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[硕士论文] 杨轶博
生物学 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:日本三角涡虫(Dugesia japonica)由于其强大的再生能力和较短的再生周期,为动物学再生机制的研究提供了良好的模型。本研究利用Illumina Hi SeqTM2000测序技术对整体涡虫和切割后尾再生头片段再生0d、1d、3d、5d、7d的日本三角涡虫进行转录组测序,对测序结果进行了初步的生物学信息学分析。根据分析结果,挑选了在再生早期表达水平显著调高的三个基因DjCAT、DjGST和DjSOD,利用RNAi和qPCR技术对三个基因功能进行了分析。本研究目的是对日本三角涡虫在再生过程中的生理活动及再生机制进行探索。主要结果如下:
  (1)通过转录组测序丰富了日本三角涡虫的基因信息,本次测试共获得101183条unigenes,其中有30.78%的unigenes至少比对到一个进行功能预测的数据库中,随机挑选了9个差异表达基因进行qPCR验证,结果证明了转录组数据的可靠性。结合KOG和GO数据库对不同实验组的差异基因的功能进行预测和分类。KEGG数据分析有8106个基因参与了涡虫再生过程中257条代谢或信号通路。分别以整体组和再生0d组作为对照组,在再生1d和再生5d时所得到的差异基因最多(分别为839和239个unigenes),参与的代谢通路也最为丰富。日本三角涡虫在再生的第1d发生了活跃的生理生化反应,对切割损伤后的修复及再生起着关键作用,在再生的第5d时,再生前期的上调或下降的基因表达逐渐恢复正常,是重要的功能恢复期。因此认为再生的1d和5d是头部再生的关键期。
  (2)DjCAT不同再生时期表达量变化检测结果显示:与整体组相比,DjCAT的表达在整个再生过程中呈上调趋势,在第1d达到最高值。RNAi结果显示:3/5的整体涡虫尾部溃烂解体,身体皱缩死亡。9/10的涡虫在头再生尾第5d时观察不到咽部的再生,2/5的涡虫在尾再生头第5d时眼点异常。芽基测量结果显示:在再生第3d时,尾再生头片段的再生芽基长度显著大于对照组,在再生第7d基本恢复正常。标记基因检测结果显示:DjCAT干扰后sigma-neoblasts标记基因DjSoxp-1、细胞周期调节基因DjcyclinA、DjcyclinB、尾部标记基因DjFrizzled、肌肉纤维标记基因Djmhcb都显著升高,眼点标记基因Djtyrosinase显著下调。推测DjCAT被干扰之后促进再生,影响眼点色素的合成和咽的形成,肌球蛋白基因的表达和尾部的正常维持受到了严重的影响。
  (3)DjGST不同再生时期表达量变化检测结果显示:与整体组相比,DjGST的表达在整个再生过程中上调表达并在再生第3d达到最高值。RNAi结果显示:整体(4/20)和再生涡虫(4/20)都出现了尾部溃烂,身体皱缩的现象。芽基测量结果显示:头再生尾涡虫的芽基长度在再生第3d和第4d显著小于对照组,尾再生头涡虫芽基的长度在再生第5d显著小于对照组,而在第7d基本都恢复正常。标记基因检测结果显示:DjGST干扰后neoblasts标记基因DjpiwiA、Djpcna表达量显著下调,干细胞分裂标记基因DjAGAT-2、DjNB21.11.e表达量则显著上调。推测DjGST被干扰之后neoblast细胞的增殖受到抑制,但促进了neoblast的早期分化。
  (4)DjSOD不同再生时期表达量变化检测结果显示:与整体组相比,在再生早期持续升高并在再生第1d达到最高值,在再生第3d逐渐下降至第5d时下调到最低值,而在第7d又显著调高。RNAi结果显示:1/2的整体涡虫出现尾部溃烂,身体不同部位皱缩的现象。芽基测量结果显示:再生组涡虫生长速度缓慢,头再生尾和尾再生头的的涡虫再生芽基在第3、4、5、6d长度都显著低于于对照组,然后逐渐恢复至正常状态。另外在再生第5d有2/5的头再生尾片段出现了解体现象。标记基因检测结果显示:DjSOD干扰后DjpiwiA、Djpcna表达量显著下调,DjA GAT-2、DjNB21.11.e、Djmhcb、DjFrizzled表达量则显著上调。推测DjSOD被干扰之后neoblast细胞增殖受到抑制,促进了neoblast细胞的早期分化,干扰了肌球蛋白基因的正常表达和尾部的稳态的维持。
  综上所述:切割后再生的第1d和5d分别是再生开始和功能恢复的关键时期。DjCAT、DjGST和DjSOD通过调控干细胞的增殖影响了涡虫的再生,并在维持涡虫正常组织更新和内稳态平衡方面起重要作用。
[硕士论文] 李新阳
发育生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:EAP1是一种转录调节因子,最初是由Sabine Heger等在对雌性猴子下丘脑发育研究中被发现,由于它的表达量在青春期时持续增加,将其命名为enhanced at puberty1,即EAP1。在非人灵长类动物和啮齿类动物下丘脑中,EAP1在青春期的表达都有选择性地增加。通过慢病毒介导的EAP1siRNA靶向啮齿动物下丘脑抑制EAP1的表达,导致青春期延迟,发情周期性被破坏,卵巢发育异常。因此探究EAP1的功能对于研究哺乳动物青春期和女性生殖周期具有重要的意义。
  本实验室在前期研究中利用CRISPR-Cas9敲除斑马鱼EAP1基因并得到纯合突变体,初步研究在雄鱼中未发现明显异常的表型。因此本论文集中在雌性斑马鱼青春期及生殖能力的研究。斑马鱼EAP1基因敲除后,发现纯合突变体后代性别比例严重失衡,雌鱼约占16.37%,而在同一时期相同条件饲养的野生型斑马鱼中,雌鱼约占45.53%。通过qPCR检验发现EAP1基因在早期性腺发育过程中表达量稳定,在成熟的精巢和卵巢中也有表达,推测EAP1基因可能参与斑马鱼的性别决定过程。通过选择相同鱼龄的雌雄斑马鱼进行交配,对其第一次产卵时间、产卵数目,死卵数目、6-48hpf胚胎死亡率、卵巢发育、产卵周期等数据进行统计,发现EAP1纯合突变体后代第一次产卵时间延迟:野生型平均为94天,纯合突变体平均为108天;通过石蜡切片及HE染色发现卵巢发育延迟;产卵数目减少:野生型平均为160颗,纯合突变体平均为123颗;0-48h胚胎死亡率高于野生型;产卵周期推迟:野生型产卵周期平均为4.025天,EAP1纯合突变体产卵周期平均为4.775天;EAP1纯合体卵子成熟速度降低。
  有研究认为EAP1是KISS1(蛋白编码基因,产物为kisspeptins神经元产生的一类多肽类激素,在斑马鱼中KISS基因有KISS1和KISS2两种)和GnRH(促性腺激素释放激素,在斑马鱼中有GnRH2和GnRH3两种)的上游基因。EAP1的表达对KISS1有抑制作用,同时抑制自身的表达。KISS1编码的kisspeptins能够促进GnRH的分泌。EAP1、KISS1、GnRH的表达均定位在鱼脑中,EAP1基因敲除后,通过qPCR检验发现KISS1和KISS2的表达量都受到不同程度的抑制,且GnRH2、GnRH3的表达量都降低,这与雌性斑马鱼第一次产卵时间延迟和卵巢发育延迟是一致的。同时EAP1对于卵巢细胞的凋亡也产生影响,通过流式检测卵巢细胞凋亡情况发现纯合突变体的细胞凋亡高于野生型,但是无显著的统计学差异。本研究表明EAP1参与调控斑马鱼的青春期并影响雌性斑马鱼的生殖功能。
[硕士论文] 张世阳
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究鞭毛内转运蛋白172(Intraflagellartransportprotein172,IFT172)在小鼠生精细胞中的功能以及精子鞭毛形成过程和生育能力中的作用。
  方法:1、将成年的Ift172flox/flox雌性小鼠与Stra8-iCre雄性小鼠杂交,建立的Ift172生精细胞条件敲除小鼠为实验组小鼠,以野生型小鼠为对照。2、用10对六周以上的Ift172条件敲除雄鼠或野生型雄鼠分别与成年的野生型雌鼠交配两个月以上,评估其生育力及繁殖能力。3、收集附睾精子,精子计数,检测精子活力,光镜下观察精子形态。4、收集小鼠睾丸和附睾进行HE染色,观察精子发生过程的各个阶段。5、透射电镜(TEM)观察两组小鼠精子的超微结构。6、蛋白印迹(WesternBlot)检测IFT25、IFT27、IFT81、AKAP4、ODF2、SPAG16L等相关蛋白的表达水平。7、分离小鼠睾丸生精细胞,免疫荧光染色染色检测IFT172的定位以及Ift172条件敲除小鼠体内IFT172敲除水平,并观察精子中纤维鞘蛋白AKAP4和外周致密纤维蛋白ODF2的定位。
  结果:Ift172floJflox;Stra8-iCre条件敲除小鼠都能够生长至成年。1、与正常的小鼠相比较,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的睾丸重量/体重比例没有明显差别。其中有六成的成年雄性纯合子小鼠是不育的。2、组织学检测显示,与野生型小鼠相比,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的精子形成阶段发生异常。3、Ift172被敲除后,小鼠附睾中仅残存少量发育完全的精子,大部分精子出现精子尾卷曲。且精子数目比野生型小鼠减少了10倍左右,精子活力较野生型小鼠有明显降低。4、与野生型小鼠相比,在Ift172条件敲除小鼠的睾丸内,其他的几种IFT家族B复合物的成员IFT20、IFT25、IFT27和IFT81以及IFT家族A复合物中的IFT140的表达水平没有明显的变化。此外,轴丝蛋白SPAG16L的表达量也没有明显变化。但是外周致密纤维结构蛋白ODF2以及线粒体鞘蛋白AKAP4的表达量显著下降。5、免疫荧光染色结果显示,在野生型小鼠中IFT172定位在生精细胞中定位在长形精子细胞的精子领处,而AKAP4和ODF2在Ift172条件敲除小鼠精子中的定位与野生型小鼠相比没有明显改变。
  结论:IFT172在生精细胞中表达量减少导致小鼠精子数目、活力以及生育能力下降,IFT172是一个对于雄性小鼠的生育能力以及精子发生所必需的蛋白,它很可能参与精子发生过程中特殊的结构蛋白的运输和组装。
[硕士论文] 镇景开
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48kD转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。
  方法:(1)用Consite方法分析人SPA G16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织cDNA为模版,构建含有SPA G16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/pGL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pcDNA3和S-SOX5/pTarget)以及抑制其表达的siRNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/pGL3转染至BEAS-2B细胞,以pGL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pcDNA3转染至BEAS-2B细胞,以pcDNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L mRNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pcDNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPA G16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。
  结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48kDa的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16LmRNA的水平。SOX5RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。ChIP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPA G16L的表达。
  结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPA G16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。
[硕士论文] 戴优
食品科学与工程 浙江工商大学 2018(学位年度)
摘要:在前期的工作中,为研究自由基在活体动物体内的分布,我们将DCFH-DA静脉注射到SD大鼠体内,发现自由基有规律地集中分布于腹白线等结缔组织中。本研究首先使用DCFH-DA与mito-SOXTM Red两种极为常用的荧光探针静脉注射入新西兰兔和食蟹猴体内,观察其自由基分布规律,进一步证实了上述发现;进而通过构建可在线粒体内表达能标记超氧阴离子的环状排列的黄色荧光蛋白(circularly permuted yellow fluorescent protein,cpYFP)的转基因动物模型——C57BL/6-TgH(mito-cpYFP)来证实自由基的规律性分布,并研究线粒体与自由基的相关性和传导方式。
  现将主要的研究结果报告如下:
  1.对新西兰兔和食蟹猴静脉注射荧光染料DCFH-DA和mito-SOXTM Red后,发现自由基在其体内主要沿结缔组织分布;同时,在体视显微镜下观察结缔组织,发现其结缔组织中的胶原蛋白有强烈的荧光现象,即自由基在结缔组织中沿胶原蛋白纤维传导;
  2.通过构建C57BL/6-TgH(mito-cpYFP)转基因小鼠模型,发现在发育期间超氧阴离子自由基主要沿其腹白线呈线性分布,并随日龄的增加逐渐向上延伸;同时,其荧光强度在每天的11:30-13:30间达到峰值;
  3.流经腹白线之电流导致胶原蛋白纤维显色。在以金属导线模拟代替腹白线后,野生型C57BL/6小鼠的腹白线电流在接通电路的瞬间即达到0.7μA,而转基因小鼠则是在约70分钟后才出现0.1μA的电流,此外,滴加双氧水于转基因小鼠的肝脏表面进行氧化刺激干预时,电流升至0.4μA左右;这些结果表明自由基在腹白线的传递是以电流的方式进行的,该电流来自于线粒体,与代谢相关。
  上述的结果初步证实了哺乳动物体内的自由基在结缔组织中以电子移动的方式传导及有规则的分布,暗示着一个由结缔组织组成的用于收集、储藏、传导和处理由线粒体泄露的电子的系统存在的可能性。
[硕士论文] KHAN Abdul Jamil
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:分子水平上阐明受精过程一直是有性繁殖研究中的一大难题。解决这一难题对生命的繁殖和成功的体外受精都至关重要。研究发现,精子和卵子融合在一起形成受精卵,而蛋白质间的相互作用影响受精过程。为了成功受精,精子需要具备穿透卵子外层的能力。受精过程主要分为三个部分:精子获能,精子与透明带结合诱发顶体反应;以及精子与卵子结合并且膜融合。sllp1由位于17q11.2的SPACA3编码。SLLP1抗体和重组蛋白阻断小鼠体外受精和精卵结合,表明SLLP1可能在精卵相互作用中发挥重要作用。PDIA3也被称为ERp57,属于蛋白二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI)家族,能够催化蛋白中的二硫键反生氧化还原反应。先前的研究表明,PDIA3也可能参与精子运动和配子融合。到目前为止,这两种蛋白质之间是否存在相互作用仍然未知。
  因此,我们从雄性绵羊睾丸组织中克隆了sllp1基因,长度为566bp;并且构建了原核表达重组载体pET-28a-sllp1,表达和纯化重组蛋白质SLLP1-HIS。本研究构建了酵母双杂交重组载体pGAD-sllp1和pGBK-pdia3,分别转化Y187、Y2H Gold菌株并杂交,在SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-α-Gal/AbA缺陷型固体培养基上长出了蓝色菌落。结果初步证明,两种蛋白之间存在相互作用。构建了哺乳动物双杂交系统的pACT-pdia3、pBIND-sllp1载体,结果以均数±标准差(n=3)表示,单因素方差分析执行。阳性对照组p<0.01,存在显著差异;实验组p<0.01,具有明显差异,表明PDIA3和SLLP1在293T细胞中有较强的相互作用。上述实验结果表明,PDIA3和SLLP1之间存在直接的相互作用。
[硕士论文] 李媛
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:在卵母细胞和精细胞中存在一类组蛋白H2A和H2B的组蛋白变体,初步研究表明这些组蛋白变体参与早期胚胎基因组的形成,调节早期胚胎的染色体结构、基因表达,在早期胚胎重编程中发挥重要作用。本实验主要以H2A、H2B以及其变体TH2A、TH2B为研究对象,研究它们在过表达情况下对小鼠早期胚胎发育的影响。
  我们采用PCR技术克隆了小鼠H2A、H2B以及它们的变体TH2A和TH2B全长基因,并将它们分别克隆到pGEM-T载体,通过DNA序列分析与NCBI基因库中的基因比较,证明我们所获得的H2A、H2B、TH2A和TH2B是小鼠的H2A、H2B、TH2A和TH2B的全长基因。然后,把所得的这四个基因分别克隆到pEGFP-C2真核细胞表达载体,将外源基因置于CMV启动子的下游,以便应用于体细胞的表达。为了在小鼠早期受精卵中表达这些组蛋白基因,我们又分别把H2A、H2B、TH2A和TH2B基因克隆到pSP64poly(A)载体,利用SP6RNA聚合酶分别合成H2A、H2B、TH2A和TH2B基因的mRNA,最后通过显微注射方法分别将H2A/H2B或TH2A/TH2B的mRNAs注射到小鼠原核期的胚胎中,研究H2A/H2B或TH2/TH2在过表达条件下对小鼠早期胚胎发育的影响。
  结果表明,在体外培养90小时后,注射H2A/H2B mRNAs胚胎的囊胚发育率为34.37%,显著低于对照组(43.92%,P<0.05),说明在小鼠胚胎发育过程中过表达H2A/H2B对小鼠胚胎早期发育有抑制作用;而注射TH2A/TH2B mRNAs胚胎的囊胚发育率为76.12%,显著高于对照组(43.92%,P<0.05)以及注射H2A/H2B胚胎组(34.37%,P<0.05),该结果表明在小鼠胚胎发育过程中,过表达组蛋白变体TH2A/TH2B可促进小鼠早期胚胎发育。因此,我们的实验结果表明H2A/H2B和TH2A/TH2B对早期胚胎发育具有不同的作用,这些结果对体细胞克隆以及建立iPSc提供了参考价值。
[博士论文] 赵伟巧
神经生物学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:神经系统如何编码、存储和提取信息是神经科学领域一直关心和想要回答的问题。神经元之间复杂的通讯组成的神经网络或神经环路决定了我们每时每刻的行为和心理活动。神经系统最基本的功能之一是帮助动物根据外界信息的动态变化产生合适的运动动作。那么,从外界信息的输入到最终运动动作的产生,神经环路是如何工作的?为了回答这个问题,我们以果蝇幼虫作为动物模型,以幼虫的避光扭头行为作为范式,以期阐明视觉信息最终转变成幼虫的扭头回避动作的神经环路机制。
  通过大规模的行为筛选和钙成像的筛选,我们找到了果蝇幼虫中央脑中对光刺激有升高或下降的钙响应信号并且影响避光行为的神经元。用光遗传结合钙成像的手段,我们将新发现的与果蝇幼虫避光相关的神经元包括CCLP、ACLP、IN神经元和已知的视觉通路神经元之间建立了环路联系。通过光遗传的方式激活环路中的神经元或者通过对神经元进行阻断或者激活后所观察幼虫的行为表现,并用SOS这一视频分析软件对幼虫的行为动作进行提取分析,我们可以明确各个神经元在避光行为中的具体功能,同时确定视觉信息在该神经网络中的处理机制。
  本研究揭示了去抑制微环路对避光扭头的调控机制。发现了去抑制促进幼虫遇光之后的扭头动作发起,而去抑制后的抑制恢复可以保障幼虫成功有效的停留在黑暗安全的环境中。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 周杰
生物工程 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:动物对于不同的外界刺激会产生不同的行为,例如感受到伤害性刺激时,动物通常表现躲避行为,这是动物适应外界环境变化及维持自身生存的基础,但人们对其中的机制了解有限。在脊椎动物和无脊椎动物神经系统中,广泛存在神经元的off-response,即在刺激过程中不表现出神经元兴奋,而在刺激撤走瞬间神经元表现出兴奋,该类神经元在对刺激信号的精细调节以及维持物种自身的稳态性中,起着至关重要的作用。然而对于调控该类神经元的分子机制和环路机制知之甚少。
  伤害性刺下秀丽线虫ASI神经元呈现off-response,并且ASI神经元与ASH神经元有相互抑制的作用。ASH神经元介导多种感受模式,其参与多种伤害性刺激,而对ASI神经元在伤害刺激中呈现off-response的机制了解有限。基于前期研究,我们提出如下问题:ASI神经元在伤害性刺激感受过程中,是否受到其他神经元的调节呢?我们通过增加伤害性刺激的时程,使其远远超过ASH活化的时程时,发现ASI神经元仍然表现出off-response,这提示了ASI神经元受到ASH神经元以外的其他神经元的调控。之后我们采用定量的行为学,微流控钙成像,光遗传和化学遗传学,分子生物学等技术手段探究在伤害刺激情况下,研究调控ASI off-response的环路机制。我们的研究结果发现ASER神经元对ASI神经元有抑制作用,且ASER通过作用ASI神经元上ser-3,ser-6实现对ASI神经元的调控作用。本研究将加深对神经元off-response调控机制的理解。
  
[硕士论文] 刘淑琰
渔业 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:鲇(Silurus asotus),属鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridae)、鲇属(Silurus)。以鲇仔鱼、稚鱼、幼鱼和成熟雄性鲇为对象,系统研究了鲇性腺发生及精巢分化、精巢发育、成熟精巢周期性变化、精子结构和精子活力特征等项内容。
  本研究主要内容包括:⑴鲇性腺的发生始于鲇出膜后3日龄,生殖嵴的出现为起始标志。性腺分化发生在鲇18日龄~40日龄:卵巢分化开始于鲇18日龄,标志为卵巢腔的形成,卵巢分化完成于鲇24日龄,此时卵巢内出现大量初级卵母细胞;精巢分化于30日龄,标志为输精管的出现;而精巢分化完成于鲇40日龄,标志为精巢内出现大量初级精母细胞。⑵根据精巢形态特征,结合精子发生的组织学和细胞学特点,将鲇精巢从分化后至发育成熟分为6个时期:Ⅰ期精巢(2月龄)为1对细丝,透明或淡黄色,长≦2mm,重≦0.03g,组织切片可见少量精原细胞分散于间质细胞群间;Ⅱ期精巢(3月龄~5月龄)呈”V”形,半透明或白色,表面光滑,无明显血管,长≦35mm,重0.02 g~0.12 g,组织切片可见精原细胞增多;Ⅲ期精巢(6月龄~8月龄)边缘凹凸不平,稍皱褶,少量毛细血管,呈淡粉色,长40mm~62mm,重1.0g~3.73g,组织切片中可见精母细胞;Ⅳ期精巢(9月龄~11月龄)呈分枝不明显的树枝状,白色或淡红色,表面褶皱明显,血管粗而多,长81mm~109 mm,重1.8g~4.8g,组织切片可见精子细胞;Ⅴ期精巢,已成熟,分枝明显,白色或淡红色,长89 mm~117 mm,重2.34 g~5.0 g,组织切片可见大量成熟精子;Ⅵ期精巢为排精后的精巢,其体积缩小,血管收缩,组织切片可见少量发育不成熟的精子。⑶春季(2月~4月)精巢呈淡粉色,不饱满,血管不明显,处于Ⅲ~Ⅳ期。夏季(5月~8月)精巢呈白色或淡红色,血管显著,成熟系数为1.24%~1.83%,处于Ⅳ~Ⅴ期;7月的精巢已充分成熟,即处于第Ⅴ期,可进行人工催产。秋季(9月~11月)鲇精巢呈白色或米黄色;鲇已经排过精子,精巢明显萎缩,成熟系数下降至0.75%,处于Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅵ期。冬季(12月~翌年2月)鲇精巢呈米黄色,其内精子退化。⑷鲇精巢分为白膜和实质两部分,实质主要由小叶间质、精小叶、贮精囊和输出管构成。小叶间质由间质细胞、微血管和纤维结缔组织组成。精小叶呈不规则的管状结构,其壁分布多个精小囊;精小囊是生精细胞的发源地。贮精囊呈蜂窝状,内有嵴和腔隙,为成熟精子的贮存地。⑸采用扫描电镜和透射电镜技术观察:鲇精子由头和尾两部分组成,无颈部。精子头部近球形,直径1.85μm~2.51μm;头部无顶体,内有高度致密的细胞核染色体;头部后方凹陷形成植入窝,内有近端中心粒和远端中心粒;细胞核后方与质膜间的空隙(称袖套)内富含细胞质和线粒体、囊泡等细胞器。尾部细长,无主段、尾段之分,长44.3μm~50.7μm;横切面呈圆形,直径0.269μm~0.308μm;透过横断面可见,鲇精子尾部由轴丝和附属纤维构成,外有一层质膜包裹,无侧鳍;轴丝为典型的“9+2”结构。⑹观察不同pH、水温下鲇精子的快速运动时长和存活时长,结果表明:精子活力的适宜pH为7.0~8.5,pH8.0时,精子活力最强;精子活力的适宜温度为25℃~28℃,28℃时,精子活力最强。
[博士论文] 曹婧
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物中,卵泡闭锁是卵泡发育过程中一个复杂且不可避免的退化过程,受到激素、生长因子等多种因素的调控,而颗粒细胞在卵泡的发育中扮演至关重要的角色,其凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因。Aurora B(丝氨酸/苏氨酸激酶)作为染色体乘客蛋白的一员,参与调控染色体的排列、纺锤体的组装以及胞质分裂等有丝分裂过程。此外,SUMO修饰参与蛋白质互作、信号转导、核质运输、转录调控以及调节基因组稳定性等方面,虽已有文献报道Aurora B可以被SUMO修饰,但是对于Aurora B及其SUMO修饰对卵泡发育的影响方面,仍然是个未解之谜。因此,本课题将以小鼠卵泡及其颗粒细胞为研究模型,主要研究Aurora B及其SUMO修饰对卵泡及其颗粒细胞发育的影响,初步探索可能存在的调控机制。本实验分为两个部分,具体内容和结果如下:
  实验一:Aurora B对小鼠卵泡及其颗粒细胞发育的影响研究
  1、AuroraB在卵泡及颗粒细胞中的定位与表达模式。获取不同发育阶段卵泡及颗粒细胞,检测Aurora B的定位及表达。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核,当胞质分裂时,位于围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的发育,Aurora B在各级卵泡和颗粒细胞中的表达水平上升,在有腔期达到最大;
  2、Aurora B影响卵泡的发育。体外分离获得次级卵泡,添加Aurora B抑制剂培养,观察记录卵泡的生长情况。研究结果显示,抑制AuroraB活性后,卵泡生长速度成下降,闭锁率增加,卵泡的发育受到抑制;
  3、Aurora B影响颗粒细胞的生长。选取有腔期颗粒细胞(pre-GCs),进行抑制剂培养,检测细胞周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,抑制Aurora B后,G0/G1期细胞比例显著增加、S期细胞比例显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻;
  4、初步探索Aurora B调控颗粒细胞生长的分子机制。选取pre-GCs进行抑制剂培养,检测调控细胞增殖与凋亡相关基因和蛋白水平。研究结果显示,Aurora B参与调控p38MAPK与Fas/FasL信号通路,下调G1期向S期转化的细胞周期蛋白CDK4、增殖相关蛋白PCNA以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,上调细胞死亡蛋白Fas、凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表达量,最终参与颗粒细胞的生长调控。
  实验二:Aurora B的SUMO修饰验证及其对卵泡颗粒细胞的影响
  1、SUMO修饰验证。成功构建几种真核表达质粒,选取pre-GCs体外分离培养,利用免疫共沉淀法检测SUMO修饰。研究结果显示,在颗粒细胞中,Aurora B可以被SUMO2修饰,Lys207为主要的SUMO2修饰位点;
  2、SUMO2修饰影响Aurora B的生物功能。体外分离培养pre-GCs,首先利用免疫细胞化学法检测Aurora B的定位分布。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核内,而Aurora BK207R主要定位在细胞核,部分定位在细胞质中;其次利用Westernblot法检测Aurora B的蛋白稳定性。研究结果显示,SUMO2可以在一定范围内促进Aurora B的蛋白表达水平。表明,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的定位与蛋白稳定性;
  3、SUM02修饰影响颗粒细胞的生长。体外分离培养pre-GCs,分别转染对照组(HA)、正常组(HA-Aurora B)和突变组(HA-Aurora BK207R),检测细胞的周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,突变组G0/G1期细胞比例显著增加、S期和G2/M期细胞比例均显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻。
  综上,本研究发现在小鼠卵泡中,Aurora B定位于颗粒细胞核,胞质分裂时,转定位至中间体和围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的成熟,Aurora B在卵泡和颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,在有腔期达到最大。抑制Aurora B后卵泡生长受阻、凋亡增加,并通过p38MAPK和Fas/FasL信号通路,下调CDK4、PCNA和Bcl-2的水平,上调caspase-8、caspase-3水平,影响颗粒细胞生长。此外,发现AuroraB可以被SUMO2修饰,Lys207为主要修饰位点,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的亚细胞定位和稳定性,影响颗粒细胞的生长。本研究结果将为卵泡的发育和闭锁提供一定的理论依据,同时也为更好的治疗卵巢疾病奠定基础。
[博士论文] 黄纯杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:随着社会进步,人类生殖障碍已成为全世界令人堪忧的医学和社会学难题。其中一个重要因素就是由各种已知或未知原因导致的女性卵子数量和/或质量恶化。恶化的卵子往往无法完成减数分裂或在减数分裂过程中染色体更易发生异常分离产生非整倍体配子,进而导致女性不孕、流产和新生儿先天缺陷。因此,从分子水平阐明调控卵子减数分裂和胚胎发育的机制对于提高和改善人类生殖能力具有重要的医学和社会学意义。SENP7是一种去SUMO化蛋白酶,作用于多聚SUMO链的剪切,从而维持SUMO化修饰的动态平衡。体细胞中,SENP7参与调控染色质稳态和DNA损伤修复。然而,SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的作用仍有待研究。本研究以小鼠为模型,通过敲低卵子和早期胚胎中内源性SENP7的表达以研究其在哺乳动物卵子成熟和早期胚胎发育过程中的作用及其分子机制。主要研究结果如下:
  (1)敲低GⅤ期(减数第一次分裂前期)卵子内SENP7的表达后卵子减数分裂进程受到明显抑制。表现为卵子恢复减数分裂(GVBD)和第一极体排放(PBE)受阻,导致成熟卵子的产生显著减少;
  (2)敲低SENP7表达后,组蛋白H3K9和H3K27表观修饰状态的改变(乙酰化上调和三甲基化下调),以及Cdc14B/C表达水平上调伴随着的CyclinB1和CyclinB2降解导致卵子恢复减数分裂受阻以及卵子内纺锤体组装异常;
  (3)y-tubulin定位紊乱以及泛素化修饰介导的γ-tubulin表达量下调也直接引起SENP7缺失型卵子内纺锤体组装异常;
  (4)纺锤体组装异常使恢复减数分裂的SENP7缺失型卵子后续发育受阻;同时持续活化的纺锤体组装检验点将这些卵子的发育进程阻滞在MⅠ期之前,导致这些卵子无法进入AⅠ期,进而无法排出第一极体;
  (5)敲低受精卵内SENP7表达后,胚胎发育同样出现明显缺陷。表现为胚胎卵裂受阻,大部分胚胎甚至无法发育到2细胞时期,导致囊胚发育率趋于零水平。同时,伴随着时间的延长,胚胎会发生凋亡;
  (6) SENP7缺失型胚胎内组蛋白H3K9和H3K27表观修饰的紊乱(乙酰化水平上调和三甲基化水平下调)以及DNA5hmC修饰水平的下调导致DNA损伤位点邻近的染色质无法维持DNA修复所需的理想空间结构;HP1α在常染色质上的分布导致DNA修复蛋白Rad51C的表达量下调;胚胎有丝分裂过程中纺锤体组装同样出现异常。这些因素共同导致缺失母源性SENP7的胚胎无法修复其基因组中存在的DNA损伤,因而胚胎发育出现缺陷甚至胚胎发生凋亡;
  综上,本研究揭示了母源性SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的关键作用及其分子机制。另外,本研究将SUMO化修饰与染色质上的其他修饰在生殖生物学的一些事件中联系起来,有助于认识生殖发育过程中蛋白质水平的复杂调控网络,为提高动物繁殖和人类生殖健康提供重要理论依据。
[硕士论文] 严志会
动物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:福寿螺原产于南美洲亚马逊河流域,目前已侵入我国在内的许多亚洲国家。2000年世界自然保护联盟将其列为恶性外来物种之一。福寿螺不仅危害农作物等水生作物,而且还传播广州管圆线虫病等。本文首次利用RACE技术克隆到福寿螺雌激素受体cDNA全长,并且探究E R在福寿螺的组织分布、卵巢发育不同阶段的表达量以及在不同外源激素作用下精巢、卵巢中ER的表达量。主要结果如下:
  (1)ER的分子特征
  根据亲缘关系较近物种的ER的保守区域设计引物,通过克隆测序拼接后获得cDNA全长序列,共1636bp,包括5′UTR128bp,3′UTR101bp。开放阅读框长1407bp,编码468个氨基酸,其中编码区GC含量为50.68%,等电点为7.40,分子量为51.1KD,亲水性氨基酸含量为67.32%,没有检测到信号肽序列和跨膜肽段结构。
  (2)ER的组织分布
  通过实时荧光定量PCR方法研究福寿螺ER的组织分布。结果显示:ER在福寿螺精巢、卵巢、头、肝脏、足、触角、胃、鳃、肌肉和蛋白腺中都有表达,并且在头、肝脏、精巢、卵巢和蛋白腺等这些生殖轴组织中的表达量相对较高。
  (3)ER在卵巢发育过程中的表达
  通过实时荧光定量PCR研究在卵巢发育过程中ER的表达情况,检测到在福寿螺卵巢发育的各个阶段都存在特异性表达。在卵巢发育过程中,ER的表达呈先上升后下降趋势,在成熟期时到达最高值,休止期时到达最低值,其中,成熟期时的ER的表达量与其他时期的表达量之间都存在显著差异,排放期和增殖期、休止期之间亦存在显著差异。
  (4)外源激素处理下ER的表达
  通过实时荧光定量PCR研究在外源激素作用下ER的表达情况,从整体来看,高浓度雌二醇可以促进ER的表达,并且在作用第三天表达量达到最高;不同浓度的他莫昔酚都可以抑制ER的表达,并且抑制雄性福寿螺的效果更加显著。
  本论文的研究结果为进一步阐明福寿螺等腹足类的生殖发育调控机制,理解固醇类外源激素对软体动物性成熟的影响奠定基础,同时也为福寿螺的生殖调控提供一定的理论依据。
[硕士论文] 高洋
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:肌肉抑制素(myostatin,MSTN)是TGF-β超家族的一员,广泛参与机体的生长发育调控。MSTN基因的自然突变会产生肌肉肥大的表型,在牛、羊、狗、小鼠以及人类中均有报道。MSTN通过负调控成肌生长因子,影响肌肉组织的发育和分化,同时,还参与调控肌纤维的代谢活动。
  本研究利用CRISPR/Cas9技术,获得了MSTN第三外显子部分序列敲除的小鼠。以该小鼠为模型,检测MSTN敲除对小鼠基础代谢活动以及细胞线粒体功能的影响。结果如下:通过原核注射获得的MSTN-/-小鼠各器官中的MSTN基因表达量总体呈减少的趋势,小鼠体重显著增加,肌肉发达,表现出较明显的双肌现象。MSTN-/-小鼠基础代谢率下降,体温降低。MSTN基因的敲除显著影响了肌肉组织细胞中线粒体的功能,增强了线粒体中脂肪酸的β氧化,抑制了三羧酸循环和氧化磷酸化过程;参与线粒体合成的Tfam、Nrf1与Clpp等基因的表达显著上调,参与线粒体抗氧化的Sirt1和GSH等活性也显著提升。上述结果表明,MSTN基因敲除后,显著影响了小鼠的基础代谢,抑制了肌肉组织细胞线粒体的三羧酸循环和氧化磷酸化过程。
[硕士论文] 崔荣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究在前期实验研究中获得一种由四因子c-Myc,Klf4,E-cadherin,Glis1诱导的,形态、体外增殖和体内外分化能力类似于胚胎干细胞,但不具有嵌合能力的部分重编程细胞,KMEG-prCs。该细胞虽具有一定多能性,但oct4,sox2,nanog,AKP并不表达,且SSEA1只在部分细胞中被激活。经转录物组分析显示,KMEG-prCs处于重编程的中间状态。该细胞可以作为一个新的细胞模型来研究重编程过程中内源多能性信号网络激活的分子机制。本研究旨在利用KMEG-prCs细胞,筛选可激活该细胞中内源多能性基因表达的小分子化合物或组合,为进一步探讨内源多能性调控网络的激活和发现新的小分子化合物组合建立新的小分子诱导体系奠定理论和技术基础。通过流式细胞分析显示,重编程不同阶段的表面标记蛋白Thy1(CD90)完全下调,CD54(ICAM-1)完全上调,CD44和SSEA1分别部分上调,CD31仅少数上调。结合转录物组的分析,进一步确定KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞。分选获得SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs,并用含有不同小分子化合物的培养液进行培养,内源多能性基因激活显示,加入HDAC抑制剂TSA、VPA、Oct4激活剂(OAC1)与腺苷酸环化酶活化剂(Forskolin)后激活了多能性基因AKP的表达,并且使一部分SSEA1阴性细胞转变为SSEA1阳性细胞。随后加入EZH2蛋白胞内增强子抑制剂(DZNeP)进一步诱导后,在小分子组合PCA+FD处理下, SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs内源oct4均被激活,SSEA1+KMEG-prCs中oct4高水平表达。获得了一个新的细胞状态,KMEG-prCs-O+,该细胞仍然保持体内外分化能力。随后,虽然将PCA+FD中的A-83-01替换为E-616452,并联合LiCl,构成PCE+FD+Li小分子化合物组合可有效激活nanog的表达,但oct4的表达被下调。综上所述,KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞,通过小分子化合物的处理其内源多能性调控网络可以被激活。该研究为探讨小分子化合物对重编程的作用机理以及进一步获得完全重编程的iPSCs奠定了基础,同样对于细胞在重编程过程中信号通路,代谢途径,表观遗传修饰等的研究提供依据。
[硕士论文] 王永永
发育生物学 青岛农业大学 2017(学位年度)
摘要:雌性哺乳动物生殖寿命主要决定于原始卵泡库,而原始卵泡形成伴随着生殖细胞簇解聚。小鼠原始卵泡形成于出生前后,期间超过2/3的卵母细胞丢失,细胞自噬与细胞凋亡在此期间都有发生,然而卵母细胞丢失的具体机制至今尚不清晰。近期研究发现,在原始卵泡形成过程中性腺微环境一直存在细胞自噬,这提示原始卵泡形成过程中卵母细胞自身能量不足。
  本研究建立了新生小鼠饥饿模型,对1.5dpp小鼠饥饿处理36 h后发现,小鼠血糖等相关代谢指标发生紊乱,并且卵巢代谢相关基因表达也发生了明显改变。进一步深入分析营养阻断与卵巢代谢、氧化应激、凋亡自噬的关系,结果发现:饥饿组小鼠卵巢的氧化应激水平显著升高,调节氧化应激酶的相关基因的表达明显上调;细胞凋亡与细胞自噬水平在饥饿小鼠卵巢中显著增高,TUNEL阳性细胞数目明显增加,凋亡相关蛋白BAX与BCL2的比例在饥饿组中也显著增加。进一步对原始卵泡形成相关转录因子与前颗粒细胞增殖情况检测发现,原始卵泡相关转录因子Nobox的表达以及前颗粒细胞的增殖显著减少,并最终导致原始卵泡形成比例降低。以上结果说明,新生小鼠营养缺陷会引起代谢紊乱与氧化应激反应,造成卵巢中生殖细胞与体细胞凋亡与自噬,进而损害了生殖细胞簇解聚与原始卵泡形成。
[硕士论文] 王晨
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:FHL2(Four and a half LIM domains protein2)是FHL蛋白家族成员之一,可作为转录因子共结合因子,参与细胞增殖、迁移、凋亡、信号转导和基因转录等诸多过程。目前,基于FHL2的研究主要集中在心脏、骨骼和癌症中,对生殖发育方面的研究较少。研究表明,FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,可通过结合NR5A1,调控抑制素α基因的转录,提示FHL2对生殖具有重要调控作用,但调控作用及作用机制尚不清楚。因此,本实验以昆明小鼠卵巢颗粒细胞(mGCs)为模型,研究FHL2对小鼠颗粒细胞的调控作用及作用机制,旨在为阐明哺乳动物卵泡发育调控机制提供理论基础。主要研究结果如下:
  (1) FHL2在小鼠卵巢中的时空表达与定位规律:收集新生小鼠(1-6天)及3周和10周的小鼠卵巢,免疫组化实验结果表明,FHL2的表达量随着卵泡组装和原始卵泡池的形成逐渐升高,在颗粒细胞和卵母细胞中均有表达;Western Blot检测结果显示,出生后1天、4天和7天小鼠卵巢FHL2表达量逐渐上升;
  (2) FHL2在颗粒细胞细胞核和细胞质中表达:Western Blot和免疫荧光方法证明,FHL2在mGCs细胞核和细胞质中均有表达,定位与细胞所处的分裂周期有关;
  (3) FHL2促进小鼠颗粒细胞的增殖:体外培养小鼠颗粒细胞,分别转染FHL2小干扰RNA或过表达质粒,CCK-8、细胞计数,流式细胞分析方法结果表明,敲低FHL2后,细胞活力显著降低,S期细胞比例显著降低,细胞凋亡显著增加;过表达FHL2,则可以显著促进小鼠颗粒细胞生长,提高细胞活力,抑制细胞凋亡;
  (4) FHL2通过结合转录因子AP-1和NF-κB调控EGF和EGFR转录:转染FHL2 siRNA后,敲低组EGF和EGFR的mRNA表达量和蛋白表达量显著降低,而超表达FHL2则显著提高EGF和EGFR的表达量;进一步利用Co-IP和CHIP方法证明,FHL2分别结合转录因子AP-1和NF-κB,在转录水平上调控EGF和EGFR的表达;
  (5) EGF对小鼠颗粒细胞生长的调控依赖于FHL2表达量:EGF(20 ng/mL)可显著促进mGCs增殖、提高细胞活力,提高S期细胞比例;敲低FHL2后,EGF对颗粒细胞的促增殖作用受到抑制,提示EGF对小鼠颗粒细胞的调控依赖于FHL2表达量;此外,EGF处理可诱导颗粒细胞EGF和EGFR的表达量显著上升;敲低FHL2后再用EGF处理,EGF对其自身和其受体的诱导作用被显著抑制;
  (6) EGF可促进FHL2表达,尤其是诱导细胞核内FHL2表达量上调:上述实验说明,EGF通路可能与FHL2存在互作,为进一步验证该假设,利用EGF处理小鼠卵巢颗粒细胞,结果表明,EGF(20 ng/mL)处理可诱导mGCs FHL2表达;而分别添加EGFR抑制剂(AG1478)、MEK抑制剂(UO126)和PI3K抑制剂(LY294002)则可以阻断EGF对FHL2表达的调控,说明EGF可通过结合EGFR,激活MEK和PI3K信号通路,参与小鼠颗粒细胞FHL2的表达调控;免疫荧光检测结果显示,EGF可诱导颗粒细胞核内FHL2表达量显著上调;Western Blot结果进一步表明,随EGF处理时间的增加,FHL2在核内表达的表达量逐渐增加,呈时间依赖模式。
  在本研究中,发现FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,并参与颗粒细胞的生长调控。EGF与EGFR在细胞膜上结合,激活MEK和PI3K信号通路,调控FHL2表达,并促进FHL2在细胞核内聚集,而核内FHL2可作为转录因子共激活子,通过结合转录因子AP-1和NF-κB,促进EGF和EGFR的表达,从而形成EGF/EGFR/FHL2自分泌通路,调控颗粒细胞的生长与增殖。研究结果阐明了FHL2对颗粒细胞生长的调控作用及作用机制,有助于我们更好的理解哺乳动物生殖发育调控网络,并为提高家畜繁殖力新技术研发提供科学依据。
[博士论文] 欧阳宏佳
遗传学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:鸡骨骼肌胚胎期的生长发育是影响肌肉产量的主要因素,而肌肉产量直接影响着肉鸡的生产性能。骨骼肌的发育生长涉及一系列非常复杂的生物学过程,受到许多基因与非编码RNA的调控。环状RNA是近年来新发现的一类具有特殊环形结构的功能生物大分子,在众多的生物学过程和疾病中都发挥着重要的作用,然而它对家禽骨骼肌生长发育的影响目前尚未有报道。
  本研究采取11胚龄、16胚龄和1日龄的杏花鸡骨骼肌进行环状RNA测序,分析环状 RNA在鸡肌肉组织中的表达情况,筛查影响家鸡胚胎骨骼肌生长分化的关键环状RNA,并分析它们与基因或miRNA的相互作用。同时利用iTRAQ技术对鸡胚胎期的骨骼肌进行蛋白质组分析,鉴定骨骼肌胚胎期发育过程中的差异表达蛋白,并对它们进行功能网络分析。此外,我们进一步结合转录组和环状 RNA测序数据进行联合分析,构建蛋白、lncRNA和环状RNA综合互作网络,更系统地了解肌肉发育的分子调控通路。获得主要结果如下:
  1、在杏花鸡骨骼肌中共发现13377个环状RNA,其中有11064个环状RNA来源于编码基因(3589个),大多数环状RNA来自外显子序列,特别是编码区序列(n=8110)。
  2、在杏花鸡骨骼肌中表达量较高的环状RNA(BSRP>1)有3036个。比较腿肌E11、E16和P1三个不同的发育时期,发现有1470个差异表达的环状RNA,GO分析差异环状RNA的亲本基因,富集到多个肌肉相关的生物学过程。
  3、外显子环状RNA的miRNA结合位点分析发现有946个环状RNA含有一个或多个miRNA结合位点,共涉及到150个已知的miRNAs。验证发现鸡circRBFOX2.2-3和 circRBFOX2.2-4可结合 miRNA-206,促进成肌细胞增殖和抑制成肌细胞分化。鸡circSVIL.6-14结合miRNA-203,促进成肌细胞增殖和分化。
  4、对鸡E11、E16和P1期腿肌进行蛋白质组分析,鉴定出3240个蛋白,其中差异表达蛋白491个。互作网络分析发现这些差异表达蛋白主要与蛋白质合成、肌肉收缩和氧化磷酸化相关。少部分的差异蛋白可能受lncRNA和circRNA的调控,特别是与肌肉收缩过程相关的DMD、MYL3、TNNI2、TNNT3和TPMs等,这些差异蛋白可能与非编码RNA共同影响胚胎期骨骼肌的生长发育。
  5、克隆鸡MEF2D基因,鉴定出5种新的变异转录本,这些转录本均含有高度保守的序列,包括MADS-Box和MEF2-Domain功能区域。其中转录本MEF2D-V4在肌肉中特异性表达,其表达量受到 RBFOX2基因调控并可以促进鸡成肌细胞分化。MEF2D基因的SNP位点g.36195C>T与鸡多个生长性状显著相关,特别是0-4周龄体重。
  综上所述,本研究发现环状 RNA在鸡骨骼肌胚胎发育过程中有丰富和动态的表达,可以通过与miRNA结合调控成肌细胞的增殖和分化,从而影响鸡胚胎期骨骼肌的生长发育。同时我们分析了肌肉胚胎期差异表达蛋白之间以及与非编码 RNA之间的互作网络,为鸡骨骼肌胚胎期发育生长提供更全面的分子调控网络。
[硕士论文] 杜健
动物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:外泌体,一类直径在50-150nm具有双层膜结构的细胞外囊泡,存在于生物的各种体液中。外泌体可以通过负载蛋白质、多肽、mRNA、长链非编码RNA、miRNA、环状RNA以及tsRNA调节不同细胞的生物活性。目前,许多研究表明外泌体在肿瘤的形成、迁移和代谢方面发挥着重要作用,同时还与许多疾病的发生密切相关。
  在精子发生的过程中,精原干细胞除了形成一个走向分化命运的精原细胞外,还会形成一个与自身相同仍旧拥有干性的细胞。在睾丸曲细精管内的“niche”微环境中,支持细胞分泌的各类因子对于精原干细胞的自我维持与更新发挥着重要的作用。附睾和精浆中的细胞外囊泡参与了精子发生的过程中,然而,在曲细精管内支持细胞来源的胞外囊泡对精原干细胞的调节作用所知甚少。
  本研究对支持细胞分泌的胞外囊泡进行了鉴定,并且探究了其对精原干细胞的影响,主要结果为:
  (1)收集不同发育阶段小鼠的睾丸,通过免疫组织化学的方法,在曲细精管内对外泌体标志性蛋白质CD63进行了定位。发现在小鼠不同发育阶段,CD63主要定位在支持细胞的细胞质,并且呈颗粒状分布。同时,CD63在小鼠出生后前7d有很高的表达量,这表明含有CD63的阳性囊泡在精子发生的过程中发挥着重要作用。
  (2)通过梯度离心和超速离心的方法,首次分离纯化出原代支持细胞释放的细胞外囊泡。在电镜下可以观察到囊泡具有双层膜结构,并且通过纳米颗粒跟踪仪测量出囊泡的大小主要在76nm左右。利用蛋白质免疫印迹发现分离出的囊泡含有外泌体的特异性蛋白质CD63。因此,从形态特征、粒径大小以及标志性蛋白质这三个方面鉴定出这类囊泡主要是外泌体。
  (3)用DiI对分离出的外泌体进行标记,发现DiI-外泌体可以附着在C18-4细胞以及原代精原干细胞的表面,呈现颗粒状不均匀分布。
  (4)在无血清的培养条件下添加100ng/μL外泌体培养24h,同时未添加外泌体的细胞作为对照组。发现加入外泌体后,C18-4细胞和原代精原干细胞的状态良好,细胞饱满,表面光滑,而对照组的细胞表面出现大量颗粒,细胞萎缩,细胞状态变差。
  因此,本研究首次分离纯化出支持细胞来源的外泌体,通过表型分析发现这类外泌体可以附着在精原干细胞表面,并且可以维持精原干细胞的存活。通过本项研究,能够进一步揭示支持细胞调控精原干细胞的方式,对于了解精原干细胞的功能和调控机制开辟了新的视野并奠定了前期的工作基础。
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