析求偶歌的类型及参数;并探讨翅斑与求偶中“伸展双翅”行为之间的关系及其在性选择中的意义性选择。获得如下实验结果。
  1)求偶高峰、杂交、回交及其后代翅斑大小:D.nepalensis和D.trilutea羽化后第2天开始观察到求偶行为,到第6天出现求偶高峰。杂交和回交结果显示,D.nepalensis雌蝇与D.trilutea雄蝇杂交可产生可育的F1雌蝇,不育的F1雄蝇。F1雄蝇翅斑显著小于母本雄蝇,回交后代雄蝇翅斑小于母本雄蝇,但没有显著性差异。而D.trilutea雌蝇与D.nepalensis雄蝇存在明显的交配前隔离,无法达成交配。
  2)性选择及翅斑的影响:配偶选择和翅斑改造实验结果显示,攀爬前和攀爬后均为雌蝇选择占主导。对于没有翅斑的D.trilutea雄蝇,人工添加翅斑后雄蝇与同种雌蝇的交配成功率明显低于无处理组,显示D.trilutea雌蝇与D.nepalensis雄蝇杂交时所存在的强烈交配前隔离现象可能很大程度上由D.nepalensis雄蝇上的翅斑所致。
  3)求偶行为:不具翅斑的D.trilutea及具有翅斑的D.nepalensis具有相似的求偶行为程序,均展示出定向(orientation)、触碰(tapping)、跟随(following)、振动单翅(wing vibration)、环绕(circling)、双翅剪刀式运动(scissoring)+身体摆动(body swing)的伸展双翅(wings display)、尝试攀爬(attemptto mount)等行为要素。两者明显不同的是“伸展双翅”行为要素:不具翅斑的D.trilutea以大幅度摆动双翅(<90-180°),而具有翅斑的D.nepalensis以小幅度摆动双翅(>90-180°),导致单位时间内的摆动次数比D.trilutea多,具有更多机会向雌蝇展示翅斑。
  4)求偶歌分析结果显示,两个物种均产生不连续的脉冲歌和连续的脉冲歌。D.trilutea产生的不连续脉冲歌因脉冲长度(pulselength,PL)不同分为两种,连续脉冲歌因脉冲内循环波数(cycle number,CN)不同也分两种,共有四种脉冲歌。D.nepalensis则分别只产生一种PL较长的不连续脉冲歌和一种CN较多的连续脉冲歌。
  5)翅斑与求偶中“伸展双翅”行为要素之间的关系及其在性选择中的意义:求偶中,具有翅斑的D.nepalensis雄蝇对雌蝇展示的小幅度频繁的“伸展双翅”行为,对于不具翅斑的D.trilutea雌蝇是一种负面的行为。对于翅斑消失的D.trilutea虽然仍具“伸展双翅”的行为,但展示这种行为的个体数量降低,且伴随着大幅度慢速的“伸展双翅”行为。D.trilutea的“伸展双翅”行为可能伴随着翅斑消失在进化中正在改变并慢慢丢失。对于D.nepalensis,翅斑所伴随的是快速小幅度的“伸展双翅”行为,展示该行为的个体数较高,但它并不是必须的,在求偶中它可能是居于求偶歌之下的备选策略。另外,当求偶时有竞争对手的情形下,展示“伸展双翅”的求偶成果往往容易被其他雄蝇所窃取,翅斑可能给予D.nepalensis雄蝇在种内或种间竞争中的优势,从而获得交配的权利。
  本论文所获得的研究成果为解析近缘种的物种形成机制以及翅斑和“伸展双翅”求偶要素在性选择中的作用提供了新的数据,在物种形成和进化遗传学研究中具有重要的意义。
[硕士论文] 陶霞芳
生物学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子广泛存在于动物、植物及真菌中,组成了一个庞大的转录因子超家族,对生物的生长发育起着重要的调控作用。动物bHLH转录因子按照功能特性分为45个家族,同时根据所结合的目标DNA元件和自身结构特点将45个家族分为A、B、C、D、E和F六个高阶组;其中A组22个家族、B组12个家族、C组7个家族、D组1个家族、E组2个家族以及F组1个家族。
  黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)是鳞翅目斑蝶属的模式种,是地球上唯一一种迁徙性蝴蝶,对黑脉金斑蝶基因表达模式的研究具有重要意义与价值。分析与鉴定黑脉金斑蝶中具有哪些 bHLH转录因子家族成员有助于对其迁徙行为以及昼夜节律响应等开展进一步研究。本文采用Blast搜索、多序列比对和系统发生分析等生物信息学手段对黑脉金斑蝶的bHLH转录因子进行鉴定和分类,并将其与其它昆虫的bHLH家族成员进行比较与分析,获得如下结果:
  1、从黑脉金斑蝶基因组中成功鉴定出55个bHLH家族成员,并将其归入40个基因家族和6个高阶组;其成员分别为A组26个,B组10个,C组11个,D组1个,E组6个以及F组1个;通过分析黑脉金斑蝶bHLH蛋白的特殊结构域,发现其成员符合动物各高阶组bHLH蛋白结构域的特征。
  2、在鉴定出的55个黑脉金斑蝶bHLH家族成员中,49个成员在GenBank蛋白序列数据库中有对应的蛋白质序列,其中24条的注释与我们的分类结果一致,8条与我们的分类结果不一致,17条注释为假定蛋白;因此,本研究为修订25条及新增6条新的黑脉金斑蝶bHLH蛋白注释信息提供了有用资料。
  3、黑脉金斑蝶在E12/E47、MyoD、Twist和Hand家族中分别具有2个成员,其它昆虫一般只有1个成员。黑脉金斑蝶具有3个AHR家族成员,其它昆虫一般只有2个成员。上述五个家族成员的bHLH基因分别在调控肌肉、心脏、气管的发育中发挥作用,意味着黑脉金斑蝶为了适应长距离迁徙很可能演化出了特殊的发育调控机理。
  4、本文还详细调查了14种昆虫bHLH基序编码区内含子的分布情况,得到了昆虫bHLH基序编码区内含子分布的总体特征,即:昆虫B组bHLH基序编码区分别与A、C、E和F组共同拥有某种内含子结构,说明其它组的bHLH编码区均不同程度地继承了B组的内含子结构;只有A组bHLH在螺旋1区存在内含子,这些内含子很可能是昆虫为了创造新的bHLH基因而插入的。
  上述研究结果不仅为进一步研究 bHLH转录因子在黑脉金斑蝶生长发育中的调控机理建立了良好基础,也为比较分析不同昆虫 bHLH基因的结构与功能以及探讨昆虫bHLH基因结构的演化机理积累了有用资料。
[硕士论文] 吴榴宇
生态学 南昌大学 2017(学位年度)
摘要:竹纹枯叶蛾和青黄枯叶蛾是鳞翅目枯叶蛾科纹枯叶蛾属和黄枯叶蛾属昆虫,其幼虫取食重要经济植物,是重要的经济害虫。目前有关两种枯叶蛾的研究主要集中于形态学和生物学方面。本研究利用 PCR和测序技术测得两种枯叶蛾线粒体基因组全序列,分析其基因结构、组成、排列等特征;基于竹纹枯叶蛾、青黄枯叶蛾以及35种现有鳞翅目昆虫线粒体基因组蛋白质编码基因的氨基酸、核苷酸序列和2个rRNA基因序列建立系统树。结论如下:
  1.竹纹枯叶蛾和青黄枯叶蛾的线粒体基因组全长分别为15,368bp和15,281bp,登录号(GenBank accession number)为KU870700和KU884483,AT含量为80.19%和80.87%。两者都具有37个基因(13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因)和1个AT富集区。两种枯叶蛾的tRNA基因的前三个的排列方式典型tRNAMet-tRNAIle-tRNAGln位于AT富集区和ND2之间,剩余基因的排列则与其它昆虫一致。两种枯叶蛾线粒体基因组分别存在18和11个基因间隔区(总长为192bp和149bp),9和12个基因重叠区(总长为26bp和49bp)。两种枯叶蛾的间隔区长度波动较大,相对于重叠区,间隔区的长度较长,而最大间隔区(70bp和54bp)都是位于tRNAGln和ND2之间,且最长的重叠区也都是位于tRNALeu(UCN)和16S rRNA之间。
  2.竹纹枯叶蛾和青黄枯叶蛾线粒体蛋白质编码基因除COI以CGA为起始密码子外,其余 PCGs则以 ATN(ATA、ATC、ATG、ATT)为起始密码子,而终止密码子为TAA或者单独T碱基。两种枯叶蛾都有13个蛋白质编码基因,总长分别11,213bp和11,211bp,AT含量为78.72%和79.40%,分别编码3,726和3,727个氨基酸。两种枯叶蛾的密码子使用频率最高的分别是UUU(F)、AUU(I)和UUA(L),相应的三种氨基酸(Phe、Ile和Leu)编码数量也最多,而Cys数量是最少的。
  3.竹纹枯叶蛾和青黄枯叶蛾的线粒体 tRNA基因总长为1,468bp和1,t452bp,AT含量都在81%上下波动,基因长度为60-70bp。除tRNASer(AGN)缺失二氢尿嘧啶臂,其它tRNA基因都形成典型的三叶草结构。两种枯叶蛾线粒体基因组tRNA中分别出现了20和16处碱基错配(U-G),分别出现在二氢尿嘧啶臂、反义密码子臂、氨基酸接受臂和TΨC臂上。两种枯叶蛾线粒体的16S rRNA和12S rRNA长度分别为1,390bp、776bp和1,354bp、778bp,rRNA基因总AT含量分别为84.67%和85.23%。
  4.两种枯叶蛾线粒体基因组AT富集区位于12S rRNA和tRNAMet之间,其长度分别为372bp和383bp,AT含量高达91.40%和91.64%。在两种枯叶蛾的AT富集区中具有“ATAGA+Poly-T”和Poly-T,Poly-A结构。在竹纹枯叶蛾线粒体AT富集区出现了两处微卫星结构:(TA)6和(TA)7,而在青黄枯叶蛾线粒体AT富集区中未出现,推测以上几种结构对线粒体基因的复制、转录起调控作用。
  5.基于线粒体基因组13个PCGs氨基酸序列、13个PCGs、13个PCGs+2 rRNA基因的核苷酸序列建立NJ树、MP树、ML树和BI树。最为可信的BI树中显示的鳞翅目各总科的亲缘关系为:(((((((蚕蛾总科+尺蛾总科)+(枯叶蛾科+夜蛾总科))+螟蛾总科)+(凤蝶总科+弄蝶总科))+卷蛾总科)+巢蛾总科)+蝙蝠蛾总科)。蝙蝠蛾总科昆虫的线粒体基因组发生了基因重排:基因排列特点与鳞翅目昆虫祖先一致,所以在系统发育分析中是在最外围的。在许多研究报道中均能发现典型的凤蝶和弄蝶的系统发育关系:(((((灰蝶科+蚬蝶科)+蛱蝶科)+粉蝶科)+弄蝶科)+凤蝶科)。四种系统发育树显示枯叶蛾科和蚕蛾总科这两大支是分开的,其分类关系为:(((天蛾科+蚕蛾科)+大蚕蛾科)+尺蛾科)+枯叶蛾科,支持枯叶蛾科从蚕蛾总科中分离出来的结论。
[硕士论文] 董梦书
动物学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:缅甸安小叶蝉Anaka burmensis Dworakowska隶属于半翅目叶蝉科小叶蝉亚科,是竹子上的重要叶蝉类害虫。取食危害竹子的叶蝉种类多,其外形特征很相似,依靠传统的分类学方法进行种类的快速准确鉴定较为困难。为了了解缅甸安小叶蝉种群的遗传结构,本文通过mtDNA COI、16S rRNA、Cyt b基因序列作为分子标记对我国缅甸安小叶蝉26个地理种群的遗传多样性进行研究,分析其不同地理种群的遗传结构及分化,探讨该虫内在的遗传因素。研究结果有利于深入了解该虫在中国分布和变化,可为叶蝉类昆虫分子生物学研究及缅甸安小叶蝉的防治奠定基础。
  本研究主要内容包括:⑴测定了26个地理种群的缅甸安小叶蝉共241个个体的线粒体DNA COI基因的部分序列,计算核苷酸组成、各群体间的遗传距离、分子变异 AMOVA分析等,构建单倍型网络图。结果表明:获得缅甸安小叶蝉基因序列长度为615bp,共检测出546个保守位点,变异位点有69个,33个单倍型,其中A+T含量占72.4%;种群间的平均遗传距离为0.0166,单倍型多样性指数(Hd)为0.845,核苷酸多样度(Pi)为0.00877,中性检验Tajima’s D为-1.65898,Fu’s Fs为-5.787,结果不显著(0.05< P<0.10),种群间的遗传分化系数(Fst)为0.72915,平均基因流(Nst)为0.5985。分子变异结果显示缅甸安小叶蝉26个地理种群间的遗传分化主要来自于种群间(72.92%)。根据构建的单倍型网络图,各地理种群呈现高频率单倍型向低频率扩散的现象。⑵测定26个不同地理种群的缅甸安小叶蝉共243个个体的线粒体mtDNA16S rRNA基因部分序列,计算核苷酸组成、各群体间的遗传距离、分子变异AMOVA分析等。结果表明:获得缅甸安小叶蝉该基因序列长为471bp,共检测出442个保守位点,变异位点有29个,19个单倍型,A+T含量为78.7%;种群间的平均遗传距离为0.0020,单倍型多样性指数(Hd)为0.332,核苷酸多样度(Pi)为0.00198,数(Hd)为0.332,核苷酸多样度(Pi)为0.00198,中性检验Tajima’s D为-2.22989,Fu’s Fs为-14.788,结果差异极显著(P<0.01),种群间的遗传分化系数(Fst)为0.2654,基因流(Nst)为0.2656,分子变异结果显示缅甸安小叶蝉26个地理种群间的遗传分化主要来自于种群间(63.23%)。⑶测定22个不同地理种群的缅甸安小叶蝉共200个个体的线粒体mtDNA Cyt b基因部分序列,计算核苷酸组成、各群体间的遗传距离、分子变异AMOVA分析等。结果表明:获得缅甸安小叶蝉该基因序列长度为593bp,共检测出546个保守位点,变异位点有47个,28个单倍型,A+T含量为78.1%;总总群的平均遗传距离为0.0057。单倍型多样性指数(Hd)为0.830,核苷酸多样度(Pi)为0.00562,中性检验Tajima’s D为-1.80834,Fu’s Fs为-9.171,结果差异显著(P<0.05),种群间的遗传分化系数(Fst)为0.6727,基因流(Nst)为0.6729,分子变异结果显示缅甸安小叶蝉22个地理种群间的遗传分化主要来自于种群间(77.33%)。⑷利用线粒体COI、16S rRNA、Cyt b三个基因部分序列探讨了缅甸安小叶蝉与近似种之间关系,并构建ML和NJ树。结果表明:缅甸安小叶蝉与绿安小叶蝉 Anak a. sp.之间的遗传距离依次分别为0.1528~0.1731、0.1459~0.2283、0.1779~0.1924;与竹白小叶蝉 Sweta bambusan之间的遗传距离依次分别为0.2101~0.3213、0.1608~0.1668、0.2547~0.3067;与四斑双干小叶蝉 Trifida quadripunctata之间的遗传距离依次分别为0.2437~0.2635、0.2020~0.2524、0.2114~0.2375。缅甸安小叶蝉间种内的遗传距离在0.0166~0.0490间可确定到种;种间遗传距离在0.1528~0.2547可确定不同的种。NJ和ML分子系统树显示,缅甸安小叶蝉各地理种群格局总体呈平行关系;树的拓扑结构分为2个分支,它与竹白小叶蝉的亲缘关系比四斑双干小叶蝉的近,而与绿安小叶蝉的亲缘关系最近。初步筛选出Cyt b作为分子标记鉴别不同的种,初步建立分子体系。
[硕士论文] 李萌琪
植物保护 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:随着全基因组测序技术的不断发展,越来越多的昆虫物种全基因组测序工作完成。加之众多昆虫学工作者的努力,基因注释工作不断展开,大量的数据涌现在科研人员面前。如何深入研究和挖掘这些信息背后隐藏的基因功能信息成为问题的关键,解决这个问题的重要手段是靶向基因组编辑技术。CRISPR(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeat)系统是存在于细菌和古生菌中抵抗噬菌体DNA的免疫机制。在人们利用的第Ⅱ类CRISPR系统中,Cas9蛋白可以在一小段gRNA的引导下对基因组特定位点进行识别并切割,产生双链断裂,然后生物体通过不同的机制进行修复,从而实现靶向基因组编辑。本研究以模式昆虫黑腹果蝇Drosophila melanogaster(双翅目:Diptera;果蝇科:Drosophilidae)为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术,对眼色决定基因white进行靶向编辑,并利用tRNA-gRNA技术实现多位点打靶CG18208基因。
  1利用CRISPR/Cas9技术敲除果蝇white基因
  从flybase(http://flybase.org/)上下载得到果蝇white基因CDS序列,分析其内含子与外显子区域。通过flycrispr网站的Flycrispr Optimal Target Find(http://flycrispr.molbio.wisc.edu/tools)查找并选择合适的靶位点。体外转录得到Cas9 mRNA和gRNA,按照Cas9 mRNA300ng/μL、gRNA40 ng/μL的浓度注射到红眼野生型果蝇Canton-S早期胚胎生殖细胞系中。得到的G0代果蝇通过自交得到G1代,并未观察到白眼突变,分析可能是操作过程中RNA降解所致。接下来利用pDCC6质粒自带的启动子在体内同时转录得到Cas9mRNA和gRNA。将制备好的质粒以400ng/μL的浓度注射到果蝇早期胚胎中,成功在G1代观察到白眼突变表型。通过分子检测到G1代在相应的靶位点产生碱基的缺失。
  2利用tRNA-gRNA技术实现多位点打靶CG18208基因
  从flybase(http://flybase.org/)上下载得到果蝇编码章鱼胺受体的CG18208基因CDS序列,分析其含子与外显子区域。通过flycrispr网站的Flycrispr OptimalTarget Find(http://flycrispr.molbio.wisc.edu/tools),查找并选择合适的靶位点。将4个gRNA同时克隆到pCFD5质粒中得到pCFD5-OA3质粒,其中利用单一U6:3启动子启动转录得到一个长的RNA转录本,通过生物体内在的tRNA精确剪切系统,最后得到独立的4个gRNA。另外制备含有两个1kbp同源臂的OA3-donor质粒,该质粒含有GAL4和mini-white元件,预计这两个元件将定点插入到CG18208靶位点。将这两个质粒以pCFD5-OA3400 ng/μL、OA3-donor250 ng/μL的浓度注射到生殖细胞系特异表达Cas9的转基因果蝇中。得到的G0代果蝇与三号染色体TM3/TM6平衡子果蝇杂交,最终我们通过Sanger测序、TIDE分析和HRMA方法检测到靶位点突变。
[硕士论文] 徐丹
生物安全 西南大学 2016(学位年度)
摘要:阔野螟属Patania Moore,1888隶属于鳞翅目Lepidoptera螟蛾总科Pyraloidea草螟科Crambidae斑野螟亚科Spilomelinae,其模式种为Botys concatenalis Walker,1866。全世界已记载约50种,我国已记载28种。本属一些种类在外部形态上较为相似,种类鉴定多依据外生殖器特征。本文结合传统分类学方法和分子生物学的技术手段,首次对中国阔野螟属Patania进行分子系统学研究,探讨基于线粒体及核基因的物种间亲缘关系,旨在揭示阔野螟属Patania的种间关系,为斑野螟亚科昆虫的系统发育与演化研究打下基础。
  本研究选用线粒体基因CO1长为658bp的片段,核基因CAD长为615bp的片段和核糖体基因RpS5上长为597bp的片段对中国阔野螟属进行基因组DNA的提取及目的片段的扩增,应用Clustal等软件进行序列的比对和分析,并采用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)3种方法构建系统发育树来推测系统发育关系。主要结果和讨论如下:
  1.使用DNA Barcoding技术成功的鉴定出阔野螟属27个种,结果显示每个种均能聚到一起,证明了使用通用引物LCO/HCO扩增出来的长为658 bp的基因片段,作为DNA Barcode序列来鉴定物种是有效的。
  2.使用MEGA5.05软件,基于Kimura-2-parameter模型,bootstrap1000次计算得到CO1基因在阔野螟属种内的平均遗传距离0.013。阔野螟属26个种基于CO1基因的种间平均遗传距离为0.101。种内平均遗传距离明显小于种间平均遗传距离。
  3.根据CO1基因序列构建的NJ树、ML树和BI树的结果表明,三者拓扑结构基本相同,中国阔野螟属26个种可以分为8支。此外,每个种的个体均能聚合,包括新种丁紫阔野螟Patania clava Xu et Du,与其相似种聚合成1支。
  4.根据CAD+CO1+RpS5基因联合序列构建的NJ树、ML树和BI树的拓扑结构基本相同,NJ树基于遗传距离建树所得种类聚类情况较ML树与BI树更粗放,在进行系统发育关系分析时,采用ML树与BI树的建树结果,认为中国阔野螟属17个种可以分为7支。
  5.综合分析外部形态特征、外生殖器特征和系统发育树的结果,最后,本研究将中国阔野螟属的27个种,包括1新种按亲缘关系分成7组。组内种间的亲缘关系相对组外的种较近。分组如下:1)四目阔野螟Patania inferior(Hampson,1898),窗斑阔野螟P.mundalis(South,1901),四斑阔野螟P.quadrimaculalis(Kollar et Redtenbacher,1844);2)橙缘阔野螟 P.costalis(Moore,1888),三纹阔野螟 P.harutai(Inoue,1955),暗黑阔野螟P.holophaealis(Hampson,1912),宽缘阔野螟 P.scinisalis(Walker,1859)和灰褐阔野螟 P.verecunda(Warren,1896);3)丁紫阔野螟P.clava Xu et Du,sp.nov.,紫褐阔野螟P.iopasalis(Walker,1859),黄褐阔野螟P.obfuscalis Yamanaka,1998和甘薯阔野螟P.plagiatalis(Walker,1859);4)枇杷阔野螟P.balteata(Fabricius,1798),三条阔野螟P.chlorophanta(Butler,1878),橙黑阔野螟P.nigriflava(Swinhoe,1894),栅纹扇野螟P.punctimarginalis(Hampson,1896),豆阔野螟P.ruralis(Scopoli,1763)和淡黄阔野螟P.sabinusalis(Walker,1859);5)橙纹阔野螟 P.orissusalis(Walker,1859),褐缘阔野螟P.sellalis(Guenée,1854),P.concatenalis(Walker,1866),暗纹阔野螟P.definita(Butler,1889),P.sp.和黑纹阔野螟P.xuthusalis(Walker,1859);6)二斑阔野螟P.deficiens(Moore,1887);7)亮斑阔野螟P.expictalis(Christoph,1881)和P.semivialis Moore,1888。
[硕士论文] 周菁
动物学 华中师范大学 2016(学位年度)
摘要:在漫长的进化历程中,昆虫逐渐具备了极其灵敏的嗅觉系统,并以此感知来自于外界的多种化学刺激并作出相应的生理行为反应,如寻找配偶、定位食物源和栖息地,两性交流,聚集产卵和趋避敌害等,由此可见,嗅觉及化学感受系统在昆虫的各项生命活动中发挥着重要功能。通过鉴定筛选靶标害虫信息素成分干扰和阻断昆虫的嗅觉识别行为,并将其成功应用于田间实践一直是害虫综合生物防控的重要措施之一。豆野螟是一种在世界范围内都具有较大危害的豆科作物害虫,其幼虫具有较强的钻蛀习性,化学药剂的大量使用不易杀死害虫,并容易导致农药残留超标,严重威胁各蔬菜基地豆类蔬菜产品的供应和食品安全。豆野螟主要分布在热带和亚热带地区,幼虫主要蛀食豆科作物幼嫩的花、叶和豆荚等,给豆科蔬菜生产造成了巨大的损失。
  基于课题组前期豆野螟触角转录组测序结果,我们克隆、表达并纯化了豆野螟MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1,采用RT-PCR技术分析检测这三个基因在豆野螟成虫的不同组织的表达情况。利用荧光竞争结合实验分析研究了MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1与寄主植物花挥发性化合物的结合,并利用三维结构模拟以及分子对接技术对MvitGOBP1、MvitC SP1蛋白与配体分子的可能的关键结合位点进行预测。主要研究结果如下:
  1.豆野螟MvitGO BP1、MvitCSP1、MvitOBP1的克隆、序列和进化分析
  克隆获得豆野螟三个嗅觉基因,分别命名为MvitGOBP1、MvitCSP1、MvitOBP1,序列分析三个基因的ORF分别为486bp、387bp和471bp。多重序列比对显示,MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1均与鳞翅目其他昆虫的相应基因具有较高的相似性。系统进化分析发现,MvitGOBP1与CmedGOBP1聚为一支,MvitCSP1和CmedCSP,MvitOBP1和CmedOBP11分别具有较高序列相似性。
  2.组织特异性表达分析
  利用荧光定量PCR技术分析检测了MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟成虫不同组织的表达水平。结果表明,这三个基因主要在触角中高表达,在头、足和翅等组织中分别有少量的表达分布。
  3.MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1的原核表达及亲和层析纯化
  将构建好的原核表达重组载体转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中,不同IPTG条件诱导后破碎取上清,采用Ni柱亲和层析的方法来纯化目的蛋白,并利用肠激酶切除His标签。SDS-PAGE分析检测显示,这三个蛋白大小在25 kD到35kD之间产生特异性的条带。
  4.荧光竞争结合实验
  荧光竞争结合实验结果显示,MvitGOBP1对1H-Indol-4-ol(4-羟基吲哚)、Butanoic acid butyl ester(丁酸丁酯)和Limonene(柠檬烯)的结合能力较强;MvitCSP1对1H-Indol-4-ol和2-methyl-3-phenylpropanal(2-甲基-3-苯基丙醛)的结合能力较强;MvitOBP1对1H-Indo1-4-ol和Butanoic acid butyl ester的结合能力较强。
  5.田间诱捕试验
  基于嗅觉目的蛋白与寄主挥发物的结合特性分析结果,我们从17种豇豆花挥发物气味分子中选取了六种结合能力较强的化合物来进行田间诱捕实验,分别是Butanoic acid butyl ester、Limonene、1H-Indol-4-ol、2-methyl-3-phenylpropanal、Butanoic acid octyl ester(丁酸辛酯)和4-ethylpropiophenone(乙基苯丙酮)。田间诱捕实验结果显示,相对于空白对照组,这六种化合物均能够有效吸引雌蛾,产生类似产卵聚集效应,其中柠檬烯的诱捕效果最为显著。
  6.同源建模和分子对接
  通过构建目的蛋白三维结构模型与分子对接分析,我们发现MvitGOBP1和MvitCSP1的结合腔主要由疏水性氨基酸组成,促进两种嗅觉蛋白与寄主挥发物成分1H-indol-4-ol和2-methyl-3-phenylpropanal的特异性结合,推测可能的关键氨基酸位点分别是Asn83和Arg127,Thr26和Glu63。
  上述试验结果表明,MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟不同组织中分布广泛,结合特性分析和田间诱捕试验表明,MvitGOBP1、MvitCSP1和MvitOBP1在豆野螟的寄主识别以及产卵定位等嗅觉生理活动中发挥着重要作用。
[硕士论文] 赵新威
生物学 重庆大学 2016(学位年度)
摘要:基因表达的差异被认为是导致近缘物种之间表型改变和进化的主要原因。而基因表达是由顺式调控元件(cis-regulatory element)和其相应的反式调控元件(trans-regulatory element)共同调控的,它们的变化均会导致基因表达的改变。一般而言,转录因子结合位点的变化只会影响单个基因或少数基因的表达,因此只会影响基因调控网络(gene regulatory network)上的某些节点的变化。相反,当转录因子发生改变后,其所有的靶基因的表达都有可能受到影响,这种大量基因表达的改变对生物体的生存是有害的。另外,转录因子是编码蛋白质的功能基因,相对而言,转录因子在进化过程中较为保守,先前的研究也表明转录调控进化主要是顺式调控区域的改变导致的。目前对一些特殊世系物种间转录因子条目变化及其可能的功能分化仍然知之甚少。
  本研究主要内容包括:①昆虫中转录因子数目差异较大。本文鉴定了35个物种中26808个转录因子,并将其分为65个转录因子家族(transcription factor family)。我们发现同一个转录因子家族其基因数目在不同物种中并不相同。尽管在世系内部其趋势可能有一部分相同,但在近缘物种中依旧有数目变化。这说明转录因子的变化的确存在,这些变化可能是物种之间基因调控网络和表型变化的重要来源。②世系特异转录因子的变化会导致基因调控网络的变化。为进一步研究转录因子重复后的功能变化,本文通过系统发生分析的方法系统鉴定了昆虫世系特异重复的转录因子。最终,鉴定了20个在昆虫世系间存在拷贝数特异改变的转录因子,其中6个世系特异的转录因子仅在果蝇世系中产生重复而在其他世系中并未重复。利用已有的黑腹果蝇基因调控数据,本文构建了这6对世系特异转录因子的基因调控网络,发现两拷贝之间的基因调控网络发生了分化,说明转录因子的变化会导致基因调控网络的改变。③世系特异重复转录因子间功能发生了明显分化。通过搜寻Flybase中6对世系特异重复转录因子等位表型数据,发现转录因子的不同拷贝对果蝇表型有不同影响。进一步用时空表达数据分析发现重复转录因子之间的表达模式的确发生了明显分化。
[硕士论文] 冯雪皎
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我国常见种类,分布广泛,携带多种病原体,严重危害人类健康和畜牧业的发展。因此研究我国不同地理种群长角血蜱遗传多样性,有利于了解长角血蜱在我国的生存状况和发展趋势,从而对长角血蜱更有效的进行防控。本研究使用COI基因、16S rRNA基因和ITS2基因对采自河北小五台山地区、贵州茂兰地区、甘肃兰州地区和湖北武汉地区的长角血蜱种群进行了种群遗传多样性分析,结果如下:
  本研究共获得93条COI序列,片段为802bp。其中变异位点79个,序列未出现插入和缺失,A+T含量大于G+C含量,具有AT偏倚性。转换高于颠换,转换比颠换值为4.256。获得75条16S rRNA序列,片段为406碱基,变异位点为17个。序列中出现了缺失位点,A+T含量高于G+C含量,具有AT偏倚性。转换大于颠换,转换比颠换值为4.711。获得79条ITS2序列长为671碱基,变异位点32个,序列存在插入和缺失,其中G+C碱基所占比值高于A+T。转换高于颠换,转换比颠换值为3.756。长角血蜱的COI基因单倍型48个,其中共享单倍型两个占单倍型比例为21.5%。单倍型多样性为0.958,核苷酸多样性为0.00847。小五台山地区单倍型多样性最高。16S rRNA基因检测出单倍型12个,其中共享单倍型一个占单倍型的比例为81.3%。单倍型多样性为0.33838,核苷酸多样性为0.00112。武汉地区单倍型多样性最高。ITS2基因单倍型26个,共享单倍型两个占单倍型比例为68.4%。单倍型多样性为0.76371,核苷酸多样性为0.000327。兰州地区单倍型多样性最高。三个基因片段共享单倍型较少独享单倍型较多有着丰富的单倍性多样性,说明长角血蜱适应能力较强。使用COI基因、16S rRNA基因和ITS2基因对长角血蜱四个地理种群进行了FST值分析。其中COI基因四个地区之间的FST值均小于0.25,说明种群之间出现了一定的遗传分化,武汉地区和小五台山地区分化程度最高。16S rRNA基因四个地区之间的FST值均小于0.25,说明种群之间出现了一定的遗传分化,茂兰地区和小五台山地区分化程度最高。ITS2基因的部分FST值大于0.25,遗传差异较大是由于ITS2进化速率较快导致的结果,武汉地区和茂兰地区分化程度最高。对长角血蜱的3个基因进行了分子差异(AMOVA)分析,三个基因的变异均来自种群内部而非种群间。使用COI、16S rRNA和ITS2基因构建单倍型网络图和贝叶斯系统发育树。三个基因的单倍型网络图中单倍型和地理单元之间没有明显的对应关系,不同地理种群的单倍型相互混杂分布,未形成明显的地理格局。通过对三个基因的单倍型分别构建系统发育树,拓扑结构显示所有长角血蜱单倍型聚集形成一个分支,但未按对应的地理单元进行聚类,相互混杂,没有明显的地理分化结构使用COI基因、16S rRNA基因和ITS2基因对四个种群联合进行中性检验和错配分析。中性检验中COI基因Tajima's D值不显著,16S rRNA基因和ITS2基因Fu's FS值不显著说明种群未出现近期的扩张。COI基因错配分析图为双峰说明种群未出现种群扩张,但16S rRNA和ITS2基因错配分析图为单峰表明种群近期经历过种群扩张。这与中性检验结果不一致,可能由于其分析数据量不足造成的结果。
[博士论文] 肖花美
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA基因,主要包括小RNA(如miRNA等)和长的非编码RNA(lncRNA)。研究表明,miRNA和lncRNA具有重要的功能。本文预测了五种昆虫的非编码RNA基因,通过基因家族分析发现了昆虫特异性的miR-14,进行了靶标预测及双荧光素酶报告基因验证,以及miR-14和其靶标基因的表达分析,过表达或干扰miR-14的表达等实验表明,昆虫特异性miR-14靶向蜕皮激素合成代谢通路中的9个基因,明显增强了对通路的调控能力,在昆虫蜕皮完成后抑制蜕皮激素的合成,维持了家蚕发育的稳定性和一致性。主要工作如下:
  1、5种昆虫非编码RNA基因的发现及特征分析
  将褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱5个物种卵、幼虫、蛹、成虫等不同发育阶段的个体分别混合,提取RNA,经测序获得5个物种小RNA序列,过滤后获得五个物种Uniq reads信息。构建miRNA预测流程,分别在褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱的小RNA文库中发现了110、76、64、108、118个miRNA基因。收集褐飞虱低繁殖力雌成虫、高繁殖力雌成虫、低繁殖力五龄若虫、高繁殖力五龄若虫、Mudgo品系脂肪体、TaichungNative1品系脂肪体、Mudgo品系唾液腺、TaichungNative1品系唾液腺、Izumo87品系、Chikugo89品系以及普通种群的转录组数据,构建了lncRNA预测流程,从12个转录组中共发现1,882个lncRNA基因。褐飞虱lncRNA主要为两个外显子的转录本,转录本长度显著短于蛋白质编码基因(841bp vs1106 bp,T-test,P<0.01)。19%的褐飞虱lncRNA发生选择性剪切。繁殖力与致害性种群中均存在特异性表达的lncRNA,且发现3个lncRNA基因与繁殖力密切相关的蛋白质编码基因发生重叠,表明lncRNA可能参与调控褐飞虱的繁殖力。
  2、昆虫miRNA基因家族分析
  依据物种进化关系,选取了5种脊椎动物(人、小鼠、家鸡、非洲蟾蜍、斑马鱼)、17种昆虫(二化螟、黑腹果蝇、意大利蜜蜂、丽蝇蛹集金小蜂、冈比亚按蚊、致倦库蚊、埃及伊蚊、诗神袖蝶、烟草天蛾、家蚕、赤拟谷盗、豌豆蚜、褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱)、水蚤、线虫和海蠕虫共25个物种的miRNA。基因家族分析发现,let-7、mir-1、mir-133等14个miRNA家族在所有物种中高度保守;bantam、mir-2、mir-263等9个miRNA家族在无脊椎动物中保守;mir-14、mir-277、mir-316、 mir-932等为昆虫特异性miRNA基因家族,其序列在昆虫中高度保守。
  3、昆虫特异性miR-14基因对蜕皮激素通路的调控
  选择昆虫特异性的miR-14基因开展功能研究。收集了12种昆虫的miR-14基因序列以及3'UTR数据,利用RNAhybrid和miRanda两个软件预测靶标,结果表明miR-14在所有昆虫中靶向蜕皮激素通路中的多个基因。为进一步分析昆虫特异性的miR-14基因在变态发育中的调控功能,通过文献挖掘构建了昆虫蜕皮激素的上游调控通路、合成通路及下游应答通路(以下简称为昆虫蜕皮激素通路),靶标预测发现家蚕miR-14可作用于通路中的12个基因。
  考虑家蚕3'UTR数据丰富及实验操作方便等优点,利用双荧光素酶报告基因载体系统验证了预测靶标,分别将12个预测为靶标基因的3'UTR克隆进pMIR-REPORT载体,与miR-14的mimics共转染HEK293T细胞,测定荧光含量。同时,对靶标基因的3'UTR进行了突变,检测mimics的干扰效果是否有影响。结果表明,miR-14的mimics对携带有InR、Akt、Erk、Torso、Nvd、Shd、EcR、E74和Brc等9个靶标基因3'UTR的载体荧光素酶活性具有明显的抑制作用,而当3'UTR的靶标位点被突变后,干扰作用消失。
  综合软件预测和靶标验证的结果,表明miR-14对昆虫蜕皮激素通路中的多个基因具有调控作用。分析认为,这种作用模式显著增强miR-14基因对蜕皮激素合成及其作用的调控能力。lnR、Akt、Erk、Torso分别位于诱导和刺激蜕皮激素合成的三条上游调控通路上,Nvd,Shd等位于蜕皮激素的合成通路上,EcR、E74、Brc,是蜕皮激素的受体及下游应答基因,通过对这9个基因的调控,miR-14可以成功地控制蜕皮激素的上游调控,合成及下游应答通路,实现对蜕皮激素的全面调控作用。
  4、miR-14及靶标基因的表达谱分析
  对家蚕头、前胸腺、中肠、马氏管和表皮五个组织进行了miR-14的表达分析。结果表明,两个miR-14成熟体(miR-14-5p和miR-14-3p)在五个组织中的表达量大致相似, miR-14为组成型表达的miRNA基因。对3龄第1天至蛹期第2天共18个样本进行了发育时期的表达分析,结果显示miR-14在龄期转换过程中呈规律性变化。miR-14-3p在每个龄期的第1天高表达,miR-14-5p在每个龄期的最后一天高表达。
  为更细致地研究miR-14的表达,对家蚕3龄第1天至4龄第1天每6h样共20个样本进行了表达量分析。结果表明,miR-14-5p于蜕皮前24h表达开始上升,蜕皮前12h表达量升至最高,其表达量变化与蜕皮激素合成具有密切的关系。在需要蜕皮激素的发育时间点上,miR-14基因表达量降低。而在不需要蜕皮激素的时间点上, miR-14表达明显升高。
  检测了InR、Ras、Spo、Shd、EcR、E74、Brc等靶标基因的表达情况,对3龄第1天至蛹期第2天共18个样本进行表达分析。结果表明,InR、Ras两个基因的表达无明显规律;E74基因在每个龄期最后一天高表达;Brc在蛹期高表达;Spo、Shd、EcR三个基因的表达趋势一致,在每个龄期蜕皮前2天高表达。分析了Spo在家蚕3龄第1天至4龄第1天每6h样本中的表达,发现Spo于蜕皮前30h左右表达量升至最高。Spo与Shd基因直接参与蜕皮激素的合成,EcR基因为蜕皮激素的受体基因,Spo、Shd、EcR三个基因的表达趋势与蜕皮激素滴度的变化趋势一致,与miR-14-5p的表达呈负相关。表达量分析结果,进一步证明了miR-14-5p对蜕皮激素通路的调控作用。
  5、过表达与干扰miR-14对家蚕变态发育的影响
  合成了miR-14的类似物agomir-14,注射3龄2天家蚕,过表达家蚕miR-14。定量PCR检测结果显示,在三个重复中,过表达24 h后的表达量分别上升了3倍、8倍和22倍,过表达48h后仍可维持高丰度。注射不同浓度的agomir-14-5p均可致家蚕蜕皮延迟,注射540 pmol agomir-14-5p致大约10%的家蚕个体蜕皮延迟,注射1080pmol agomir-14-5p导致大约60%的家蚕个体蜕皮延迟,而agomir-14-3p组蜕皮时间与NC接近,表明家蚕中主要以miR-14-5p起作用。
  合成了miR-14的抑制剂antagomir-14,注射3龄1天家蚕,干扰miR-14的表达。利用qRT-PCR检测干扰后24h和48h miR-14-5p的表达量,结果显示干扰后两个时间点miR-14-5p的表达量均下降,其中48h达到显著下降,表明注射antagomir-14达到了抑制miR-14表达的效果。antagomir-14-5p可致20-30%家蚕个体蜕皮延迟,而antagomir-14-3p蜕皮时间与NC接近。综合过表达与干扰实验结果,表明家蚕miR-14-5p通过调控蜕皮激素通路基因的表达,调控蜕皮激素的合成,进而影响家蚕的变态发育。
[硕士论文] 王曼曼
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2015(学位年度)
摘要:灰飞虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]属半翅目,飞虱科,是一种非常重要的农业害虫。在世界上分布范围广泛。灰飞虱在我国各地均有分布,能够本地越冬,因此一般认为是本地虫源。
  本研究通过利用一段1368bp的线粒体DNA片段(包括769bp的COⅠ和599bp的COⅡ),对我国22个地理种群的灰飞虱进行种群遗传学的分析,这22个种群的地理位置分布在四个气候带中(中温带:moderate temperatezone(MT),暖温带:warmtemperatezone(WT),亚热带北部:northern subtropicalzone(NS),亚热带南部:southernsubtropicalzone(SS))。初步研究结果如下:
  (1)种群遗传多样性:整体上,我国灰飞虱种群的遗传多样性较好,但东北地区的灰飞虱种群多样性较差;在中温带地区(MT)的灰飞虱个体其单倍型多样性Hd及核苷酸多样性π均显著低于暖温带地区(WT)、亚热带南部地区(SS)、亚热带北部地区(NS)这三个温区的灰飞虱个体。此外,亚热带南部SS个体的核苷酸多样性低于暖温带地区WT和亚热带北部地区NS个体。
  (2)种群分化指数FST:种群分化指数FST在-0.078到0.442之间,平均值是0.075。从中温带到其余三个温区之间种群的FST平均值是0.176,相比较其他温区之间,种群分化指数FST较低,平均值只有0.016。主成分分析PCoA显示来自中温带地区的6个地理种群牡丹江、哈尔滨10、哈尔滨12、双吉、延吉11和延吉12与其他地理种群是显著分化的。
  (3)在1323个样本中,共发现107个单倍型,贝叶斯聚类及单倍型网络分支图均显示,107个单倍型很明显的分为两个单倍群,HGⅠ和HGⅡ,这两个单倍型的频率随着地理位置非随机分布。总体上,HGⅠ所占的频率(61.3%)比HGⅡ所占的频率(38.7%)要高,且在中温带地区占有绝对的优势。
  对于这种线粒体单倍型随环境出现非随机分布的现象,我们认为温度是形成灰飞虱线粒体DNA单倍型分布的主要原因,研究也发现线粒体单倍型HGⅠ的频率与冬季平均最低温度显著相关,单倍型HGⅠ在中温带具有显著频率优势的原因可能是由于HGⅠ比HGⅡ个体更能适应低温环境。
  为探索不同单倍型灰飞虱的抗寒性差异,对相同种群不同单倍型灰飞虱四龄若虫进行-1℃,2h处理后,测其冷冻昏迷恢复时间。结果发现,单倍型HGⅠ灰飞虱的个体低温冷冻昏迷后比HGⅡ单倍型个体恢复的快,说明HGⅠ这种单倍型灰飞虱的抗寒性较强。
  本研究比较了两种单倍型灰飞虱个体的线粒体COⅠ基因的相对拷贝数和低温处理前后雌虫线粒体DNA上编码蛋白的12个基因的相对表达量,结果发现:
  1)常温下,HGⅠ这种单倍型灰飞虱体内COⅠ基因的拷贝数明显多于HGⅡ单倍型灰飞虱个体。
  2)在-1℃低温放置2h后,HGⅠ单倍型灰飞虱雌虫个体与对照组相比,其12个线粒体基因表达量都是上升的,而对于HGⅡ这种单倍型灰飞虱雌虫个体来说,在低温-1℃放置2h后,nd1,nd2,nd3,nd4这四个编码NADH脱氢酶亚基的基因的表达量出现下降,其他基因的表达量都高于对照组。
  3)对照组中HGⅡ单倍型线粒体基因表达量都高于单倍型HGⅠ,但差异不显著;低温处理后,HGⅡ单倍型灰飞虱个体线粒体基因只有atp6,atp8,nd6基因表达量高于单倍型HGⅠ,而其余9个基因表达量都低于HGⅠ单倍型灰飞虱个体,其中cox2,nd1,nd2,nd4,nd5基因表达量显著降低。
  对HGⅠ,HGⅡ两种单倍型灰飞虱个体线粒体的全基因组进行测序及分析,结果发现,在ND2(第341个碱基),ND5(第277个碱基)和CYTB(第691个碱基)这三个基因上发生了非同义突变。用treeSAAP软件对系统发生过程中ND2,ND5,CYTB这三个线粒体基因序列进行适应性选择分析,结果发现这三个点突变带来的氨基酸的很多理化性质的改变等级在6-8级之间,说明这三个位点在进化过程中可能发生了适应性进化。
[硕士论文] 杨杰
动物学 南开大学 2015(学位年度)
摘要:蜻蜓目(豆娘和蜻蜓),是现生有翅昆虫中最古老的类群之一,包括差翅亚目Anisoptera、间翅亚目Anisozygoptera、均翅亚目Zygoptera。其中,差翅亚目Anisoptera包括5总科11科,344属,3011种;间翅亚目Anisozygoptera包括1科1属4种;均翅亚目Zygoptera包括4总科18科,308属,2941种。蜻蜓目高级阶元的系统发育关系至今仍未解决,尤其是3亚目的系统发育地位近年来备受人们关注。此外,均翅亚目色蟌总科“Calopterygoidea”的单系性也有待进一步研究,尤其是拟丝蟌科与其近缘的山蟌科的位置较混乱还需要进一步解析。近年来,核糖体DNA(rDNA)作为分子标记已经被广泛用于蜻蜓目高级阶元的系统发育研究中去。而事实上,除了依据 rDNA序列的这种一级结构信息外,相应的核糖体RNA(rRNA)的二级结构信息可以用来校正软件自动给出的序列比对结果,并且也可以在二级结构的长度变异区段(LVRs)找寻共有衍征。
  本研究通过总结GenBank中蜻蜓目nrDNA数据使用情况,发现蜻蜓目中同时具有18S全长、28S rDNA全长的数据并不多,仅有62条,而且都没有相应ITS的序列,因此,本研究选取蜻蜓目中,同时具有与18S全长、28S rDNA>2kb的序列共118条构建矩阵,其中包括蜉蝣目2条序列作为外群,另有8科10种数据由本研究提供。研究中首先结合序列初步比对结果,基于丽拟丝蟌Pseudolestes mirabilis全长rDNA簇的序列对蜻蜓目18S、28S rRNA二级结构模型进行重建,并根据得到的模型进一步校正序列比对结果,基于长度变异区段挖掘分子共有衍征,作为系统发育推断的新证据。研究初步得到以下结果:通过对蜻蜓目18S、28S rRNA二级结构模型重建,认为长度变异区可以作为共有衍征,包括类群特异性插入或缺失、相同的长度变异区段长度和类群特异性长度扩展。发现单系Anisoptera+Anisozygoptera中28S rDNA中可变区D2-9都具有1个碱基;18S rRNA中可变区B的5个碱基长度成为支持Zygoptera单系性的一个共有衍征;单系Perilestidae+(Lestidae+Synlestidae)在28S rDNA中可变区D2-5都有8个碱基,D3-1都有5个碱基,D5-1有9个碱基可以作为该单系的分子自有衍征;可变区D2-615个碱基的长度可以作为单系Euphaeidae+Lestoideidae的独征;蜻科Libellulidae18S rRNA可变区D都有3个碱基;大伪蜻科Macromiidae中,28S rRNA可变区D2-3也具有3个碱基的长度;春蜓科Gomphidae和澳蜻科Synthemistidae分别在可变区Da和D3-2都有4个碱基。基于18S+28S rDNA重建的贝叶斯树和ML树也支持上述衍征所在单系的可靠性。可见,尽可能多的得到蜻蜓目 rDNA的全长序列,结合二级结构和分子共有衍征两方面的证据,有望对蜻蜓目中系统发育关系不详的类群解析提供帮助。
[硕士论文] 王强
动物学 江西农业大学 2015(学位年度)
摘要:蚋(Diptera:Simuliidae)不仅叮刺吸血,同时还会传染疾病,是一种十分重要的人畜共患病的病媒昆虫,因此许多国家都非常重视对蚋的生态习性及防治的研究工作。但并不是所有的蚋都会传播疾病,因此精确的鉴定蚋种便成为这些工作的基础。由于蚋的形态高度相似性,尤其是同一种团内的近缘种难以用形态学方法进行鉴定,细胞遗传学方法虽然可对近缘种进行鉴别,但是操作费时且需要特定发育阶段的样本。所以利用分子方法等多种综合手段对蚋科昆虫的分子分类和系统发育进行研究分析,是非常有必要的,同时也可以为蚋的防控研究奠定基础。
  本文对江西省7个标志地点进行标本采集并分析,根据形态学分类方法将所采集标本进行分类,得到4种形态种。纺蚋亚属的黄毛纺蚋S.aureohirtumnr。蚋亚属的五条蚋S.quinquestriatum、双齿蚋S.bidentatum和爬蚋S.reptans,其他标本鉴定到属,其中爬蚋S.reptans是江西未记录种。将已经鉴定过的标本提取线粒体基因COI片段,利用MEGA5.0对其进行成分、系统发育和种间遗传差异的分析,得到的结果与形态鉴定的结果相一致。同时利用PCR步移法对S.aureohirtumnr的线粒体基因组全序列进行了测定和分析。得到的结果表明S.aureohirtumnr的线粒体基因组基因的排列方式与假想昆虫祖先的排列方式trnI-trnQ-trnM相一致。
  本研究为我国蚋科昆虫的分子研究及江西省蚋科昆虫的分类研究做出了一定的贡献,对进一步厘定江西蚋科昆虫的分类及基于分子方法对其行鉴定具有重要作用。
[硕士论文] 李秀荣
动物学 南开大学 2015(学位年度)
摘要:曼蝽属(Menida Motschulsky)隶属于半翅目异翅亚目(Hemiptera-Heteroptera)蝽科(Pentatomidae)蝽亚科(Pentatominae)。本文对中国曼蝽属进行了分类学研究,同时基于几何形态学Geometric Morphometrics对该属的种间亲缘关系进行了初步分析。
  本研究分为两个部分:第一部分为中国曼蝽属分类学研究,该部分介绍了曼蝽属在中国乃至世界范围的研究简况;详细描述了该属中国记载的18个种的形态特征;介绍了研究材料与实验方法;对本研究中所涉及的术语及量度进行了详细说明;本文提供了曼蝽属30幅成虫彩色照片和34幅生殖节图;亦给出了中国已知种类检索表,并对该类群的生物学特性及经济意义进行了简要概述。第二部分为基于几何形态学的种间亲缘关系研究,介绍了几何形态学在昆虫学研究领域的应用概况;以该属物种小盾片为样本,获取该属15个种小盾片的地标点、质心距离等信息,将所得数据进行了统计学分析,建立系统发育树,探讨了各种间亲缘关系。结果显示:宽曼蝽M. lata、华美曼蝽M. speciosa、斑驳曼蝽M. mosaica、北曼蝽M. disjecta能与其余各种较明显的分开,斑驳曼蝽M. mosaica与北曼蝽M. disjecta有交叉表明两种在小盾片形状和大小上有相似性,具有较近的亲缘关系。
[硕士论文] 侯洋
遗传学 合肥工业大学 2015(学位年度)
摘要:柞蚕是一种重要的经济昆虫,起源于我国,由于其蚕体较大,易于饲养,对光照敏感,长期以来一直是研究光周期、神经内分泌调控和分子遗传等方面的模式昆虫。性信息素合成激活肽(Pheromone biosynthesis activating neuropeptide,PBAN)作为FXPRLamide神经肽家族中的一员,主要功能是调节昆虫雌蛾性信息素的合成和释放,对昆虫的交配和繁衍继代起关键作用。PBAN受体(Pheromonebiosynthesis activating neuropeptide receptor, PBANR)属于G蛋白偶联受体。PBAN受体与配体结合后,将胞外信号跨膜传递到细胞内,调控细胞的行为。本论文克隆了柞蚕PBAN受体基因全长cDNA,并对其进行序列分析;通过与PBAN结合的Ca2+活性分析,对其进行鉴定,同时,获得结合活性高的不同模拟肽;最后,调查了PBAN与PBAN受体基因及与性信息素合成相关的基因的组织和在性腺中的发育表达。
  利用RACE方法,克隆获得柞蚕PBAN受体基因全长cDNA序列,柞蚕PBANR的ORF为933bp,编码311个氨基酸,5'端非编码区长330bp,3'端非编码区长171bp。柞蚕PBAN受体包含G蛋白偶联受体典型的7次跨膜结构域,与鳞翅目其他昆虫的PBANR相一致。系统发育分析表明,柞蚕PBANR与家蚕和烟草天蛾PBANR处于同一分支,且与烟草天蛾的相似性是83.9%,与家蚕和谷实夜蛾的相似性均为83.6%,与小菜蛾的相似性为73.1%。
  构建并获得含柞蚕PBANR的ORF的PCDNA5重组质粒,转染到CHO细胞株,与柞蚕PBAN进行结合分析。柞蚕PBAN与重组质粒结合后,能产生显著的Ca2+应答,并且产生的信号呈现剂量依赖型。PBAN和PBAN受体结合的EC50值为1.95nM,说明我们所克隆的基因就是PBAN的功能性受体。柞蚕PBAN的cDNA编码5个FXPRL家族神经肽与PBAN受体均出现不同程度的结合活性,其中Anpγ-SGNP的结合活性最高,Anpβ-SGNP、Anpα-SGNP和AnpDH与PBAN受体的结合活性依次减弱,表明PBAN神经肽C端的5个氨基酸对于其与受体的结合起关键作用。把柞蚕PBAN截短,保留C端的9个氨基酸,同时对C端的FSPRL依次突变,进行结合分析。C端的9个氨基酸的模拟肽与PBAN受体的结合活性几乎与PBAN相当;PBAN的C端的P、R、L3个氨基酸对于其与PBAN受体的结合能力起关键作用。另外,PBAN的C末端的酰胺化对于其发挥功能具有重要的作用。
  柞蚕PBAN受体基因在性腺中表达量最高,在脂肪体中也有相对较高的表达;PBANR在柞蚕不同发育时期的性腺中的表达量随着雌蛾羽化时间的增加,其表达量显著增大。柞蚕PBAN和DHR基因组织分布及在性腺中的表达模式与PBANR不同。
  对柞蚕蛹后期的个体进行转录组分析,明确与性信息素合成相关的15个基因的序列。对与性信息素合成相关的15个基因的组织分布和在性性腺中的发育表达进行调查。乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸2个基因在性腺中的表达量显著高于其他组织;醇脱氢酶、乙酰基转移酶等13个基因在中肠或脂肪体等组织中表达高于性腺。除3-羟基辅酶A脱氢酶基因外,所调查的其他14个基因在发蛾前后的性腺中表达量均产生显著变化,其中乙酰辅酶A脱氢酶基因、乙酰辅酶A氧化酶基因等8个基因在发蛾后2天的性腺中的表达量显著高于发蛾前2天。脂肪酸合成酶基因、脱饱和酶基因等6个基因在发蛾后2天的性腺中的表达量显著低于于发蛾前2天。
[博士论文] 张赞
农业昆虫与害虫防治 南京农业大学 2014(学位年度)
摘要:转录组通常指所有信使RNA的集合。通过RNA-Seq技术,人们可获得大量的转录组序列信息,开展基因表达、功能分析、信号通路构建和分子进化分析等。本文以昆虫转录组为研究对象,开展了6种昆虫的比较转录组学研究,对昆虫转录组进行了分类,提出了两个评估昆虫转录组拼接质量的参数(Contigs containing the intact CDS,长度比率中住数LR50),开发了基于转录组的昆虫信号通路构建软件iPathCons,建立了昆虫信号通路数据库iPathDB。
  1、三化螟和稻纵卷叶螟的转录组测序分析
  将三化螟(Scirpophaga incertulas)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)的卵、幼虫、蛹、成虫等不同发育时期的试虫分别提取RNA,混合后进行转录组测序。分别获得2100万条三化螟的Reads,总共约15亿bp的转录组数据;4300万条稻纵卷叶螟Reads,约32亿bp的转录组数据。使用Trinity和SOAPdenovo拼接,经过比较,选用Trinity的拼接结果进行了表达丰度分析、基因注释、COG分析等。结果显示,三化螟和稻纵卷叶螟的转录组分别有45%和50%的序列能够被注释为蛋白编码基因,其余转录本无法注释,可能为非编码RNA序列或蛋白基因序列的非翻译区。
  2、六种昆虫的比较转录组分析
  从SRA数据库中下载了中华蜜蜂、丝光绿蝇、褐飞虱和烟粉虱的转录组原始数据,进行了拼接,使用nr数据库注释。然后对三化螟、稻纵卷叶螟、中华蜜蜂、丝光绿蝇、褐飞虱和烟粉虱等6个昆虫的转录组进行比较分析。丝光绿蝇转录组被注释为蛋白编码基因的比例最高,达到57%;其次为褐飞虱转录组,为56%;最少为烟粉虱,仅28%。利用双向Blast的最优匹配法进行直系同源搜索,长度比值在0.9~1.1之间的序列作为含有完整CDS的序列。在三化螟、稻纵卷叶螟、中华蜜蜂、丝光绿蝇、褐飞虱和烟粉虱等6个昆虫中分别发现了2,258、2,058、3,626、5,053、2,094和2,173条完整CDS的转录本序列。GO分析发现,6个昆虫在生化过程(Biological Process)中的差异最为明显,丝光绿蝇在发育过程(Developmental Process)中所占比例为44%,明显比其他五个物种多。在三化螟、稻纵卷叶螟、褐飞虱和烟粉虱等4个农业害虫中发现的细胞色素P450基因序列比丝光绿蝇和中华蜜蜂多,可能与农业害虫受到农药等环境因子更多的选择压力有关。丝光绿蝇中有一类特异的嗅觉蛋白(Odorant BindingProtein,OBP),表明蝇类具有更发达的嗅觉。在三化螟、稻纵卷叶螟、中华蜜蜂、褐飞虱和烟粉虱等昆虫中,发现了系统性RNAi相关的关键基因Sid-2,但是该基因没有在丝光绿蝇中找到。上述结果表明,不同昆虫转录组之间差异较大,一方面可能是由测序覆盖度的差异造成,另一方面也反映了物种之间的差异,显示转录组可用于分子进化和分子分类等研究,比较转录组学是将来转录组数据分析的发展方向之一。
  3、昆虫转录组数据拼接质量的评估软件开发
  转录组数据质量影响到后续分析的可靠性。目前主要根据N50的大小进行转录组质量评估,具有较大的局限性。为此,我们提出了两个指标来评估转录组的质量,包含完整CDS序列的百分比(CCIC)和长度比率中位数(LR50),其主要是通过转录组序列的完整性来评价转录组拼接质量。首先,将转录组序列分为四个类别:有完整CDS的序列、有5'UTR的片段、有3'UTR的片段和CDS片段。然后,计算转录组中的CCIC百分比和LR50。利用果蝇转录组数据进行模拟分析,表明CCIC百分比和LR50能够更加客观合理地反应转录组的拼接质量。使用LR50评估了6种昆虫转录组的拼接质量,发现三化螟和稻纵卷叶螟转录组的拼接质量不高。
  4、昆虫信号通路的构建软件iPathCons
  为了充分利用转录组数据,开发了iPathCons软件用于从昆虫转录组数据构建信号通路。以KEGG中20个昆虫的信号通路信息为模板,利用iPathCons分析了其他15个昆虫的基因组数据,构建了信号通路。因此,总共获得了35个昆虫的信号通路数据,以这些数据为模板,构建了iPathCons网络服务器,用于从转录组数据构建昆虫信号通路。进一步利用iPathCons从17个昆虫转录组数据中构建了信号通路,并进行了比较分析,发现72%的人类疾病相关信号通路在昆虫中能够被发现,表明昆虫可作为人类疾病模型开展相关研究。通过文献搜索,在35个基因组已知的昆虫中检索出翅发育相关的基因,构建了昆虫翅发育的信号通路。结果表明,9个昆虫的翅发育信号通路是完整的,16个昆虫缺失Ser基因,6个昆虫缺失Vg基因,4个昆虫缺失Ser和Vg两个基因。分析发现,在同等测序深度下,信号通路“淀粉和糖代谢(Starchand sucrose metabolism)”在中华蜜蜂中是完整的,包含了所有9个基因,而在其他昆虫中仅发现了3个基因,表明与糖代谢相关的基因在中华蜜蜂中的表达量很高,这可能与中华蜜蜂采集花蜜有关。
  5、昆虫信号通路的数据库iPathDB和在线分析网站
  构建了52个昆虫信号通路的数据库iPathDB,搭建了昆虫信号通路网站,提供昆虫信号通路数据的查询和下载,网站地址为:http://ento.njau.edu.cn/iPath。该数据库共包含了6个目,12,074个昆虫信号通路,98,813个基因的注释,414,895条序列。目前,分子生物学已经进入到系统生物学时代,从信号通路和基因网络的层次研究“基因与性状”之间的关系,是未来发展趋势,iPathDB的构建为从信号通路水平开展相关分析提供了可能和重要的参考。
[硕士论文] 李洋
植物保护 山东农业大学 2014(学位年度)
摘要:蝇蛹金小蜂Nasonia vitripennis,作为具有世界性分布的重要的遗传模式生物,是研究生物系统发育和进化的良好材料。关于其在北美洲和欧洲的不同地理种群的系统发育情况前人已进行调查,本研究结合已有调查结果,通过对中国蝇蛹金小蜂六个地理种群的线粒体COI基因进行序列分析,对我国蝇蛹金小蜂种群间的遗传多样性及遗传分化情况进行了初步研究,并与北美洲和欧洲种群进行比较。同时对所采集的不同地理种群的蝇蛹金小蜂Wolbachia感染情况进行了检测,分析了Wolbachia感染与其线粒体COI基因多样性的关联。研究结果如下:
  ⑴基于线粒体COI基因的不同地理种群的蝇蛹金小蜂的遗传多样性分析。为分析我国蝇蛹金小蜂不同地理种群的遗传变异情况,对六个地理种群48头蝇蛹金小蜂的线粒体COI基因片段进行了测序分析。在获得的619bp大小的线粒体COI基因片段中共发现63个单倍型和97个变异位点,其中包括30个简约信息位点和67个自裔位点。A+T含量为72.3%,G+C含量为27.7%,表现出明显的A/T碱基偏向性;基于线粒体COI基因的NJ系统发育树显示,整体上中国、欧洲和北美洲三个种群的蝇蛹金小蜂各自聚在一起,聚类结果与自然地理种群分布有明显的规律性和一致性,Mantel检验同样表明,各地理种群的遗传距离与地理距离间具有显著的相关性;总体上中国种群单倍型多样性指数Hd为0.856,核苷酸多样性指数Pi为0.00919,多样性水平明显高于北美洲,低于欧洲;和其他种群相比,新疆种群明显的表现出较高的多样性水平,接近欧洲和北美洲的种群;中国六个地理种群间的平均基因流Nm为0.65,总群体的固定系数Gst为0.277,表明中国蝇蛹金小蜂地理种群的基因流水平较低,种群间产生了一定程度的遗传分化,其中浙江种群和芜湖种群遗传分化程度较高。AMOVA分子方差分析结果表明,中国蝇蛹金小蜂地理种群的遗传分化主要来自种群内(68.36%);基于线粒体COI基因的不同地理种群蝇蛹金小蜂的中性检验结果显示,北美洲种群和欧洲种群的Tajima's D值均不显著(P>0.05),但我国Tajima's D值为显著的负值(P<0.05),说明我国蝇蛹金小蜂种群在过去可能出现过群体扩张和持续增长模式。
  ⑵Wolbachia感染与不同地理种群蝇蛹金小蜂线粒体COI基因多样性的关联。Wolbachia感染情况为新疆、芜湖和浙江种群全部感染,黑龙江、南岭、北京的感染率为62.5%、57.1%和71.4%。基于线粒体COI基因对黑龙江、南岭和北京三个种群的感染Wolbachia的个体和不感染Wolbachia的个体进行多样性分析,发现感染Wolbachia种群个体的多样性水平明显低于不感染Wolbachia种群的个体。
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