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[硕士论文] 陈健
生态学 贵州师范大学 2017(学位年度)
摘要:大蹄蝠(Hipposideros armiger)广泛分于贵州省境内。关于大蹄蝠(H. armiger)的分子系统地理学的研究已有报道,本文使用线粒体DNA控制区(D-loop区)作为分子标记,针对这一物种进行了省级区域范围内的遗传多样性、种群遗传结构、历史动态等方面的研究,阐述了贵州省大蹄蝠的种群扩散中心,初步探讨了小尺度范围内大蹄蝠(H. armiger)是否存在偏性扩散现象,分析了贵州省内当今的大蹄蝠种群分布情况。
  本研究主要内容包括:⑴按照《贵州兽类志》所划分的兽类地理区划将贵州分为五个地理省,对这五个地理省及相邻的云南和广西地区进行大蹄蝠标本采样,在这七个样区,共采集到大蹄蝠样本(翼膜或肌肉)475号。将所采集的样本分为三个类群分别进行分析:475个不分性别群体、261个全雄性群体、194个全雌性群体。结果显示相较于全国范围大蹄蝠的遗传多样性,本研究中的三个类群的遗传多样性均较低。不分性别群体的单倍型多样性 Hd=0.555,核苷酸多样性 Pi=0.00295;全雄群体的单倍型多样性 Hd=0.653,核苷酸多样性 Pi=0.00293;全雌群体的单倍型多样性 Hd=0.449,核苷酸多样性 Pi=0.00345。说明了贵州省大蹄蝠种群进化历史较近。在所有的种群中,VIB4种群的遗传多样性是最高的(不分性别群体:Hd=0.832,Pi=0.00431;全雄群体Hd=0.876,Pi=0.00392;全雌群体Hd=0.743,Pi=0.00494),暗示了该地区可能是贵州省大蹄蝠种群扩散的中心。⑵Arlequin软件计算得到的遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)显示,贵州的五个种群及广西种群间产生了较小的遗传分化,各种群间存在较频繁的基因流,表明遗传分化发生在近期;而这六个种群与云南种群间则产生了显著的遗传分化,存在有限的基因流。遗传分化分析还显示全雄群体各种群间的遗传分化较雌性群体中各种群的遗传分化系数显著,暗示了雌性种群间持续的基因流。⑶对于三个类群中大蹄蝠种群结构的分析显示了相同的结果,系统发育树和单倍型网络结构分析呈现了高度的一致性,贝叶斯树被分为两个明显的分化支(A、B支)。网络结构图也产生了两个明显的聚类,其中VA1、VIB4种群的部分单倍型与云南种群的单倍型聚在一起,而贵州各种群则与广西聚为一支,显示了贵州种群与广西种群较近的亲缘关系。⑷遗传分化分析和分子方差分析(AMOVA)显示全雌群体中47%的种群间存在小而不显著的遗传分化,且雌性群体中各种群间的基因流要大于全雄群体中各种群的基因流,雌性群体并未形成稳定系统地理结构。说明了在省级区域范围内雌性群体参与了种群扩散并存在较频繁的基因交流。但由于D-loop控制区为母系遗传,在此并不能完全说明大蹄蝠是否存在显著的偏性扩散。⑸贵州地区喀斯特地貌发达,存在较多的岩溶洞穴,为大蹄蝠提供了理想的栖息场所。其中VIB4地区包括了贵州的一个高温区,有较好的植被环境和较多的大洞长洞,良好的环境、丰富的资源使该地区成为现今贵州省大蹄蝠种群主要的分布区。
[博士论文] 李扬威
生物信息学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:氧是地球上大多数生物赖以生存的必需元素,低氧(Hypoxia)环境会造成生物体内部组织或细胞缺氧,继而引起机体的应激反应,产生生理病理变化并影响生长发育过程。地下鼠长期生活于氧气含量较低的地下洞道系统中,在形态、生理、行为和遗传等方面形成了良好的低氧适应。棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)终生营地下生活,是一种典型的地下鼠,其近缘种布氏田鼠(L. brandtii)则以地面活动为主,二者是地下低氧环境适应比较研究的理想对象。
  本论文以棕色田鼠为研究对象,以布氏田鼠为对照;通过对棕色田鼠野外环境参数的调查,获得了不同季节洞道系统中O2/CO2含量、温度、湿度等数据;通过构建基于线粒体基因组序列的进化树,确定了棕色田鼠和布氏田鼠的分类地位与亲缘关系;在低氧舱内模拟慢性低氧和急性低氧状态,完成不同氧环境下棕色田鼠和布氏田鼠脑组织转录组的测序、de novo组装和注释;采用比较转录组方法,分析不同低氧处理对棕色田鼠和布氏田鼠脑组织转录组基因表达的影响;结合棕色田鼠的全基因组测序、de novo组装和注释结果,对棕色田鼠有参和无参转录组差异表达结果的一致性进行了研究;最后,系统整理了棕色田鼠和布氏田鼠低氧转录组数据以及棕色田鼠全基因组数据,构建具有存储、管理、查询和局域网远程访问功能的数据库,实现数据的共享和可视化操作。
  主要结果分述如下:
  1)棕色田鼠洞道长约40 m,分支较少,取食与活动洞道深度为20~30 cm,主巢和粮仓深度为60~80 cm。洞道内温度恒定为24±2℃、湿度保持90%以上;正常洞道内氧气含量为17.24%~19.48%,雨后最低达到16.04%;洞道内CO2含量在0.03%~2.55%之间,与氧气浓度呈显著负相关(r=-0.85,p<0.001)。
  2)基于线粒体基因组序列系统进化分析结果表明,棕色田鼠与布氏田鼠同隶属于毛足田鼠属(Lasiopodomys),该属独立成枝,与田鼠属(Microtus)分枝有明显区分,与狭颅田鼠(Microtus gregalis)和凉山田鼠(Proedromys liangshanensis)共同构成单独进化枝。
  3)通过高通量测序,获得棕色田鼠和布氏田鼠的18个脑组织样品的135Gbp高质量转录组数据;使用合并组装法分别获得了两种鼠转录本的unigene集,N50长度均大于2,200 bp,组装效果较好;转录本注释后分别得到棕色田鼠的20,172和布氏田鼠的19,215个注释结果,其中,棕色田鼠Nr注释结果中有2%的基因与同为地下鼠的盲鼹形鼠(Spalas galili)相似性较高。
  4)与常氧处理相比,10%慢性低氧处理48 h后,棕色田鼠有695个基因表现出差异表达,布氏田鼠则仅为158个;进一步采用差异表达基因的功能注释、代谢通路富集及蛋白互作网络分析等方法研究,结果显示,棕色田鼠上调了氧气运输、血管生成、抑制血管生成、DNA修复、细胞凋亡、细胞自噬等功能的调控基因,脑神经保护和修复、CO2防护、血压和神经兴奋性升高等功能也有相应上调,此外,下调了蛋白水解、辅酶代谢等耗氧功能调控基因;布氏田鼠氧气运输、血管生成和抑制、脑神经保护和修复及 CO2防护等功能的调节基因有所上调,神经递质多巴胺合成及传递相关的多个基因表达下调。比较两物种慢性低氧应答发现,布氏田鼠细胞水平的应答较少,暗示棕色田鼠对慢性低氧的敏感性和应答强度均较高。
  5)与常氧处理相比,5%急性低氧处理6 h后,棕色田鼠有1,386个基因表现出差异表达,布氏田鼠则高达1,878个;进一步分析发现,二者差异基因的功能注释、代谢通路富集结果较为接近,均在血管生成、无氧呼吸激活、DNA修复和细胞增殖与凋亡等方面有大量功能基因表达上调。不同的是,棕色田鼠急性低氧下神经细胞生成与保护和多个抑制血管生成相关基因上调、多巴胺合成与运输相关基因下调,且有多个癌症相关基因和抑癌基因表现出与肿瘤微环境相反的表达模式;布氏田鼠的主要上调功能集中于血管生成和免疫应答,调控功能较为单一,神经细胞生成与保护相关基因出现下调表达,暗示棕色田鼠的急性低氧应答策略可能更为高效。
  6)棕色田鼠全基因组测序获得140X基因组覆盖度的高质量数据,组装后得到总长为2.10Gbp的Contigs,N50为51.15kbp,补洞后得到代表基因组全长的Scaffolds共2.15Gbp,N50达到6.15Mbp;reads回比分析获得777万余个SNP位点;同源比对和从头预测共获得33.93%的重复序列、21,229个编码基因和7,000余个非编码RNA序列,共有19,801个编码基因得到注释;基于棕色田鼠全基因组的有参/无参转录组结果呈极显著的正相关关系(r=0.836,p<0.0001)。
  7)使用Access软件将棕色田鼠和布氏田鼠的转录本拼接和注释结果归类整理为本地化数据库;通过BLAST+和Sequenceserver构建两个转录组和棕色田鼠全基因组的本地BLAST比对数据库;最后使用过Java语言和Apache+ Tomcat服务器实现数据库信息的局域网远程访问。
  结论:
  1)棕色田鼠洞道系统温度稳定,湿度较高,氧气含量较低,二氧化碳含量较高,与Spalax属物种的野外洞道环境参数相似;
  2)棕色田鼠与布氏田鼠均隶属于毛足田鼠属,与田鼠属分枝区分明显,与狭颅田鼠和凉山田鼠共同构成单独进化枝;
  3)棕色田鼠和布氏田鼠的转录本 unigene集各参数均比较相似,可能与二者亲缘关系接近有关;棕色田鼠 Nr注释结果中有2%与盲鼹形鼠相似性较高,推测与地下低氧环境适应产生的趋同进化有关;
  4)与布氏田鼠相比,棕色田鼠对急性和慢性低氧均具有较强的适应能力,分子机制主要包括高效的能量利用、严格的血管生成调控以及多层面的细胞修复与凋亡调节;
  5)布氏田鼠具有一定的低氧适应能力,主要表现在低氧时血管生成调控及氧气运输能力的提升,但能量代谢和细胞增殖/凋亡水平的调控少于棕色田鼠,与地面动物常见的低氧应答机制类似;
  6)棕色田鼠全基因组测序得到高质量的组装和注释结果,有参转录组分析与无参转录组分析结果拥有较高的一致性;
  7)构建的棕色田鼠转录组和棕色田鼠基因组数据库实现了数据的局域网访问及可视化查询。
[硕士论文] 周辉
设施农业 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:南麂列岛国家级海洋自然保护区是1990年创建的5个国家级海洋自然保护区之一。它是我国建立的第一个海岛海域生态系统自然保护区,其保护对象主要包括海洋贝类和藻类资源,以及海岛海域生态环境。相对来说鱼、虾、贝、藻等,对此地多毛类生物的研究比较匮乏,因此本文主要对多毛纲动物进行着重研究。
  随着对生物学认识和探索的不断深入,单一的形态学方法已不能适应现代分类学发展的需要。加拿大分类学者Hebert等从2003年开始把线粒体COI基因作为动物界的DNA条形码,进而拉开了以形态和分子分类相结合的崭新分类时代的序幕。近年来,DNA条形码技术的不断完善,已经广泛应用于生态环境学及相关领域的科学研究工作中。多毛纲是环节动物门最大的一个纲,是海洋中极为常见的动物类群,不仅是鱼类及其他动物的重要饵料,也是海洋资源调查的重要组成部分。
  本文根据2015年10月、2016年3月、2016年5月、2016年8月春、夏、秋、冬四个季节在南麂列岛国家级海洋自然波保护区的设立的9个采样点进行的采样,对共获得底栖动物多毛类环节动物360个个体,经过形态及分类学鉴定,共得到多毛类36种。在形态学的基础上,运用了分子生物学方法对部分样本进行了DNA条形码分析,获得的COⅠ DNA与GenBank上的其他研究者上传同源序列进行比对,再通过聚类和遗传距离分析,得出了6个确定的物种的条形码数据,并进行确切的描述。最后,本文主要计算了4个季节的生物多样性指数,对4个季节的指数进行了比较。2016年8月(夏季)的丰富度指数(D)最高,2015年10月(秋季)次之,2016年3月(冬季)和2016年5月(春季)较低;生物多样性指数(H'),基本都在2左右,生物多样性较好。不同的采样地点及季节会出现不同的多样性指数。
[硕士论文] 孙海坤
水产养殖 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本文以三个不同地理鲇(Silurus Asotus)群体(黄河郑州段ZZ、松花江哈尔滨段 HEB和大洋河东港段 DG)为研究对象,通过形态学和分子标记的方法研究了三群体的形态差异、遗传结构和遗传多样性,并比较了三个鲇群体背部肌肉的营养成分差异,旨在为鲇的资源保护和利用提供基础资料。
  本研究主要内容包括:⑴以三个鲇群体形态学的可数性状、可量性状和框架数据为研究对象,通过四种多元统计方法比较了三群体的形态学差异。三鲇群体间可数性状卡方检验表明其可数性状已出现分化。单因素方差分析结果表明,三群体的可量性状和框架数据有不同程度的差异,性状间的差异系数均小于1.28,三群体差异属于不同地理间差异。聚类分析结果表明,DG群体和 HEB群体形态相似程度高,两群体和ZZ群体相似程度较低。判别结果表明判别方程取得了良好效果,可以初步判别三群体的归属。影响第一主成分的11个性状主要集中在头部和鱼体的部分框架数据。四种分析方法的结果表明三群体在形态学上有一定的差异,多元统计方法可以有效地区分三群体。⑵通过国家标准方法对三个鲇群体背部肌肉的一般营养成分、脂肪酸和氨基酸进行了测定。结果表明,DG群体与ZZ和HEB两群体在一般成分上有较明显差异。对三群体的一般营养成分进行了体重和体长的协方差检验表明,体重和体长对一般营养成分的影响未达到显著水平。ZZ、DG和HEB三群体脂肪酸间比例接近理想模式。三群体的氨基酸均符合FAO/WTO的理想模式。三群体中HEB群体的必需氨基酸指数(EAAI)评分最高。缬氨酸为第一限制性氨基酸,异亮氨酸为第二限制性氨基酸。通过主成分分析三群体差异,表明三群体背部肌肉的差异主要体现在C20:5n-3、C22:5n-3、甘氨酸、丙氨酸、TDAA/TAA、∑n-3/∑n-6、C22:6n-3、粗脂肪和∑EPA+DHA。三群体均有较高的营养品质,能较好的满足人们的营养需求。⑶选取线粒体 D-loop区作为标记对三个自然河段鲇群体的遗传多样性进行比较分析。三个鲇群体碱基G+C含量显著(P<0.05)低于A+T含量。三群体单倍型数、多态位点数和核苷酸多态性从高到低依次为DG、HEB和ZZ。三群体共有21种单倍型,单倍型邻接树和中介网络图均得到单倍型3、8和19构成一支,其它单倍型构成一支的结果。三群体中HEB群体和DG群体间的遗传距离最大,DG群体和ZZ群体亲缘关系近。三群体ZZ群体和HEB群体间的遗传分化系数最高,ZZ群体和DG群体间遗传分化系数最低,群体间平均基因流(Nm)为1.532。三群体各群体的Fu'Fs中性检验和Tajima's D检验都为负值,但差异不显著(P>0.05)。碱基错配分布的实测值曲线没有一个明显地峰值。三群体均有较高的遗传多样性,群体间不存在显著(P>0.05)的遗传分化,三群体群体稳定,过去没经受种群扩张。⑷通过AFLP标记对三个自然河段鲇群体的遗传多样性进行比较分析,结果表明,DNA模板的提取、酶切连接、预扩增和选择性扩增均取得了良好的效果,64对引物中共筛出7对引物,扩出3700条AFLP条带。HEB群体的多态位点比例和Shannon遗传指数结果最高,ZZ群体结果最低。三群体变异的主要来源于群体内部。三群体具有较高的遗传多样性和较好的环境适应能力。三个鲇群体间和群体内的分子变异都存在显著性(p<0.001)。三群体中ZZ群体和DG群体间的遗传分化系数最小为0.118,ZZ群体和DG群体间的基因流最大为1.869。Structure分析、PcoA分析和UPGMA进化树三种方法均得到三个鲇群体明显地分为两大类群的结果,DG群体和ZZ群体为一类群,HEB群体为另一类群。
[硕士论文] 宫亚运
生物学·生态学 暨南大学 2016(学位年度)
摘要:鲱形目(Clupeiformes)是硬骨鱼纲(Osteichthyes)辐鳍亚纲(Actinopterygii)中的一个目,普遍生活在温带及热带的海水、咸淡水和淡水中,在世界和我国的渔业中都占有重要地位,具有极高的经济价值、医疗价值和科研价值。银鲈属(Gerres)是隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲈形目(Perciformes)银鲈科(Gerreidae?)的肉食性鱼类,在我国主要分布在南海和东海海域,因营养丰富、肉质美味,也具有较高的经济价值。目前,随着全球海洋环境的不断恶化和酷渔滥捕,鲱形目鱼类和银鲈属鱼类的产量愈发减少甚至部分种类濒临灭绝,亟待采取措施以更好地保护和合理利用鲱形目和银鲈属鱼类资源。准确的物种鉴定是深入开展海洋生态和渔业资源评估以及相关政策制订的前提,但由于鲱形目和银鲈属鱼类种类多,一些近缘种外部形态相似,且同一物种自身形态受外界环境和发育阶段的影响而有较大变化,基于传统的形态鉴定往往不能准确鉴定物种。DNA条形码是一项可对物种进行快速、准确鉴别的分子标记技术,已被广泛应用于物种的鉴定。本文以动物分类鉴定中广泛使用的标准序列线粒体COI基因652bp的序列作为DNA条形码,分析了鲱形目2亚目4科24属48种407条序列和银鲈属6种405条序列,其中本文测定的鲱形目有3科11属25种共317尾鱼类,鲈形目银鲈科银鲈属6种共399尾鱼类;GenBank中下载的鲱形目有4科19属32个种共90条序列,鲈形目银鲈科银鲈属5种共6条序列,以探讨中国近海鲱形目和银鲈属鱼类的分类地位以及DNA条形码在鲱形目和银鲈属鱼类鉴定中的有效性,分析近缘种的的系统发育关系,得到的结果如下:
  (1)鲱形目全部48个种的种内平均遗传距离为0.6%,其中有45个种的种内遗传距离小于2%,存在明显的条码间隔,满足Hebert提出的种内遗传距离标准,确定了它们的物种有效性,表明DNA条形码能对鲱形目绝大部分物种进行准确鉴定。全部24个属中有18个属形成了各自的单系分支,表明COI基因序列也能在属的水平上对鲱形目大部分类群进行很好的区分。鲚属中的凤鲚分为了2个种,刀鲚、短颌鲚为同一个种,与前人研究结论相一致;棱鳀属中的黄吻棱鳀和中颌棱鳀在NJ树上各为单系但聚为一支,可能为2个亚种或近期分化形成的种;青鳞小沙丁鱼分为2个单系支,推测可能存在2个种亦或是GenBank中序列的命名有误;洁白鲱属中的洁白鲱和鳓属中的鳓聚为一支,小沙丁鱼属中的长头小沙丁鱼和中华小沙丁鱼聚在一支,推测有可能是GenBank中鉴定的错误或是受到种间杂交、近期辐射进化的影响。
  (2)银鲈属全部6个种聚类为7个分支,除长棘银鲈外,其余5个种的种内遗传距离均小于2%,种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的62倍,远大于Hebert提出的10倍标准,表明线粒体COI基因适合作为银鲈属的DNA条形码对大部分银鲈属鱼类进行区分。长棘银鲈分为2个不同的支系,分支间的遗传距离13.8%为分支内平均遗传距离0.15%(0.1%-0.2%)的93倍,远远大于种内种间的10倍标准,表明可能存在2个不同的种,短棘银鲈和来自GenBank的缘边钻嘴鱼处于同一分支,二者系同物异名。
  (3)COI基因能够作为DNA条形码对鲱形目和银鲈属绝大部分种类在种间种内水平上进行较好的区分,但COI基因在对近期分化形成物种、杂交物种以及高阶分类水平上的类群进行鉴别时存在不足,今后对鲱形目和银鲈属的研究应结合多种分子标记和多学科进行深入探讨。
[硕士论文] 袁晓立
动物学 河南大学 2016(学位年度)
摘要:基因组编辑技术尤其是新兴的 CRISPR/Cas9系统,能高效地对基因组进行靶向修饰,理论上可以实现任何物种任何基因的编辑,对生命科学、医学等都展示出巨大的研究价值。传统的基因打靶技术依赖于DNA片段的同源重组,效率低(低于10-6)。相对于ZFNs和TALENs的复杂组装,CRISPR/Cas9系统依靠guide RNA和Cas9蛋白就可以实现基因定点编辑,具有构建简单、打靶效率高、成本低等优点。本实验设计利用CRISPR/Cas9系统分别在小鼠ES细胞和胚胎水平实现基因定点敲除,并获得单等位基因敲除小鼠模型。
  本课题以小鼠母源印记基因Kcnq1ot1作为敲除对象。该基因位于Kcnq1ot1印记基因簇中并起调控作用。本课题第一条技术路线为ES细胞介导的囊胚注射法制备转基因小鼠,策略为敲除Kcnq1ot1启动子以及其起始部位共3.7 kb长DNA片段,并敲入puro-eGFP。在敲除片段5’和3’端各找了3个靶位点并成功构建基于靶位点的6个gRNA和打靶载体 Kcnq1ot1-puro-eGFP-pGalk。将打靶载体、Cas9表达质粒和5’gRNA-1及3’gRNA-1共转染至小鼠ES细胞,得到单等位基因敲除ES细胞株。将单等位基因敲除细胞株扩大培养以后进行囊胚注射。采用CD1小鼠作为供胚鼠,共注射1836枚囊胚,移植826枚,共出生138只小鼠,出生率为16.7%,成功获得4只嵌合体小鼠,但没有生殖系嵌合。
  第二条技术路线采用受精卵原核注射法制备转基因小鼠。同样敲除3.7 kb长DNA片段,敲入mCherry荧光报告基因。为了增加同源重组效率,将同源臂长度提高至1.5 kb,构建了基于受精卵的打靶载体 Kcnq1ot1-mCherry-pGEM-3CZF。通过本实验室建立的荧光报告基因法在质粒水平检测了6个gRNA位点同源重组修复效率,筛选出同源重组效率较高的5’gRNA-2、3’gRNA-3和打靶载体及Cas9表达质粒进行原核注射。供胚鼠为D6B2F1,共注射583枚胚胎,移植327枚,出生66只,出生率20%。因同源重组修复效率低,经初步鉴定,未发现阳性鼠,目前准备增加注射胚胎的数量以获得基因敲除小鼠。
[硕士论文] 张赛赛
水产养殖 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本研究以我国辽宁地区刀鲚(Coilia nasus)为主要研究对象,以太湖群体刀鲚做对照。从形态学、肌肉生化组成和分子遗传三个层次,由浅入深的对辽河群体、大洋河群体和鸭绿江群体刀鲚的遗传多样性做了较为全面的研究。
  本研究主要内容包括:⑴通过统计传统可量性状数据和框架测量数据共40个比例参数研究了大洋河群体(DYH)、鸭绿江群体(YLJ)和太湖群体(TH)形态差异。通过软件使用主成分分析、聚类分析和判别分析三种多元分析方法,发现不同群体刀鲚形态存在差异。主成分分析表明3个群体刀鲚形态差异发生在背鳍以后的尾部。判别分析建立的判别函数对群体内判别准确率均为100%,群体间综合判别准确率为96.74%,能有效判别各群体刀鲚归属。聚类分析将鸭绿江和太湖群体聚为一支,说明在形态上两群体较接近。由此可知,3个群体刀鲚在不同的生长环境中形态发生了变异,主成分分析、判别分析和聚类分析方法一定程度能鉴别出它们的形态差异,判别分析能有效的将3个群体区分开。⑵对框架数据加以改进,有效的增加了群体内和群体间的判别准确率。改进的刀鲚框架数据中水平隔膜长度(D13)对主成分2的贡献负荷值0.804>0.500,具有显著贡献作用;反映刀鲚身体中部厚度的参数D14-14′在判别分析中从40个参数中被筛选出来,用于构建判别函数并提升了各群体内判别准确率,使准确率高达100%,群体间判别率提升至96.74%。在框架测量法中增加了不同位置鱼体体厚的数据建立,使反映鱼体体型的框架更加全面,这是对现有框架测量法的改进,值得在其它鱼类的形态学研究中进一步研究和探讨。⑶通过生化分析法比较了辽河群体、大洋河群体、鸭绿江群体和太湖群体刀鲚在肌肉营养组成上的差异。辽河群体粗蛋白含量是辽宁地区3个群体中最低(78.10%)。辽宁地区刀鲚粗脂肪含量从高到低顺序为:辽河群体>鸭绿江群体>大洋河群体,三者间相互差异显著(P<0.05)。鸭绿江群体刀鲚灰分含量最小(3.76%),其它3个群体灰分含量较高,三者之间差异不显著(P>0.05)。鸭绿江群体刀鲚的饱和脂肪酸(SFA)和多不饱和脂肪酸和(PUFA)是辽宁地区群体中含量最高的,其 EPA+DHA含量是4个群体中最高的,且均差异显著(P<0.05)。鸭绿江群体刀鲚肌肉中总氨基酸(TAA)、总必需氨基酸(TEAA)和总呈鲜味氨基酸(TDAA)含量均显著低于太湖群体,但均显著高于辽宁各群体(P<0.05)。以 AAS评数分析,缬氨酸(val)和半胱氨酸+甲硫氨酸(Met+Cys)是4个群体的第一、二限制氨基酸。以 CS评分分析,4个群体第一限制氨基酸均为半胱氨酸+甲硫氨酸(Met+Cys),第二限制氨基酸大洋河群体为异亮氨酸(Ile),其它3个群体为缬氨酸(Val)。必需氨基酸指数(EAAI)中鸭绿江群体和大洋河群体是辽宁地区中较高的,分别为75.03%和74.87%,两者间差异不显著(P>0.05)。⑷应用线粒体基因测序法,获得了辽河、大洋河、鸭绿江和太湖4个地理群体34尾刀鲚的mtDNA D-loop区域部分基因序列(长度为489bp),分析了4个群体刀鲚的遗传多样性和遗传结构。结果显示,辽河群体、大洋河群体和鸭绿江群体刀鲚的单倍型多样性指数分别为0.85700、0.84400和0.85700,核苷酸多样性指数分别为0.00263、0.00318和0.00351,都明显高于太湖群体刀鲚0.41700和0.00091。鸭绿江群体的Tajima′s D值为-1.76179,显著偏离中性(P<0.05),其历史上可能经历过种群扩张。4个群体间的遗传距离范围为0.00177~0.00323,明显低于刀鲚与七丝鲚(Coilia grayi)种间的遗传距离0.0528。Fst值为0.00543<0.05,说明4个群体间未发生分化。以NJ和MP两方法构建的分子系统分支树结果支持4个群体刀鲚间未发生分化这一结果。
[硕士论文] 刘欢
生态学 哈尔滨师范大学 2016(学位年度)
摘要:胎生蜥蜴(Zootoca vivipara)隶属于有鳞目(Squamata)蜥蜴科(Lacertian)蜥蜴属(Zootoca),是有鳞目中在种内水平呈现两种生殖模式的典型代表。我国胎生蜥蜴主要分布在黑龙江、内蒙古、新疆等地区,是我国分布最北线的蜥蜴物种。随着全球气候变化,对爬行动物的影响更为显著,生存现状面临极大的挑战,而保护生物学强调对生物多样性的保护,特别是对物种遗传多样性的保护。
  物种在长期进化过程中可能由于地理隔离而产生种内变异。本文对中国胎生蜥蜴不同种群线粒体DNA(mtDNA)Cytb基因序列和控制区D-loop部分序列进行测序。
  利用线粒体Cytb分子标记技术测定了中国7个种群的42个样本,比对后全长为1143bp,共获得9个单倍型,得到中国胎生蜥蜴地理种群间的遗传距离为(0.0000-0.00183),然后将胎生蜥蜴9个单倍型与GenBank上查到的胎生蜥蜴(Cytb)48个单倍型构建系统进化树。进化树中国VC6和VC9所聚的一支与东欧的单倍型VU1聚为一支,中国的胎生蜥蜴在进化树中并没有显示明显的地理分子系统结构。在GenBank上下载蜥蜴科已经上传的Cytb序列,经过比对分析以奥利诺科鳄(Crocody lusintermedius)作为外群,构建了蜥蜴科17个种的进化关系树。分子系统树除外群外明显分为两支,一支为麻蜥属,蜥蜴属、地蜥属、草蜥属和麻蜥属的虫纹麻蜥聚为一支,其中蜥蜴属的胎生蜥蜴和捷蜥蜴聚为一支,这与胎生蜥蜴的形态学分类地位是一致的。
  基于线粒体D-loop区测定了中国胎生蜥蜴七个种群的42个样本,结果显示有9个变异位点,共获得5个单倍型,七个种群间的遗传距离在(0.0000-0.00717)之间,利用最大似然法(MJ)构建的分子进化树显示:新疆布尔津种群与内蒙古额尔古纳种群聚为一支并与黑龙江呼玛种群聚为一支,同时这三个种群与内蒙古额尔古纳的另一个单倍型聚为一支。
  中国胎生蜥蜴不同地理种群间存在较为复杂的亲缘关系,从分子进化树中并没有发现各个地理种群间有明显的进化关系,种群间并没有按照地理分布区构成不同的谱系。并且新疆种群与内蒙古种群和黑龙江种群间存在较远的地理隔离,但各个种群之间存在明显的基因交流。
[硕士论文] 刘贤曦
海洋生物学 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本研究以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)自交9代家系为实验材料,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、最小显著差法(LSD)多重比较分析,对三疣梭子蟹连续多代自交家系的繁殖性能和生长性能进行了比较分析,评估自交对人工养殖的三疣梭子蟹的繁殖、生长、存活及与存活相关的产量等若干生长性状方面是否有影响,以及自交家系间免疫及抗氧化能力等抗病相关能力的影响。
  本研究主要内容包括:⑴通过人工定向交尾的方式建立三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)连续1~9代家系内自交全同胞家系为材料评价连续多代自交幼体发育和形态性状的影响。实验结果表明,在幼体发育方面,F1~F9各家系之间的排幼量并不呈线性关系,也无明显上升或下降的趋势,但在幼体变态率的测定中发现,在溞状幼体和大眼幼体2个阶段中总体呈现衰退趋势,尤其自交家系程度高的F9代变态率最低,F9代Z1-Z2变态率为74.87%±13.18%, Z2-Z3变态率为73.50%±14.77%,Z3-Z4变态率为59.17%±13.58%,Z4-M变态率为41.96%±18.74%;在形态学方面,在80日龄时,F1~F9家系的各个形态学指标差异不大(P>0.05),但随着生长日龄的增加,随着自交代数的增加,F3~F9代各项指标均低于F1、F2代家系,其中F9各项指标皆是最小且与其他各代差异显著(P<0.05),但在150日龄时对梭子蟹整齐度的研究中发现,F9的全甲宽变异系数为7.5444,甲宽变异系数7.6365,甲长变异系数7.5591,体高变异系数8.3282,体质量变异系数22.6644,其中甲宽、甲长、体高变异系数在所有家系中最小,整齐度最好。9代家系所有实验结果均指明自交对三疣梭子蟹的幼体变态、个体形态大小以及梭子蟹150日龄时个体的生长特性产生的影响程度不同,造成一定程度的衰退,除了F2代家系以外,随着自交系数的增加,相对于F1代,全甲宽出现-6.12%~-21.95%的衰退,甲宽出现-1.85%~-16.36%的衰退,甲长发生-10.08%~-27.66%的衰退,体高发生-9.39%~-22.7%的衰退,而体质量和排幼量的衰退系数相较于其他几个性状衰退较高,体质量的衰退系数为-13.39%~-47.99%,排幼量的衰退系数为-9.03%~-45.13%。实验结果将为三疣梭子蟹的繁育工作中提供数据支持。⑵研究了不同体质量三疣梭子蟹在进行人工侵染后的免疫相关指标以及抗氧化参数的变化。结果显示大个体梭子蟹的总血细胞数量(THC)、噬菌率、酚氧化酶原以及酚氧化酶在侵染溶藻弧菌72h之后皆比小个体的三疣梭子蟹水平高。抗氧化参数皆呈现出类似的趋势:无论血淋巴还是肝胰腺中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物岐化酶活力(SOD)以及还原型、氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)都与体质量密切相关(P<0.05)。血淋巴中的α2-巨球蛋白、抗菌和溶菌活力,以及血淋巴和肝胰腺中的谷胱甘肽过氧化物酶活力之间的差异都不明显。血细胞的酚氧化酶原和crustin基因表达水平,以及血细胞与肝胰腺中的 SOD基因表达量都呈随着体重增加而上升的水平。结果表明,相比小个体三疣梭子蟹来说,大个体梭子蟹对溶藻弧菌有更高的抵抗能力来防御弧菌的侵染。⑶研究了不同程度的自交对三疣梭子蟹家系生长过程中的免疫及抗氧化能力的影响。结果表明,自交九代之后,引起了梭子蟹总血细胞数量、噬菌活力、酚氧化酶原、酚氧化酶以及抗菌活力的的下降。相关抗氧化指标显示:血淋巴和肝胰腺的总抗氧化能力( T-AOC)、超氧化物岐化酶活力( SOD)以及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)呈下降趋势,而游离在血淋巴中的过氧化氢酶活力(CAT)呈上升趋势(P<0.05)。在九代自交家系血淋巴中的α2-巨球蛋白和溶菌活力,以及血淋巴和肝胰腺中的谷胱甘肽过氧化物酶活力都没有明显的差异。血细胞的酚氧化酶原(proPO)、crustin,与血细胞及肝胰腺中的超氧化物岐化酶的基因表达水平都呈随着自交代数的增加而明显下降。本实验结果说明,高水平的自交会严重影响三疣梭子蟹生理健康的各项指标。实验结果将为三疣梭子蟹的繁育工作中提供数据支持。
[硕士论文] 马微微
动物学 哈尔滨师范大学 2016(学位年度)
摘要:黑龙江草蜥(Takydromus amurensis)隶属于爬行纲(Reptilia),有鳞目(Squamata),蜥蜴亚目(Lacertiformes),蜥蜴科(Lacertidae),草蜥属(Takydromus),主要分布在我国东北部的长白山脉及其延续地区。本研究主要包括3部分,即黑龙江草蜥线粒体基因组全序列的测定、我国蜥蜴科系统发育的研究及对黑龙江草蜥不同地理种群细胞色素B基因(Cytb)的比较。主要的研究结果如下:
  1.黑龙江草蜥线粒体基因组全序列总长度为17333 bp,包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和1个控制区(D-loop),与已报道的脊椎动物线粒体基因组结构相似,在进化上具有高度的保守性。线粒体基因组中的碱基含量A为31.23%,C为26.06%,G为13.91%,T为28.8%,A+T含量(60.03%)大于G+C含量(39.97%);GC和AT偏斜值分别为-0.304和0.040。黑龙江草蜥与白条草蜥(T.wolteri)、南草蜥(T.sexlineatus)线粒体基因组全序列比较的结果表明,黑龙江草蜥与白条草蜥的亲缘关系较南草蜥近。
  2.从线粒体基因组全序列的结构、长度、碱基含量、遗传距离等方面对我国蜥蜴科4属12种蜥蜴进行系统发育研究,结果表明,这12种蜥蜴的线粒体基因组全序列长度为17046~19914 bp,平均长度为18471 bp,结构均由13个蛋白基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和1个控制区(D-loop)组成;4种碱基含量中,G的含量最低,平均为13.46%,T和C的含量较为接近,平均为28.99%和26.56%,A的含量最高,平均为30.99%,且A+T的平均含量(59.98%)大于G+C的平均含量(40.02%);4个属的遗传距离表明,地蜥属(Platyplacopus)和草蜥属(Takydromus)的遗传距离最近,为0.207;麻蜥属(Eremias)和草蜥属的遗传距离最远,为0.321。
  3.对黑龙江草蜥5个地理种群的Cytb基因进行测序和遗传多样性分析,结果表明不同地理种群Cytb基因的序列长度相同,均为1143 bp;27个样本共检测到27个变异位点,占总位点的3%,均为碱基转换和颠换;共定义了13种单倍型,单倍型多态度(Hd)为0.932±0.025,核苷酸多态度(pi)为0.00487±0.00038;Tajima's D和Fu’s FS值检测结果表明,这5个黑龙江草蜥种群相对于中性进化的歧异度并没有明显的偏离(P>0.1)。
[硕士论文] 孙婷婷
生态学 南昌大学 2016(学位年度)
摘要:淡水蚌类(Freshwater mussel; Unionoid bivalves)广泛分布于北美、欧亚大陆、中美洲、非洲和东南亚,是淡水生态系统的重要组成部分之一。龙骨蛏蚌(Solenaia carinata)是双壳纲(Bivalvia)蚌科(Unionidae)种类,为亚洲特有种,现生种仅分布在江西鄱阳湖流域。由于环境及人为因素的影响,龙骨蛏蚌的分布范围已经从历史记载的化石种的最北到陕西缩小至鄱阳湖流域,属于极为濒危的种类。作者首次对龙骨蛏蚌的转录组进行了高通量测序,获得了大量的转录本及功能基因注释信息,同时利用获得的转录本序列开发了龙骨蛏蚌微卫星引物,用于龙骨蛏蚌及近缘物种的遗传多样性及遗传结构的评估。主要结果如下:
  1)对龙骨蛏蚌的mRNA进行了测序,共得到141092条转录本,去冗余重复后得到125767条Unigenes,在NR数据库中共注释了26315条Unigenes,在NT数据库中共注释了2837条Unigenes,在KOG数据库中共注释了10021条Unigenes,在Swissprot数据库中共注释了18689条Unigenes,在PFAM数据库中共注释了26543条Unigenes,在GO数据库中共注释了26888条Unigenes,在KOG数据库中共注释了12351条Unigeness。在七个数据库中都注释了的有1601条Unigenes,仅仅占总数量的1.27%。
  2)筛选得到33对具有多态性的引物。期望杂合度(HE)范围从0.042到0.742,平均0.396。多态位点含量PIC范围从0.077到0.676;经过哈迪-温伯格平衡的检验,在33个龙骨蛏蚌微卫星位点中,只有2个微卫星位点外(PHW<0.05),其它均符合哈迪温伯格平衡。
  3)利用筛选到的19对微卫星引物对龙骨蛏蚌三个野生地理种群进行遗传多样性评估及种群遗传结构分析。微卫星标记数据显示龙骨蛏蚌种群具有中等遗传多样性,各位点的平均观测杂合度为0.405-0.586,平均期望杂合度为0.464-0.484。平均PIC指数为0.400-0.432之间,显示为中等水平的遗传多样性,表明所研究的三个龙骨蛏蚌野生群体内部遗传变异处于中等程度。Structrue分析显示,三个群体属于同一个聚类簇,遗传结构一致。
[博士论文] 汪正飞
生物学;动物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:鲸类(Cetacea)是一类在进化上具有十分重要和特殊意义的次生性水生动物,约56-53百万年前其祖先从陆地重返海洋,伴随着形态的巨大改变和快速地适应辐射,形成了丰富多样的现生鲸类。从陆地重返海洋,鲸类面临的首要挑战就是生活介质的改变,由原先的空气变为了水,而水这种高效的热传导体,在相同的温度下,从体内带走热量的速度比空气快25倍。因此对于鲸类而言,一方面面临着严重的热量丧失,必须获取足够的保温物质;另一方面面临环境变迁、季节更替所造成的食物短缺,必须形成独特的代谢机制以获取足够的能量。为了应对这些挑战,鲸类的鲸脂层较其他陆生哺乳动物显著增厚。这个改变在鲸类适应水生生境的过程中具有非常重要的意义,增厚的鲸脂层不仅能够起到保温、保证身体流线型、增加浮力和促进运动等作用,而且更为重要的是能通过脂肪代谢提供机体所需的能量和淡水。显然,鲸类在适应水生生境的过程中,已经形成了完善的鲸脂层增厚及相关的脂肪代谢机制。然而,这一适应的分子进化机制尚不清楚。本研究首次对鲸类脂肪消化、鲸脂层增厚和脂质代谢通路三个方面的基因进行了分子进化分析,试图阐明鲸类脂肪代谢适应性进化历史,并从分子水平上揭示脂肪代谢相关基因与鲸类水生适应之间的关系。
  论文第二章,研究了在脂肪的消化、溶解和吸收过程中起关键作用的四个消化酶基因(PNLIP、LIPC、LIPF和CYP7A1)在鲸类和其他陆生哺乳动物中的分子进化。结果表明,脂肪消化酶的三个关键基因(CYP7A1、LIPF和PNLIP)在鲸类中受到了强烈的正选择作用,提示这些基因发生了适应性进化,有助于提高对于食物中脂肪物质消化和吸收的能力,从而促进了鲸类食性的转变。同时,CYP7A1和PNLIP两个消化酶基因还在鲸类和食肉目两个枝之间检测到了3个平行/趋同位点,进一步说明了鲸类中的脂肪消化酶基因发生了适应性进化,而且表明鲸类和食肉目动物在脂肪消化方面存在相似性。
  论文第三章,首次在鲸类代表物种和其他哺乳动物中研究了88个三酰甘油代谢相关基因的分子进化,揭示了三酰甘油代谢相关基因的适应性进化在鲸脂层增厚过程中的关键作用。研究结果发现88个候选基因中的41个被检测到受正选择作用,这些基因分别参与三酰甘油的合成、分解和调控等过程。三酰甘油代谢相关基因存在如此广泛的正选择信号,可能与鲸类鲸脂层的温度调节、浮力控制、保持身体流线型、代谢能量储存和促进运动等重要功能有关。有趣的是,一些阻止脂解的调控基因在鲸类中也检测到了显著的正选择证据,表明鲸类已经进化出了一种有效机制防止鲸脂层被无限制降解,这对鲸类在禁食期维持鲸脂层厚度尤为重要。这些结果表明,鲸类存在有效且复杂的机制来保证鲸脂层维持合适厚度,从而更好的适应水生生活;同时也表明“肥胖”对于人类而言与多种慢性疾病有关,但是对于鲸类则是一种健康状态。
  论文第四章,对KEGG数据库中整个脂质代谢通路的327个基因进行了研究,全面揭示了脂质代谢通路基因在鲸类水生适应进化过程中的重要作用。结果发现,在鲸类中受正选择作用的149个基因分别位于脂质代谢通路中的15个分通路,并且鲸类的各个枝系都检测到了正选择基因,提示鲸类脂质代谢通路基因发生了持续的适应性进化。结合各个代谢途径的功能,表明脂质代谢通路中TAG合成、脂肪酸分解及多不饱和脂肪酸的代谢等功能都得到了增强,为鲸类更好的适应水生生境并辐射到全球各个水域起到了积极的推动作用。
[硕士论文] 陈相源
发育生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:在之前对非人类灵长动物以及啮齿类动物的研究中发现一种对青春期启动和雌性动物性周期维持至关重要的基因-EAP1,随着研究的不断深入发现EAP1在动物的青春期下丘脑位置表达量会上调。并且它是作为一个转录调控因子对大脑神经内分泌行使着调控作用,它可以直接或者间接激活促性腺激素释放激素基因的表达,从而对雌性性成熟和生殖周期维持起到一定的调节作用。
  在本研究中我们首次利用EAP1基因敲除的斑马鱼作为研究对象,在初步的研究中我们发现在雌性斑马鱼中EAP1的表达模式与已知的非人灵长类和啮齿类相同。我们对EAP1雌性纯合突变斑马鱼的性状进行研究,在一系列的性状中我们发现雌性纯合突变体会出现青春期延迟现象,但是在接下来研究中我们并没有发现雌性纯合突变体出现排卵周期紊乱的现象。我们以雌性斑马鱼为研究对象对其青春期进行研究时发现在产卵量方面纯合突变体与野生型和杂合体存在统计学差异,但是在产卵质量方面三种基因型的斑马鱼并无显著差异;同时,我们也对三种基因型雌性斑马鱼形态学进行了研究,在众多形态学中只有在生殖体重比方面纯合雌性斑马鱼与野生型和杂合体存在统计学差异。之前对于EAP1的研究从来没有涉及到雄性动物,我们对EAP1的研究首次涉及到雄性动物;但是雄性斑马鱼EAP1的表达模式和突变表型与之前在非人灵长类和啮齿类的研究结果并不完全相同。在对雄鱼的众多性状研究中仅仅发现性成熟的纯合突变雄鱼产精量与野生型和杂合体在统计学上存在差异。
  在本论文中我首次对EAP1在雌性和雄性斑马鱼青春期性成熟和生殖能力方面进行了初步的研究,在研究中虽然我们发现EAP1在雌性斑马鱼中的功能部分与在非人灵长类和啮齿类动物中的功能相同,但是仍然存在一些差异,如:雌性动物产生配子的数量以及EAP1发挥功能的具体机制。这可能是由于进化原因造成的,但是造成这一差异的具体原因以及EAP1在雄性动物中行使的功能和机理还有待我们进一步的研究。
[硕士论文] 王则夫
生物学·生态学 兰州大学 2016(学位年度)
摘要:青藏高原(QTP)是世界上海拔最高的高原,低温、低氧和高紫外辐射等恶劣的环境是青藏高原上动物生存的主要制约因素。青藏高原上的动物在长期的生存过程中往往会进化出相似的高海拔适应性特征,而不同的物种由于适应相似的环境呈现出的表型或分子水平的相似性被称为趋同进化(Convergent evolution)。牦牛(Bos grunniens)和藏羚羊(Pantholops hodgsonii)是青藏高原上的两种大型土著哺乳动物,生理生化水平的研究发现它们都具有血细胞含量增加、心肺体积增大等特征,说明它们的血氧系统在高海拔环境下发生了趋同进化。然而,我们并不知道牦牛与藏羚羊之间是否存在分子水平的趋同进化。为了探究牦牛与藏羚羊之间的分子水平趋同进化,我们对牦牛与藏羚羊进行了全基因组水平的趋同进化分析,这将有助于我们更好的了解它们背后的高海拔适应机制。
  本研究利用牦牛与藏羚羊的基因组数据,构建了高质量的单拷贝同源基因集,在7个物种中得到了7,950组单拷贝同源基因。通过GO分析的手段,我们鉴定出了660个牦牛特有的加速进化的GO分类,以及568个藏羚羊特有的加速进化的GO分类。虽然牦牛与藏羚羊共有的加速进化的GO分类只有118个,但是其中很多都与高海拔环境适应相关,比如“线粒体基质”、“磷脂代谢过程”、“糖酵解”、“ATP水解偶联质子运输”、“心脏收缩力的调控”、“固醇运输活动”、“脂质运输调节”、“冷响应”、“蛋白质泛素化负反馈调节”、以及“角质细胞分化”等。这说明牦牛与藏羚羊在长期的进化过程中各自产生了大量特异的适应性特征,在能量代谢、低温响应与紫外防护等方面它们可能发生了趋同进化。为了进一步探索牦牛与藏羚羊之间的趋同基因,我们设计了一套严格的趋同基因筛选流程。通过祖先位点重建、全基因组趋同位点检索、随机突变检验、位点水平似然值支持度(SSLS)评估、PCR验证与系统发育分析等一系列手段,我们发现且只发现了SOCS4基因在牦牛与藏羚羊间发生了显著的趋同进化。通过对其趋同位点与功能的进一步分析,我们发现SOCS4基因可能是导致牦牛与藏羚羊血氧系统趋同进化的原因之一,对于牦牛与藏羚羊在高海拔环境中的生存具有重要意义。
  本研究通过对牦牛与藏羚羊全基因组水平的趋同进化分析,探究了其在高海拔适应过程中可能存在的分子机制,对于进一步研究生物的高海拔适应性具有重要的意义。
[硕士论文] 化朝举
动物遗传育种与繁殖 中国农业科学院 2016(学位年度)
摘要:MicroRNA是一类长度22nt左右的单链非编码RNA,通过对microRNA调控机制模型研究表明其种子序列的2~4bp碱基可在AGO2蛋白的协助下随机结合到mRNA的3’-UTR区沿3’-5’方向前移,直至找到与其种子序列(2~8bp碱基)完全互补的序列便停止前进,与mRNA3’-UTR稳定结合抑制mRNA的蛋白翻译。MicorRNA高通量测序数据表明在小鼠体内四条不同的染色体上,分别存在着编码mmu-miR-378a/b/c/d的四个microRNA基因座,这四个基因座转录形成的成熟microRNA序列长度20-22bp不等,两两之间有1-2个碱基的差异变化,但他们有完全一样的种子序列,因此推测他们发挥类似的基因调控作用。在miRbase数据库中小鼠的mmu-miR-378a的表达量最高,其位于18号染色体上,峰值达到4.48M reads。目前对miR-378a基因功能研究主要集中在脂肪代谢、癌症迁移及发展、卵泡的成熟和细胞分化等方面,虽然众多数据显示miR-378a在骨骼肌中高表达,然而尚未有足够的实验数据说明 miR-378a在骨骼肌中高表达的意义所在。本实验旨在探索miR-378a在骨骼肌肌纤维类型组成及其在糖代谢中的功能,以解释miR-378a在骨骼肌中高表达的意义。
  为探究miR-378a在骨骼肌中的功能,本研究制备了miR-378a敲除小鼠,并分析了骨骼肌的表型和调控机制。采集miR-378a敲除小鼠和野生小鼠的股四头肌(Qua),通过ATPase染色和检测肌纤维相关类型相关基因myh1和myh2的表达分析,表明miR-378a影响小鼠肌纤维类型组成;为探究miR-378a对骨骼肌代谢的影响,本研究分析了miR-378a敲除小鼠和野生小鼠的血清生化指标,并通过生物信息学和实验生物学方法,发现miR-378a通过锚定Rora调控骨骼肌纤维类型转化和糖代谢。
  本研究主要获得以下结果:①小鼠mmu-miR-378a在骨骼肌中的表达量较高;且在分离的小鼠腓肠肌(Gas)、比目鱼肌(SOL)、胫骨前肌(TA)、趾长伸肌(EDL)和股四头肌(Qua)中发现富含酵解型肌纤维的Gas、EDL和Qua组织中miR-378a的表达量最为丰富。②通过miR-378a敲除和野生小鼠的Qua及Gas组织进行碱性ATPase酶染色发现miR-378a敲除组小鼠的 Qua和 Gas组织中氧化型纤维所占面积百分比增加,其中 Qua组织中增加量极显著(p=0.002),而Gas组织中氧化型纤维亦有所增加但不显著(p=0.136);③通过对miR-378a敲除小鼠和野生小鼠血清中生化指标检测结果表明:miR-378a敲除组血清中与骨骼肌葡萄糖酵解相关的乳酸脱氢酶(LDH)以及与底物磷酸化生成 ATP相关的肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量上升。④通过microRNA靶标调取实验找到miR-378a的靶基因Rora,并用双萤光素酶活性实验证实了miR-378a对Rora的靶标作用。⑤通过在C2C12上过表达Rora,验证了miR-378a敲除对小鼠Qua组织中LDH和CK的表达量影响是通过其靶基因Rora进行调控的。
  结论:Rora是miR-378a的一个靶标,miR-378a可通过其调控骨骼肌肌纤维类型和糖代谢。
[硕士论文] 王娟
发育生物学 湖南师范大学 2016(学位年度)
摘要:多倍体是含三套或三套以上完整的染色体组的生物体。多倍化是生物进化和物种发生的重要方式。本研究,对自然界中同源多倍体鲫鱼群体以及人工诱导同源多倍体鲫鱼群体的形成机制和生物学特征进行了系统的研究。具体研究如下:
  1.在洞庭湖水系统中,鲫鱼群体表现出二倍体形式(2n=100,简称2nCC)和多倍体形式(3n=150,简称3nCC,4n=200)共存的特征。为了进一步了解多倍体鲫鱼的遗传组成和起源,本研究利用5S rDNA基因和物种特异性着丝粒序列为探针进行荧光原位杂交(FISH)检测。在细胞遗传水平上证明了染色体数目为150的鲫鱼(简称3nCC)为三倍体。同时证明了3nCC的3套染色体均来自于鲫鱼,是同源三倍体起源。这是首次在细胞遗传水平上证明自然界中三倍体鲫鱼为同源三倍体起源,为鱼类遗传育种和生物进化研究提供了重要的理论知识。
  2.异源四倍体鲫鲂(简称4nF1)(AABB,4n=148)包含了2套红鲫(AA,2n=100)染色体和2套团头鲂(BB,2n=48)染色体,其在减数分裂过程中表现出异常染色体行为,产生各种不同遗传组成的配子,其中包括同源三倍体配子(AAA,3n=150)。本研究利用紫外线灭活的团头鲂精子诱导雌性4nF1的卵子,没有经过染色体加倍处理,获得了大量发育正常的雌核发育后代。其中,一部分雌核发育后代是具有3套红鲫染色体的同源三倍体鲫鱼(简称G1)(AAA3n=150)。G1全部是雌性,并且在Ⅰ龄时期能够产生不减数的三倍体卵子。继续用紫外线灭活的团头鲂精子,诱导G1的卵子进行雌核发育,没有经过染色体加倍处理,获得了的第二代雌核发育同源三倍体鲫鱼(简称G2)(3n=150)。目前,雌核发育同源三倍体鲫鱼已经繁殖到第3代,建立了一个能稳定产生同源三倍体卵子的雌核发育的同源三倍体鲫鱼克隆体系(G1-G。)。该克隆体系为同源多倍体鱼研究和应用提供了重要的配子资源,这在生物进化和鱼类遗传育种研究中具有重要意义。
  3.在鱼类遗传育种中,三倍体和单性后代往往在抗逆性和生长方面具有显著优势。本研究对雌核发育同源三倍体鲫鱼的外形和生长速度进行了比较研究。在外形方面,雌核发育同源三倍体鲫鱼和红鲫在体色、可数性状和可量性状表现了出了显著差异;在生长速度方面,G1和G2的生长速度明显快于红鲫,而G1与G2的生长速度并没有明显差别。这说明雌核发育同源三倍体鲫鱼具有明显的遗传变异,而且这些遗传变异能稳定的遗传给后代,为其产业化推广奠定了基础。
[硕士论文] 罗光杰
生物学·动物学 兰州大学 2016(学位年度)
摘要:沙鼠属(Meriones)和短耳沙鼠属(Desmodillus)均属于啮齿目(Rodentia)仓鼠科(Cricetidae)。我国境内有隶属于沙鼠属的四个物种,分别为柽柳沙鼠(M. tamariscinus),长爪沙鼠(M. unguiculataus),红尾沙鼠(M. libycus)和子午沙鼠(M. meridianus),短耳沙鼠属是单种属,只有短耳沙鼠(D. auricularis)一种。
  从野外采集的柽柳沙鼠、红尾沙鼠、子午沙鼠和短耳沙鼠的肌肉样本中分别提取、扩增线粒体基因组,长爪沙鼠的线粒体基因组从Genbank数据库中下载。分别对五种沙鼠的线粒体基因组结构、碱基组成和G+C含量进行分析。以线粒体基因组为标记,对五种沙鼠进行系统进化分析,结合化石记录计算各自的分歧时间。
  在以沙鼠亚科(Gerbillinae)和仓鼠亚科(Cricetinae)物种线粒体基因组、总蛋白序列和D-loop序列构建的系统发育树中,五种沙鼠被聚类于同一进化枝,具备共同祖先,起源于2.96 Myr。柽柳沙鼠为最早分化出现的物种,是我国沙鼠属的起源物种。短耳沙鼠位于柽柳沙鼠和红尾沙鼠之间,于2.56 Myr分化而来。红尾沙鼠于2.12 Myr分化出现,子午沙鼠和长爪沙鼠于1.75 Myr分化而来。根据沙鼠类物种在全球范围内的历史迁移及扩散,我国沙鼠类物种进化历史较短,起源时间晚于其他地区的沙鼠类物种。受沙鼠类物种的种群迁移及地理环境的演变影响,本研究中采集自克拉玛依地区的红尾沙鼠具备与阿拉伯国家的红尾沙鼠相近的历史地位,其分化时间早于我国吐鲁番地区的红尾沙鼠。我国短耳沙鼠的系统进化地位在形态学数据和分子数据方面均缺乏研究,导致短耳沙鼠归于沙鼠属的原因或许是我国独特的地理环境演变使其有着不同的进化历史,或者是采用的分子标记不同。
  本文首次将线粒体基因组作为标记应用于啮齿目下属分类单元的系统进化研究,从基因组水平阐述了五种沙鼠的系统发育关系和进化历史,体现出线粒体基因组作为分子标记在解决近缘物种之间系统进化关系的优越性。该研究将为沙鼠亚科的系统发育和其他相关研究提供重要的参考资料,并对重建啮齿目乃至哺乳动物的系统发育关系起着重要作用。
[硕士论文] 梁延峰
动物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:在哺乳动物早期胚胎发育以及体外建立的细胞分化及重编程过程中均存在X染色体的失活及其重活化,作为X染色体失活(Xchromosome inactivation,XCI)的关键调控因子长非编码RNA(longnon-coding RNA,LncRNA)基因Xist通过顺式缠绕目的失活的X染色体,从而介导了多种RNA/蛋白复合物的募集,最终启动XCI的发生。在之前的研究中利用基于类转录激活效应物设计的体外转录因子(Transcriptional-activator-like effectors based designer TranscriptionFactors,Tale-dTFs)研究Xist在体细胞重编程中的作用,Xist抑制因子R4和R6均对小鼠诱导性多能干细胞系的形成具有促进作用,而R6对小鼠iPSC(induced Pluripotent Stem Cell)的诱导具有促进作用更加明显,但由Xist R-dTFs诱导的小鼠iPSC的嵌合体形成能力尚未报道。
  本研究拟利用四种转录因子(Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4)与Xist的基于类转录激活效应物的转录抑制因子(Xist Tale R-dTF)共转染重编程技术,利用携带有GOF-GFP基因的小鼠胎儿成纤维细胞诱导为iPSC,并利用碱性磷酸酶染色、免疫组织化学,畸胎瘤形成,拟胚体(EB)分化和实时定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技术对获得的Xist R-dTFs来源iPS细胞系进行鉴定,并比较由R4和R6诱导获得的iPS细胞系的嵌合体发育能力。实验结果:
  1、在获得的9只小鼠胎儿中,除4#丢失GOF-GFP外,其余8只均为GOF-GFP阳性,此外,2#、3#、6#和8#为雄性,其余为雌性。
  2、由Xist Tale R-dTF+4F(Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4)诱导成功获得了R4、R6和ConR三种iPS细胞系。建立的iPS细胞克隆形态显示为典型的干细胞克隆形态,并可传50代以上。
  3、Xist Tale R-dTF来源的iPS细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性;实时定量PCR显示在由Xist Tale R-dTF+4F诱导获得的iPS细胞中Oct4、Sox2、Nanog、 Rex1等多能性基因的表达水平与干细胞相近;将iPS细胞注入小鼠皮下成功形成了畸胎瘤并且分化形成了三胚层组织;于体外悬滴培养iPS细胞成功形成了拟胚体,免疫荧光染色结果显示来源于三胚层的经典标记AFP、T和NCAM1均为阳性;将雌性小鼠iPS细胞进行囊胚注射,最终成功获得到了嵌合体小鼠,嵌合体的获得效率如下:ConR为1/8,R4为1/6,R6为1/5。
  综上所述,Xist R-dTFs来源的iPS细胞具有与ES类似的多能性,并且囊胚注射所使用的R4、R6和ConR三种雌性小鼠iPS细胞系均具有形成嵌合体小鼠的能力。
[硕士论文] 郜星晨
生物学微生物学 暨南大学 2015(学位年度)
摘要:鲀形目(Tetraodontiformes)现存10科100属约350种,主要分布在热带和亚热带海洋,仅少数种类定居在淡水中,或在一定季节进入江河。鲀形目很多种类是重要的养殖鱼类和海洋捕捞对象,其中绿鳍马面鲀(Thamnaconus modestus)、黄鳍马面鲀(T.hypargyreus)等目前面临资源枯竭的困境。东方鲀属(Takifugu)鱼类近年来在水产养殖、河豚毒素医药开发、脊椎动物基因组研究方面有着广泛的应用,具有重要的经济地位、科研及医药价值,与此同时误食河鲀引起的中毒乃至死亡事件也时有发生。准确的物种鉴定不仅能有效地区分鲀毒鱼类,而且可以促进渔业资源合理开发、生态调查及生物多样性保护。但由于鲀形目鱼类外部形态总体差异较大,近缘种间十分相似,传统分类学多以条纹、斑点、体色等易受主观因素影响的形态特征作为主要辨别依据,以致至今鲀形目鱼类分类一直存在争议。DNA条形码通过对标准基因DNA序列的分析快速鉴定物种,已成功应用于动物、植物及微生物。本文测定了中国沿海8科19属33种110尾鲀形目鱼类线粒体COI基因5’端652 bp的序列,结合GenBank下载的序列,共分析了8科25属56种210条鱼类COI序列,旨在利用DNA条形码技术鉴定我国沿海常见的鲀形目鱼类,澄清目前分类的混乱,揭示可能存在的隐存种,并进行初步的系统发育分析,基于K2P替代模型的研究结果如下:
  (1)鲀形目亚目内科间、科内属间、属内种间、种内平均遗传距离分别为20.38%(18.59%-27.04%)、16.57%(0.89%-22.74%)、7.35%(0.03%-17.09%)、0.56%(0-5.41%),其中53种种内遗传距离小于2%的遗传距离阈值,48种种内遗传距离小于1%。56种鱼类种间平均遗传距离约为种内遗传距离的34倍,51种鱼类最小种间遗传距离大于最大种内遗传距离,在种内、种间乃至属间均无重叠,形成理想的DNA条形码间隙。但东方鲀属的鱼类可能受到种间杂交、近期辐射进化等干扰,墨绿东方鲀(T.basilevskianus)与红鳍东方鲀(T.rubripes)、双斑东方鲀(T.bimaculatus)与黄鳍东方鲀(T.xanthopterus)等未形成明显的DNA条形码间隙;而兔头鲀属(Lagocephalus)鱼类种间遗传距离已经达到鲀形目鱼类属间平均水平(16.57%),分类地位需要进一步研究。
  (2)在邻接树上鲀形目鱼类总体按物种名聚类,与形态学鉴定结果基本一致;属内能形成具有较高支持率的分支,但较高阶类群的系统发育关系不明确。除兔头鲀属(Lagocephalus)外,其余24个属均为单系。马面鲀属(Thamnaconus)的马面鲀(T.septentrionalis)与黄鳍马面鲀(T.hypargyreus)、东方鲀属(Takifugu)的铅点东方鲀(T.alboplumbeus)和斑点东方鲀(T.poecilonotus)可能存在同物异名现象。棘箱鲀(Kentrocapros aculeatus)、尖鼻箱鲀(Rhynchostracion nasus)、翻车鲀(Mola mola)等可能存在隐存种。
[硕士论文] 向玲
海洋生物学 广东海洋大学 2015(学位年度)
摘要:金钱鱼不但是一种具有观赏和食用价值的名贵海水经济鱼类,而且雌性生长速度明显高于雄性。因此,获得雌雄性别差异分子标记,从遗传角度鉴定金钱鱼的性别,对实现分子辅助育种及后续的单性化养殖意义重大。目前,随着环境恶化,金钱鱼种质资源退化越来越严重,因此,对金钱鱼遗传多样性进行评估,可为制定科学的资源保护提供理论参考。
  本文以金钱鱼为研究对象,采用SSR、AFLP、SRAP三种分子标记技术筛选其雌雄性别差异标记,并分析雌、雄群体遗传多样性。主要结果如下:
  1、基于SSR技术的金钱鱼性别特异分子标记筛选及雌雄群体遗传多样性分析
  以金钱鱼基因组为模板,通过磁珠富集法得到65条微卫星序列,并设计了45对引物对金钱鱼雌雄基因池进行初步筛选。结果发现,2对引物(SAS21、SAS23)可扩增出雌雄差异条带。分别以雌雄金钱鱼各30尾DNA为模板,再次采用引物SAS21、SAS23进行扩增。引物SAS21扩增的差异条带在雌性金钱鱼中出现比率为30%,在雄性金钱鱼中所占比率为10%;而引物SAS23扩增的差异条带在雌性金钱鱼中所占比率为10%,在雄性金钱鱼中出现比率为60%。以筛选获得多态性较高的3对微卫星引物对金钱鱼雌雄群体进行遗传多样性分析,结果表明,金钱鱼雌雄群体Nei'基因多样性指数(H)分别为0.5342和0.5408,Shannon's信息指数(Ⅰ)分别0.962和0.996;多态信息含量(PIC)分别为0.4708和0.4853;有效等位基因(Ne)分别为1.2034和1.252。
  2、基于AFLP技术的金钱鱼性别特异分子标记筛选及雌雄群体遗传多样性分析
  利用144对AFLP引物组合对雌、雄金钱鱼基因池进行初步筛选,得到5760个条带,其中3对引物(E7M8、E1M3、E2M8)可扩增出雌雄差异条带。以雌、雄金钱鱼各30尾DNA为模板,再次用引物E7M8、E1M3、E2M8进行扩增,其中引物E7M8扩增的差异条带在雌性个体中所占比率为83.3%,在雄性个体中所占比例为40%;引物E1M3扩增的差异条带在雌性个体中所占比率为100%,在雄性个体中所占比率为44%;引物E2M8扩增的差异条带在雌性个体中所占比率41.1%,在雄性个体中所占比率为0%。利用筛选所得多态性较好的6对引物对金钱鱼雌、雄群体进行遗传多样性分析,结果发现雌性个体检测到51个多态位点,多态位点比例为29.48%,雄性个体检测到68个多态位点,多态位点比例较高,达到39.31%。金钱鱼雌雄群体的H分别为0.1149和0.1465;Ⅰ分别为0.1682和0.2169; Ne分别为1.2034和1.252;此外金钱鱼雌、雄个体间的相似系数为0.8927-0.8986,遗传距离为0.1069-0.1135,表明金钱鱼雌雄间分化不大。
  3、基于SRAP技术的金钱鱼性别特异分子标记筛选及雌雄群体遗传多样性分析
  利用64对SRAP引物组合对金钱鱼雌、雄基因池DNA进行初步筛选,共得到461个扩增条带,并不具有雌雄特异条带。此外,引物Me4Em5扩增出的差异条带在30尾雌性金钱鱼中所占比率为96.7%,在雄性金钱鱼中所占比率为30%。筛选所得多态性较好的3对SRAP引物组合对金钱鱼雌雄群体遗传多样性进行分析,结果发现金钱鱼雌性群体和雄性群体的H分别为0.3585和0.3984;Shannon指数分别为0.5269和0.5757; PIC分别为0.28482和0.30935; Ne分别为1.616和1.703。金钱鱼雌性群体和雄性群体间的遗传距离和遗传相似性分别为0.1329和0.8756。
  利用SSR、AFLP、SRAP三种分子标记对金钱鱼雌雄差异条带进行筛选,未找到性别特异标记,但采用SSR技术,以引物SAS23扩增,出现差异条带的个体85.7%的可能为雄性;采用AFLP技术,以引物E2M8扩增,出现差异条带的个体100%的可能为雌性。用同样三种分子标记分析金钱鱼雌、雄群体的遗传多样性,结果表明三种分子标记SSR、AFLP、SRAP技术所得结果具有一致性,即金钱鱼群体遗传多样性较低,雌雄间遗传变异小,而雄性金钱鱼遗传多样性高于雌性,良种选育的潜力较小。
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