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[硕士论文] 沈香莲
生物化学与分子生物学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:盐碱土壤严重制约植物的生长、发育以及生物产量,也是影响生态环境和农业生产的主要因素,因此,研究探讨盐胁迫下植物的分子应答机制是生物学研究的重要课题,具有重要的意义。本课题组在研究氮素代谢与植物盐胁迫间关系的前期实验表明,在种子萌发期时,脲酶的缺失突变体(aturease)、过表达谷氨酰胺合成酶(AtGS1.1)基因都能够提高植物对盐胁迫的耐受性,且与野生型拟南芥(WT)相比体内NH4+含量明显减少,相关结果暗示了氮素代谢(尤其是尿素代谢)与植物的耐盐性密切相关。精氨酸酶(Arginase)作为尿素代谢途径中水解精氨酸产生尿素的关键酶,本研究对拟南芥精氨酸酶(AtArgAH1和AtArgAH2)基因与植物耐盐性之间的关系做了迸一步的解析。具体研究结果如下:
  首先,本研究对AtArgAH1和AtArgAH2基因的表达特性做了系统解析。通过组织特异性表达分析发现,拟南芥在成熟期时,AtArgAH1在根中表达量最高,而AtArgAH2在果荚中表达量最高。同时通过非生物胁迫处理发现AtArgAH1与AtArgAH2表达具有一定的差异,在NaCl盐处理下AtArgAH1和AtArgAH2在子叶和根部的表达趋势一致,但AtArgAH2表达量高于AtArgAH1。在不同浓度NH4C1胁迫下AtArgAH1及AtArgAH2在子叶中分别呈上调表达及下调表达。在不同浓度Urea胁迫下AtArgAH1在子叶中呈上调表达,根中呈下调表达;而AtArgAH2表达则相反。在不同浓度Arginine胁迫下,AtArgAH1表达量高于AtArgAH2。
  为了解精氨酸酶基因的功能,对其突变体在不同处理条件下的表型进行了解析。通过在不同形态氮素处理下WT、argah1和argah2长势和含量分析发现,Arginine作为唯一氮源时,argah1的生长势与WT和argah2相比明显受到抑制,且体内NH4+含量明显低于WT和argah2;而在Urea作为唯一氮源时,argah2的生长势与WT和argah1相比明显受到抑制,且体内NH4+含量明显低于WT和argah1。以上结果暗示:argah1不能利用外源Arginine作为唯一氮源,而argah2不能利用外源Urea作为唯一N源。
  通过在盐胁迫下添加精氨酸酶活抑制剂来阻断精氨酸酶的活性,随着添加抑制剂浓度的升高能明显提高WT在盐胁迫下种子的萌发,并能显著性降低WT体内NH4+的含量。同时在高盐处理下,argah1和argah2的生长势要优于WT,子叶和根部的尿素、NH4+含量明显低于WT。通过在盐胁迫下探究精氨酸酶作用时间发现,在低温处48h之前,随着处理时间的延长,两个精氨酸酶缺失突变在长势和根长上明显优于WT;而在春化48h后进行正常光照培养发现,随着光照培养时间的延长,WT、argah1和argah2在长势和根长上无明显差异。
  argah1和argah2对精氨酸代谢相关酶(精氨酸脱羧酶:ADC和一氧化氮合酶:NOS)基因表达影响的研究发现,正常条件下argah1和argah2体内ADC1、ADC2和NOS酶活性并不相同。在盐胁迫下,argah1和argah2体内ADC1、ADC2和NOS表达量与正常条件相比显著升高。这些结果暗示在盐胁迫下ADC和NOS也参与其应答。
  以上结果表明,拟南芥两个精氨酸酶基因(AtArgAH1和AtArgAH2)表达与盐胁迫及不同形态氮素(Arginine和Urea)存在一定的应答关系,argah1和argah2突变体在不同处理条件下表型分析的结果也进一步暗示氮素代谢(尤其是尿素代谢)与植物的耐盐性存在密切关联,为进一步探究植物种子萌发期耐盐分子机制奠定理论基础。
[硕士论文] 于亚慧
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:钙是植物生长发育所必需的矿质营养元素,能够维持细胞膜的结构与功能,增强细胞壁结构的稳定性,调节生物酶活性并稳定细胞内环境.植物细胞质内钙离子(Ca2+)作为第二信使,应对各种胁迫刺激,在细胞信号转导过程中起着重要作用.植物中钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent Protein Kinases,CPKs)能够与Ca2+结合,参与Ca2+信号转导.拟南芥(Arabidopsis thaliana)中共有34个AtCPK基因编码的蛋白,本课题重点研究AtCPK6的生理功能.
  为了研究AtCPK6在拟南芥中的功能,对AtCPK6基因缺失突变体atcpk6-2(Salk_033392)和atcpk6-3(Salk_025460)进行了纯合鉴定,获得两种纯合突变体.通过分析野生型拟南芥Col-0和atcpk6突变体在不同Ca2+浓度培养基上的生长表型,发现atcpk6在低Ca2+条件下,相对Col-0,表现生长受抑制的表型,而在其他二价阳离子Fe2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+缺乏条件下,atcpk6突变体与野生型Col-0相比无明显差异.构建含有AtCPK6启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的转基因材料,通过GUS组织化学染色法,发现AtCPK6启动子在拟南芥幼嫩叶原基和根中有活性.AtCPK6编码的钙依赖性蛋白激酶是一种钙结合蛋白,进一步研究了低Ca2+环境对AtCPK6启动子活性的影响,发现低Ca2+条件下,AtCPK6启动子在叶片中的活性增强.
  为了深入研究AtCPK6基因是否影响植物对钙的吸收和积累,通过原子吸收光谱法(Atomic absorption spectrometry,AAS)对植物总钙含量进行测定.结果显示,拟南芥野生型Col-0和atcpk6之间,在对照和低Ca2+条件下,总钙含量没有显著差别,表明AtCPK6基因不影响植物对钙的吸收和积累.各种外界刺激会诱导植物细胞内H2O2的产生和积累,通过3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)组织化学染色法,发现低Ca2+条件下,atcpk6叶中H2O2的积累量显著高于Col-0.利用二氢罗丹明123(Dihydrorhodamine123,DHR)荧光探针,发现低Ca2+条件下,atcpk6根中H2O2的积累量显著高于Col-0,证明AtCPK6是介导低Ca2+诱导植物积累H2O2的负调控因子.本研究有助于揭示植物对低Ca2+环境的适应机制.
[博士论文] 李焕勇
林木遗传育种 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:土壤盐渍化已成为全球重要的资源与环境问题,NaCl是盐渍土中最常见且分布最广泛的盐分。植物代谢物是基因与环境互作的结果,也是特定环境条件植物生理生态功能的赋予者。盐生植物在长期演化过程中形成了一系列适应盐渍环境的特殊生存策略,进化出特殊的耐盐适应机制,是研究和解析耐盐分子调控及生理代谢机制的理想材料。西伯利亚白刺(Nitraria sibirica Pall.)属蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Nitraria L.)灌木,为第三纪孑遗植物和典型盐生植物,具有极强的耐盐碱、耐干旱能力。然而,关于西伯利亚白刺对盐胁迫的分子和生理代谢响应机制还不清楚。
  本研究以NaCl处理后的西伯利亚白刺叶片为材料,在生理响应基础上,利用高通量测序技术和GC-TOF/MS技术研究西伯利亚白刺响应盐胁迫的转录和代谢变化规律,通过转录组和代谢组关联分析,确定差异基因和差异代谢物的相关性网络,阐释了西伯利亚白刺对盐胁迫的分子和生理代谢响应机制。主要研究结果如下:
  (1)西伯利亚白刺通过增加渗透调节物质及内源激素ABA和GA含量来提高对盐胁迫的适应性。西伯利亚白刺叶片中可溶性糖含量随处理时间的延长表现出先降低后增加趋势,在处理3d时可溶性糖含量逐渐开始增加;处理初期,随着处理浓度的升高可溶性糖含量逐渐减少,从处理3d开始,随着处理浓度的升高可溶性糖含量逐渐增加。脯氨酸和其它氨基酸含量变化趋势基本一致,随着处理浓度的升高其含量不断增加;而随着处理时间的延长,两者含量呈现出先增加后减少的趋势,在处理3d时达到最大值。内源激素脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)的含量的变化趋势也基本一致,随着处理浓度的增加,ABA和GA含量也逐渐增加;而随着处理时间的延长,ABA和GA含量也呈现一个先增加后略微下降的变化,在处理3d时达到最大值。生长素(IAA)含量随着处理时间的延长逐渐减少;而随着处理浓度的升高IAA含量表现为先增加后降低,在100 mmol·L-1NaCl处理时IAA含量最高。
  (2)西伯利亚白刺主要通过信号转导及氨基酸、有机酸和糖代谢等过程相关基因的协同调控提高对盐胁迫适应性。利用Illumina HiSeq2000测序平台对西伯利亚白刺叶片三个处理的9个样本进行转录组测序,最终得到72.21G clean reads,经拼接处理后得到205540条transcripts和126059条genes。基因功能注释发现有91099(72.26%)条unigene至少在一个数据库中获得了注释。通过对unigene进行差异表达分析,发现100mmol·L-1NaCl处理与未施盐处理之间共有1337条差异表达基因;400 mmol·L-1NaCl处理与未施盐处理之间共有526条差异表达基因。与未施盐处理相比,100和400 mmol·L-1NaCl处理的差异表达基因在结合、细胞壁、外部封装结构、胞外区域与核苷酸结合等GO条目中表现出显著富集。KEGG富集分析发现,NaCl处理显著提高了西伯利亚白刺叶片中主要代谢途径及信号转导等相关基因的表达,主要包括植物病原互作,氨基酸代谢中的β-丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和甘氨酸代谢,碳代谢中的糖酵解、糖异生、半乳糖、淀粉和蔗糖代谢,植物信号转导以及可变剪接等途径。
  (3)西伯利亚白刺通过增强氨基酸代谢及TCA循环等代谢过程,增加了相关代谢物含量来提高对盐胁迫的适应性。NaCl处理3d后,西伯利亚白刺叶片提取物中共检测到619个有效峰,PCA分析发现400 mmol·L-1NaCl处理与未施盐处理在第一主成分区分明显,但100 mmol·L-1NaCl处理与未施盐处理区分不明显,而OPLS-DA分析显示在不同处理浓度下均有明显区分。依据OPLS-DA的VIP得分值及t检验的P值筛选差异代谢物,100 mmol·L-1NaCl处理与未施盐处理之间有10个差异代谢物,400 mmol·L1NaCl处理与未施盐处理之间有34个差异代谢物,差异代谢物主要为氨基酸类(脯氨酸、天冬氨酸等)、有机酸类(草酰乙酸、富马酸等)及多元醇(肌醇、核糖醇等)等。氨基酸合成及TCA循环等主要代谢途径中的丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、木糖、蔗糖、甘露糖、草酰乙酸、苹果酸等代谢物含量在400 mmol·L-1NaCl处理下明显增加。KEGG注释及富集分析发现,与未施盐处理相比,100 mmol·L-1NaCl处理对西伯利亚白刺叶片中硫代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢影响比较大,而400 mmol·L-1NaCl处理显著影响了西伯利亚白刺叶片中的各种氨基酸代谢、TCA循环、光合作用碳固定及硫代谢等代谢途径。
  (4)转录组中差异基因和代谢组中差异代谢物关联分析发现,100 mmol·L-1NaCl处理下,上游转录调控层面的α-淀粉酶(AMY2)、β-淀粉酶(BAM1)及甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT3)等基因表达量增加,提高了淀粉酶活性,从而在代谢层面促进了淀粉的水解,利于下游L-半胱氨酸及2-氨基苯酚等代谢物的合成;在400 mmol·L-1NaCl处理下,天冬氨酸转氨酶基因(ASP1)表达增强,促进了氨基酸类及其衍生物的合成;钙调蛋白基因(CML38的上调表达,可以激活多重刺激信号,使胁迫相关基因表达,调节蛋白和代谢物的合成;核糖体蛋白基因(RPL4)表达上调,促进了蛋白及酶的合成。
  综上所述,本研究基于西伯利亚白刺耐盐生理基础,确定了不同处理条件下西伯利亚白刺叶片中的差异基因和差异代谢物,分析了其在NaCl处理下的转录调控和生理代谢机制。研究发现AMY2、BAM1、GPAT3、ASP1、CML38及RPL4等基因和L-半胱氨酸、脯氨酸、4-氨基丁酸和草酰乙酸等代谢物在西伯利亚白刺耐盐调控中发挥重要作用。本研究丰富了西伯利亚白刺耐盐机制,为盐碱地治理及盐生植物培育提供了理论依据和技术支撑。
[硕士论文] 殷倩
生物化学与分子生物学 宁夏大学 2018(学位年度)
摘要:以往研究显示,在影响植物生长发育的众多重要环境因子中,昼夜长度的周期性变化是最重要的因素之一。尽管一些昼夜周期响应基因的功能已经被明确,但光周期调控植物生长发育的分子机制仍属于未知。本实验室前期测定了不同光周期处理马铃薯叶片转录组,分析发现,差异表达基因(DEG)涉及121个代谢通路,实验数据分析,确定了20个光周期响应上游调控基因。其中DMG400012536(St536)、DMG40000663(StASR3)响应光照功能未知,并且St536属于新基因家族的成员之一。本研究旨在研究这些基因的功能,具体研究结果如下:
  (1)数据库检索和序列分析表明,St536基因cDNA序列包含648bp的ORF,编码215个氨基酸组成的多肽,第91到第110位形成20个氨基酸组成的跨膜结构域;StASR3基因cDNA序列包含336bp的ORF,编码111个氨基酸组成的多肽。
  (2)合成两个基因cDNA,亚克隆将其连接到植物真核表达载体T-DNA,构建了含有过量和抑制表达载体的重组根癌农杆菌菌株GV3101-pC-35S-St536+/-、GV3101-pC-35S-StASR3+/-,通过根癌农杆菌介导途径,转化重组菌株普通烟草体内,筛选得到阳性转化株系。
  (3)St536表达的亚细胞定位结果显示,St536-GFP融合蛋白与线粒体标记信号完全重叠,结合其跨膜结构域的存在,表明St536蛋白表达于线粒体膜;结果证实了基因组注释中St536同源物线粒体表达的预测。
  (4)StASR3过量表达株系气孔导度和净光合速率均值比对照分别降低了33%和26%,ATP积累均值比对照增加了57%,水杨酸积累均值比对照降低了44%。结合以往研究报道,结果表明,StASR3表达增加,减少了叶片内源激素水杨酸积累,降低了气孔导度和氧化还原水平,使叶片对ABA胁迫的敏感性减弱。尽管StASR3过量表达,叶绿素和ATP积累增加,但气孔导度降低导致净光合作用速率下降。
  (5)St536过量表达,叶片纤维素积累和气孔相对长度,分别比对照降低了20%和17%,气孔导度和光合速率分别是对照的4.6和3.5倍,ATP和叶绿素积累显著增加,结合以往研究报道,本研究表明,St536过量表达,减少了叶片纤维素积累,气孔开闭更灵活,气孔导度和光合速率随之提高。
  (6)结论认为:StASR3过量表达增强耐早性,归因于水杨酸积累减少导致气孔导度下降所致。线粒体膜蛋白St536反向调控保卫细胞壁纤维素积累,增强气孔导度和光合速率。
  本研究不仅明确了线粒体膜蛋白St536参与纤维素积累,调控气孔和光合作用,而且为解析两者的信号提供了重要的实验证据。
  此外,还明确了增加StASR3表达,降低气孔导度,明确了导致气孔导度降低的内源激素,为进一步揭示ASR基因如何调控耐早性提供理论依据。
[博士论文] 张明明
生物化学与分子生物学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:目前,全球气候变暖和人口增长等因素日趋严重,土壤盐碱化也越来越严重,成为全世界公认的农业和生态问题。盐胁迫是世界农业生产中的最主要也是最常见的非生物胁迫,是目前影响植物生长发育和农作物产量的主要非生物因素之一。东北地区是中国典型的盐碱地分布区域,因此在东北地区研究植物的盐胁迫具有重要的实际意义。
  基因组学的出现使植物抗盐研究进入了一个全新的时代,由单基因的研究转向了基因组层面对大量基因结构和功能的系统研究,识别了大量的抗盐基因。近年来,随着高通量测序技术和生物信息学的不断发展,人们逐渐认识到植物的盐胁迫分子机制往往与多基因的相互作用有关,因此如何从海量的大数据中高效准确地识别植物的盐胁迫相关分子标志物及其调控关系是目前面临的一大挑战。
  本课题以植物研究中模式生物拟南芥作为研究对象,以系统生物学为核心思想,利用结合生物学知识的数据挖掘方法,识别拟南芥盐胁迫相关的风险因子(基因、GO功能节点、KEGG通路、网络模块)。首先,本课题对GEO数据库中下载的五套基因芯片数据进行转录组分析,识别了盐胁迫相关的差异表达基因。并利用先验的生物功能数据库(GO数据库和KEGG数据库)信息及基因集合富集分析方法,运用AgriGO和WebGestalt在线分析工具将差异表达基因进行生物学功能注释,识别出拟南芥盐胁迫相关的GO功能节点和KEGG通路。考虑到微效基因的影响,开发了基于微效基因的通路识别策略,并应用于GSE46205数据中,识别出三个显著富集的通路。最后,发现Plant hormone signal transduction、MAPK signaling pathway-plant、Spliceosome、Ribosome biogenesis in eukaryotes和Circadian rhythm-plant这五个通路可能与盐胁迫有关,其中前三个通路在文献中已有证据表明它们与盐胁迫的相关性。这些通路与盐胁迫的靶向关系需要未来的实验研究和理论研究进一步证实。
  此外,结合蛋白质互作网络和已有数据库信息来识别盐胁迫相关的基因。首先,将胁迫应答的转录因子数据库STIFDB2中的41个拟南芥盐胁迫相关基因作为种子基因,采用重启型随机游走方法识别蛋白质互作网络中与种子基因相似度高的基因作为候选风险基因预测,最后列出了排秩在前10位的基因。这些基因中发现AT3G03000和AT3G62870两个基因在GSE46205中是差异表达基因,这也说明这种方法的有效性。其次,建立了五套数据识别的差异表达基因互作网络,利用MCODE算法识别出6个网络模块,将模块进行通路注释,注释到Ribosome和Ribosome biogenesis in eukaryotes两个生物学通路,这再一次表明Ribosome biogenesis in eukaryotes可能与盐胁迫相关。还利用CytoHubba中的MCC算法筛选出差异表达互作网络中的10个Hub节点,这10个基因也是后续研究的靶向基因。
  总之,我们的研究利用系统生物学的方法识别了拟南芥盐胁迫相关的风险基因、GO功能结点及生物学通路,这将为拟南芥的抗盐分子机制的研究和转基因育种提供帮助,同时也为其他植物的抗逆研究提供借鉴。
[硕士论文] 罗迪
园林植物与观赏园艺 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:植物生物钟是植物内源的能够维持植物生命活动与环境昼夜变化相适应的调节机制,生物钟系统使植物能够更好的适应环境并提高对环境资源的利用效率。环境光周期改变后,植物对不同光周期的应答过程中所涉及的蛋白质及调控网络尚不清楚。本研究以野牛草(Buchloe dactyloides)为材料,以12L/12D光周期为对照,设置6L/18D、18L/6D两个光周期处理,测定三种光周期下生理指标的动态变化趋势,以及利用蛋白质组学技术对不同光周期下野牛草叶片和根系中蛋白质组进行研究,探索了野牛草对不同光周期的生理及蛋白质组学应答,研究结果如下:
  (1)野牛草叶绿素含量、叶片和根系的细胞膜透性、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性具有日周期性节律变化,差异光周期下各指标动态变化趋势不同,同一光周期下各指标变化趋势整体相对一致;野牛草叶片和根系中MDA含量的变化反映了野牛草细胞膜脂过氧化的程度。
  (2)相较于12L/12光周期,6L/18D和18L/6D光周期下野牛草叶、根细胞中SOD、CAT活性增加,在植物抗氧化保护系统中发挥重要作用。
  (3)不同光周期下野牛草叶、根中共鉴定出蛋白4717个,发生显著性变化(倍数上调大于2倍或下调小于0.5且P值小于0.05)的蛋白1103个;与12L/12光周期相比,6L/18D光周期下显著上调的蛋白198个,显著下调的蛋白197个;18L/6D光周期下显著上调的蛋白389个,显著下调的蛋白319个。
  (4) GO注释的结果显示受到光周期影响数量较多的蛋白质定位在细胞的膜脂、细胞器上,主要具有抗氧化活性、信号识别粒子、转运蛋白活性等分子功能,主要参与植物碳代谢、响应刺激、生物调节等途径。
  (5) KEGG pathway分析结果显示光合作用通路、氧化磷酸化通路、光合生物的碳固定代谢通路、光合作用-天线蛋白通路、乙醛酸和二羧酸代谢通路、过氧化物酶体、苯丙素生物合成通路、MAPK信号通路及植物昼夜节律等通路呈现蛋白质富集,在野牛草响应不同光周期处理中起主要作用。
  综上所述,对不同光周期下野牛草叶、根中生理指标及蛋白质组变化进行了初步探究,光周期改变,各生理指标的节律性变化趋势发生变化,同时野牛草通过光合作用、光合生物的碳固定、氧化磷酸化、昼夜节律等途径来调整适应新的光周期环境。6L/18D和18L/6D光周期下野牛草叶片、根系通过活性氧清除系统等途径减少光周期改变带来的细胞损伤,通过改变光合速率及昼夜节律来调整适应新的光周期环境并维持植株正常生长。
[硕士论文] 任丽媛
生态学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:黄土高原地区水土流失严重,生态环境脆弱,自我国实施退耕还林还草工程以来,草本植物作为该地区重要的植被类型,具有加速碳循环、保护环境、水土保持等重要作用,但一些草本物种近年来出现衰退现象,严重影响草地生产效应,其中干旱地区人工种植的紫花苜蓿衰退现象尤为严重,其生长盛期持续较为短暂,并在生长第6年后出现生长衰退,而造成其现象的生理机制尚未探讨。多年生草本根部年轮资料是反映草本物种生长状态的重要指标,已被应用于草本物种年际生长动态特征、生活史策略及气候响应敏感性研究当中,然而这方面研究在黄土高原还未引起足够的重视。
  本研究在黄土高原沿降水梯度的13个地点共采集16种多年生草本物种共113个根部年轮样品,通过根部解剖结构识别年轮结构,并分析每个物种的年轮宽度和每年生长的导管大小随年龄的变化趋势特征。研究结果表明调查样品中共有14个草本物种(占总数87.5%)具有清晰可识别的年轮结构,平均年龄为7年左右。各物种草本年轮宽度随年龄均有不断减小的趋势,最大减小范围是92.7-221.6μm,这主要是由于气候暖干化及随年龄不断增强的水分胁迫导致的。根部导管大小随年龄的变化趋势有三种类型:自然草本物种导管直径(导水能力)随年龄有不断变大的趋势,最大变化范围是6.9-21.2μm,生长具有可持续性;人工种植草本物种的导水能力随年龄有不断减弱趋势,导管直径的最大变化范围是19.1-25.0μm,生长趋于衰退;而分布于黄土高原北缘至半荒漠地区的二色补血草导水能力则随年龄有先上升后下降的趋势,导管直径的变化范围为13.6-17.9μm,表现出输水效率和安全的权衡策略。
  为研究物种衰退的生理机制,本研究在黄土高原4个降水梯度的地点采集人工种植物种苜蓿和自然对照物种委陵菜的根部年轮样品并收集气象数据,分析了苜蓿与委陵菜的年轮宽度和导管大小随年龄的变化趋势特征及与气候要素的相关关系。研究结果表明:在气候暖干化环境下,苜蓿和委陵菜的年轮宽度随年龄增加都有不断下降的趋势,且在降水量越低的样点下降更为显著,临汾地区(降水量550mm)苜蓿和委陵菜的平均年轮宽度分别为191.6μm和164.3μm,而盐池地区(降水量350mm)苜蓿和委陵菜的平均年轮宽度则为76.2μm和63.5μm,这是由于植株在降水量小的地点遭受更为严重水分胁迫,以致无法满足生长所需的水分而造成根部生长速率明显减缓。此外,苜蓿的根部导管大小随年龄增加均有明显下降趋势,且下降趋势在降水量小的样点更加显著,而委陵菜的根部导管大小随年龄增加均有明显上升趋势且在降水量越小的样点趋势更显著,在临汾地区(降水量550mm)苜蓿和委陵菜的导管平均每年分别变化0.40μm和0.61μm,在盐池地区(降水量350mm)苜蓿和委陵菜的导管平均每年分别变化1.51μm和2.10μm,这表明在水分胁迫下,苜蓿的导管逐年减小以致不能满足自身生长的水分需求,而呈现衰退趋势,且在水分胁迫严重的地点,出现衰退时间更早,委陵菜则可不断增大导管以提高对水分输导效率,满足了植株随年龄增长不断增加的水分需求。本研究阐述了黄土高原多年生草本的年轮学价值和草本物种在胁迫生境条件下的生活史策略,探讨了人工种植物种苜蓿与自然物种委陵菜的生长机制差异,旨在为该地区的生态恢复系统和植被建设提供科学基础。
[硕士论文] 唐尧
生物学;植物学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:拟南芥卵形家族蛋白,是新发现的转录因子,是植物特有的蛋白家族,参与调控拟南芥的生长发育。有报道称水稻OFPs中有能够参与逆境胁迫应答的,而在拟南芥中还没有类似功能的报道。最新研究表明,拟南芥中共有19个该家族成员,AtOFP8是Ⅱ型AtOFPs的成员之一。本实验室前期研究发现AtOFP8可能参与干旱应答。为探究AtOFP8是否参与拟南芥应对非生物胁迫,对AtOFP8基因在逆境下的转录水平进行检测,结果显示,在干旱胁迫下,AtOFP8基因的转录水平上升最为明显。本研究以Col野生型、Atofp8-1突变体和35S∶HA-AtOFP8过表达体植株为材料,对干旱胁迫下种子萌发率及绿叶率、叶片内丙二醛含量、叶片内脯氨酸含量、叶片抗氧化酶活性、叶片可溶性蛋白含量等进行分析,发现35S∶HA-AtOFP8过表达体在干旱胁迫下抗旱性更强,说明AtOFP8确实能够增强拟南芥的抗旱性,帮助拟南芥抵抗干旱。本试验为研究AtOFPs家族成员参与逆境胁迫应答提供了重要的依据,对研究AtOFPs功能具有较好的理论与实践意义。
  本研究主要试验结果如下:
  1.AtOFP8基因(At5g19650)位于拟南芥的第5号染色体上,该基因全长共954bp,基因中没有内含子,其中CDS区长666bp,编码蛋白包含221个氨基酸。AtOFP8蛋白的分子式为C1118H1755N315O348S9,分子量为25.466kDa,理论等电点为9.05,脂肪指数为56.88,稳定系数数值为67.78,属于不稳定蛋白。组成AtOFP8蛋白的氨基酸总共有20种,其中Set含量最多,占氨基酸总数的16.70%,Trp含量最少,仅占氨基酸总数的0.90%。AtOFP8蛋白中共有37个具正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys),31个具负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)。AtOFP8蛋白亲水能力较强,是非分泌蛋白。在AtOFP8蛋白中,α螺旋和无规卷曲含量最多。
  2.AtOFP8蛋白定位在细胞核中。通过拟南芥亚细胞定位预测网站SUBA4对AtOFP8蛋白进行亚细胞定位预测,AtOFP8蛋白定位在细胞核中的SUBAcon数值达到0.975,主要定位在细胞核中。通过构建AtOFP8-GFP载体,利用农杆菌转化洋葱表皮中,发现AtOFP8-GFP融合蛋白也出现在洋葱内表皮细胞的细胞核中。生物信息学预测和亚细胞定位实验都证明AtOFP8在细胞核内行使功能。
  3.AtOFP8基因在拟南芥多个器官中表达。AtOFP8基因在拟南芥根、茎、叶、花等器官中均有表达,其中,在拟南芥根中的转录水平最高。
  4.AtOFP8基因响应逆境胁迫。在几种逆境胁迫下,AtOFP8基因的表达发生变化,说明AtOFP8基因可能参与逆境胁迫过程。干旱胁迫下,AtOFP8基因的转录水平明显上升。高温处理下,AtOFP8基因的转录水平也有所增加。但在低温和黑暗条件下,AtOFP8基因的转录水平变化不明显。这些结果说明AtOFP8基因可能参与逆境胁迫过程,尤其对干旱胁迫和高温胁迫较为敏感。
  5.AtOFP8基因的过表达增强拟南芥抗旱性。正常环境下,Col野生型、Atofp8-1突变体和35S∶HA-AtOFP8过表达体之间的种子萌发率、绿叶率、叶片丙二醛含量、叶片抗氧化酶活性、叶片脯氨酸含量、叶片可溶性蛋白含量均没有太大的差异。但是干旱胁迫下,过表达AtOFP8基因的拟南芥种子萌发率及绿叶率更高,叶片丙二醛含量更低,叶片脯氨酸含量更高,叶片抗氧化酶活性更强,叶片可溶性蛋白含量更高,表现出更强的抗旱性,而Atofp8-1突变体的抗旱性很弱。这些结果说明AtOFP8基因能够增强拟南芥的抗旱性。
  6.AtOFP8能够促进干旱应答基因的表达。ADH1、RD26、RDUF2、ERD7在35S∶HA-AtOFP8过表达体中表达量明显上升,在Atofp8-1突变体中明显下降。
[硕士论文] 闻志刚
农业推广 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:随着全球盐渍化土地面积的不断扩大,土壤盐胁迫成为制约农林业发展的主要因素之一。构树是桑科(Moraceae)构属(Broussonetia)植物,在我国的分布极其广泛,不仅耐盐碱、耐贫瘠、耐干旱,还富含粗蛋白,因此具有重要的生态价值和经济价值。本文以构树幼苗为材料,通过施加0、50、75、100、150、200、300 mmol·L-1 NaCl溶液,研究构树光合气体交换参数、光合色素含量、有机渗透调节物质、膜脂过氧化及抗氧化酶活性在不同浓度NaCl处理下的变化情况。通过解析构树在盐胁迫下的生理变化规律,为进一步研究构树的耐盐机制提供理论依据。主要研究结论如下:
  1.随盐胁迫浓度的增加,构树叶中叶绿素a、叶绿素b和叶绿素(a+b)含量减少,同时成熟叶的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)也随之降低,表明盐胁迫下构树叶片光合作用受到抑制,且抑制效果随盐浓度的升高而增强。
  2.在盐胁迫下,构树叶和根中可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸含量升高。在盐胁迫下,可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸作为渗透调节物质,参与渗透胁迫,从而减轻高盐造成的渗透胁迫。
  3.在盐胁迫下,构树叶中过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱苷肽还原酶活性升高,激活了体内的抗氧化酶系统,加快清除体内活性氧物质,从而减轻盐胁迫造成的氧化伤害。
  4.通过盐胁迫下构树的干重和鲜重变化,确定了构树的耐盐阂值为6.75~6.90‰。
  综上所述,构树在盐胁迫下通过提高体内有机渗透调节物质来维持适当的细胞渗透势,增加抗氧化酶酶活性及非酶类抗氧化物含量来抑制膜脂的过氧化作用,从而增强自身的耐盐能力。
[博士论文] 陈琪
生态学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:植物在生存过程中会面临极其复杂的生态环境,其中机械损伤在植物体生命周期中是一种持续不断的威胁。植物受损后所造成的裸露伤口不仅会破坏植物体组织和器官的完整性,也是病原菌潜在侵入的威胁点。机械受损后还会导致植物体内发生一系列生理生化改变,诱发代谢调控,从而影响植株的正常生长。抗性较弱的个体还会发生代谢紊乱甚至死亡。植物外在生长状态往往源于其体内代谢的调节和变化。为了探究植株不同部位遭受机械损伤后在代谢水平上对损伤胁迫的响应,本研究以次生代谢模式植物长春花(Catharanthus roseus)为材料,利用GC-MS/MS非靶向和LC-qTOF-MS靶向代谢组学技术相结合的手段,针对植株上位叶、下位叶和根三个部位进行机械损伤处理后不同时序下各组织部位在初级和次级代谢水平上的特异性响应进行比较。本论文的主要研究内容及结果如下:
  1.利用GC-MS/MS技术通过非靶标无偏向性检测方法共获得283个化合物,经不同处理组Q值时间筛选分析选定lh为强烈响应时间点,并通过模式识别方法PCA和PLS-DA分析获得52个显著差异代谢物,其中糖类30个,氨基酸2个,醇类6个,酸类8个,脂类2个,它们都是长春花在不同部位遭受机械损伤时发生重大代谢变化的初级代谢产物。并被KEGG富集到3个主途径:糖类代谢(Carbohydrate metabolism)、脂肪酸类代谢(Fatty acid metabolism)和氨基酸类代谢(Amino acid metabolism),9个分支途径,糖类代谢5个:半乳糖代谢(Galactose metabolism)、淀粉和蔗糖代谢(Starch and sucrose metabolites)、糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、果糖和甘露糖代谢(Fructose and mannose metabolism)和氨基糖与核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism),脂肪酸类代谢2个:脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)和不饱和脂肪酸生物合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids),氨基酸类代谢2个:赖氨酸降解(Lysine degradation)和苯丙氨酸代谢(Phenylalanine metabolism)。受损后各处理组植株的初级代谢应答都以糖类代谢为主。相对于对照组(Control check group,CK组),下位叶机械损伤处理组(Wounded lower leaf group,WLL组)代谢合成被显著刺激,酸类代谢物响应快速,在处理组中响应最为强烈。共有20个组间差异代谢物参与上位叶机械损伤胁迫,其中糖类11个,酸类2个,脂肪酸类2个,醇类4个;KEGG富集了7个代谢通路,其中糖类4个。上位叶机械损伤处理组(Wounded upper leaf group,WUL组)响应次之,有18个组间差异代谢物,其中糖类10个,酸类3个,脂类2个,醇类2个,氨基酸1个;富集代谢通路5个,糖类代谢物消耗较大。根机械损伤处理组(Wounded root group,WR组)最弱,共获得18个组间差异代谢物,糖类10个,酸类3个,醇类4个,氨基酸类1个,富集3个代谢通路;其中非糖类代谢物主要在地上部分被显著合成,而大部分糖类代谢物显著降低。
  2.基于LC-qTOF-MS建立了一个包含39种酚类化合物(Phenolic compounds,PCs)在内的酚类定性库。不同处理组Q值筛选以3h为最佳响应时间点。经过PLS-DA(VIP>1和P<0.05)分析共获得12个显著差异代谢物:肉桂酸(Cinnamic acid)、儿茶素(Catechin)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(Quercetin-3-O-rhamnoside)、大豆苷元(Daidzein)、原儿茶酸(3-4-Hydroxybenzoic acid)、橙皮苷(Hesperidin)、木犀草素(Luteolin)、甘草素(Liquiritigenin)、芹菜素(Apigenin)、异甘草素(Lsoliquiritigenin)、染料木素(Genistein)和杨梅苷(Myricetin),并以此为基础深入对比不同处理组各组织部位间差异代谢物的应答响应。在WUL组PCs合成前体物质苯丙氨酸(L-Phenylalanine)只在上位叶中显著积累,下游大豆苷元代谢通路甘草素和大豆苷元,木犀草素代谢通路木犀草素,代谢物杨梅苷,染料木素和橙皮苷均显著参与上位叶机械损伤应答。WLL组中苯丙氨酸在各组织部位均显著下降,其中大豆苷元代谢通路中甘草素,木犀草素代谢通路木犀草素,代谢物原儿茶酸、槲皮素-3-O-鼠李糖苷及橙皮苷积极应答下位叶机械损伤胁迫。相对于其它处理组,WR组在PCs代谢水平上响应最弱。只有大豆苷元整条代谢通路,木犀草素代谢通路木犀草素和代谢物杨梅苷共同完成了根损伤后的机械胁迫应答。
  3.利用LC-MS建立了一个可检测7种萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids,TIAs)在内的TIAs定量测定方法,不同处理组时间响应Q值筛选5h为最佳应答时间。与PCs应答存在时序差异。经过PLS-DA(VIP>1和P<0.05)有监督方法分析共获得马钱苷(Loganin)、色胺(Tryptamine)、蛇根碱(Serpentine)和长春碱(Vinblastine)4个显著差异代谢物。进一步对其在各处理组组织部位差异积累进行分析,其中马钱苷和蛇根碱响应最为明显。在WUL组中马钱苷和蛇根碱都直接参与了上位叶损伤应答;WLL组中只有蛇根碱显著参与下位叶损伤应答;而在WR组中马钱苷和蛇根碱的合成都受到了不同程度的合成障碍。此外长春碱在不同处理组中都只在茎中显著积累,还处于响应准备阶段。
  机械损伤会普遍刺激植株能量供应来源初级代谢响应的升高,为次级代谢应答提供充足的能量和原料基础。TIAs和PCs作为长春花两类重要的次级代谢产物,既会共同抵御外界的机械损伤,也会存在对初级代谢原料的相互竞争。通过共同的前体物质分支酸(Chorismic acid)分别进入以苯丙氨酸途径为主的PCs合成途径和以色氨酸途径为限制因素的TIAs合成途径,从而共同完成机械损伤胁迫应答。PCs与TIAs在应答响应上存在时序差异。经源-库模型及资源分配权衡,各处理组均以PCs代谢作为主要的机械损伤胁迫响应物质,其中WLL组采取抵御型策略,WUL组采取偏重抵御的抵御-耐受型策略,WR组则采取耐受型策略。
  本研究首次运用靶向LC-qTOF-MS和非靶向GC-MS/MS相结合代谢组学技术从代谢网络水平上对比了上位叶、下位叶和根机械损伤后,长春花初级和次级代谢的响应差异。并以源-库模型和资源权衡为基础探讨了受损后植株各组织部位时序变化下次级代谢防御系统的响应机制。揭示了长春花3种不同机械损伤应答方式和防御病菌入侵模式的差异,为植物响应机械损伤提供了细致全面的理论依据和实践基础。同时对于利用代谢工程进行植株抗损伤能力及品种改良方面有深远意义。并为解决由干扰因子介入所导致的常见逆境胁迫等生态问题提供了一种新型、高效的技术手段。
[博士论文] 任永兵
食品科学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:作为陆生固着生物,植物经常会面临各种环境胁迫,比如干旱和冷冻胁迫。脯氨酸积累是植物响应这些逆境胁迫的最重要的适应性机制之一。虽然目前对植物体内脯氨酸代谢途径的研究比较多且比较清楚,但对植物在逆境条件下如何调节脯氨酸动态平衡的分子机制还了解的很少。本研究中,我们鉴定了一个拟南芥基因DFR1编码一种未知的线粒体蛋白,这种蛋白参与了植物对脯氨酸降解途径的调控。DFR1基因通过不同的mRNA剪切方式主要编码两种不同的蛋白,我们将这两个转录本分别命名为DFR1.1和DFR1.2,它们均被干旱和低温胁迫强烈诱导。表型分析表明,DFR1敲低突变体(dfr1)表现出对干旱和冷冻胁迫的高度敏感性,而DFR1.1OE和DFR1.2OE过表达植株则表现出对干旱和冷冻胁迫的高度耐受性。此外,在正常条件下,DFR1基因并不显著影响植株的生长,而在中度的干旱和低温胁迫条件下,DFR1基因则会显著提高植株的生物量。更为重要的是,DFR1基因的完全缺失是致死的,表明DFR1基因对植物的生长发育至关重要。进一步的研究显示,DFR1介导的干旱与低温胁迫耐受性与植物体内脯氨酸的积累成正相关性。此外,我们也发现DFR1.1和DFR1.2蛋白均能与脯氨酸降解途径上的三个酶PDH1,PDH2,P5CDH相互作用,并且显著抑制它们的活性。而且,当干旱和低温胁迫解除后,DFR1基因的表达量快速下降,使得PDH和P5CDH酶的活性被迅速释放,植株快速降解多余脯氨酸使其恢复到正常水平。进一步的遗传上位性研究表明,DFR1基因作为PDH1,PDH2,P5CDH基因的上游调控因子正调节干旱与冷冻胁迫的耐受性。因此,我们的实验结论是:在干旱与冷冻胁迫条件下,未知蛋白DFR1与PDH1,PDH2,P5CDH酶相互作用并抑制它们的活性,从而引起脯氨酸积累,最终提高植物对干旱和冷冻甚至其它胁迫的耐受性。此外,脯氨酸也是甜菜碱,2-乙酰基-1-吡咯啉等多种食品风味化合物的前体,提高脯氨酸含量对改良食品品质十分重要,因此研究脯氨酸代谢在食品生物技术领域也具有重要意义。
[博士论文] 曹玲
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:ICKs/KRPs(Inhibitors of cyclin-dependent kinase/Kip-related proteins,以下简称ICKs)是植物细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent Kinase,CDK)的抑制因子,能抑制细胞周期进程和细胞分裂进而在细胞周期调控中起着重要作用。拟南芥基因组中有7个ICK基因,由于成员之间功能上的冗余性,目前对植物中ICK基因家族的功能以及各成员之间的功能特异性还缺乏深入了解。本实验室先前对ICK1/2/5/6/7的T-DNA插入五突变体进行了研究。本研究旨在创建ICK T-DNA插入六突变体和七突变体的基础上,系统研究ICK基因家族所有成员的敲除对植物生长发育的影响。
  对一个拟南芥六突变体ick123567和七突变体(所有ICK基因被敲除)表型分析显示,与五突变体ick12567和野生型相比,七突变体的植物幼苗鲜重和粒重显著增加。多种非生物胁迫处理,包括植物生长素、细胞分裂素、脱落酸、氯化钠、蔗糖、paraquat和S-甲基甲烷硫代磺酸,野生型和七突变体的根长及生长量之间的差异不显著。
  ICK七突变体角果变短、每个角果种子数减少。细胞学观察发现,七突变体中有47%的胚珠败育,而五突变体ick12567、六突变体ick123567和野生型中胚珠正常。正反交结果显示七突变体作为母本时才能观察到短角果的表型,说明这个表型是由于雌配子体发育缺陷造成的。对处于雌配子体发育第7时期(FG7)的胚囊发育观察表明,野生型胚囊在授粉之前三个反足细胞降解;而七突变体胚囊中除了正常的配子外,还有额外的细胞核,这些细胞核可以被区分为是具有一个卵细胞、一个中央细胞和两个助细胞的两套、三套或者四套的配子体,不同配子体间有时可见清楚的界限,表明突变体胚珠中有多个独立的胚囊存在。利用卵细胞标记pEC1.1::GUS和中央细胞标记pFIS2::GUS确定了七突变体胚珠中多个卵细胞和中央细胞的存在。
  功能大孢子时期,野生型胚珠只观察到一个功能大孢子。七突变体中,有30%的胚珠观察不到功能大孢子,而其余70%胚珠中可观察到1-3个功能大孢子,极少胚珠中有4个。在FG2时期,野生型胚囊中有一对典型的细胞核,七突变体中有1-4对细胞核,每对细胞核之间界限分明。但在2-Ⅰ阶段的胚珠中,野生型和七突变体中均只有一个大孢子母细胞。这些结果说明,七个ICK基因的敲除导致多个功能大孢子的形成并且能继续发育成多套雌配子体。
  开花后三天,野生型胚珠有一个胚和形态一致且分布在整个胚囊中的胚乳细胞核,而在七突变体胚珠中观察到胚乳中有不同类型的细胞核,或两个或三个独立的胚乳囊室,并且有双胚的存在。在携带pEC1.1::GUS标记的七突变体开花后三天的胚珠中,除了胚能观察到GUS染色外,在合点端有1-2个不同的点也可观察到GUS染色,说明受精后三天胚珠中没有受精的额外卵细胞依然存活在胚囊中。与双胚发育一致,七突变体中有2%的种子可以观察到双胚苗。经野生型和携带有中央细胞标记(pFIS2::GUS)的七突变体混合花粉授粉的七突变体,其后代中双胚苗的基因型检测发现每一对双胚苗具有相同或不同的基因型,表明双胚苗是两个卵细胞分别接受两个不同花粉管所释放的精子细胞经受精产生的。
  互补实验证明,单个ICK4或ICK7基因组片段导入七突变体中均能回复其突变表型。本研究证明了ICK基因不仅调控植物生长的细胞周期调控,还在非功能大孢子细胞的退化过程起重要作用。正常植物中多个ICK基因功能上的冗余性,可以确保每个胚珠中只形成一个功能大孢子和一个雌配子体以及随后胚的正常发育。
[硕士论文] 黄博
植物学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:光能是光合作用的能源和基本动力,光能不足会严重限制光合作用。但是,光能过剩而超过光合作用的需要会引起光合作用的光抑制,甚至光合机构的光破坏,影响植物的生长发育导致植株死亡、作物减产等。植物在长期的演化过程中,为避免光损伤,形成了一套强光适应的机制,其中最主要的是清除活性氧,快速对光系统进行损伤修复,使光系统维持一定的光合能力。由于褪黑素具有能够作为抗氧化剂清除活性氧的功能逐年来成为人们关注的热点,所以本试验以拟南芥哥伦比亚野生型和以拟南芥哥伦比亚为遗传背景的褪黑素合成受阻突变体snat-1、snat-2为材料,检测了内源褪黑素和施加外源褪黑素对强光胁迫下生理参数的影响和光系统功能、结构的影响,探究褪黑素缓解光合机构受到光损伤的机理。研究主要结果如下:
  1、突变体snat-1和snat-2内源褪黑素含量(3.25ng g-1FW、3.24ng g-1FW)显著低于野生型(13.04ng g-1FW),施加外源褪黑素后野生型和突变体内源褪黑素含量显著增加,强光胁迫导致内源褪黑素含量显著增加,预施加褪黑素后强光胁迫使得内源褪黑素含量进一步增加;
  2、生长光下,野生型和突变体的表型、生物量、色素含量无显著性差异,强光胁迫下色素含量均显著下降,wt、snat-1和snat-2分别降低29.92%、33.33%和53.14%,外源施加褪黑素能缓解色素的降解;
  3、生长光下,野生型和突变体的活性氧水平,膜脂过氧化程度、渗透调节物质、细胞死亡情况等均无显著性差异,强光胁迫导致活性氧大量积累,膜完整性遭到破坏,渗透胁迫加剧,且突变体受影响程度更为严重,外源施加褪黑素通过改变抗氧化酶活性和非酶促抗氧化物质的含量能缓解氧化损伤;
  4、由光合参数和叶绿素荧光参数可以看出,生长光下野生型和突变体的光合系统功能无显著差异,强光胁迫导致了光系统活性的下降,且突变体下降幅度更大,褪黑素能缓解光系统活性的下降;
  5、蛋白印迹分析表明,生长光下,突变体的光系统蛋白含量总体低于野生型,强光导致了野生型和突变体光系统蛋白的含量显著减少,褪黑素处理能缓解强光胁迫造成的光系统蛋白含量的降低。
[硕士论文] 梁双
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:钙在地壳物质含量中排第五,植物从土壤中吸收重量最多的是钙。细胞外Ca2+在毫摩尔级范围内,维持细胞壁和质膜的坚韧度。细胞质中的Ca2+在微摩尔级范围,在植物细胞中是最重要的第二信使,使植物感受不同环境和内部刺激,并增加相应的生理响应。
  本研究经过对采购的2200种拟南芥膜蛋白相关的基因缺失型突变体种子,进行了三次不同Ca2+浓度梯度的表型分析,最终选择AtSEC61-β基因缺失突变体atsec61为实验材料继续深入研究。为了研究AtSEC61-β基因对钙依赖性生理特征的作用,首先对AtSEC61-β基因缺失突变体atsec61进行了表型分析,发现该突变体在低钙环境下相比于野生型Col-0,出现了叶片颜色变黄,叶边缘卷曲,植株矮小的生长特征。而在植物必需的其他二价阳离子Fe2+、Zn2+、Mg2+,以及K+、NO3-、PO43-的表型分析,发现只有在高Mg2+条件下突变体与野生型Col-0相比存在生长差异。在移苗实验中,在10μM Ca2+、15mM Mg2+培养基上仍出现生长受抑制表型。当检测突变体atsec61以及Col-0体内的总Ca、Mg含量,发现植物在CK和低Mg2+条件下体内Ca含量积累极显著高于低Ca2+、高Mg2+条件下的积累,而Mg积累相反。将AtSEC61-β基因完整插入到AtSEC61-β基因缺失突变体atsec61之后,发现其低钙表型恢复到野生型Col-0。
  为了研究AtSEC61-β蛋白亚细胞定位,利用带有AtSEC61-β-GFP的重组农杆菌注射烟草叶表皮细胞进行瞬时表达,发现AtSEC61-β所编码的蛋白定位于质网上。为了探究AtSEC61-β基因启动子活性,利用含AtSEC61-β基因启动子驱动β葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的转基因植株进行GUS酶活染色,发现AtSEC61-β基因的启动子在拟南芥幼嫩的叶片、花苞、豆荚以及根系中能够有效驱动GUS基因的表达。得到结论如下:1)AtSEC61-β基因确实在钙依赖性生长表型中起重要作用。2)AtSEC61-β基因参与植物体内Ca2+的积累。3)AtSEC61-β基因编码的蛋白定位在内质网上。4)AtSEC61-β基因启动子在幼嫩的叶片、花苞、豆荚以及根系中表现出很强的活性。这一研究有利于推进AtSEC61-β基因钙相关机理的研究。
[硕士论文] 灵芝
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:甜瓜(Cucumis melo L.)属于葫芦科甜瓜属,在果实成熟特性的研究中是一种重要的模式植物。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv.Hetao)为研究材料,利用分子生物学方法研究了CmGH18和CmEBF基因与果实成熟之间的关系。主要研究结果如下:
  (1)根据甜瓜果实转录组数据筛选出在甜瓜果实生长期、成熟期、呼吸跃变期、以及呼吸跃变后期等四个时期内具有显著差异表达的CmGH18和CmEBF基因。
  (2)使用甜瓜果实为材料克隆了CmGH18和CmEBF基因的cDNA全长序列。序列长度分别为1097bp、2134bp,编码300、640个氨基酸序列。生物信息学分析蛋白理化性质、跨膜螺旋区、蛋白质二级结构、三级结构以及信号肽与亚细胞定位。同时,使用MEGA6.0与MEME在线软件分析了蛋白CmGH18、CmEBF与其他10个物种相应蛋白质之间的亲缘关系。
  (3)利用qRT-PCR方法检测基因CmGH18、CmEBF在甜瓜果实不同发育时期的表达量。CmGH18基因在27d果实中表达量最高,CmEBF基因在跃变期果实中表达量最高。
  (4)成功构建了CmGH18、CmEBF基因的超表达载体pPZP221-CmGH18、pPZP221-CmEBF以及CRISPER/Cas9编辑载体pCRI-CmGH18、pCRI-CmEBF。通过甜瓜子房注射法进行遗传转化,对获得的T1代植株进行PCR检测,阳性率分别为10%、12.5%、40%、41.7%。来源于阳性率高的母果实的T1代种子种植于温室,观察T1代甜瓜的果实成熟相关表型,结果表明CmGH18基因具有促进果实成熟的功能,CmEBF基因具有抑制果实成熟的功能。
[硕士论文] 徐娇
遗传学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:随着现代工业发展和世界人口的不断增长,矿石及其它来源的重金属逐渐流入周边环境,不断对土壤、水体及空气造成严重污染。重金属污染直接影响了植物尤其是作物的生长,造成农作物减产。然而,人们对植物响应重金属胁迫机制的关注远远不够。为确保合理利用植物进行重金属污染治理,亟待更多抗重金属相关机制的深入研究。
  实验室前期以普通小麦济南177(JN177)和长穗偃麦草为亲本,通过非对称体细胞杂交的技术,选育出耐盐碱小麦渐渗系新品种—山融4号(SR4)。利用第二代高通量测序技术从SR4耐盐碱转录组中克隆了一个受诱导上调表达的小麦谷胱甘肽转移酶基因TaGSTF3,其开放阅读框全长约669bp。将该基因构建入双子叶植物表达载体pRI101-AN。以农杆菌介导的花器官浸染法转化拟南芥Col-0,获得了两个转TaGSTF3拟南芥过表达株系。研究发现异源过表达TaGSTF3基因的拟南芥并未表现出抗盐碱旱等逆境胁迫的功能。但经重金属硝酸铅Pb(NO3)2和硫酸镍NiSO4处理后,TaGSTF3过表达拟南芥表现出对Pb2+和Ni2+的胁迫抗性。据此,本论文通过对过表达TaGSTF3拟南芥表型、功能等的初步探究,发现了TaGSTF3响应Pb2+和Ni2+的可能机制。
  1、过表达TaGSTF3拟南芥的铅耐受性分析
  在培养皿生长条件下,铅Pb2胁迫处理后,过表达系相较野生型地上部更大,根系更长更发达;生长在土壤中的过表达系,经铅Pb2+胁迫处理后,表现出比野生型更明显的生长迟缓,植株矮小,所结荚果少的表型。通过对培养皿中生长的WT、OE1和OE2植株鲜重统计,叶绿素含量、丙二醛含量、总谷胱甘肽含量及ROS清除酶活力测定,结果显示,与野生型相比两个过表达系经铅(Pb2+)胁迫处理后,其鲜重、总叶绿素含量、总谷胱甘肽含量、POD酶活力更高;丙二醛含量及SOD酶活力则显著低于野生型,表现出更高的耐铅Pb2+胁迫能力。DAB和NBT染色结果显示转TaGSTF3过表达系积累的ROS更少。ROS相关Marker genes表达分析显示,经铅Pb2+胁迫处理后过表达系ROS合成相关Marker genes表达量显著低于野生型,ROS清除相关Markergenes表达量显著高于野生型。铅胁迫相关基因AtATM3、AtPDR12和AtGSH1的表达分析结果显示TaGSTF3可能通过AtA TM3和AtGSH1调控对铅Pb2+的耐受性。利用GSH合成抑制剂BSO(丁硫氨酸-亚砜亚胺)对过表达系的抑制结果表明,转TaGSTF3拟南芥对铅Pb2+的耐受性依赖于GSH。
  综上,转TaGSTF3拟南芥响应铅Pb2+的机制可能与依赖GSH的代谢途径及ROS信号通路有关。
  2、过表达TaGSTF3拟南芥的镍耐受性分析
  培养皿生长条件下,镍Ni2+胁迫处理后,过表达系相较野生型地上部更大,根系更长更发达;土壤生长条件下,镍Ni2+胁迫处理后,过表达系和野生型均表现出地上部青枯,叶片褪绿、黄化,但是过表达系较野生型叶片更绿。通过对培养皿生长条件下的WT、OE1和OE2植株鲜重统计,叶绿素、丙二醛和总谷胱甘肽含量测定及ROS合成和清除酶活力测定,结果显示经镍Ni2+胁迫处理,两个过表达系植株鲜重更高,总叶绿素、丙二醛、SOD酶活力、POD酶活力及总谷胱甘肽含量显著高于野生型,表现出对镍Ni2+胁迫更高的耐受能力。DAB和NBT染色结果显示转TaGSTF3过表达系积累的ROS更少。ROS相关Marker genes表达分析显示过表达系植株在镍Ni2+胁迫处理后ROS合成相关Marker genes表达量显著低于野生型,ROS清除相关Marker genes表达量显著高于野生型。以GSH合成抑制剂BSO处理结果表明,转TaGSTF3拟南芥对镍Ni2+的耐受性依赖于GSH。
  综上,转TaGSTF3拟南芥耐镍Ni2+的响应机制可能与依赖GSH的代谢途径有关。ROS信号通路亦可能在TaGSTF3介导的耐受重金属镍机制中发挥重要作用。
[硕士论文] 张凤菊
遗传学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:在不利环境下,植物体能够迅速感知并发生一系列的生理生化反应,包括体内生理代谢改变、激素等物质含量发生变化、抗逆相关基因表达量改变等等。糖基转移酶是专门负责糖基化修饰的一类酶。植物分子被糖基化后能够改变分子的水溶性以及生物活性,进而对植物的生理活动产生影响。
  根据公开发表的基因芯片数据得知,拟南芥糖基转移酶基因UGT86A1的表达能够对非生物胁迫做出响应。暗示该基因可能参与植物对非生物胁迫的适应性调节。为了明确糖基转移酶基因UGT86A1在植物应对逆境胁迫中的作用,开展了本课题研究。
  首先对野生型拟南芥进行了NaCl和Mannitol的胁迫处理,并用qPCR技术检测了UGT86A1在胁迫处理后的表达水平。结果发现,UGT86A1受非生物胁迫诱导表达上调。然后,构建了UGT86A1的CRISPR/Cas9敲除载体、过表达载体、GUS报告载体以及原核表达载体,并通过转基因技术成功获得了UGT86A1的敲除株系、过表达株系、GUS转基因株系以及原核表达菌株。UGT86A1启动子:GUS转基因株系在经过NaCl和Mannitol处理以后,GUS染色较对照明显加深,进一步证明了UGT86A1受非生物胁迫诱导表达。通过对UGT86A1敲除株系和过表达株系一系列的逆境适应性分析,发现在NaCl和Mannitol的逆境处理下,与野生型相比,UGT86A1敲除株系无论是在种子萌发、子叶转绿还是在主根伸长等方面都表现出对逆境敏感的表型。与此相反,UGT86A1的过表达株系都表现出对逆境耐性增强的表型。在土壤培养条件下,同样进行了耐盐和耐旱实验。实验结果表明,UGT86A1敲除株系在盐和干旱处理条件下都比野生型的存活率低,而过表达株系都比野生型的存活率高。这些结果说明了UGT86A1无论是在植物萌发期还是在苗期都参与了植物对逆境的适应性调节,能够增强植物的耐逆性。
  为了探索UG T86A1在植物应对逆境胁迫中的作用机制,测定了UGT86A1敲除体和过表达体在逆境条件下的生理学变化。首先统计了UGT86A1敲除系和过表达系的离体叶片失水率,并观察了叶片在干旱条件下的气孔开度。发现UGT86A1敲除株系的离体叶片失水率高,而UGT86A1过表达株系离体叶片失水率相对较低。与之相一致,发现在干旱条件下,敲除株系气孔开度较大,而过表达株系气孔开度较小。这表明UGT86A1的生理学功能可能与气孔运动有某种联系,它的功能丧失导致在干旱条件下叶片失水较快。进一步测定了UGT86A1敲除体和过表达体在逆境环境下与耐逆相关的其他一些生理学变化。结果发现,在UGT86A1敲除体中,可溶性糖的含量比野生型低,而丙二醛的含量比野生型高。而在UGT86A1过表达体中,可溶性糖的含量比野生型高,丙二醛的含量比野生型低。通过盐处理和干旱条件下的总抗氧化能力测定以及叶片细胞学染色技术,发现UGT86A1敲除体的清除活性氧的能力低于野生型,过表达体清除活性氧的能力高于野生型。这些实验数据说明UGT86A1的作用可能还涉及到渗透保护、膜的稳定性以及活性氧清除等方面。
  最后检测了UGT86A1敲除体和UGT86A1过表达体在逆境条件下抗逆相关基因表达量的变化,包括DREB2A、RD29B、AIL1、RD22、COR47和CAT1等。发现这些抗逆相关基因在UGT86A1敲除体中的表达普遍下调,而在过表达体中表达上调。推测,UGT86A1之所以能够引起以上多种生理学指标的变化,可能与这些耐逆相关基因的表达变化有关系。
  本研究曾试图从糖基转移酶的底物入手进一步挖掘UGT86A1发挥作用的分子机制,但由于酶蛋白表达和纯化的困难,目前在底物鉴定方面还没有获得进展。
  总之,通过对UGT86A1突变体和过表达体的一系列研究,明确了糖基转移酶基因UGT86A1在增强植物对非生物胁迫的适应性反应中发挥着重要的作用。同时,初步发现UGT86A1基因在逆境环境下可能通过影响抗逆相关基因的表达,进而对植物抗逆的的生理学过程产生影响。糖基转移酶UGT86A1的底物鉴定以及UGT86A1发挥作用的深层分子机理,还需要进一步研究。
[博士论文] 田延臣
植物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:活性氧(ROS)是植物在进行有氧代谢过程中不可避免的副产物。当植物遭遇逆境胁迫时,活性氧会在体内大量积累,并对蛋白质、DNA、脂质造成氧化伤害,引起细胞损伤,所以长期以来活性氧被认为是一类毒害分子。然而,随着近年来的研究发现,活性氧尤其是其中的过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)还可作为信号分子调控植物的生长发育和逆境响应,但是其中的信号转导途径以及过氧化氢如何与其它激素信号和环境信号交叉互作来调控植物生长发育和逆境响应的分子机理并不清楚。油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)是一种重要的植物激素,调控植物生长发育的多个方面。本研究采用生物化学、分子生物学、基因组学、遗传学及细胞生物学等手段,对H2O2与BR交叉调控植物生长发育的分子机制进行探究。我们取得的主要研究结果如下:
  1.BR诱导植物体内H2O2的积累。外源BR处理后,在野生型Col-0以及BR缺失突变体rot3-2中会积累H2O2,但在BR不敏感突变体bri1-116中H2O2的含量没有改变。此外,NADPH氧化酶抑制剂Diphenylene iodonium(DPI)与BR同时处理时,BR不能诱导植物中H2O2的积累,说明BR通过BRI1介导的信号转导途径诱导H2O2的产生,并且这个过程依赖于NADPH氧化酶的活性。
  2.BR促进细胞的伸长需要H2O2。为了探究H2O2在BR介导的植物生长发育过程中的作用,我们利用H2O2合成抑制剂DPI以及H2O2含量较低的遗传材料CAT2-Ox,rbohD rbohF研究H2O2对BR信号转导的影响。实验结果显示,DPI处理导致植物对BR促进细胞伸长的响应降低,并且随着DPI浓度的升高,最终会导致植物对BR不敏感。为了验证DPI的抑制效果是由于H2O2含量降低引起的,我们在DPI处理时加入H2O2再分析植物对BR的敏感性。实验结果显示,H2O2可显著提高DPI引起的植物对BR不敏感。为了进一步验证以上结果,我们利用H2O2含量降低的遗传材料CAT2-Ox和rbohD rbohF分析植株对BR的响应。结果显示这些H2O2含量降低的遗传材料在下胚轴伸长实验中都表现为BR弱敏感。这些结果说明,H2O2缺失抑制植物对BR的响应,而BR促进植物细胞伸长需要H2O2。
  3.H2O2促进BR诱导的细胞伸长不依赖BIN2。BIN2是BR信号通路中的负调控因子,依赖其激酶活性,BIN2可以磷酸化不同的底物参与多种信号途径。最新的研究表明,BR信号转导途径中的负调控因子BIN2的激酶活性能被一氧化氮(Nitric oxide,NO)抑制。而且,NO和H2O2有时会作用于同一目的蛋白来调控植物的生长发育和逆境响应。为了验证H2O2是否通过调节BIN2的活性参与BR信号转导途径,我们利用GSK3蛋白家族的抑制剂Bikinin、氯化锂以及BIN2和其同源基因BIL1/2的缺失突变体bin2bil1bil2分析H2O2对下胚轴伸长的影响是否跟BIN2相关。结果显示,即使在BIN2以及其同源基因功能缺失的情况下,当H2O2水平降低的时候BR诱导的机体响应依然会受到抑制。此外,我们利用BZR1缺失与BIN2相互作用区域的转基因材料BZR1ΔDM-Ox、BZR1功能获得突变体bzr1-1D和BZR1同源基因BES1功能获得突变体bes1-D分析缺失H2O2后的下胚轴表型。实验结果显示,在H2O2缺失的条件下,它们的下胚轴伸长被显著抑制。我们还分析了H2O2和BZR1在根中的分布模式,发现H2O2和有活性的BZR1具有类似的分布模式,这一结果说明二者存在相互作用的共定位基础。所以我们得出结论H2O2在BR信号转导过程中的作用位点位于BIN2的下游,可能通过BZR1来调控植物生长发育。
  4.H2O2促进BZR1的转录调控活性。为进一步研究H2O2通过BZR1来调控植物的生长发育,我们比较分析了野生型Col-0和BZR1功能获得型突变体bzr1-1D在正常条件、DPI介导的H2O2缺失条件及DPI+H2O2条件下的转录组差异。实验结果显示在正常条件下有4428个基因受BZR1调控,但其中64%的基因在H2O2缺失的条件下不再受BZR1调节,然而在H2O2重新处理后又有48%的基因开始响应BZR1的调控。进一步利用散点图进行分析,结果显示DPI会抑制BZR1的转录活性,其调控能力为正常条件下的67%,而在重新施加H2O2后BZR1的转录活性恢复到正常条件下的87%。此外,我们发现,在4428个受BZR1调控的基因中,有2200个同时受DPI调节,其中有2053个基因(93.3%)以相反的表达模式受bzr1-1D和DPI的调控。这些结果表明H2O2促进BZR1的转录活性。
  5.H2O2不改变BR诱导的BZR1的蛋白稳定性、磷酸化水平和亚细胞定位。BZR1作为BR信号途径中的关键转录因子,目前报道的BZR1调控方式主要包括磷酸化-去磷酸化修饰、蛋白稳定性调控和细胞质-细胞核定位调控。为了分析H2O2是如何促进BZR1转录活性的,我们分别在正常条件下,DPI介导的H2O2缺失条件下和H2O2处理条件下,分析BZR1的蛋白含量和磷酸化水平。实验结果显示,DPI和H2O2处理都不会影响BZR1的蛋白稳定性和磷酸化水平。我们进一步利用激光共聚焦显微镜观察不同处理条件下BZR1的亚细胞定位情况,结果显示,不管是在DPI存在条件下,还是在外源施加H2O2的情况下BR诱导的BZR1进核现象都没有改变。这些结果说明H2O2调控BZR1的转录活性与BZR1的蛋白稳定性、磷酸化水平和亚细胞定位无关。
  6.H2O2不影响BZR1的DNA结合能力。BZR1作为转录因子,DNA结合能力会影响其转录活性,因此我们利用染色质免疫共沉淀(ChIP)和DNA-protein pull-down两种方法分析BZR1与其靶基因启动子pDWF4和pSAUR15的结合能力是否受H2O2影响,这两种方法的分析结果显示,H2O2并不影响BZR1与pDWF4和pSAUR15结合能力。
  7.H2O2氧化修饰BZR1。H2O2作为一种信号分子可以通过对目的蛋白的氧化修饰来调节其活性。所以我们推测H2O2可能通过对BZR1进行修饰来调控植物细胞伸长。为了验证这一假设,我们利用BIAM-labeling assay和Biotin-switch assay分析BZR1的氧化修饰状态。实验结果显示,H2O2促进BZR1发生氧化修饰,并且这种氧化修饰主要发生在第63位的半胱氨酸。液相色谱-串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC/MS)的结果进一步证明H2O2氧化修饰BZR1。我们发现外源BR的处理不仅能诱导植物体内的BZR1发生去磷酸化,还会诱导BZR1发生氧化修饰。此外,我们发现H2O2还诱导BZR1的同源基因BES1发生氧化修饰,并且修饰位点发生在与BZR1中Cys-63对应的第84位的保守半胱氨酸。这些结果说明H2O2诱导BZR1/BES1在保守的半胱氨酸位点发生氧化修饰。
  8.Cys-63是BZR1发挥功能的关键位点。生物化学以及质谱分析的数据都显示Cys-63是H2O2修饰BZR1的重要位点,那么半胱氨酸在BZR1行使功能的过程中起什么作用呢?为了探求这个问题,我们构建了以bzr1-1D为背景的半胱氨酸突变体转基因材料包括:bzr1-1D-Ox,bzr1-1DC63S-Ox,bzr1-1DC63,73S-Ox,bzr1-1DC91,174,240S-Ox和bzr1-1D5S-Ox。PPZ敏感性分析实验结果显示,bzr1-1D-Ox,bzr1-1DC91,174,240S-Ox呈现出PPZ不敏感的表型。相反bzr1-1DC63S-Ox,bzr1-1DC63,73S-Ox以及bzr1-1D5S-Ox对PPZ的不敏感表型被明显抑制。长日照生长3周的幼苗,对其叶片表型分析结果显示,bzr1-1D-Ox,bzr1-1DC91,174,240S-Ox呈现出叶片卷曲的表型,而这种表型在bzr1-1DC63S-Ox,bzr1-1DC63,73S-Ox以及bzr1-1D5S-Ox中被显著抑制。qRT-PCR和原生质体瞬时表达分析的结果显示,bzr1-1DC63S和bzr1-1D5S对下游基因的转录调节能力明显低于bzr1-1D。综合以上结果,我们发现只要是包含Cys-63位点突变就会影响BZR1的功能,说明Cys-63在BZR1行使功能的过程中起至关重要的作用。对BZR1同源基因BES1的研究得到类似的实验结果,Cys-84突变会显著降低BES1的功能。这些结果说明进化上保守的Cys-63对维持BZR1的功能起重要的作用。
  综上所述,BR调控植物细胞伸长需要H2O2,H2O2缺失会导致植物对BR不敏感。H2O2能氧化修饰BR信号转导途径中的关键转录因子BZR1,促进BZR1与其互做蛋白PIF4或者ARF6的结合能力,增强了BZR1的转录调节能力,进而调控基因表达,促进植物细胞伸长。本研究为进一步探索H2O2作为信号分子调控植物生长发育和逆境响应提供了新的证据。同时,H2O2通过氧化修饰BZR1参与BR信号转导过程也极大地丰富和拓展了BR调控网络,为更好的阐明植物生长发育与环境适应的机制提供了新的依据。
[硕士论文] 曹博
生物化学与分子生物学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:冷激蛋白(Cold shock protein,Csp)作为应激蛋白几乎分布于所有原核生物当中。当细胞遭受非生物逆境胁迫时,Csp作为RNA的分子伴侣,与单链核苷酸非特异性结合,阻止mRNA二级结构的生成,避免转录和翻译终止,保证细胞的正常代谢。除此之外,Csp还作为转录激活因子,与启动子结合提高基因的水平。大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的Csp基因已经克隆,并验证其功能,转化植物后显著改良其对干旱等非生物逆境的抗性。
  在极端非生物逆境下生存的极端微生物,大多具有独特细胞结构和环境适应机制。嗜盐芽孢杆菌(Halobacillus halophiles)产生Csp等多种相容性溶质,抵御高盐环境的危害。本研究在生物信息学分析的基础上,根据玉米基因组密码子偏爱性,对嗜盐芽孢杆菌Csp基因(Hh Csp)进行密码子优化,构建双子叶植物表达载体,农杆菌介导法转化拟南芥,探索其异源表达改良耐盐等非生物逆境抗性的可能,为玉米等作物抗逆转基因研究奠定基础。主要结果如下:
  (1)HhCsp基因cDNA序列全长195bp,编码65个氨基酸。同源建模分析表明,HhCsp蛋白由5条反向折叠的β链构成桶状结构,表面含有芳香族氨基酸。与已知功能的枯草芽孢杆菌CspB序列相似性达到83.58%,包含RNA结合基序RNP1(KGFGFI)和RNP2(VFVHF)等Csp蛋白典型的保守结构域。因此,推测HhCsp基因的编码蛋白同样具有分子伴侣功能。
  (2)根据玉米基因组密码子偏爱性对HhCsp基因序列进行优化,G/C含量从39.71%提高到50.26%,碱基改变了10.25%,密码子改变了30.76%,与原始基因相似性为85.35%,自由能从70.6降到40.39,消除稀有密码子使其密码子使用频率与玉米基因组基本保持一致。
  (3)构建双子叶植物表达载体pCAMBIA2300-35S-HhCsp,酶切和测序鉴定正确,农杆菌介导法转化拟南芥。通过自交繁育和PCR检测,获得5个独立的T3代株系。
  (4)在1/2MS高渗培养基上,转基因株系和野生型拟南芥根系发育均随着甘露醇和NaCl浓度的增加而受抑制,但转基因株系根系明显较野生型长。
  (5)在营养土中,自然干旱20d后转基因株系和野生型拟南芥的生长均受抑制,但转基因株系只有部分萎蔫,而野生型基本全部枯萎。复水1周后,转基因株系部分恢复正常生长,而野生型则全部干枯死亡。提高NaCl至350mmol/L,转基因株系仅部分萎蔫,野生型全部枯死。
  上述结果表明,HhCsp基因已经整合到拟南芥基因组中,异源表达明显提高转基因株系的耐旱性和耐盐性。密码子优化后的HhCsp基因可用于玉米等作物的抗逆转基因研究。
[硕士论文] 周杨洪
植物营养学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:氮(Nitrogen,N)肥施用引起的开花延迟现象众所周知。碳(Carbon,C)源水平(细胞糖含量)通过影响生物钟中心振荡器基因(主要为PRR7)表达而调控开花。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是氮同化(硝酸还原酶催化)的副产物,它参与了植物的各种生长发育调控和应激反应。本研究以拟南芥为试验材料,研究N、蔗糖(Sucrose,S)、NO对拟南芥根伸长和开花的调控机制。主要结论如下:
  1.N、S、NO对植物根伸长和开花的影响
  低氮(Low-Nitrogen,LN)使植物开花提前,高氮(High-Nitrogen,HN)使植物开花变晚。蓝光和高浓度硫酸亚铁(高铁硫)处理分别促进了CRY1和FNR1表达,从而逆转了HN导致的开花延迟。NO能增强植物的营养生长,延迟植物开花,增加植株莲座叶数,延缓根部生长。S能逆转高水平NO带来的生长抑制。
  (1)fnr1突变体开花晚于Col-0,且fnr1突变体对于N水平的改变不敏感;(2)cry1突变体与Col-0开花时间差异不大;(3)prr7突变体在N和NO处理时开花迟于Col-0,它对S的敏感度低于Col-0;(4)高NO的突变体cue1-6开花晚于Col-0,且对NO水平的改变敏感;(5)低NO的突变体noa开花早于Col-0,叶片早衰,对NO水平变化比Col-0更敏感;(6)co突变体开花早于Col-0,NO处理逆转co突变体开花早和植株矮小的表型;(7)gi突变体开花晚于Col-0和各突变体,且莲座叶数明显多于Col-0和各突变体。
  2.N、S对内源NO含量和能量代谢的影响
  (1)NO造成根系紊乱、细胞碎裂、根部结构混乱的表型可以被高糖(5%S)处理逆转;HN、LN和NO处理诱导拟南芥内源NO含量升高,S处理有相同作用。但是,S处理有逆转NO介导的根系发育紊乱的作用,与内源NO含量没有直接联系;(2)N和NO处理显著降低ATP/AMP和NADPH/DADP+比值,S处理使ATP/AMP和NADPH/DADP+比值升高。所以,糖逆转NO带来的生长抑制可能与其提高了植物细胞能荷有关。
  3.N、S、NO对开花相关基因表达的影响
  光周期核心元件基因CCA1、LHY的相位与TOC1的相位相反,CCA1和LHY在清晨时分表达量达到波峰,在傍晚时分达到波谷;而TOC1则在清晨和傍晚表达量分别达到最低值和最高值。光周期输出元件基因GI和CO的振幅和相位同样是呈现出相反趋势,即GI分别在清晨和傍晚达到最低值和最高值,反之CO则在傍晚和清晨分别达到最低值和最高值。N处理使光周期基因振幅变小,NO使输入和中心元件基因CRY1、CCA1、TOC1和LHY振幅变大,输出元件基因GI和CO振幅变小。S导致输入和中心元件基因CRY1、CCA1、TOC1和LHY振幅变小,输出元件基因GI和CO振幅变大,与NO变化规律相反,所以S逆转NO造成的晚花表型可能与其拮抗调控光周期基因表达有关。
  4.通过二次消减杂交(SSH)筛选受NO调控的开花相关基因
  光周期是开花调控的下游事件,为了寻找光周期上游受NO调控的开花相关基因,我们用两种SSH的方法进行了基因筛选。每一种方法都得到23个特异性表达的基因,其中两种方法共同获得的基因有以下5个:ACX1(过氧化物酶乙酰基辅酶A氧化酶1)、EPS15(EPS15同源蛋白)、GDH2(谷氨酸脱氢酶2)、RNP1(RNA识别基序蛋白质)、XTH4(内氧葡聚糖糖基转移酶)。
  N和NO处理都导致植物晚花,但是N和NO调控开花的分子机制存在差异。N素整体负向调控光周期基因表达,而NO对光周期的输入、核心和输出元件的影响是相反的(输入和中心元件基因振幅变大,输出元件基因振幅变小)。此外,蓝光能逆转HN引起的开花延迟,而S处理则不能;蓝光不能逆转NO引起的根伸长抑制和开花延迟,但S处理可以。我们的实验证实N、S、NO在植物生长发育调节中存在相互作用,但其具体分子机制还有待进一步研究。
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