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[硕士论文] 镇景开
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48kD转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。
  方法:(1)用Consite方法分析人SPA G16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织cDNA为模版,构建含有SPA G16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/pGL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pcDNA3和S-SOX5/pTarget)以及抑制其表达的siRNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/pGL3转染至BEAS-2B细胞,以pGL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pcDNA3转染至BEAS-2B细胞,以pcDNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L mRNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pcDNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPA G16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。
  结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48kDa的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16LmRNA的水平。SOX5RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。ChIP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPA G16L的表达。
  结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPA G16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。
[硕士论文] 张世阳
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究鞭毛内转运蛋白172(Intraflagellartransportprotein172,IFT172)在小鼠生精细胞中的功能以及精子鞭毛形成过程和生育能力中的作用。
  方法:1、将成年的Ift172flox/flox雌性小鼠与Stra8-iCre雄性小鼠杂交,建立的Ift172生精细胞条件敲除小鼠为实验组小鼠,以野生型小鼠为对照。2、用10对六周以上的Ift172条件敲除雄鼠或野生型雄鼠分别与成年的野生型雌鼠交配两个月以上,评估其生育力及繁殖能力。3、收集附睾精子,精子计数,检测精子活力,光镜下观察精子形态。4、收集小鼠睾丸和附睾进行HE染色,观察精子发生过程的各个阶段。5、透射电镜(TEM)观察两组小鼠精子的超微结构。6、蛋白印迹(WesternBlot)检测IFT25、IFT27、IFT81、AKAP4、ODF2、SPAG16L等相关蛋白的表达水平。7、分离小鼠睾丸生精细胞,免疫荧光染色染色检测IFT172的定位以及Ift172条件敲除小鼠体内IFT172敲除水平,并观察精子中纤维鞘蛋白AKAP4和外周致密纤维蛋白ODF2的定位。
  结果:Ift172floJflox;Stra8-iCre条件敲除小鼠都能够生长至成年。1、与正常的小鼠相比较,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的睾丸重量/体重比例没有明显差别。其中有六成的成年雄性纯合子小鼠是不育的。2、组织学检测显示,与野生型小鼠相比,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的精子形成阶段发生异常。3、Ift172被敲除后,小鼠附睾中仅残存少量发育完全的精子,大部分精子出现精子尾卷曲。且精子数目比野生型小鼠减少了10倍左右,精子活力较野生型小鼠有明显降低。4、与野生型小鼠相比,在Ift172条件敲除小鼠的睾丸内,其他的几种IFT家族B复合物的成员IFT20、IFT25、IFT27和IFT81以及IFT家族A复合物中的IFT140的表达水平没有明显的变化。此外,轴丝蛋白SPAG16L的表达量也没有明显变化。但是外周致密纤维结构蛋白ODF2以及线粒体鞘蛋白AKAP4的表达量显著下降。5、免疫荧光染色结果显示,在野生型小鼠中IFT172定位在生精细胞中定位在长形精子细胞的精子领处,而AKAP4和ODF2在Ift172条件敲除小鼠精子中的定位与野生型小鼠相比没有明显改变。
  结论:IFT172在生精细胞中表达量减少导致小鼠精子数目、活力以及生育能力下降,IFT172是一个对于雄性小鼠的生育能力以及精子发生所必需的蛋白,它很可能参与精子发生过程中特殊的结构蛋白的运输和组装。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 崔荣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究在前期实验研究中获得一种由四因子c-Myc,Klf4,E-cadherin,Glis1诱导的,形态、体外增殖和体内外分化能力类似于胚胎干细胞,但不具有嵌合能力的部分重编程细胞,KMEG-prCs。该细胞虽具有一定多能性,但oct4,sox2,nanog,AKP并不表达,且SSEA1只在部分细胞中被激活。经转录物组分析显示,KMEG-prCs处于重编程的中间状态。该细胞可以作为一个新的细胞模型来研究重编程过程中内源多能性信号网络激活的分子机制。本研究旨在利用KMEG-prCs细胞,筛选可激活该细胞中内源多能性基因表达的小分子化合物或组合,为进一步探讨内源多能性调控网络的激活和发现新的小分子化合物组合建立新的小分子诱导体系奠定理论和技术基础。通过流式细胞分析显示,重编程不同阶段的表面标记蛋白Thy1(CD90)完全下调,CD54(ICAM-1)完全上调,CD44和SSEA1分别部分上调,CD31仅少数上调。结合转录物组的分析,进一步确定KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞。分选获得SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs,并用含有不同小分子化合物的培养液进行培养,内源多能性基因激活显示,加入HDAC抑制剂TSA、VPA、Oct4激活剂(OAC1)与腺苷酸环化酶活化剂(Forskolin)后激活了多能性基因AKP的表达,并且使一部分SSEA1阴性细胞转变为SSEA1阳性细胞。随后加入EZH2蛋白胞内增强子抑制剂(DZNeP)进一步诱导后,在小分子组合PCA+FD处理下, SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs内源oct4均被激活,SSEA1+KMEG-prCs中oct4高水平表达。获得了一个新的细胞状态,KMEG-prCs-O+,该细胞仍然保持体内外分化能力。随后,虽然将PCA+FD中的A-83-01替换为E-616452,并联合LiCl,构成PCE+FD+Li小分子化合物组合可有效激活nanog的表达,但oct4的表达被下调。综上所述,KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞,通过小分子化合物的处理其内源多能性调控网络可以被激活。该研究为探讨小分子化合物对重编程的作用机理以及进一步获得完全重编程的iPSCs奠定了基础,同样对于细胞在重编程过程中信号通路,代谢途径,表观遗传修饰等的研究提供依据。
[硕士论文] 高洋
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:肌肉抑制素(myostatin,MSTN)是TGF-β超家族的一员,广泛参与机体的生长发育调控。MSTN基因的自然突变会产生肌肉肥大的表型,在牛、羊、狗、小鼠以及人类中均有报道。MSTN通过负调控成肌生长因子,影响肌肉组织的发育和分化,同时,还参与调控肌纤维的代谢活动。
  本研究利用CRISPR/Cas9技术,获得了MSTN第三外显子部分序列敲除的小鼠。以该小鼠为模型,检测MSTN敲除对小鼠基础代谢活动以及细胞线粒体功能的影响。结果如下:通过原核注射获得的MSTN-/-小鼠各器官中的MSTN基因表达量总体呈减少的趋势,小鼠体重显著增加,肌肉发达,表现出较明显的双肌现象。MSTN-/-小鼠基础代谢率下降,体温降低。MSTN基因的敲除显著影响了肌肉组织细胞中线粒体的功能,增强了线粒体中脂肪酸的β氧化,抑制了三羧酸循环和氧化磷酸化过程;参与线粒体合成的Tfam、Nrf1与Clpp等基因的表达显著上调,参与线粒体抗氧化的Sirt1和GSH等活性也显著提升。上述结果表明,MSTN基因敲除后,显著影响了小鼠的基础代谢,抑制了肌肉组织细胞线粒体的三羧酸循环和氧化磷酸化过程。
[硕士论文] 刘淑琰
渔业 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:鲇(Silurus asotus),属鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridae)、鲇属(Silurus)。以鲇仔鱼、稚鱼、幼鱼和成熟雄性鲇为对象,系统研究了鲇性腺发生及精巢分化、精巢发育、成熟精巢周期性变化、精子结构和精子活力特征等项内容。
  本研究主要内容包括:⑴鲇性腺的发生始于鲇出膜后3日龄,生殖嵴的出现为起始标志。性腺分化发生在鲇18日龄~40日龄:卵巢分化开始于鲇18日龄,标志为卵巢腔的形成,卵巢分化完成于鲇24日龄,此时卵巢内出现大量初级卵母细胞;精巢分化于30日龄,标志为输精管的出现;而精巢分化完成于鲇40日龄,标志为精巢内出现大量初级精母细胞。⑵根据精巢形态特征,结合精子发生的组织学和细胞学特点,将鲇精巢从分化后至发育成熟分为6个时期:Ⅰ期精巢(2月龄)为1对细丝,透明或淡黄色,长≦2mm,重≦0.03g,组织切片可见少量精原细胞分散于间质细胞群间;Ⅱ期精巢(3月龄~5月龄)呈”V”形,半透明或白色,表面光滑,无明显血管,长≦35mm,重0.02 g~0.12 g,组织切片可见精原细胞增多;Ⅲ期精巢(6月龄~8月龄)边缘凹凸不平,稍皱褶,少量毛细血管,呈淡粉色,长40mm~62mm,重1.0g~3.73g,组织切片中可见精母细胞;Ⅳ期精巢(9月龄~11月龄)呈分枝不明显的树枝状,白色或淡红色,表面褶皱明显,血管粗而多,长81mm~109 mm,重1.8g~4.8g,组织切片可见精子细胞;Ⅴ期精巢,已成熟,分枝明显,白色或淡红色,长89 mm~117 mm,重2.34 g~5.0 g,组织切片可见大量成熟精子;Ⅵ期精巢为排精后的精巢,其体积缩小,血管收缩,组织切片可见少量发育不成熟的精子。⑶春季(2月~4月)精巢呈淡粉色,不饱满,血管不明显,处于Ⅲ~Ⅳ期。夏季(5月~8月)精巢呈白色或淡红色,血管显著,成熟系数为1.24%~1.83%,处于Ⅳ~Ⅴ期;7月的精巢已充分成熟,即处于第Ⅴ期,可进行人工催产。秋季(9月~11月)鲇精巢呈白色或米黄色;鲇已经排过精子,精巢明显萎缩,成熟系数下降至0.75%,处于Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅵ期。冬季(12月~翌年2月)鲇精巢呈米黄色,其内精子退化。⑷鲇精巢分为白膜和实质两部分,实质主要由小叶间质、精小叶、贮精囊和输出管构成。小叶间质由间质细胞、微血管和纤维结缔组织组成。精小叶呈不规则的管状结构,其壁分布多个精小囊;精小囊是生精细胞的发源地。贮精囊呈蜂窝状,内有嵴和腔隙,为成熟精子的贮存地。⑸采用扫描电镜和透射电镜技术观察:鲇精子由头和尾两部分组成,无颈部。精子头部近球形,直径1.85μm~2.51μm;头部无顶体,内有高度致密的细胞核染色体;头部后方凹陷形成植入窝,内有近端中心粒和远端中心粒;细胞核后方与质膜间的空隙(称袖套)内富含细胞质和线粒体、囊泡等细胞器。尾部细长,无主段、尾段之分,长44.3μm~50.7μm;横切面呈圆形,直径0.269μm~0.308μm;透过横断面可见,鲇精子尾部由轴丝和附属纤维构成,外有一层质膜包裹,无侧鳍;轴丝为典型的“9+2”结构。⑹观察不同pH、水温下鲇精子的快速运动时长和存活时长,结果表明:精子活力的适宜pH为7.0~8.5,pH8.0时,精子活力最强;精子活力的适宜温度为25℃~28℃,28℃时,精子活力最强。
[博士论文] 黄纯杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:随着社会进步,人类生殖障碍已成为全世界令人堪忧的医学和社会学难题。其中一个重要因素就是由各种已知或未知原因导致的女性卵子数量和/或质量恶化。恶化的卵子往往无法完成减数分裂或在减数分裂过程中染色体更易发生异常分离产生非整倍体配子,进而导致女性不孕、流产和新生儿先天缺陷。因此,从分子水平阐明调控卵子减数分裂和胚胎发育的机制对于提高和改善人类生殖能力具有重要的医学和社会学意义。SENP7是一种去SUMO化蛋白酶,作用于多聚SUMO链的剪切,从而维持SUMO化修饰的动态平衡。体细胞中,SENP7参与调控染色质稳态和DNA损伤修复。然而,SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的作用仍有待研究。本研究以小鼠为模型,通过敲低卵子和早期胚胎中内源性SENP7的表达以研究其在哺乳动物卵子成熟和早期胚胎发育过程中的作用及其分子机制。主要研究结果如下:
  (1)敲低GⅤ期(减数第一次分裂前期)卵子内SENP7的表达后卵子减数分裂进程受到明显抑制。表现为卵子恢复减数分裂(GVBD)和第一极体排放(PBE)受阻,导致成熟卵子的产生显著减少;
  (2)敲低SENP7表达后,组蛋白H3K9和H3K27表观修饰状态的改变(乙酰化上调和三甲基化下调),以及Cdc14B/C表达水平上调伴随着的CyclinB1和CyclinB2降解导致卵子恢复减数分裂受阻以及卵子内纺锤体组装异常;
  (3)y-tubulin定位紊乱以及泛素化修饰介导的γ-tubulin表达量下调也直接引起SENP7缺失型卵子内纺锤体组装异常;
  (4)纺锤体组装异常使恢复减数分裂的SENP7缺失型卵子后续发育受阻;同时持续活化的纺锤体组装检验点将这些卵子的发育进程阻滞在MⅠ期之前,导致这些卵子无法进入AⅠ期,进而无法排出第一极体;
  (5)敲低受精卵内SENP7表达后,胚胎发育同样出现明显缺陷。表现为胚胎卵裂受阻,大部分胚胎甚至无法发育到2细胞时期,导致囊胚发育率趋于零水平。同时,伴随着时间的延长,胚胎会发生凋亡;
  (6) SENP7缺失型胚胎内组蛋白H3K9和H3K27表观修饰的紊乱(乙酰化水平上调和三甲基化水平下调)以及DNA5hmC修饰水平的下调导致DNA损伤位点邻近的染色质无法维持DNA修复所需的理想空间结构;HP1α在常染色质上的分布导致DNA修复蛋白Rad51C的表达量下调;胚胎有丝分裂过程中纺锤体组装同样出现异常。这些因素共同导致缺失母源性SENP7的胚胎无法修复其基因组中存在的DNA损伤,因而胚胎发育出现缺陷甚至胚胎发生凋亡;
  综上,本研究揭示了母源性SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的关键作用及其分子机制。另外,本研究将SUMO化修饰与染色质上的其他修饰在生殖生物学的一些事件中联系起来,有助于认识生殖发育过程中蛋白质水平的复杂调控网络,为提高动物繁殖和人类生殖健康提供重要理论依据。
[博士论文] 曹婧
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物中,卵泡闭锁是卵泡发育过程中一个复杂且不可避免的退化过程,受到激素、生长因子等多种因素的调控,而颗粒细胞在卵泡的发育中扮演至关重要的角色,其凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因。Aurora B(丝氨酸/苏氨酸激酶)作为染色体乘客蛋白的一员,参与调控染色体的排列、纺锤体的组装以及胞质分裂等有丝分裂过程。此外,SUMO修饰参与蛋白质互作、信号转导、核质运输、转录调控以及调节基因组稳定性等方面,虽已有文献报道Aurora B可以被SUMO修饰,但是对于Aurora B及其SUMO修饰对卵泡发育的影响方面,仍然是个未解之谜。因此,本课题将以小鼠卵泡及其颗粒细胞为研究模型,主要研究Aurora B及其SUMO修饰对卵泡及其颗粒细胞发育的影响,初步探索可能存在的调控机制。本实验分为两个部分,具体内容和结果如下:
  实验一:Aurora B对小鼠卵泡及其颗粒细胞发育的影响研究
  1、AuroraB在卵泡及颗粒细胞中的定位与表达模式。获取不同发育阶段卵泡及颗粒细胞,检测Aurora B的定位及表达。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核,当胞质分裂时,位于围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的发育,Aurora B在各级卵泡和颗粒细胞中的表达水平上升,在有腔期达到最大;
  2、Aurora B影响卵泡的发育。体外分离获得次级卵泡,添加Aurora B抑制剂培养,观察记录卵泡的生长情况。研究结果显示,抑制AuroraB活性后,卵泡生长速度成下降,闭锁率增加,卵泡的发育受到抑制;
  3、Aurora B影响颗粒细胞的生长。选取有腔期颗粒细胞(pre-GCs),进行抑制剂培养,检测细胞周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,抑制Aurora B后,G0/G1期细胞比例显著增加、S期细胞比例显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻;
  4、初步探索Aurora B调控颗粒细胞生长的分子机制。选取pre-GCs进行抑制剂培养,检测调控细胞增殖与凋亡相关基因和蛋白水平。研究结果显示,Aurora B参与调控p38MAPK与Fas/FasL信号通路,下调G1期向S期转化的细胞周期蛋白CDK4、增殖相关蛋白PCNA以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,上调细胞死亡蛋白Fas、凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表达量,最终参与颗粒细胞的生长调控。
  实验二:Aurora B的SUMO修饰验证及其对卵泡颗粒细胞的影响
  1、SUMO修饰验证。成功构建几种真核表达质粒,选取pre-GCs体外分离培养,利用免疫共沉淀法检测SUMO修饰。研究结果显示,在颗粒细胞中,Aurora B可以被SUMO2修饰,Lys207为主要的SUMO2修饰位点;
  2、SUMO2修饰影响Aurora B的生物功能。体外分离培养pre-GCs,首先利用免疫细胞化学法检测Aurora B的定位分布。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核内,而Aurora BK207R主要定位在细胞核,部分定位在细胞质中;其次利用Westernblot法检测Aurora B的蛋白稳定性。研究结果显示,SUMO2可以在一定范围内促进Aurora B的蛋白表达水平。表明,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的定位与蛋白稳定性;
  3、SUM02修饰影响颗粒细胞的生长。体外分离培养pre-GCs,分别转染对照组(HA)、正常组(HA-Aurora B)和突变组(HA-Aurora BK207R),检测细胞的周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,突变组G0/G1期细胞比例显著增加、S期和G2/M期细胞比例均显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻。
  综上,本研究发现在小鼠卵泡中,Aurora B定位于颗粒细胞核,胞质分裂时,转定位至中间体和围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的成熟,Aurora B在卵泡和颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,在有腔期达到最大。抑制Aurora B后卵泡生长受阻、凋亡增加,并通过p38MAPK和Fas/FasL信号通路,下调CDK4、PCNA和Bcl-2的水平,上调caspase-8、caspase-3水平,影响颗粒细胞生长。此外,发现AuroraB可以被SUMO2修饰,Lys207为主要修饰位点,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的亚细胞定位和稳定性,影响颗粒细胞的生长。本研究结果将为卵泡的发育和闭锁提供一定的理论依据,同时也为更好的治疗卵巢疾病奠定基础。
[硕士论文] 王晨
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:FHL2(Four and a half LIM domains protein2)是FHL蛋白家族成员之一,可作为转录因子共结合因子,参与细胞增殖、迁移、凋亡、信号转导和基因转录等诸多过程。目前,基于FHL2的研究主要集中在心脏、骨骼和癌症中,对生殖发育方面的研究较少。研究表明,FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,可通过结合NR5A1,调控抑制素α基因的转录,提示FHL2对生殖具有重要调控作用,但调控作用及作用机制尚不清楚。因此,本实验以昆明小鼠卵巢颗粒细胞(mGCs)为模型,研究FHL2对小鼠颗粒细胞的调控作用及作用机制,旨在为阐明哺乳动物卵泡发育调控机制提供理论基础。主要研究结果如下:
  (1) FHL2在小鼠卵巢中的时空表达与定位规律:收集新生小鼠(1-6天)及3周和10周的小鼠卵巢,免疫组化实验结果表明,FHL2的表达量随着卵泡组装和原始卵泡池的形成逐渐升高,在颗粒细胞和卵母细胞中均有表达;Western Blot检测结果显示,出生后1天、4天和7天小鼠卵巢FHL2表达量逐渐上升;
  (2) FHL2在颗粒细胞细胞核和细胞质中表达:Western Blot和免疫荧光方法证明,FHL2在mGCs细胞核和细胞质中均有表达,定位与细胞所处的分裂周期有关;
  (3) FHL2促进小鼠颗粒细胞的增殖:体外培养小鼠颗粒细胞,分别转染FHL2小干扰RNA或过表达质粒,CCK-8、细胞计数,流式细胞分析方法结果表明,敲低FHL2后,细胞活力显著降低,S期细胞比例显著降低,细胞凋亡显著增加;过表达FHL2,则可以显著促进小鼠颗粒细胞生长,提高细胞活力,抑制细胞凋亡;
  (4) FHL2通过结合转录因子AP-1和NF-κB调控EGF和EGFR转录:转染FHL2 siRNA后,敲低组EGF和EGFR的mRNA表达量和蛋白表达量显著降低,而超表达FHL2则显著提高EGF和EGFR的表达量;进一步利用Co-IP和CHIP方法证明,FHL2分别结合转录因子AP-1和NF-κB,在转录水平上调控EGF和EGFR的表达;
  (5) EGF对小鼠颗粒细胞生长的调控依赖于FHL2表达量:EGF(20 ng/mL)可显著促进mGCs增殖、提高细胞活力,提高S期细胞比例;敲低FHL2后,EGF对颗粒细胞的促增殖作用受到抑制,提示EGF对小鼠颗粒细胞的调控依赖于FHL2表达量;此外,EGF处理可诱导颗粒细胞EGF和EGFR的表达量显著上升;敲低FHL2后再用EGF处理,EGF对其自身和其受体的诱导作用被显著抑制;
  (6) EGF可促进FHL2表达,尤其是诱导细胞核内FHL2表达量上调:上述实验说明,EGF通路可能与FHL2存在互作,为进一步验证该假设,利用EGF处理小鼠卵巢颗粒细胞,结果表明,EGF(20 ng/mL)处理可诱导mGCs FHL2表达;而分别添加EGFR抑制剂(AG1478)、MEK抑制剂(UO126)和PI3K抑制剂(LY294002)则可以阻断EGF对FHL2表达的调控,说明EGF可通过结合EGFR,激活MEK和PI3K信号通路,参与小鼠颗粒细胞FHL2的表达调控;免疫荧光检测结果显示,EGF可诱导颗粒细胞核内FHL2表达量显著上调;Western Blot结果进一步表明,随EGF处理时间的增加,FHL2在核内表达的表达量逐渐增加,呈时间依赖模式。
  在本研究中,发现FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,并参与颗粒细胞的生长调控。EGF与EGFR在细胞膜上结合,激活MEK和PI3K信号通路,调控FHL2表达,并促进FHL2在细胞核内聚集,而核内FHL2可作为转录因子共激活子,通过结合转录因子AP-1和NF-κB,促进EGF和EGFR的表达,从而形成EGF/EGFR/FHL2自分泌通路,调控颗粒细胞的生长与增殖。研究结果阐明了FHL2对颗粒细胞生长的调控作用及作用机制,有助于我们更好的理解哺乳动物生殖发育调控网络,并为提高家畜繁殖力新技术研发提供科学依据。
[硕士论文] 杜健
动物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:外泌体,一类直径在50-150nm具有双层膜结构的细胞外囊泡,存在于生物的各种体液中。外泌体可以通过负载蛋白质、多肽、mRNA、长链非编码RNA、miRNA、环状RNA以及tsRNA调节不同细胞的生物活性。目前,许多研究表明外泌体在肿瘤的形成、迁移和代谢方面发挥着重要作用,同时还与许多疾病的发生密切相关。
  在精子发生的过程中,精原干细胞除了形成一个走向分化命运的精原细胞外,还会形成一个与自身相同仍旧拥有干性的细胞。在睾丸曲细精管内的“niche”微环境中,支持细胞分泌的各类因子对于精原干细胞的自我维持与更新发挥着重要的作用。附睾和精浆中的细胞外囊泡参与了精子发生的过程中,然而,在曲细精管内支持细胞来源的胞外囊泡对精原干细胞的调节作用所知甚少。
  本研究对支持细胞分泌的胞外囊泡进行了鉴定,并且探究了其对精原干细胞的影响,主要结果为:
  (1)收集不同发育阶段小鼠的睾丸,通过免疫组织化学的方法,在曲细精管内对外泌体标志性蛋白质CD63进行了定位。发现在小鼠不同发育阶段,CD63主要定位在支持细胞的细胞质,并且呈颗粒状分布。同时,CD63在小鼠出生后前7d有很高的表达量,这表明含有CD63的阳性囊泡在精子发生的过程中发挥着重要作用。
  (2)通过梯度离心和超速离心的方法,首次分离纯化出原代支持细胞释放的细胞外囊泡。在电镜下可以观察到囊泡具有双层膜结构,并且通过纳米颗粒跟踪仪测量出囊泡的大小主要在76nm左右。利用蛋白质免疫印迹发现分离出的囊泡含有外泌体的特异性蛋白质CD63。因此,从形态特征、粒径大小以及标志性蛋白质这三个方面鉴定出这类囊泡主要是外泌体。
  (3)用DiI对分离出的外泌体进行标记,发现DiI-外泌体可以附着在C18-4细胞以及原代精原干细胞的表面,呈现颗粒状不均匀分布。
  (4)在无血清的培养条件下添加100ng/μL外泌体培养24h,同时未添加外泌体的细胞作为对照组。发现加入外泌体后,C18-4细胞和原代精原干细胞的状态良好,细胞饱满,表面光滑,而对照组的细胞表面出现大量颗粒,细胞萎缩,细胞状态变差。
  因此,本研究首次分离纯化出支持细胞来源的外泌体,通过表型分析发现这类外泌体可以附着在精原干细胞表面,并且可以维持精原干细胞的存活。通过本项研究,能够进一步揭示支持细胞调控精原干细胞的方式,对于了解精原干细胞的功能和调控机制开辟了新的视野并奠定了前期的工作基础。
[硕士论文] 李阳
动物遗传育种与繁殖 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:约束应激会造成卵母细胞的氧化应激,并进一步导致卵母细胞的损伤,影响发育能力。褪黑素(melatonin,MT)是高效的抗氧化剂。在体外环境、老化、化学物质等诱发的卵母细胞和胚胎氧化应激中,适度的褪黑素处理可以有效清除活性氧族(reactive oxygen species,ROS)缓解氧化应激,改善卵母细胞和胚胎发育能力。因此,我们推测针对母体的褪黑素处理,可以缓解约束应激造成的卵母细胞损伤。本试验将以约束应激小鼠为模型,探究母体注射褪黑素对卵母细胞的保护作用。
  试验对小鼠超排后的卵母细胞进行收集统计,观察约束应激和褪黑素对小鼠超排效果的影响。结果显示,与对照组相比,约束应激处理48小时后小鼠排卵数显著增加(P<0.05),而注射褪黑素后排卵数恢复至正常超排水平,表明约束应激增强了小鼠的超排反应,褪黑素能够对其进行有效地缓解。
  通过检测卵母细胞活性氧水平、线粒体拷贝数、线粒体活性和膜电位,以此来评价褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞质量的影响。结果显示,与对照组相比,约束应激后卵母细胞内ROS含量显著上升(P<0.05),线粒体拷贝数显著增加(P<0.05)、线粒体活性显著降低(P<0.05)、膜电位异常升高(P<0.05),而褪黑素处理后线粒体活性显著升高(P<0.05)、膜电位显著降低(P<0.05),但拷贝数变化不显著(P>0.05)。这些结果表明约束应激造成小鼠卵母细胞氧化应激,增加了线粒体的数量但同时对线粒体的功能造成损伤,影响了卵母细胞的质量,而母体注射褪黑素可以提高约束应激小鼠卵母细胞的质量。
  利用卵母细胞体外受精技术并对获得的囊胚进行细胞数和凋亡染色,评价褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞体外发育能力的影响。结果发现与对照组相比,约束应激小鼠卵母细胞体外受精后受精率和卵裂率并未显著降低(P>0.05),但囊胚率和囊胚细胞数显著下降(P<0.05),并且凋亡的囊胚比例显著上升(P<0.05)。注射褪黑素后可以显著提高囊胚率和囊胚细胞数,并且显著降低凋亡的囊胚比例(P<0.05)。这些结果表明,约束应激会损伤小鼠卵母细胞受精后到附植前的发育能力,而褪黑素的使用提高了约束应激小鼠卵母细胞的体外发育能力。
  上述试验结果证实:母体的约束应激会诱发异常的超排反应,并造成卵母细胞氧化应激,降低卵母细胞质量和体外发育能力。针对约束应激小鼠进行褪黑素注射,能有效缓解约束应激反应,改善卵母细胞质量,并提高卵母细胞体外发育能力。
[硕士论文] 罗利娟
生理生态及行为生态学 沈阳师范大学 2017(学位年度)
摘要:表型可塑性是生物长期进化过程中形成的一种适应策略。消化器官形态和生理方面的表型可塑性,能够限制动物获取营养和能量的速率。在自然环境中,动物时常会经历食物质量和数量的变化,为满足其对能量和营养的需求,消化道器官形态和小肠刷状缘膜上的各种酶活力会发生适度的调节。为探究食物营养成分变化对不同生活史阶段小鼠消化的影响,选取了哺乳期、正常生长期及繁殖期的小鼠,测定了日摄食量、内脏器官及消化道器官的形态、小肠组织蛋白浓度、幼鼠胃内容物的蛋白浓度及小肠刷状缘膜上的消化酶(二糖酶和氨基肽酶)活力,并分析了消化率及不同食物组间消化策略的差异,主要的结果与结论如下:
  1.小鼠肠道四种消化酶活力出生后发育的时间变化模式不同。乳糖酶活力先增后降,在9~12日龄达最高,至27日龄降至微弱,且不同位置时间不同步;蔗糖酶活力12日龄始出现,自15日龄迅速升高,至18~21日龄达到最高,但随后显著降低;麦芽糖酶出生时已具有活力,但15日龄以前维持较低水平,此后迅速升高,在18~21日龄达到峰值,此后下降;小肠前段的氨基肽酶活力出生后持续下降,而后段和中段则持续升高,断乳后略有下降。这表明,小鼠小肠4种消化酶活力的时间变化能够与其食物转变的消化需求相匹配。
  2.为研究食物营养成分是否会影响母鼠乳汁成分进而影响到幼鼠的发育,在母鼠分娩当天饲喂高淀粉、普通、高蛋白食物。结果发现,食物营养成分可影响到乳汁成分,但小肠刷状缘膜上的消化酶活力受到食物成分的影响较小。
  3.为比较断乳后不同发育期的消化表型可塑性差异,不同食物驯化亚成年和成年小鼠两周后,检测比较了摄食消化、器官形态、小肠消化酶活力及血液指标。结果表明,成体小鼠肠道二糖酶活力比亚成体小鼠可塑性能力强,而氨基肽酶活力相反。
  4.高淀粉、普通和高蛋白食物饲喂哺乳期母鼠,结果发现,其摄食量随幼鼠日龄的增加而不断增加,但消化率无显著变化,且三组母鼠小肠刷状缘膜上二糖酶活力支持适应性调节假说,氨基肽酶活力不支持适应性调节假说。血清中的葡萄糖和甘油三酯浓度无显著差异,而高蛋白食物组血清中的尿素氮和肌酐浓度显著高于高淀粉组。
[硕士论文] 史文姝
动物遗传育种与繁殖 延边大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精过程中,多精入卵被视为最普遍的异常受精,而近年来的许多研究表明,透明带(ZP)的泛素化异常是造成多精入卵的主要原因之一。泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)是一种主要的去泛素化酶,研究显示UCHL1与透明带蛋白的泛素化水平相关。本试验的丰要目的是探究抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响。试验主要分三部分进行:(1)UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用DAPI染色观察极体排放情况,从而验证抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟率的影响;(2) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用SDS-PAGE和Western blot等方法检测猪卵母细胞透明带泛素化水平的影响;(3) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用Hoechst染色观察精卵粘附及多精入卵情况。试验得到以下结果:
  1.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,对照组成熟率为66.22%,而30μM组的成熟率为5.30%,且各处理组成熟率差异性显著(P<0.05),结果表明抑制UCHL1对猪卵母细胞的体外成熟有影响。
  2.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,经Western blot检测结果显示各处理组的ZP在约65kDa,85kDa,120kDa处均发生不同程度的泛素标记,通过灰度值分析差异显著(P<0.05),结果表明随UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。
  3.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,进行体外受精,经Hoechst染色显示对照组ZP精子粘附数最多,精子入卵数最少;随着UCHL1抑制剂浓度逐渐增大,ZP精子粘附数逐渐减少,精子入卵数逐渐增多;添加30μM UCHL1抑制剂组的ZP精子粘附数少,没有精子入卵。结果表明UCHL1调节ZP精子粘附及多精入卵。
  结果显示,UCHL1抑制剂对猪卵母细胞的体外成熟有影响。随着UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。UCHL1调节ZP精子粘附以及多精入卵。
[硕士论文] 李元志
发育生物学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:在许多动物体和人体中,气管系统(呼吸系统)发育的缺陷会导致致死性的疾病。由于脊椎动物脉管系统和果蝇气管系统发育机制上的相似性,研究果蝇的气管发育可以为脊椎动物脉管系统疾病的产生机理提供借鉴。果蝇是经典的模式生物,在遗传发育生物学史上具有重要地位,可以作为研究气管系统发育的理想的生物学模型。
  果蝇气管是从20团基板前体细胞中发育而来,经历了细胞分裂、分化、迁移、变形、分支融合等多个复杂过程,最终发育成了遍布全身各处的气管网络系统。果蝇气管的发育过程是受到多种因子调控的生物学过程,多种生物分子和信号通路相互协调合作,构成了一个庞大的调控网络来调控气管的正常形成。
  T-box家族转录因子在生物发育的早期起到重要作用,其会在特定的器官或细胞类型中表达,对早期的细胞命运决定、细胞分化和器官形成也是必须的。Midline(Mid)作为T-box家族转录调控因子在果蝇胚胎发育的早期就开始表达发挥作用,对果蝇的肌肉、性腺、眼、腿、翅、心脏和神经系统等多种组织和器官的发育产生重大影响,但是目前关于Mid对果蝇气管发育的调控机制还没有报道过,本研究旨在探究Mid在气管发育过程中发挥的重要功能。
  本课题利用lacZ标记、原位杂交、免疫荧光染色等生物学技术,分析了T-box转录调控因子Mid在果蝇气管发育中的作用,并研究了其表达模式和功能。本研究发现转录调控因子Mid在果蝇的气管中广泛表达,并且对于果蝇气管的发育起到重要的作用。在气管系统中,Mid功能的缺失或者过表达都会引起气管发育的异常或受损,而通过表型拯救的气管则会发育正常。在研究过程中还发现,mid和slit基因的表达在气管系统中存在共定位情况,且先前有文献报道slit基因可调控气管发育过程,进而我们发现mid和slit存在遗传学相互作用,并且Mid直接调控slit在气管上的表达。综上所述,我们提出Mid通过激活slit基因的表达来调控果蝇气管的发育。
  本研究是首次探究了Mid对果蝇气管发育的影响,阐明了Mid控制气管发育的机制,为其他动物体和人体中气管系统(呼吸系统)发育的研究奠定了理论基础,同时为研究气管系统(呼吸系统)疾病提供重要依据,具有重大的意义。
[硕士论文] 杜安丽
动物学 华中师范大学 2017(学位年度)
摘要:沃尔巴克氏体(Wolbachia)是一类普遍存在于节肢动物和丝虫线虫体内的革兰氏阴性菌,Wolbachia具有多种操控宿主生殖的方式,如孤雌生殖、杀雄、精卵细胞质不亲和(CI)和雌性化。其中细胞质不亲和(CI)是最常见也是研究的最多的一种表型,即当感染了Wolbachia的雄性和未感染或感染不同Wolbachia的雌性宿主交配时,会导致后代胚胎孵化率很低或为零。精卵细胞质不亲和引起受精卵第一次分裂时,来自父本的染色质浓缩缺陷,雄性原核的发育速度滞后,形成染色质间桥,导致胚胎发育停止,从而引起胚胎死亡。虽然已有许多研究提出了多种解释CI表型产生的模型,但是Wolbachia诱导产生CI的分子机理尚在探究中。
  有研究者用SDS-聚丙烯凝胶电泳和质谱分析技术,在感染Wolbachia的尖音库蚊卵巢以及与感染Wolbachia雄蚊交配后的雌蚊受精囊中都检测到了Wolbachia基因wPip_0282编码的56kDa的蛋白。通过与多种不同种Wolbachia编码的蛋白同源比对发现,与wPip_0282及其同源下游共转录基因wPip_0283编码的蛋白具有同源性的Wolbachia蛋白只存在于能够诱导CI产生的Wolbachia中。在wMe1Wolbachia菌株中只有wMe1_0631和wMe1_0632与wPip_0282和wPip_0283编码的蛋白具有同源性,编码wMe1_0631和wMe1_0632蛋白的基因为WD0631和WD0632。因此,为了探究WD0631和WD0632是否和CI发生相互关联,本研究提取Dme1wMe1果蝇基因组DNA,从中扩增出Wolbachia基因WD0631和WD0632的CDS全长,将扩增的WD0631基因和pEASY-T1载体连接,构建成pEASY-T1-WD0631质粒。pEASY-T1-WD0631质粒经过glⅡ和KpnⅠ双酶切后与双酶切后的pUAST表达载体相连接,形成重组质粒pUAST-WD0631。将重组质粒pUAST-WD0631和转座酶质粒P△2-3按照一定的比例混合,将混合质粒通过胚胎显微注射技术,注入w1118品系果蝇早期胚胎的生殖质中,注射后成活的果蝇可通过重组质粒中带有的mini-white眼色标记基因进行筛选,得到转基因成功的果蝇。将获得的有眼色的果蝇与平衡子品系果蝇进行杂交,逐步完成染色体的平衡和定位,最终获得纯合的转基因果蝇。将扩增的WD0632基因和pEASY-T1载体连接pEASY-T1-WD0632质粒。pEASY-T1-WD0632质粒经过XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后,将纯化的酶切后WD0632基因与双酶切后的pUAST表达载体相连接,但是经过多次尝试,均未连接成功,最后本研究没能得到重组质粒pUAST-WD0632。
  为了研究pUAST-WD0631转基因果蝇是否会产生CI相关表型,将nosGal4和bamGal4品系果蝇分别和转基因品系杂交,通过UAS/Ga14系统驱动WD0631基因分别在果蝇生殖腺和精巢中过表达,然后通过RT-qPCR的方法检测了WD0631基因在果蝇精巢中的表达量,发现与对照组相比,WD0631基因在转基因果蝇中极显著升高(p<0.01),说明过量表达成功。为了进一步研究WD0631基因对转基因雄性果蝇后代繁殖力的影响,本研究分别用actGal4、nosGal4和bamGal4驱动的WD0631过量表达的一日龄雄蝇与未感染果蝇三日龄处女蝇交配,统计后代胚胎孵化率和产卵量,结果显示,后代的胚胎孵化率和产卵量与对照组相对比并没有呈现出差异(p>0.05),说明WD0631基因单独作用不能对果蝇繁殖力产生影响。WD0631基因和WD0632为上下游基因,并发生共转录,因此两个基因可能在一起发挥作用才能诱导果蝇产生CI。
  综上所述,本研究成功构建了Wolbachia基因WD0631分别在果蝇Ⅱ和Ⅲ号染色体上的纯合转基因果蝇品系,初步分析表明,整合在果蝇基因组中的Wolbachia基因WD0631能在果蝇体内过表达,但是过表达的WD0631基因还不足以影响果蝇后代繁殖力,推测基因WD0631和WD0632共同发挥作用才有可能影响果蝇后代的繁殖力,使宿主果蝇产生类似CI的表型。
[硕士论文] 郭佳银
动物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:精子发生包括精原细胞的增殖与分化,减数分裂和精子细胞的变形成熟等过程,受到转录因子、组蛋白修饰和非编码RNA等表观调控因子调控。近期研究表明m6A是真核生物mRNA上最丰富的一种化学修饰,参与调控mRNA剪接,降解以及翻译等代谢过程,从而调控基因的表达;另据报道,m6A修饰参与精子发生的调控。FTO作为第一个被发现的m6A去甲基化酶,通过调控m6A修饰水平参与调控脂肪细胞的分化,癌细胞的增殖。MA2作为甲氯芬那酸(meclofenamic acid,MA)的乙酯形式,可以有效的竞争性结合到FTO的活性中心,从而抑制FTO的m6A去甲基化酶活性。为探究m6A修饰对精原细胞增殖的调控作用,本研究选择小鼠B型精原细胞和初级精母细胞之间阶段来源的GC-1spg细胞作为研究对象,采用western blot、qRT-PCR、细胞流式、EdU、m6A dot blot等方法研究m6A对GC-1spg细胞增殖的调控作用;此外,构建双荧光报告系统并验证m6A报告质粒的功能。获得结果如下:
  1、MA2处理不影响FTO蛋白的表达,mRNA的m6A修饰水平在MA2处理后显著上调,并且m6A修饰水平的增加与MA2处理浓度呈正相关。
  2、MA2处理导致GC-1spg细胞活性的降低,多核细胞数目的增加,但是TUNEL阳性细胞比例没有改变;同时,Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3,Bax和Bcl2的蛋白表达无显著变化。
  3、MA2处理GC-1spg细胞导致EdU阳性细胞比例的下降,和增殖标记基因PCNA和ki67表达的下调。另外,MA2处理诱导GC-1spg细胞周期G1/S阻滞。
  4、查询在线数据库(http://mirlab.sysu.edu.cn/rmbase/)得到含有m6A修饰的细胞周期调控基因;进一步的检测表明MA2处理上调CDK8的表达,但是下调CDK1,CDK2,CDK7,CDK9和CDK12的mRNA表达。
  5、针对CREBBP基因3'UTR区的3个m6A修饰位点成功构建了CREBBP-m6A报告系统,结果表明细胞中mCherry的荧光强度与m6A修饰水平呈负相关。构建了CDK2基因3'UTR m6A修饰位点的荧光报告质粒,并验证了CDK23'UTR区的m6A修饰可以调控CDK2转录本的表达。
  综上,通过FTO抑制剂MA2处理GC-1spg细胞,增加精原细胞中mRNA的m6A修饰,并调节细胞周期调控基因的表达,进而诱导细胞周期G1/S阻滞,抑制细胞增殖。此外,建立了以CREBBP-m6A报告质粒为基础的m6A修饰水平变化的检测系统。
[硕士论文] 马美琳
动物遗传育种与繁殖 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:骨骼肌是机体运动的主要执行者及代谢活动的主要调控因子,其生长发育主要受一系列转录因子及表观遗传调控因子的调控。mircoRNA长度为18-24个核苷酸,通过与靶基因mRNA的3'非翻译区(3'UTR)结合,在转录后水平调控靶基因的表达。研究表明,mircoRNA在骨骼肌的发育过程中发挥着重要的作用。通过mircoRNA测序分析,发现miR-432-5p在35日龄仔猪的背最长肌中的表达水平显著高于在287日龄成年荣昌猪的表达水平,差异高达7倍;且miR-432在小鼠、人和猪等不同物种中高度保守。基于此,本研究以C2C12成肌细胞系为研究材料,旨在探索miR-432在骨骼肌成肌细胞增殖与分化中的作用及调控机制。
  本实验通过对成肌细胞转染miR-432模拟物(mimics)或miR-432抑制物(inhibitor),研究了miR-432对成肌细胞增殖和分化的作用;运用生物信息学和双荧光素酶报告试验,预测并验证miR-432的靶基因,进一步探索了miR-432调控成肌细胞增殖与分化的分子机制。获得如下主要结果:
  1.miR-432抑制成肌细胞的增殖
  在成肌细胞中过表达miR-432可以显著下调增殖相关基因Cyclin E,PCNA和CDK2mRNA与蛋白表达水平,并显著下调S期的细胞数及总的细胞数目;相反,抑制miR-432后促进了成肌细胞的增殖过程。
  2.miR-432抑制成肌细胞的分化
  过表达miR-432后可以显著抑制分化关键转录因子MyoG和标志基因MyHC mRNA和蛋白表达水平;通过免疫荧光染色技术,发现miR-432能显著抑制肌管的形成并下调分化指数。
  3.miR-432直接靶定E2F3和P55PIK构建野生型及突变型双荧光素酶报告载体后,miR-432能显著抑制E2F3和P55PIK野生型荧光素酶活性,而不影响其突变型荧光活性。不同浓度的mimics处理成肌细胞后,E2F3和P55PIK的mRNA表达呈现浓度依赖式下降。
  4.miR-432通过抑制P55PIK介导的PI3K/Akt/mTOR通路抑制成肌细胞的分化
  过表达miR-432能显著下调分化期的p-Akt/t-Akt及p-mTOR/t-mTOR比值,但不影响增殖期的p-Akt/t-Akt及p-mTOR/t-mTOR比值。当加入低浓度的胰岛素(insulin)后,miR-432对分化的抑制作用被削弱,而加入高浓度的insulin后能基本消除miR-432对分化的抑制作用。
  本研究基于miRNA测序,解析了中国西部地区肉质优良地方品种荣昌猪的肌肉发育特性,发现miRNA-432-5p在35日龄荣昌猪背最长肌的表达显著高于287日龄,进一步研究表明该miRNA靶向E2F3和P55PIK,并通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制成肌过程。研究结果为探索中国地方猪品种肉质优良特性的非编码RNA调控提供了新的候选基因,也为猪优良肉品质性状选育提供了科学依据。
[硕士论文] 邵梦思
生态学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:信号转导与转录激活因子(STAT1)在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化以及免疫功能调节等生物学过程中起着重要的作用。本研究室前期运用基因差异表达谱分析方法对人类STAT1基因进行了研究分析,发现STAT1基因和骨质疏松之间相关联。斑马鱼和人类基因有着高达87%的同源性,本研究以模式生物斑马鱼为研究对象,对stat1b基因在斑马鱼骨骼发育中的作用进行探讨。
  本研究运用CRISPR/Cas9基因打靶技术对斑马鱼stat1b基因进行敲除,并获得能够稳定遗传的基因突变型斑马鱼,建立斑马鱼stat1b-/-突变模型。将两个靶位点的gRNA和Cas9-mRNA以一定的比例混合后,注射到野生型斑马鱼一个细胞水平的胚胎里进行基因编辑。通过PCR扩增、DNA纯化回收、T7E1酶切以及Sanger测序等一系列分子实验进行检测,筛选出四条基因突变的F0代斑马鱼突变体。经过杂交传代后,从F1代中筛选出能够稳定遗传的四种不同的基因突变类型,分别编号为stat1b-S1,stat1b-S2,stat1b-S3,stat1b-S4。其中stat1b-S1和stat1b-S2在编码蛋白质氨基酸的外显子上发生了小片段基因缺失且缺失的碱基数目不是三的倍数,因此在进行氨基酸序列翻译时产生了移码,改变了翻译出来的氨基酸序列,stat1b-S3和stat1b-S4为大片段的基因缺失,缺失的基因序列包括编码氨基酸的外显子和不参与翻译的内含子,缺失的外显子造成了一段氨基酸序列的缺失并没有产生移码效应。对这四种突变品系的stat1b蛋白质进行二级结构和空间结构预测,stat1b-S1和stat1b-S2的预测结果显示和野生型有明显的差异,而stat1b-S3和stat1b-S4与野生型空间结构基本相似,相似度达到了90%以上。
  stat1b-S2突变型的斑马鱼容易发生脊柱畸形弯曲和尾鳍畸形,将野生型和stat1b-S2斑马鱼突变体进行破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色,发现stat1b-S2突变型斑马鱼的破骨细胞有所增加而成骨细胞减少,mirco-CT扫描分析发现突变型斑马鱼和野生型斑马鱼在骨骼形体和发育上有一定的差异,突变型斑马鱼骨密度(BMD)和骨小梁数(Tb.N)都有明显的降低。研究表明stat1b基因和斑马鱼骨骼发育相关且可能参与破骨细胞和成骨细胞发育的调控,stat1b基因对斑马鱼骨骼发育起到促进作用。stat1b基因突变造成氨基酸的改变可能对stat1b蛋白质结构和功能产生了影响,进一步影响了斑马鱼的骨骼发育。
[硕士论文] 王奇
临床兽医学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:胚胎的成功植入依赖于容受性子宫与活性囊胚之间复杂的分子对话,子宫容受性的建立是哺乳动物胚胎成功植入的关键步骤。子宫内膜仅在一段十分短暂的时间内具有接受活性囊胚的能力,这一时期叫做“着床窗口期”。尽管体外受精和胚胎移植技术在生产实践中已被广泛应用,但是妊娠率依然不理想,子宫内膜容受性破坏被认为是辅助生殖技术失败的主要原因之一。既往的研究充分显示了蛋白编码基因和miRNAs在子宫内膜容受性建立、胚胎植入以及后继蜕膜化过程中所发挥的重要作用。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作为非编码RNA家族中数量最多的一员,在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的功能已有深入研究,但在胚胎着床过程中的作用鲜有报道。本试验收集妊娠小鼠第4天、第5天着床位点和非着床位点子宫样本进行深度测序,以期获得小鼠着床窗口期子宫中的lncRNAs图谱,为今后深入研究lncRNAs在子宫内膜容受性建立以及后继蜕膜化过程中的作用及机制奠定基础。本试验得到的主要结果如下:
  1通过Illumina HiSeqTM2500高通量测序平台获得了小鼠着床窗口期子宫组织中的lncRNAs图谱,共得到lncRNA有7764个,其中已知lncRNA6179个,新预测lncRNA1585个。我们从中挑选了13个差异表达的lncRNAs并对其进行了qRT-PCR验证,与测序结果相吻合。
  2进一步对所获得的lncRNAs的表达水平、序列和位点保守性进行分析,预测lncRNA的cis和trans作用靶基因;将获得的74个差异表达lncRNAs靶基因进行了GO和KEGG富集分析,发现在植入窗口期差异表达的lncRNAs主要参与组织重塑、免疫反应和代谢相关过程,对胚胎着床过程中的多种信号通路具有调控作用。
  3在测序结果中,我们发现一个在小鼠妊娠第4天子宫中显著上调,在第5天着床位点和非着床位点差异表达的已知lncRNA GAS5。进一步通过构建小鼠早期妊娠、延迟着床与激活、类固醇激素处理模型,揭示GAS5在着床窗口期子宫中呈现动态表达模式,GAS5在妊娠子宫中的表达受活性胚胎和孕酮的调节,预示着GAS5可能在子宫内膜容受性的建立以及胚胎植入过程中发挥作用。
  4 FISH的结果表明,GAS5定位于小鼠子宫内膜基质细胞的细胞核。人工诱导蜕膜化子宫中GAS5的表达显著上调,随体外诱导蜕膜化时间的增加GAS5表达下降,预示着GAS5可能在蜕膜化过程发挥一定的功能。
  综上所述,本研究建立了小鼠着床窗口期lncRNAs图谱,筛选出着床窗口期差异表达的lncRNAs,并且对这些差异lncRNAs进行了功能注释以及通路分析。GAS5可能参与调节小鼠的胚胎着床和蜕膜化过程,并且GAS5在早期妊娠过程中可能受到活性胚胎和孕酮的调节。
[博士论文] 周成杰
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:Centromere protein F(CENPF)是一个含有亮氨酸拉链及卷曲螺旋结构域的动粒蛋白,属于着丝粒蛋白家族成员。同时CENPF也是一个多功能蛋白,在有丝分裂中对细胞增殖、囊泡运输及细胞形变等过程具有重要的调控作用,这些功能的发挥依赖于CENPF跟微管蛋白(Microtubule,MT)的相互作用。然而,目前对于CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的功能所知甚少。因此,我们的研究将重点对CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的功能进行详细探讨。
  在第一部分(第二章)研究中,我们对CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能进行了研究。首先探讨了CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达及亚细胞定位情况,对CENPF在卵母细胞中的定位机理进行了初步探讨。其次,利用Cenpf特异性的siRNA及Morpholino(MO)对CENPF表达进行敲减,进一步研究CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能。最后,对CENPF调控小鼠卵母细胞减数分裂过程潜在的作用机理进行了研究。
  在本章研究中,收取GV、GVBD、MⅠ、AⅠ-TⅠ及MⅡ期卵母细胞,利用免疫印迹及免疫荧光技术对CENPF进行蛋白定量及定位研究。免疫印迹结果显示,CENPF在减数分裂的各个时期均有表达,在GV期表达量较低,在减数分裂中期(MⅠ期及MⅡ期)表达量较高。免疫荧光结果显示,CENPF在GV期定位于细胞核的核膜。随着卵母细胞发生GVBD,CENPF开始定位于纺锤体,并持续到减数分裂结束,除TⅠ期外,CENPF还定位于着丝粒上。为了探究CENPF的定位机制,我们利用微管干扰药物Nocodazole(促进微管解聚)和Taxol(抑制微管解聚)处理MⅡ期卵母细胞,结果发现CENPF在纺锤体上的定位依赖于微管蛋白的稳定,在着丝粒上的定位则不依赖于微管蛋白。进一步利用法尼基转移酶抑制剂(Farnesyl Transferase Inhibitor,FTI) SCH66336处理卵母细胞,发现CENPF在GV及MⅠ期的定位不依赖于自身的法尼基化,在MⅡ期的定位则依赖于自身的法尼基化。
  Cenpf-siRNA及CENPF-MO对CENPF功能干扰的实验结果表明,CENPF缺失会导致GVBD及第一极体排放(First polar body extrusion,PBE)失败。TUBB及DNA免疫荧光染色结果显示,CENPF缺失导致纺锤体组装缺陷及染色体中期板集合失败。eGFP-TUBB及mCherry-H2B实时观察结果进一步表明,CENPF缺失后,纺锤体组装失败,染色体无法正确排列到中期板,进而导致减数分裂失败。染色体铺片结果显示,CENPF缺失导致MⅡ期卵母细胞染色体的异倍性显著升高。对减数分裂失败并停滞在MⅠ期的卵母细胞研究发现,虽然染色体稳定性暂时没有受到影响,但因为姐妹染色单体着丝粒间距变宽,从而有可能导致后期染色体异倍性发生的概率增加。最后,通过CREST及TUBB免疫荧光染色发现,CENPF缺失导致微管-动粒连接缺陷,染色体无法被微管蛋白抓取。同时CENPF缺失导致纺锤体组装检验点(Spindle Assembly Checkpoint,SAC)相关蛋白Mad1及Mad2激活,从而导致中后期转换受到抑制。
  综上所述,CENPF缺失导致微管组装及微管对动粒捕捉失败,最终导致SAC持续激活。由于SAC处于激活状态,一部分卵母细胞无法完成减数分裂中后期转换,最终导致卵母细胞成熟失败。而对于部分“逃离”SAC监控的卵母细胞,虽能完成减数分裂,但由于纺锤体组装异常,且微管-着丝粒连接不稳定,染色体无法正常分离,最终导致这部分MⅡ期卵母细胞形成异倍体的概率增加。
  在第二部分(第三章)研究中,我们对CENPF在小鼠早期胚胎发育过程中的作用进行了详细探究。首先,探讨了CENPF在小鼠早期胚胎各个时期的蛋白表达及亚细胞定位情况,对CENPF在早期胚胎的定位机理进行了初步探讨。其次,在MⅡ、PN及2-cell期注射CENPF-MO,进一步研究CENPF敲减对早期胚胎发育的影响。
  收取受精后AⅡ-TⅡ、PN、Late1-cell、2-cell、4-cell、8-cell、桑葚及囊胚期胚胎,利用免疫印迹及免疫荧光技术进行CENPF蛋白定量及定位研究。免疫印迹结果显示,CENPF在早期胚胎发育的各个时期均有表达,从8-cell开始蛋白表达量逐渐减少。免疫荧光结果显示,在有丝分裂间期,CENPF定位于核膜及细胞间桥部位。进入分裂期,CENPF定位于纺锤体或者着丝粒上。我们利用FTISCH66336处理PN期胚胎,发现CENPF在桑葚胚及囊胚中定位消失,说明在早期胚胎发育过程中,CENPF的定位同样依赖于自身的法尼基化。
  MⅡ期卵母细胞注射CENPF-MO后孤雌激活,观察胚胎发育情况。结果显示CENPF敲减导致早期胚胎发育失败,胚胎发育阻滞在4-cell或8-cell期,几乎无囊胚形成。PN期胚胎敲减CENPF的结果与MⅡ期卵母细胞敲减结果一致。为了更直观地观察CENPF敲减对早期胚胎发育的影响,将带有红色荧光基团的Ctrl-MO及带有绿色荧光基团的CENPF-MO分别注射到一个2-cell的两个卵裂球中,进行活细胞实时观察。结果表明,注射Ctrl-MO的卵裂球最终发育成囊胚,而注射CENPF-MO的卵裂球则无法形成囊胚。
  综上所述,CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中发挥了重要作用。
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