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[博士论文] 关美艳
植物营养学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:中国耕地镉污染问题突出,已经成为威胁中国食品安全的主要问题之一。植物应答镉胁迫的分子生理机制,包括根系对镉的吸收及植株对镉的耐性机制,是利用生物技术或遗传育种手段培育镉积累量低的作物新品种的理论基础。近年来,许多研究表明信号分子一氧化氮在调控根系对镉的吸收及植株对镉的耐性中发挥重要作用,但镉胁迫过程中调控植物细胞内一氧化氮积累水平的因子仍不清楚。为此,本论文以拟南芥为研究材料,运用植物生理学、遗传学、分子生物学等手段,研究了一氧化氮清除系统S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶(GSNOR)和非共生血红蛋白(AHb1)在植物应答镉胁迫过程中的作用机制。主要研究结果如下:
  镉胁迫处理显著诱导根中GSNOR基因和GSNOR蛋白的表达,因此增强了S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性。通过分析镉胁迫对野生型Col-0、GSNOR功能缺失突变体gsnor1-3、和GSNOR过表达转基因植株(GSNOROE3和GSNOROE5)中一氧化氮积累和S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶酶活性的影响,发现镉胁迫诱导的一氧化氮积累与S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性与呈负相关。这说明镉胁迫诱导的S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性增强有助于抑制一氧化氮的过量积累。另一方面,利用Col-0、AHb1反义方向表达株系AHb1-L3和AHb1过表达株系AHb1-H7植株为材料,发现在镉胁迫条件下,这3个基因型植株根系中的一氧化氮含量与AHb1的表达量无关,说明镉胁迫时AHb1对一氧化氮的清除功能不参与调控植株根系中的一氧化氮水平。
  进一步研究了GSNOR和AHb1在植物镉吸收中的作用。发现Col-0、gsnor1-3、GSNOROE3和GSNOROE5中地上部和根部的镉含量以及根系的镉吸收速率均与S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性呈负相关,这说明GSNOR负调控了植物的镉吸收。然而,Col-0、AHb1-L3和AHb1-H7植株中的镉含量基本一致,说明AHb1不参与调控植物的镉吸收。通过向gsnor1-3植株添加一氧化氮清除剂或向GSNOROE5植株添加一氧化氮供体,发现GSNOR对镉吸收的调控作用依赖于一氧化氮的存在。分析镉胁迫对Col-0、gsnor1-3、和GSNOROE5植株IRT1基因表达的影响,发现S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性与IRT1基因表呈达负相关。通过构建irt1-1/gsnor1-3和irt1-1/GSNOROE双突变体,并比较它们根系的镉吸收速率与irt1-1单突变体之间的差异,发现IRT1功能缺失后,GSNOR对植物对根系镉吸收的负调控作用消失。这表明,GSNOR对镉吸收的负调控通过抑制IRT1介导的镉吸收来实现。综上,认为:镉胁迫诱导的S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性增加通过抑制一氧化氮介导的IRT1表达,降低了根系对镉的吸收速率,减少了根系对镉的吸收,降低了植株的镉含量。
  尽管S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性增强降低了植株体内的镉含量,但发现Col-0、gsnor1-3和GSNOROE5植株地上部受镉胁迫的毒害程度与S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性呈正相关。进一步分析发现镉胁迫也能诱导地上部GSNOR基因和GSNOR蛋白的表达,并增强了S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性。这说明镉胁迫诱导的S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性不利于植物对镉的耐性。进一步分析发现,镉胁迫下Col-0、gsnor1-3和GSNOROE5植株地上部CATs基因表达和CAT活性均与S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性呈负相关,H2O2含量与S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性呈正相关;且外源喷施CAT活性抑制剂3-AT后,GSNOR对CAT活性和H2O2积累量的调控作用消失。这说明,镉胁迫诱导的S-亚硝基化谷胱甘肽还原酶活性增强可通过下调植株地上部CAT相关基因的表达抑制CAT活性,进而增加植株中H2O2的积累,加剧了镉胁迫导致氧化胁迫。
[硕士论文] 王玉同
生物学 浙江师范大学 2018(学位年度)
摘要:网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis; CME)与外吐(clathrin-mediated exocytosis; CMX)是动植物细胞质膜蛋白运输的主要途径。植物网格蛋白与其接头蛋白复合体AP-2(adaptor protein-2)和TPC(TPLATE complex)共定位于质膜,又与AP-1共定位于反式高尔基网络/早期内体TGN/EE(trans-Golgi network/early endosome),它们共同介导质膜蛋白的CME和CMX途径。AP-1复合体是由AP1γ、AP1/2β、AP1μ和AP1σ组成的异源四聚体。同样,AP-2由AP2α、AP1/2β、AP2μ和AP2σ组成的异源四聚体,而TPC是由TPLATE、TML、TASH3、LOLITA、TWD40-1、TWD40-2、AtEH1和AtEH2组成的八聚体。已有研究表明,动物细胞质膜蛋白内吞途径与外吐途径之间存在相互调控机制。然而,植物细胞是否存在相似的调控机制至今仍不清楚。
  本研究的前期结果表明,拟南芥网格蛋白轻链CLC2(clathrin light chain2)和CLC3功能缺失同时抑制了质膜蛋白内吞和质膜蛋白的回收(recycling)途径。此外,植物激素水杨酸(SA)和人工合成内吞抑制剂TyrA23通过调控AP-2和网格蛋白质膜招募来调控质膜蛋白内吞,而生长素通过特异性地调控CLC质膜招募来调控质膜蛋白内吞。
  在此基础上,本研究利用激光共聚焦显微镜分析技术,结合遗传学、细胞生物学和药理学等研究方法,分析鉴定了接头蛋白复合体AP-2亚基功能缺失突变体、TPC亚基部分功能缺失对AP-1介导的外吐途径的影响。具体研究结果如下:
  (1)亚细胞共定位分析表明,植物细胞网格蛋白与TGN/EE分子标记有较高的共定位系数,相反与高尔基、液泡等分子标记的共定位系数极低,表明胞内网格蛋白主要定位于TGN/EE,明确了网格蛋白胞内作用位点。
  (2)遗传学分析表明,AP2μ、 AP2σ功能缺失和TPLATE、TML部分功能缺失减弱了质膜蛋白PIN2-GFP和RCI2A-GFP的回收途径和AP-1介导的分泌蛋白Sec-GFP的分泌/外吐途径。
  (3)药理学分析表明,CME抑制剂生长素(IAA和2,4-D)、SA和TyrA23处理明显促进了分泌蛋白Sec-GFP的胞内积累,表明CME抑制剂抑制了Sec-GFP的分泌/外吐途径。
  (4)遗传学和药理学分析表明,AP2μ、 AP2σ功能缺失和TPLATE、TML部分功能缺失以及内吞抑制剂处理均损害了AP-1亚基AP1μ和AP1σ的TGN/EE招募,但不影响其他TGN/EE分子标记的亚细胞定位。
  根据本研究结果,可初步获得以下结论:网格蛋白主要在质膜和胞内TGN/EE上起生物学功能;AP-2亚基或TPC亚基通过调控AP-1的TGN/EE招募来调控质膜蛋白外吐途径包括回收途径和分泌途径。本研究结果证明了AP-2和TPC参与调控AP-1介导的外吐途径,为进一步阐明植物细胞CME途径调控CMX途径的分子机制提供了新的观点与见解,同时对膜蛋白运输机制研究具有重要参考价值。
[博士论文] 胡慧贞
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物的细胞壁决定细胞形状和大小,为植株生长发育提供机械支撑和保护屏障。尽管细胞壁生物合成参与植物细胞分裂、伸长和分化,但相关调控机理尚未深入研究。纤维素是细胞壁的主要成分,对植物的形态建成和生长发育至关重要,然而纤维素生物合成的调控机理尚不清楚。此外,虽然纤维素合酶超大家族基因种类多,功能各异,但能成功用于遗传改良植物生长和提高生物质产量的鲜有报道。因此,深入研究纤维素合酶(CesA)家族基因及纤维素合酶类似D(CSLD)基因的生物学功能,具有重要科学意义和应用价值。本研究以拟南芥为主要研究对象,利用几十份遗传突变体和超表达材料,系统分析了AtCesAs基因和AtCSLD3/GhCSLD3基因在植物纤维素生物合成与细胞壁形成、植物细胞伸长与分裂、植物生长发育与生物质产量形成等过程中的功能和相关分子机理。主要结果如下:
  1.通过比较分析六个AtCesA家族基因(CesA2、A5、A6、A3、A7、A9)超表达和四个AtCesAs突变体(prc1-1、CesA6、rsw1/CesA1、IRX3/CesA7)的生物学功能,初步概括出从幼苗期(初生细胞壁合成)到植物成熟期(次生壁沉积)的三种模式,即初生壁增强型、初生壁调控型和次生壁限制型:(i)首先发现在初生壁时期,三个AtCesA6-like基因(AtCesA2、5、6)超表达,加速了纤维素合酶复合体在原生质膜上的运动速率,显著提高了纤维素合成和改变微纤丝特性,促进了细胞伸长或细胞伸长模式的改变,同时正向影响细胞分裂,从而促进初生壁合成和幼苗的生长;(ii)进一步发现了初生壁合成对次生壁沉积的动态调控以及对细胞壁完整性的正向影响;(iii)最后关联分析出了细胞壁完整性和次生壁沉积对细胞壁机械强度和植物生物量的正向影响。故本研究首次通过超表达三个AtCesA6-like基因显著提高了植物生物质产量,也从上述三种模式中论述了AtCesA6-like基因提高生物质产量的唯一性。提出了从细胞壁发育过程着手,先增强初生壁合成,再正向影响次生壁合成来促进植物生长发育的新思路,为植物的遗传改良提供了理论基础。
  2.依据纤维素合酶类似(CSL)家族中D基因家族与CesA序列相似性最高的特性,筛选了CSLD与CesA家族基因在这两个家族基因突变体中的超表达株系,并对部分株系做了深入的功能分析,为CSLD在特定的时期或组织中能替代CesA功能参与纤维素合成提供了进一步的实验证据。此外,本研究通过拟南芥及棉花CSLD3基因超表达转基因材料和乙烯信号传导突变体材料,系统分析了CSLD3基因对拟南芥细胞伸长、根毛发育以及植株生长的促进作用,并证明了CSLD3在处于乙烯信号传导以及磷酸盐饥饿诱导途径下游,调控根生长与根毛顶端伸长。
[硕士论文] 杜思梦
植物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:腺苷酸核糖基化作用因子(ADP-ribosylation factor,Arf)属于小G蛋白超家族中的Arf亚族,普遍存在于真核生物中,在内质网与高尔基体间的小泡运输、维持高尔基体和内质网的结构以及溶酶体/液泡运输途径中起重要作用。Arf和其它小G蛋白相似,具有很弱的本底水解GTP的GTPase活性,经GTPase激活蛋白(GTPase-activating protein,GAP)的作用,可以高效地水解GTP到GDP,变成非活性形式。Arfs的GTPase激活蛋白(ADP-ribosylation factor GTPase-activating proteins,ArfGAPs)可促进Arfs的GTPase水解,将这些Arf由与GTP结合的活性形式转化成与GDP结合的非活性形式,在调节Arfs的活性及功能中起关键作用。
  本研究从实验室截形苜蓿响应低温的表达谱中筛选了两个ArfGAP基因,MtArfGAP1(Mt1g069000)和 MtArfGAP2(Mt7g099830),其编码蛋白分别由481和443个氨基酸组成,都含有一个保守的属于CX2CX16CX2C类锌指结构域,即ArfGAP domain。MtArfGAP1和MtArfGAP2蛋白结构相似,同源性高达65%。与拟南芥中的15个ArfGAP类蛋白进行相似性比对发现MtArfGAP1和MtArfGAP2蛋白与AtAGD6和AtAGD7进化距离最近,属于Ⅱ类ArfGAP。将35S启动子驱动的MtArfGAP1-EGFP和 MtArfGAP2-EGFP载体转化水稻原生质体,利用激光共聚焦观察发现 MtArfGAP1和MtArfGAP2蛋白在细胞核中均有分布。构建PMtArfGAP1::GUS和PMtArfGAP2::GUS表达载体,利用农杆菌菌液侵染拟南芥,获得了PMtArfGAP1::GUS的转基因拟南芥,但未筛选到 PMtArfGAP2::GUS的拟南芥。通过 GUS(β-glucuronidase)组织表达检测发现MtArfGAP1主要在花和叶中表达。实时荧光定量PCR分析结果表明光照和低温对MtArfGAP1和MtArfGAP2表达都有影响,光照诱导MtArfGAP1和MtArfGAP2的表达,而低温则抑制两者的表达。
  分别构建MtArfGAP1和MtArfGAP2的过表达载体,并利用基因组编辑技术,在MtArfGAP1和MtArfGAP2的ORF5’区和功能结构域各设计1个靶点,构建MtArfGAP1和MtArfGAP2的CRISPR/Cas9载体。将过表达载体及CRISPR/Cas9载体分别转化截型苜蓿,获得了相应的过表达及基因敲除的截形苜蓿。利用 PCR检测鉴定得到过表达MtArfGAP1的转基因截形苜蓿9株,基因组编辑的转基因截形苜蓿8株;过表达MtArfGAP2的转基因截形苜蓿2株,基因组编辑的转基因截形苜蓿1株。通过在CRISPR/Cas9载体上同时设计 MtArfGAP1和 MtArfGAP2两个靶位点引物,构建MtArfGAP1和 MtArfGAP2的双基因敲除载体并转化截形苜蓿,获得 MtArfGAP1和MtArfGAP2双基因编辑截形苜蓿4株,更多的转基因植株处于生根阶段。这些结果为进一步研究MtArfGAP1和MtArfGAP2的功能奠定了基础。
[硕士论文] 李灿
风景园林 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:水分胁迫是植物生长发育中最常见的逆境胁迫。华南地区降雨量大,暴雨和特大暴雨后易引起积水,但降雨量季节分布不均,使植物遭遇复杂多变的水分胁迫,对其生长造成影响。灌木是园林绿化的重要组成部分,研究灌木对水分的适应性并从中筛选出既耐旱又耐涝的植物对构建海绵城市具有重要意义。
  本研究选取华南地区常见5种园林灌木黄蝉(Allemanda schottii)、栀子(Gardenia jasminoides)、斑叶鹅掌藤(Schefflera arboricola‘Variegata’)、钟花蒲桃(Syzygium campanulatum)、狗牙花(Tabernaemontana divaricata)为研究对象,设置对照、连续淹水、连续干旱、淹水-干旱-复水4个处理,试验持续42天,每14d观察记录植物的形态变化,试验结束时,测量植物的生长、叶性状、生理等指标,分析植物在不同水分处理下的变化规律。研究结果如下:
  (1)外部形态可作为判断植物耐涝和耐旱性的重要依据。淹水胁迫对植物的外部形态影响明显,黄蝉、栀子、钟花蒲桃表现较好;斑叶鹅掌藤根系腐烂,狗牙花大量落叶,这两种植物表现较差。干旱胁迫对植物形态的影响主要体现在叶片,钟花蒲桃和狗牙花叶片受害严重,对干旱胁迫较敏感。旱涝交替胁迫下,黄蝉和钟花蒲桃恢复明显。
  (2)淹水胁迫促进黄蝉根冠比和根系特征值增大(P<0.05);植物比叶面积大多减小,除斑叶鹅掌藤外叶干物质含量都显著增加(P<0.05)。干旱胁迫下,狗牙花的地径明显增粗(P<0.05),钟花蒲桃的地径生长受到严重抑制;黄蝉和钟花蒲桃的根生物量比、根冠比显著升高(P<0.05)。旱涝交替胁迫下植物株高地径变化差异较大,其对植物的根生物量比、根冠比影响不显著。
  (3)淹水胁迫和干旱胁迫下,植物的净光合速率、蒸腾速率显著降低(P<0.05),MDA含量都上升。淹水胁迫下,植物的叶绿素含量显著降低(P<0.05),可溶性蛋白含量都下降,斑叶鹅掌藤和狗牙花的SOD活性显著降低(P<0.05)。干旱胁迫下植物的SOD活性都下降,可溶性蛋白含量都上升。旱涝交替胁迫下植物的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度基本都与对照持平或超过对照水平,除栀子的叶绿素含量上升外(P<0.05),其它植物降低。黄蝉和栀子的SOD活性显著降低(P<0.05),斑叶鹅掌藤和狗牙花的MDA含量显著升高(P<0.05),黄蝉的可溶性蛋白含量显著升高(P<0.05),栀子的可溶性蛋白含量则显著降低(P<0.05)。
  (4)对19个指标进行主成分分析,5个主成分可反映原始数据84.31%的信息。运用模糊隶属函数评价植物对水分胁迫的适应性,得出5种植物耐涝性从强到弱依次为黄蝉、栀子、钟花蒲桃、狗牙花、斑叶鹅掌藤。耐旱性从强到弱依次为黄蝉、斑叶鹅掌藤、栀子、狗牙花、钟花蒲桃。旱涝交替胁迫下植物的适应性从强到弱依次为黄蝉、栀子、钟花蒲桃、斑叶鹅掌藤、狗牙花。综合来看,黄蝉、栀子既耐涝又耐旱,斑叶鹅掌藤耐旱不耐涝,钟花蒲桃耐涝不耐旱,狗牙花既不耐涝又不耐旱。
[硕士论文] 韩东洺
细胞生物学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:菊芋(Helianthus tuberosus)是菊科(Asterceae)向日葵属的多年生草本植物,俗称洋姜、地环等。菊芋具有广泛的生态适应性,可以生长在贫瘠的土壤中,具有霜冻及植物疾病抗性。菊芋所含的酚类物质具有重要的生理功能,已广泛应用于食品、医药等行业,但相关研究也仅限于菊芋叶片和块茎组织。本研究利用植物组织培养技术建立菊芋块茎悬浮细胞培养体系,选择3种生物诱导子(茉莉酸甲酯、水杨酸、酵母提取物)对菊芋块茎悬浮培养细胞进行诱导处理,分析3种生物诱导子对总酚含量的诱导效果,并以14种酚类物质为标品,采用超效液相色谱测定了菊芋块茎悬浮培养细胞中的酚类物质的变化。同时,采用ABTS、DPPH、FRAP三种抗氧化检测方法测定了菊芋块茎悬浮培养细胞提取液的抗氧化活性。
  (1)菊芋块茎悬浮细胞生长曲线选择菊芋块茎诱导愈伤组织并进行悬浮培养,采用激素配比1.0mg/L NAA和1.0mg/L6-BA、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的MS固体培养基诱导菊芋块茎愈伤组织,菊芋块茎悬浮培养采用激素配比1.0mg/L NAA和3.0mg/L6-BA、30g/L蔗糖的MS液体培养基,绘制出菊芋块茎悬浮细胞生长曲线,接种的细胞量为4g/100mL,第9天进入对数期,在第24天细胞生物量达到最大,第33天后进入衰退期。
  (2)3种诱导子对菊芋块茎悬浮细胞酚类物质的诱导本实验确定了酵母提取物的最佳处理浓度为0.5mg/L(4.92mg GAE/g DW)、水杨酸的最佳处理浓度为50μmol/L(2.33mg GAE/g DW)、茉莉酸甲酯的最佳处理浓度为200μmol/L(7.39mg GAE/g DW,是对照组的1.52倍),酵母提取物的最佳处理时间为第3天(4.65mg GAE/g DW)、水杨酸的最佳处理时间为第12天(4.61mg GAE/g DW)、茉莉酸甲酯的最佳处理时间为第12天(10.85mg GAE/g DW,是对照组的2.88倍)。从菊芋块茎悬浮细胞中检测出10种酚类物质:原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、东莨菪内酯、3-羟基肉桂酸、芥子酸、槲皮素。茉莉酸甲酯诱导的菊芋块茎悬浮细胞中槲皮素含量是对照组的2.56倍,儿茶素和绿原酸的含量分别是对照组的7.6倍和6倍,4-羟基苯甲酸的含量两者一样。茉莉酸甲酯处理组与对照组相比,其他6种酚类物质含量低,其中原儿茶酸在对照组中没有检测到。
  (3)菊芋块茎悬浮细胞酚类物质的抗氧化活性分析采用FRAP、DPPH、ABTS三种抗氧化活性检测方法评估了菊芋块茎悬浮细胞提取液的抗氧化活性。茉莉酸甲酯诱导菊芋块茎悬浮细胞提取液的ABTS清除率达到39.63%(对照组为14.25%)、DPPH清除率达到42.13%(对照组为10.22%)、FRAP抗氧化能力达到7.12mg TE/g DW(对照组为2.29mg TE/g DW)。
  (4)菊芋块茎悬浮细胞与茎节悬浮细胞酚类物质及抗氧化活性比较与实验室前期以茎节为外植体建立的悬浮培养细胞相比,酵母提取物诱导下块茎悬浮细胞的总酚含量(4.65mg GAE/g DW)显著高于茎节悬浮细胞的(3.63mg GAE/g DW),茉莉酸甲酯诱导后差异更大(块茎悬浮细胞10.85mg GAE/g DW、茎节悬浮细胞5.52mg GAE/g DW),增加了0.97倍;茉莉酸甲酯诱导块茎悬浮细胞的酚类物质中儿茶素(1.53mg GAE/g DW)和槲皮素(5.58mg GAE/g DW)的含量要显著高于茎节悬浮细胞(1.1mg GAE/g DW和3.94mg GAE/g DW),分别是茎节悬浮细胞的1.39倍和1.41倍,而4-羟基苯甲酸(0.37mg GAE/g DW)和绿原酸(0.23mg GAE/g DW)含量显著低于茎节悬浮细胞(0.84mg GAE/g DW和1.06mg GAE/g DW)。ABTS和DPPH的自由基清除能力以及FRAP的抗氧化能力相对于对照组增加的倍数,块茎悬浮细胞都要比茎节悬浮细胞高。
[硕士论文] 李榆杨
免疫组化与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物细胞壁是由不同多糖组成的复杂结构。储藏于植物细胞壁中的含量丰富的木质纤维素(生物质)可以通过各种物理化学预处理和生物酶解方法转化为生物乙醇等能源产品,纤维素酶解在生物质酶解中是至关重要的一步。在生物质降解过程中,细胞壁的抗降解性是阻碍生物能源产业化的最重要因素,因此,研究生物质原料的细胞壁结构对于改进生物质降解工艺流程及定向培育可高效利用的能源作物具有重要意义。本课题分为两个部分:
  免疫荧光法检测芒草细胞壁降解中的多糖变化部分主要利用细胞壁多糖特异抗体检测直接酶解过程中或酸、碱预处理加酶解过程中,芒草茎秆细胞壁中纤维素、半纤维素、果胶多糖的变化,结合吸光度法测定己糖、戊糖、糖醛酸的含量以及气相质谱测定单糖含量的变化,揭示细胞壁各组分之间的联系和对预处理酶解的影响度,为深入理解芒草细胞壁结构和芒草的定向能源作物育种的研究提供一定依据。本课题取得的主要结果如下:
  1.在预处理及酶解过程中,基本组织及薄壁细胞最先被降解,其次是维管束的韧皮部,维管束中原生木质部是最难降解的组织;
  2.碱预处理对纤维素基本不起作用,而酸预处理能去除少量纤维素;
  3.酸处理酶解释放戊糖、己糖均低于碱处理酶解释放量,而且酸碱预处理后酶解戊糖、己糖释放量显著高于直接酶解;
  4.酸碱预处理不能去除XyG(木葡聚糖),但XyG是酶解中最先被去除的成分;酸碱预处理对部分甲酯化的HG(同聚半乳糖醛酸)的降解效果明显,对半纤维素多糖的作用并不明显;
  5.本实验所用材料中,芒的戊糖、己糖、糖醛酸释放量在预处理酶解过程中始终高于荻,单糖释放量也有相同的规律;
  6.半纤维素主要成分Xylan不易去除,随着预处理酶解的进行,戊糖释放量(比色法)及xylose单糖含量(GC-MS)始终呈增长趋势。
  第二部分是关于微生物中近期发现的一种新型氧化酶真菌多糖单氧化酶(PMO),该酶在高等植物中的研究尚为空白。纤维素酶解在生物质降解中是至关重要的一步。传统的纤维素酶通过加水脱氢切断纤维素链,得到寡聚糖,最终被降解成单糖。近期发现的新型氧化酶PMO改变了传统纤维素酶解的模式,通过对C1端或C4端的氧化切断糖苷键。这种类型的酶具有平滑的底物结合表面和Cu离子活性中心,与纤维素晶体区结合,氧化酶切作用还需要电子供体和O2。随着研究的深入发现PMO的底物十分多样化,除了纤维素,半纤维素、淀粉等多糖都能被其氧化降解,从而揭示了PMO在细胞壁降解中扮演着重要的角色。PMO在细菌和真菌中的研究已十分广泛,但在高等植物中的功能未知。本文将红色面包霉中的PMO基因NcPMO-2转入高等植物拟南芥和水稻中,试图研究真菌纤维素氧化酶PMO在高等植物中发挥的作用及对生物质降解效率的影响。主要结果如下:
  1.人工合成NcPMO-2 cDNA序列,构建PMO-pD1301S与PMO-pUBI超表达载体,分别转入拟南芥和水稻,得到超表达转基因植株;
  2.拟南芥超表达植株表现出分支位置降低的表型,水稻超表达植株表现出分蘖增多、结实率降低、秸秆生物量增加的表型;
  3.拟南芥超表达植株成熟茎秆细胞壁成分中,纤维素含量显著升高,晶体纤维素比例降低;水稻超表达植株纤维素及晶体纤维素含量均显著降低;
  4.拟南芥与水稻超表达植株酶解糖化效率均显著升高,升高幅度达12%-25%。
[硕士论文] 吕亚妮
细胞生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:小麦(Triticum aestivum L.)颖果腹部韧皮部筛分子(sieve element,SEs)的主要功能是运输有机营养物质,木质部导管(tracheary elements,TEs)的主要功能是运输水分和无机盐。前期研究表明,小麦颖果腹部韧皮部筛分子的发育经历了特殊的PCD过程,发育成熟的SEs仍具有细胞活性,能将营养物质运输并储存于小麦胚乳中。本实验采用生物电镜、超微细胞化学与免疫荧光等技术手段,比较观察了筛分子和导管发育过程中超微结构的特征,并对细胞骨架的动态变化及ACPase分布的时空变化进行观察,进而探讨它们与PCD的关系。主要结果如下:
  1.显微与超微结构观察表明,筛分子呈对称性半圆形分布于导管的两侧,其细胞质主要通过液泡膜内陷包裹细胞器,形成自噬体进行降解,最终仍保留了部分细胞器碎片,筛分子仍然存活;而在导管分化中,主要是液泡破裂后,胞内形成自噬泡发挥自噬功能,最后细胞质被完全降解,导管最终死亡,形成管状分子,且在花后6-7d时,导管细胞壁多处发生溶解,形成了端壁孔。
  2.通过吖啶橙/碘化丙啶荧光染色结果显示,筛分子和导管细胞壁均被染成黄绿色,细胞核被染成红色。多数筛分子细胞核降解主要发生在花后3-5d,而导管发育过程中细胞核的降解主要发生在花后2d,在花后3d时,细胞核已被完全降解。
  3.间接免疫荧光标记微管结合透射电子显微镜观察发现,随着分化的进行,筛分子和导管内微管主要靠近细胞壁周围分布,尤以细胞壁加厚的位置分布较多。亚细胞水平观察发现微管周围有很多小囊泡。筛分子内靠近细胞壁周围的微管从花后5d开始减少直至降解,而导管中微管在花后4d出现横向微管,但在花后6-7d时,有的导管分子细胞壁上的微管增多。微丝蛋白的免疫荧光结果显示,花后2d,筛分子与导管内微丝均呈网络状。随着分化进行,微丝均在细胞壁加厚的位置分布较多。筛分子内靠近细胞壁周围的微丝从花后5d开始减少直至降解。而导管中微丝在花后4d出现横向微丝,花后6-7d时,导管细胞内横向微丝减少。
  4.ACPase定位结果表明,在导管液泡膜破裂后,ACPase活性多位于线粒体内自噬空泡内、内质网等发生降解的细胞器上。在筛分子发育初期,仅在液泡内检测到ACPase活性,且液泡内包裹少量细胞质。随着发育的进行,不仅在发生降解的线粒体等细胞器上检测到了ACPase活性,在成熟筛分子胞间连丝上也检测到了ACPase活性。
  综上所述,小麦筛分子和导管分化过程中均出现了细胞核降解,内含物缺失等典型的细胞程序性死亡现象,但二者降解细胞质的方式不同,筛分子中主要是微自噬的过程,而导管中则是形成自噬泡来降解细胞质,且导管内含物的降解要比筛分子快。从形态变化来看,导管细胞壁发生了溶解,形成了端壁孔。更重要的是,分化成熟的筛分子是活细胞,而导管是死细胞。筛分子和导管中细胞骨架的动态变化可能对细胞壁的发生具有调控作用。ACPase不仅与胞内物质的降解有一定相关性,自噬泡内ACPase活性也介导了细胞器的消亡过程,同时,分布于胞间连丝上的ACPase可能还与细胞间的物质运输和信息传递有关。
[硕士论文] 轩利娟
生物学·细胞生物学 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:自噬(Autophagy,AP)是真核生物将细胞内冗余或受损伤的蛋白质及细胞器用双层膜包裹运往液泡或溶酶体中降解再利用的过程,在生物体正常发育、衰老或遭受生物、非生物胁迫过程中发挥重要作用。关于自噬的研究早期主要集中在酵母和哺乳动物,近些年来在植物中的研究逐渐增多,但主要局限于在生物和非生物胁迫条件下的细胞的自噬,另外还局限于植物的营养生长过程,对正常生长发育过程中,尤其是植物的生殖过程中的自噬还鲜有研究。之前本实验室在透射电镜下观察发现蜀葵和油菜减数分裂期小孢子母细胞内存在复杂的类自噬体结构,但它们是否代表真正的自噬体以及它们的形成机制和功能还不清楚。为此,本研究以蜀葵为材料,通过自噬特异性染色剂MDC染色、自噬抑制剂3-MA和E-64预处理以及亚显微结构观察,对蜀葵小孢子母细胞(MMCs)中的自噬现象做了进一步定性的研究。主要结果如下:
  (1)MDC染色后荧光显微镜观察发现,正常生长条件下的早期和减数分裂期MMCs细胞质呈绿色或蓝色荧光,其内分布有数量不等的蓝色亮点,这些亮点即代表自噬体,这些亮点主要分布在细胞边缘,有些亮点在细胞边缘聚集成大的亮斑。减数分裂期MMCs内亮点的数目明显多于早期MMCs。小孢子时期亮点消失。
  (2)3-MA预处理24h和36h之后荧光显微镜观察发现,细胞质呈绿色荧光,但自噬体数目比正常组细胞(不经任何处理的细胞)稍有增多,但与DMSO对照组相比显著减少。DMSO对照组与正常组细胞相比,细胞内自噬体数目显著增多。
  (3)E-64预处理24h和36h之后荧光显微镜观察发现,细胞呈蓝色或绿色荧光,细胞内自噬体数目比正常组细胞和DMSO对照组细胞内的自噬体数目显著增多。DMSO对照组细胞内自噬体数目与正常组细胞相比也明显增多。
  (4)普通荧光显微镜观察发现,正常条件下的小孢子体积较小,大小均一。3-MA预处理后,大部分(70%)小孢子体积相对变大,大小变得不均匀;相反,E-64预处理后,大部分(80%)小孢子体积变小,大小也变得不均一。
  (5)RT-PCR检测发现,自噬相关基因ATG8在蜀葵根、茎、叶、小孢子母细胞、四分体、小孢子中都有表达。
  (6)亚显微结构观察显示,早期蜀葵MMCs内的确有典型的自噬体结构存在。其形成过程有:细胞内先出现新月状双层膜结构,这种结构的膜继续延伸形成杯状,最后膜两端融合形成自噬体结构,并将一些受损细胞器及蛋白包裹在内。随着细胞的发育,部分自噬体被周围另外的膜包裹形成多层膜结构;部分自噬体内膜断裂并卷曲,形成胞内体。最后,部分自噬体与质膜融合,将内含物排放到质膜与细胞壁之间,部分自噬体与液泡融合并降解。
  综上可知,蜀葵小孢子发生过程中细胞内的确有自噬活动参与。
[硕士论文] 梁亚平
植物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:叶绿体是绿色植物特有的细胞器,并且光合作用、光呼吸和氮代谢等多种重要代谢途径均在此发生,因此研究清楚叶绿体的生长发育对了解植物的发育和产量等具有重要意义。本研究通过EMS诱变拟南芥Col-0种子,从其M2代突变体库中筛选到一棵叶片延迟变绿突变体:该突变体的新生叶具有明显的黄化表型,黄化的幼叶随着叶片的发育由叶尖开始慢慢回绿,最终整个叶片变为绿色,因此在营养生长期该突变体表现为老叶呈绿色,新叶呈黄色,具有完整的生活史。以该突变株为材料研究叶绿体的发育,获得了如下研究结果:
  1.突变基因的定位
  将Col-0背景的突变体与Ler野生型杂交,构建图位克隆群体,以均匀分布在拟南芥5条染色体上的24对Marker引物进行初步定位。将突变基因初步定位在1号染色体3.83M~8.00M之间,通过设计新的引物将突变基因精细定位至1号染色体5.3M~5.83M之间。进行基因组重测序,发现在5.3M~5.83M区间发生较可信的SNP突变只有一个:At1g15510基因第1931位碱基由G变为A,即ECB2蛋白的Gly644转变为 Asp644。从 Tair网(拟南芥信息资源网站 https://www.arabidopsis.org/)下载At1g15510基因序列,选取基因上游1936 bp的启动子序列和基因全长2601 bp序列构建互补载体。通过浸花法侵染该突变体,经过筛选最终得到了表型恢复为野生型的互补植株。证明了该突变体表型是由At1g15510基因的突变造成的,故我们将该突变体命名为ecb2-3。
  2. AtECB2基因是PPR家族的一员
  根据拟南芥PPR蛋白数据(http://www.plantenergy.uwa.edu.au/applications/ppr/ppr.php),AtECB2蛋白属于PPR蛋白家族PLS亚家族的DYW亚类,包含17个PPR基序。通过对不同物种的ECB2同源蛋白序列对比,发现ecb2-3中被突变的Gly是非保守性氨基酸。
  3. ecb2-3突变体叶绿体发育受到抑制
  由于 ecb2-3突变体的叶片延迟变绿表型,我们对突变体进行叶绿素含量和最大光化学效率的测定,结果显示突变体绿色叶片叶绿素含量和最大光化学效率与野生型无明显差异,黄色叶片存在显著性差异。同时也通过透射电镜对突变体叶绿体超微结
  构进行观察,结果显示萌发后7天的ecb2-3子叶的叶绿体小于同时期野生型叶绿体。在萌发后21天的ecb2-3植株中,黄色真叶的叶绿体缺乏类囊体膜和淀粉颗粒,与预期相同,绿色真叶的叶绿体含有与野生型相似的类囊体膜和淀粉颗粒。同样在互补植株中,叶绿体与野生型植物具有相似的超微结构。
  4. ecb2-3突变体accD和ndhF的RNA编辑效率有所下降
  有文献报道,AtECB2参与拟南芥叶绿体基因accD(C794和C1568)和ndhF(C290)的RNA编辑。我们通过提取Col-0野生型ecb2-3突变体RNA,反转录为cDNA,以cDNA设计合适的引物将accD和ndhF的编辑位点扩增下来进行测序,同时设计dCAP引物进行 PCR反应分析其编辑效率。结果显示:与野生型相比,突变体在这三个位点的编辑效率均存在不同程度的降低,但是并没有完全消除。
  以上结果表明AtECB2是拟南芥叶绿体accD基因和ndhF基因RNA编辑和早期发育所必需的。而正是因为 ecb2-3突变体具有完整的生活史和其能够稳定遗传的生理特性使该突变体可用于在拟南芥RNA编辑和叶绿体发育的进一步研究中。
[硕士论文] 刘洋
生物学·细胞生物学 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:细胞自噬在各种逆境胁迫下对调节植物的生存起到关键作用,是一类依赖于溶酶体和液泡的蛋白质降解途径,在真核生物中高度保守。植物细胞中该降解途径主要发生在液泡中,通过液泡水解酶降解胞内回收物、破损的细胞器,以维持自身的生长发育和内环境稳态。模式植物拟南芥中已经鉴定到多个关键的ATGs基因,它们对自噬体的形成和调控起到关键作用。拟南芥中ATG1/ATG13为自噬调控的核心组分,对自噬体到液泡的转运十分重要,而蛋白激酶、蛋白磷酸酶对关键ATG蛋白的翻译后修饰目前在植物中报道甚少。
  本实验室通过磷酸组学分析和质谱鉴定,寻找TOPP4可能的互作蛋白。在蛋白磷酸组学分析中发现,与野生型相比,topp4-1中自噬蛋白ATGx磷酸化水平发生显著上调,同时质谱也鉴定到ATGx的肽段,酵母双杂实验证明ATGx和TOPP4之间确实存在很强的互作。通过酵母双杂和BiFC实验发现TOPP4与自噬关键蛋白ATGx,ATG8a,ATG8e和ATGy之间均有互作。
  topp4-1对C源的缺乏极度敏感,表现出黄化早衰的自噬表型,但T-DNA插入株系topp4-3中未观察到自噬表型。在C源、N源缺乏条件下,施加抑制剂ConA处理后,topp4-1中自噬体的数目有了明显增加,但仍少于野生型,暗示topp4-1在自噬体的形成方面可能存在缺陷。在C源和N源缺乏条件下,利用ProTOPP4-GUS,ProATG8e-GUS转基因株系发现,TOPP4和ATG8e在子叶、下胚轴、根中有相似的强烈表达,表明具有相似的表达模式。酵母双杂实验结果表明ATGx和PP1家族中TOPP1,TOPP4,TOPP5,TOPP8之间均存在互作,暗示PP1通过ATGx复合体参与植物细胞自噬过程。总之,以上研究结果证明拟南芥蛋白磷酸酶PP1参与了植物细胞自噬过程。
[硕士论文] 贺俊波
植物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物的次生壁主要由纤维素、半纤维素和木质素构成,双子叶植物和大多数单子叶植物次生壁中的半纤维素主要是木聚糖。木聚糖是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多糖,几乎占地球可更新有机碳总量的三分之一。主要由NAC和MYB转录因子组成的转录调控网络以及一些其它转录因子调控次生壁的合成,其中包括MYB46、MYB20、MYB52、MYB69、MYB85、MYB103、KNAT7、IFL1和ERF72。但是木聚糖合成的转录调控尚不是很清楚。
  本研究通过转录激活实验筛选出一些拟南芥的能够激活木聚糖合成关键基因启动子的转录因子,再从中选出一个激活作用比较强的转录因子进行深入研究。检测该转录因子基因的表达量对木聚糖合成、次生壁合成和木聚糖合成关键基因表达量的影响,并且验证该转录因子能否直接结合一个木聚糖合成关键基因的启动子。获得以下主要研究结果:
  (1)转录激活试验表明MYB46、MYB20、MYB85、MYB103、ERF72和KNAT7显著激活一个或多个木聚糖合成关键基因的启动子,其中KNAT7能够显著激活IRX9、IRX10、IRX14-L和FRA8的启动子。
  (2)用离子色谱法分析野生型植株和knat7突变体的非纤维素单糖组分,发现knat7突变体的木聚糖主要成分木糖和葡糖糖醛酸显著减少。通过酶联免疫吸附试验检测野生型植株和knat7突变体的木聚糖含量,结果显示knat7突变体的木聚糖减少。
  (3)在显微镜下观察野生型、knat7、KNAT7过量表达和35S:KNAT7/knat7植株花序茎染色的切片,并且测量导管、木质部纤维和束间纤维细胞壁的厚度,发现knat7突变体具有向内坍塌的导管分子,而35S:KNAT7/knat7植株的导管分子与野生型植株相似,knat7突变体的导管分子和木质部纤维的细胞壁变薄,而束间纤维的细胞壁变厚,KNAT7过量表达植株具有相反的表型。
  (4)利用实时定量PCR测量野生型、knat7和KNAT7过量表达植株中IRX9、IRX9-L、IRX10、IRX10-L、IRX14、IRX14-L、FRA8和F8H的表达量,结果表明knat7突变体的IRX9、IRX10和FRA8的表达量降低,KNAT7过量表达植株的IRX9、IRX10、IRX14-L和FRA8的表达量增加。
  (5)用截短的IRX9的启动子进行转录激活实验,确定 IRX9启动子中可能的KNAT7结合区域,接着用生物素标记的约50 bp的IRX9启动子片段进行凝胶迁移滞留实验,证明KNAT7能够直接结合IRX9的启动子。
  这些实验结果表明MYB20、MYB85、MYB103和ERF72很可能正调控木聚糖合成,KNAT7至少通过激活 IRX9、IRX10和FRA8表达正向调控木聚糖合成,而且直接激活IRX9表达。
[硕士论文] 樊彪
遗传学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:根作为植物的主要器官之一,其作用主要包括固定和吸收无机营养物质等。植物根的生长发育主要依赖于根尖分生组织(Root apical meristem,RAM)。RAM主要由一些未分化的干细胞组成,干细胞的分裂和分化对于维持分生组织的形态建成和生理功能有着重要的作用。
  细胞分裂素(cytokinin,CK)是一类主要的内源植物激素,研究表明,其可以通过控制细胞分裂调控RAM的形态建成;同时,细胞分裂素也可以通过与生长素之间的互作影响着这一进程。但细胞分裂素和根生长发育的具体调控机制仍未清晰。
  AtABCG14作为细胞分裂素的转运蛋白,在根部合成的tZ类细胞分裂素的向顶长距离运输中发挥着重要作用。当植物缺失AtABCG14时,根中的tZ类细胞分裂素会过度积累,导致突变体出现短根表型。针对这一表型,通过分子生物学、遗传学、细胞学以及转录组分析等试验方法去解析细胞分裂素对根部生长发育的影响及其分子机理。获得的实验结果如下:
  (1)atabcg14突变体较野生型植株相比,根部表现出明显的细胞分裂素的积累,说明atabcg14突变影响了细胞分裂素的长距离运输。
  (2)atabcg14突变体的根部明显缩短,证明过量的细胞分裂素抑制根的生长发育。
  (3)GUS染色表明CYCB1;1∷GUS在atabcg14突变体中的表达量与在野生型植物中比较明显降低,与用6-BA外源处理CYCB1;1∷GUS/WT相一致。此外,atabcg14突变体的RAM的细胞数目明显减少,证明细胞分裂素影响了RAM的细胞数目,进而影响RAM的分裂活性。
  (4)在atabcg14突变体中,生长素相关基因DR5驱动的GUS基因表达量与野生型相比同样明显降低;同时,生长素运输相关基因的GFP荧光强度出现变化,显示为PIN1,PIN2的信号明显下调,PIN7的信号明显上调。证明细胞分裂素能够影响生长素在根中的运输,从而影响生长素在RAM的分布。
  (5)RNA-seq结果分析表明,atabcg14突变体中生长素氧化相关基因DAO2的表达量明显上调,后期qPCR的结果对该结果进行了确认。说明细胞分裂素能够激活DAO2的表达,促进生长素的氧化过程。
  同时,有研究证明AtABCG14是细胞分裂素长距离运输中的关键组件,但是关于AtABCG14基因的转录调控机制的研究尚未清晰。因此,对AtABCG14的启动子进行研究,同时尝试筛选能够调控AtABCG14在不同组织表达的转录因子。获得的实验结果如下:
  (1)当截短AtABCG14的启动子时,其驱动GUS基因表达部位发生了明显变化。同时,当在atabcg14突变体中转入不同长度启动子驱动的AtABCG14进行回复实验时,发现atabcg14突变体的回复情况各不相同,证明在AtABCG14的启动子中含有关键作用元件调控其在不同组织中表达。
  (2)通过酵母单杂交和荧光双分子分析,筛选到7个候选转录因子。
[硕士论文] 赵婷婷
植物学 合肥工业大学 2017(学位年度)
摘要:细胞程序性死亡(PCD)在植物应对非生物和生物胁迫的反应中起着至关重要的作用。其中,超敏反应是植物中最典型的PCD事件之一,并且这一过程往往是由活性氧(ROS)介导。大量的研究报道过氧化氢酶2(CAT2)负调控拟南芥叶片H2O2诱导的PCD,但是植物体内调控CAT2且介导叶片PCD的关键因子还不清楚。最近的研究发现NCA1作为分子伴侣对于维持细胞内CAT活性至关重要。
  因此,本研究利用遗传学,生理学和生物化学等多种手段,比较分析了NCA1,CAT2和细胞死亡之间的关系。我们的结果发现,与cat2突变体类似,nca1突变导致了细胞内CAT活性急剧下降、氧化还原状态紊乱及生长抑制,但是却显著地抑制了拟南芥H2O2诱导的PCD。而且,进一步分析发现nca1中的水杨酸明显积累但水杨酸信号途径和PCD却没有明显被激活。此外,遗传学证据表明cat2nca1双突变体激活了水杨酸信号通路,并恢复了叶片细胞死亡的表型。综上所述,我们推测NCA1通过调控H2O2稳态和信号多重途径介导H2O2诱导的PCD。
  拟南芥中含有CAT1、CAT2及CAT3三个基因家族,为了全面分析CAT对H2O2诱导的PCD的影响,为此,本文第二部分利用CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除CAT1,CAT3基因的多靶点双元载体,并转化到cat2突变体中,以期获得cat1 cat2 cat3三突变体。该突变体将会为深入分析CAT调控H2O2的信号转导机理提供重要的遗传材料。
[硕士论文] 丁炳莉
遗传学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:细胞分裂素是一类调控植物生长发育的重要激素,与叶片衰老、植物抗病及非生物胁迫等方面有着密切的联系。相对于其合成代谢及信号转导方面的研究,人们对于细胞分裂素转运的分子机制研究尚不够深入。有研究报道,AtABCG14和AtPUP14两个转运蛋白能够在植物体内转运细胞分裂素,其中,AtABCG14主要负责细胞分裂素的向顶运输,AtPUP14负责细胞分裂素的胞内运输。AtABCG14作为首个参与细胞分裂素长距离运输的转运蛋白,在植物体内调控根部产生的细胞分裂素向顶运输。AtABCG14基因主要在拟南芥的根部表达强烈,在地上组织(主要在叶脉和花序部位)也有明显的表达。于是推测AtABCG14在地上组织也可能具有一定的生物学功能。
  本研究主要利用野生型Co1-4与atabcg14突变体嫁接植物的表型分析,结合AtABCG14基因在地上组织的组织表达定位,同位素示踪,综合运用遗传学、分子生物学和发育生物学等研究手段,阐明AtABCG14基因在地上组织的生物学功能。具体研究结果如下:
  (1)Col-4与abcg14突变体嫁接,abcg14突变体作为接穗,Col-4作为砧木时,地上组织的表型并不能恢复,说明AtABCG14在地上组织具有生物学功能。
  (2)对嫁接体地上组织细胞分裂素响应基因的相对表达量分析以及ARR5∷GUS报告基因的表达量的检测,结果表明,在abcg14突变体作为接穗,Col-4作为砧木时,AtABCG14在地上组织缺失显著降低细胞分裂素响应基因的表达水平,进一步证明AtABCG14在地上组织具有生物学功能。
  (3)AtABCG14在地上组织的组织表达:通过对ABCG14P(ro)∷GUS转基因植株的叶片进行树脂切片以及组织特异性启动子转基因材料的互补实验,说明AtABCG14在地上组织主要在韧皮部表达。
  (4)利用C13-tZ和C14-tZ外源吸收实验,分别检测嫁接体地上组织中同位素标记的细胞分裂素含量和类别。该结果充分说明abcg14突变体作为接穗,Col-4作为砧木时,细胞分裂素能够通过维管组织运输到地上组织。
  (5)观察ARR5∷eGFP/WT与ARR5∷eGFP/abcg14的嫁接体根部荧光强度以及根部ARR5的表达量的检测。该结果表明突变体作为接穗,野生型作为砧木时,地上组织细胞分裂素无法分配而达到饱和状态,根部细胞分裂素积累,导致嫁接体荧光强于野生型。
  综上所述,本研究证明AtABCG14在拟南芥地上组织参与细胞分裂素的分配。此外,当地上组织积累的细胞分裂素无法分配时,地下组织会积累细胞分裂素,初步推测其在地上组织的功能影响细胞分裂素的向顶运输。
[硕士论文] 仝贝
生物工程 西北大学 2017(学位年度)
摘要:在动物细胞凋亡的内源途径中,线粒体处于中心位置,当其中的细胞色素C释放到细胞质后,细胞发生凋亡现象。在植物的叶绿体中,存在着具有相同电子传递功能的蛋白—细胞色素C6和功能相似的质体蓝素PC。推测,在植物细胞中,PCs和Cytc6可能是植物程序性细胞死亡的重要影响因子。本研究通过构建多个稳定型和诱导型两类表达载体,以野生型拟南芥Columbia为研究背景,通过转基因技术使PCs和Cytc6在细胞质中定位表达,观察比较植株表型来研究PCs和Cytc6在植物程序性细胞死亡中的功能。主要取得以下结果:
  (1)成功构建12种稳定型表达载体。从Tair数据库中找到PC1、PC2和Cytc6三个蛋白的CDs全长序列,设计引物并获得基因片段后构建在质粒载体pB003上的组成型启动子35S后。其中表达目的基因全长的重组载体有3种,表达产物在前导肽的作用下进入叶绿体;表达目标蛋白成熟肽的重组载体有3种,表达产物因为缺乏前导肽而定位于细胞质中。另外,在所有目的基因后加上GFP构建融合蛋白,便于后续分析蛋白定位。经测序验证正确后即成功获得12种稳定表达载体。
  (2)成功构建7种诱导型表达载体。从Tair数据库中找到PC1、PC2和Cytc6三个蛋白的CDs全长序列,设计引物并获得相应目的基因的成熟肽,构建在质粒载体pTA7002上的诱导型启动子GAL4后(Pind),在诱导剂DEX的作用下使目的蛋白定位于细胞质中表达;另外,在所有目的基因后加上GFP构建融合蛋白,便于后续分析蛋白定位;用空载体pTA7002EV作为对照。经测序验证正确后即成功获得7种诱导型表达载体。
  (3)筛选得到T2代转基因植株。将所有重组质粒转入农杆菌GV3101中,通过转基因技术转入野生型拟南芥中获得转基因植株,对其进行抗性筛选、DNA水平、蛋白水平等一系列鉴定,得到转基因株系T2代。
  (4)地塞米松DEX对pTA7002相关转基因植株的诱导。DEX是一种糖皮质激素,用DEX诱导pTA7002系列转基因植株后,运用pTA7002载体具有的GVG系统的特性,使目的基因在特定组织特定时期表达蛋白。本实验所用DEX浓度为15μM。
  (5)水杨酸SA对col和突变体pete1、pete2中单线态氧的验证。SA可以使植物叶片中的单线态氧含量升高,导致程序性细胞死亡。用5mM SA处理拟南芥叶片后观察表型,三种植株的程序性死亡程度是:col>pete2>pete1,重复三次对植物死亡率进行统计,结果显著。表明这三种植物在受到SA胁迫后活性氧的增加可能和PC含量有关。
  (6)观测各种转基因植株的表现型,记录它们的死亡状态。将目的蛋白定位于叶绿体中表达和定位于细胞质中表达蛋白的各种转基因植株的死亡数没有明显的差别,但它们死亡的比例都高于野生型,初步认为将Cytc6、PC1和PC2在叶绿体或细胞质的高表达可能会提高植物细胞死亡的频率。但引起细胞死亡的因素很多,由于时间关系,不能排除各种环境因素以及表达系统本身的影响,需要更为细致的研究。
  (7)鉴定得到基因Cytc6T-DNA插入的突变体种子。从拟南芥突变体资源中心(NASC)购买了三种Cytc6T-DNA插入的突变体种子Salk_060652、Salk_060643和Salk_011266c,种植后对杂合子植株从DNA、RNA水平鉴定后,得到纯合子植株,分别是插在外显子上的Salk_060652和插在内含子上的Salk_011266c。
  (8)Cytc6蛋白抗体的制备。通过基因工程技术将Cytc6的成熟肽目的基因构建在带有GST标签的诱导型表达载体pGEX4T.3上,通过诱导GST基因的表达,产生GST融合蛋白,利用亲和纯化的方法将融合蛋白提取纯化后即获得目的蛋白,后续进行免疫抗原设计、兔免疫抗体制备等实验。
  综上,发现不论是在叶绿体中还是细胞质里,过表达PC1、PC2和Cytc6,会提高植物细胞死亡的频率,但其作用机制需要更为细致及深入的研究。另外,还鉴定了Cytc6纯合敲除突变体植株,纯化了Cytc6蛋白,为后续制备Cytc6抗体及研究Cytc6生物学功能和作用机制奠定了基础。
[博士论文] 于倩倩
细胞生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:植物根尖干细胞微环境对于植物根的生长发育具有重要作用,其中根尖干细胞是产生根中不同组织细胞的源泉,而位于干细胞中间的静止中心(QuiescentCenter,QC)细胞对于干细胞活性的维持具有十分重要的调控作用。目前研究发现的参与根尖干细胞微环境维持的调控途径主要包括SCR/SHR调控途径、PLT调控途径、WOX5调控途径、各种激素(生长素、细胞分裂素、乙烯、脱落酸以及赤霉素等)参与的调控途径。然而,参与根尖干细胞微环境维持的其它调控因子目前仍不清楚。因此,我们的研究致力于发现新的参与维持根尖干细胞微环境的调控元件,这对于进一步阐明根尖干细胞微环境维持的调控机制网络具有十分深远的意义。
  本研究以模式植物拟南芥为研究对象,通过Lugol染色,从T-DNA插入突变体库中特异的筛选具有根尖干细胞发育缺陷表型的突变体材料,进行后续研究。在此,通过筛选我们获得了一个新的参与根尖干细胞微环境维持的功能基因APP1(A-P-loop NTPase superfamily Protein)。采用分子生物学、细胞生物学、遗传学及生理学等技术方法,对APP1参与调控根尖干细胞微环境维持的分子机制进行了深入的研究分析。
  Lugol染色的结果发现,app1功能缺失突变体根尖QC细胞发生了明显的纵向分裂,并且远端干细胞(Distal stem cell,DSC)处出现了明显的能够被KI染色的淀粉粒积累,表明失去了干细胞活性。此外,QC特异标记基因QC184在app1突变体中的表达量明显低于野生型,这表明app1突变体中QC的特性受到了破坏。
  为了阐明其作用机理,我们进一步检测APP1表达模式及其编码蛋白的亚细胞定位。对pAPP1∷GUS转基因系的GUS染色结果表明,APP1主要在拟南芥的根中表达,而且主要集中在根尖处;此外,激光共聚焦观察pAPP1∷APP1-GFP转基因株系的结果发现,APP1蛋白也是主要在根尖处表达,暗示APP1可能参与根尖生长发育的调控。激光共聚焦观察结果显示,pAPP1∷APP1-GFP绿色荧光蛋白和红色荧光MT-Red标记的线粒体能够重叠,说明APP1蛋白定位于线粒体;另一方面,western blot结果显示,在pAPP1∷APP1-GFP转基因植株的线粒体蛋白中能够同时检测到APP1蛋白和线粒体特异标记COXⅣ蛋白,进一步说明APP1蛋白定位于线粒体。这也暗示APP1可能通过影响线粒体的功能参与根尖干细胞微环境的维持。
  体外ATP酶活测定结果说明,APP1具有ATP水解酶活性。为了阐明线粒体定位且具有ATP水解酶活性的APP1是否影响ROS稳态的维持。我们通过荧光染料H2DCFDA和化学染料DAB以及NBT检测app1突变体中ROS的水平。结果显示,在app1中的荧光强度或化学染色水平要明显低于野生型,表明app1中的ROS水平显著降低;此外,与野生型相比,app1突变体中线粒体O2-的标记marker Mito-cpYFP也明显低于野生型对照。并且H2O2含量的测定结果显示app1-1和app1-2突变体中H2O2的含量明显低于Col-0对照。这些结果说明APP1能影响根尖ROS的含量,包括H2O2含量和O2-含量。
  进一步分析APP1影响根尖ROS水平的机制,我们发现在app1突变体中第Ⅲ类过氧化物酶(Peroxidases,PER)家族中的PER11和PER55基因的表达受到明显诱导,说明app1突变体中较低的ROS水平可能与高表达的过氧化物酶PER11和PER55参与ROS的清除有关。此外,app1突变体中线粒体复合体Ⅰ的活性,即NADH-CoQ还原酶的活性与野生型相比明显降低,这与app1突变体中ROS水平低是相一致的。
  为了进一步验证app1突变体中QC细胞分裂和DSC分化的加快是否是由于app1突变体中较低的ROS水平引起的,我们对app1突变体进行外源施加H2O2及O2-的供体。结果显示,无论是通过MV处理升高O2-的水平,还是通过直接外源施加H2O2,都能够恢复app1突变体中QC细胞分裂和DSC分化加快的表型。此外,通过外源施加ROS的合成抑制剂DPI和清除剂catalase降低ROS的水平,则能够模拟app1突变体中的低ROS水平导致的QC细胞分裂和DSC分化的表型,破坏根尖干细胞微环境功能的维持。
  为了深入了解ROS稳态是如何影响根尖干细胞微环境的,我们对高ROS水平下QC细胞和根尖DSC细胞的表型进行了研究。我们发现高浓度的H2O2也会促进QC细胞的分裂以及DSC的分化;此外,APP1的超表达转基因株系35S∷APP1中ROS含量明显升高,并且表现出较高的QC分化率和DSC分化率的表型。以上结果说明,无论是内源升高ROS水平还是外源升高ROS水平都会加速QC细胞的分裂和DSC的分化,对根尖干细胞功能造成一定程度的破坏。
  GRAS转录因子家族的SCR(SCARECROW)和SHR(SHORTROOT)以及PLETHORA转录因子家族的PLT1和PLT2对于维持QC细胞的功能、干细胞的稳定具有重要的调控作用。为了研究APP1参与调控根尖干细胞的机制,我们对app1中SCR、SHR、PLT1以及PLT2的表达量进行了检测。qRT-PCR、细胞生物学以及western blot的结果均显示app1变变体根尖中SCR和SHR在转录水平和蛋白水平的表达量都明显降低,而PLT1和PLT2的表达量无明显变化,暗示SCR和SHR可能作为APP1的下游基因共同参与APP1对于根失干细胞微环境维持的调控。
  已有的研究表明,生长素参与根尖干细胞微环境的维持。我们发现DR5rev∷GFP和DR5∷GUS在app1-1和app1-2突变体中的表达量与野生型Col-0中相比无明显变化,说明app1突变体中生长素信号没有发生明显改变,暗示APP1对于根尖干细胞微环境的调控机制可能是独立于生长素调控途径的。
  进一步研究ROS稳态参与根尖干细胞微环境维持的分子机制,我们分析了不同ROS浓度下调控干细胞功能的转录因子SCR、SHR、PLT1以及PLT2表达量的变化。结果显示,在高ROS浓度时,PLT1和PLT2的表达量受到明显下调,而SCR和SHR的表达量没有明显变化;而在低ROS浓度时,SCR和SHR的表达量明显降低,PLT1和PLT2的表达量无显著变化,这与app1突变体中转录因子的表达情况是相一致的。这暗示高ROS水平和低ROS水平对于根尖干细胞微环境的调控可能是通过调控不同转录因子的表达,通过不同的信号通路实现的。
  综上所述,我们的研究发现APP1主要是通过影响根中ROS稳态的维持,从而下调SCR和SHR的表达,参与根尖干细胞微环境的维持。此外,我们还发现植物体内存在一个最适的ROS浓度,维持根尖干细胞的正常功能,过高的ROS水平或过低的低ROS水平都可能导致根尖干细胞微环境的破坏。
[博士论文] 喻达时
分析化学 湖南大学 2016(学位年度)
摘要:植物要按照一定的时序进行生长发育,需要精确并且及时合成相关功能蛋白质,同时也需要及时将已完成使命的蛋白质进行清除,蛋白质的降解同样至关重要。泛素/26S蛋白酶体通过选择性的降解功能蛋白质,广泛参与激素信号转导、细胞周期调控、胁迫应答等生长发育过程的调节,几乎参与了生命过程中所有环节的调控。26S蛋白酶体(26S proteasome)在植物细胞中广泛存在,是一个巨大的多亚基复合体,属于ATP依赖的蛋白酶,由19S调节颗粒(regulatory particle,RP)和20S核心颗粒(core protease,CP)两部分组成。19S调节颗粒需要ATP提供能量来帮助特异性识别被底物,去除底物的泛素共价键,进行解折叠,并且打开通道指引去折叠多肽转移到20S核心颗粒内进行降解。正是由于19S调节颗粒对底物识别的特异性,使得泛素/26S蛋白酶体可以精细的调控生长发育过程中的各个环节。目前大部分19S调节颗粒亚基具体功能尚不清楚,只有极少数被报道参与胁迫应答反应,且相关分子机制并不十分清楚,对19S调节颗粒各亚基的功能研究对揭示相关分子机制具有重要的意义。本研究中,我们通过以RPN1a为诱饵筛选酵母拟南芥全基因组质粒文库,筛选到ABA(Abscisic acid)信号途径中的关键基因ABI1与RPN1a相互作用,鉴定了RPN1A T-DNA插入突变体植株。通过ABA胁迫处理证明RPN1a参与负调控ABA信号途径;在突变体鉴定过程中观察到,RPN1A T-DNA插入突变体植株叶片表皮毛密度增大,进一步研究发现插入突变体植株叶片和主茎上表皮毛密度增大和分支数增加。本论文对RPN1a在ABA信号途径,以及表皮毛发育调控中的功能进行了研究,具体结果如下:
  (1)在Tair数据库中搜索RPN家族成员进行生物信息学分析,发现RPN家族成员呈染色体定位数目不等分布,成员之间氨基酸序列相似度低,基因结构的外显子和内含子数目变化不定不具有保守性,进化关系较远。RPN1a蛋白不含信号肽序列,没有明显的疏水区域,没有跨膜结构域不是膜蛋白。与生物信息学分析结果相对应,由RPN1a自身启动子驱动表达的带有绿色荧光蛋白质标签的RPN1a融合蛋白在细胞中各处表达。
  (2)启动子区域的转录调控元件分析发现RPN1a基因含有大量激素相关以及胁迫相关转录调控元件,说明RPN1a可能参与植物胁迫应答。以RPN1a为诱饵筛选拟南芥全基因组质粒文库,筛选到ABI1与RPN1a相互作用。通过酵母双杂交以及双分子荧光互补实验(BiFC)证实RPN1a可与ABI1相互作用,并且通过酵母双杂交实验发现RPN1a全长不能够与PYR1,PYL1,RCAR1,ABI2,HAB1,PP2CA,SnRK2.2,SnRK2.3以及OST1发生相互作用,说明RPN1a可通过与ABI1的相互作用参与ABA信号的调控。
  (3)RPN1a的mRNA的表达水平和蛋白质水平均受到ABA抑制,rpn1a突变体具有ABA超敏感表型,在ABA胁迫下萌发以及根的伸长受到抑制、气孔关闭更快,由自身启动子驱动的RPN1a融合蛋白在保卫细胞中的表达比周围细胞更强,且ABA信号途径中关键基因的表达量升高,说明RPN1a参与ABA信号途径的负调控。进一步研究发现ABI5在rpn1a突变体中积累,但是RPN1a不能与ABI5发生直接的相互作用,表明RPN1a通过与ABI1的相互作用影响ABI5蛋白质的丰度来参与ABA信号的调控。
  (4)外源性GA(Gibberellic acid)以及CK(Cytokinin)可以诱导拟南芥表皮毛细胞的形成,ZFP6(锌指蛋白质6)通过整合赤霉素和细胞分裂素信号调节表皮毛的起始,由RPN1a自身启动子驱动的RPN1a-GFP蛋白质在处于起始分化阶段以及分支的形成阶段的表皮细胞的细胞核和细胞质中的表达比周围细胞更为强烈,外源添加的GA和6-BA可抑制RPN1a的转录,结合表皮毛细胞的形成和表皮毛细胞分支形成的关键基因的转录水平分析结果说明:RPN1a通过抑制ZFP6基因的表达,调控表皮细胞起始分化;通过调控ZFP6,PYM和KAK基因的表达参与调控表皮毛分支形成。
[博士论文] 马春丽
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:钙(Calcium,Ca)是植物生长发育的大量元素,也是重要的第二信使。本实验以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana,At)为实验材料,研究Ca2+分布和Ca2+信号相关的两方面内容。第一部分研究内容是:在高钙环境下,缺失环核苷酸门控离子通道2(Cyclic nucleotide-Gated Channel2,CNGC2)基因cngc2突变体的叶片质外体Ca2+积累对其生理功能的影响。第二部分研究内容是:拟南芥短肽受体2(AtPeptide Receptor2,AtPEPR2)介导拟南芥短肽(AtPeptide1,AtPep1)诱导的根中细胞质Ca2+升高,进而抑制谷氨酰胺外排基因(GlutamineDumper,GDU)表达。
  (1) Ca是所有细胞生长发育的必需矿质元素,对于植物细胞而言,植物根细胞吸收Ca2+,并通过木质部向上运输到叶片中,进而在叶片中分布,对其分布机理的研究甚少。我们对缺失CNGC2基因的cngc2突变体进行研究,发现在0.1 mM Ca2+浓度下,cngc2与野生型植物(Columbia ecotype,Col-0)长势一样。在10mM Ca2+浓度下,当cngc2从根系吸收更多的Ca2+后,cngc2叶片细胞外空间Ca2+外溢,而后导致活性氧积累,成熟叶片边缘黄化,出现死亡斑点和生长受抑制的现象,并且死亡斑点主要分布在小叶脉周围区域。通过构建启动子连接β-葡萄糖苷酶报告基因(Glucuronidase,GUS)进行组织特异性分析,发现拟南芥CNGC2基因主要表达在叶片小叶脉周围区域。通过原子吸收方法测定总Ca含量,发现cngc2突变体比Col-0野生型叶片总Ca含量低,但细胞壁中与果胶结合的Ca含量高于Col-0,这也说明cngc2更多的Ca2+积累在质外体。当前的报道表明cngc2突变体在非毒力病原菌侵染下没有超敏反应(HypersensitiveResponse,HR),我们使用OD600=0.02的avrDC3000 RPM1+菌液侵染生长在不同Ca2+浓度的水培液中的植物,发现在0.1 mM Ca2+浓度下cngc2有HR反应;10mM Ca2+浓度处理3天,cngc2没有HR反应,表明cngc2没有HR反应是由于Ca2+外溢积累在质外体导致的。Ca2+外溢还导致了cngc2暗周期结束后淀粉的积累,说明Ca2+外溢影响了光合作用暗周期淀粉的降解。
  (2)拟南芥新型短肽受体1(AtPeptide Receptor1,AtPEPR1)和AtPEPR2是富集亮氨酸受体蛋白激酶家族的成员,能够结合一组由短肽前体(AtPROPEP)基因编码的内源肽AtPeps。前人的研究发现AtPEPR2在AtPep1介导的拟南芥叶片初级免疫反应中扮演着重要角色。在本研究中,我们发现缺失AtPEPR基因的缺失型突变体atpepr1和atpepr2有短根表型,AtPEPR1和AtPEPR2部分介导了AtPep1抑制根生长的表型,且在此过程中AtPEPR2的作用强于AtPEPR1。AtPep1引起的细胞质Ca2+浓度的升高部分由AtPEPR1和AtPEPR2介导,AtPEPR2在介导Ca2+浓度升高的过程起主要作用。为了研究AtPEPR2参与的受AtPep1诱导而转录的基因,我们对Col-0和atpepr2进行含有AtPep1处理一个小时和不含有AtPep1处理的根转录组表达谱分析,结果显示AtPep1诱导表达的基因其中75%是由AtPEPR2介导的,2个显著诱导的基因部分依赖于细胞外Ca2+的升高。在筛选基因过程中,谷氨酰胺外排基因引起了我们的重视,拟南芥基因组编码7个AtGDUs,该基因编码氨基酸外排转运体。AtPep1完全依赖AtPEPR2调控的下调基因程度最大的10个基因中,AtGDU2,3,5占其中3个。通过AtGDU3 GUS活性分析,AtPep1处理强烈抑制了根中AtGDU3的活性,螯合细胞外Ca2+能够缓解AtPep1对AtGDU3的抑制作用。过量表达AtGDU3拟南芥具有短根表型,但对AtPep1抑制短根现象不敏感。总体来说,本研究揭示了AtPEPR2在AtPep1根延伸以及根信号转导作用中扮演着重要角色。
  综上所述,本实验一方面研究植物叶片对Ca2+的分布,为Ca2+分布与Ca2+吸收的关系研究打下基础;另一方面,AtPep1是从拟南芥体内提取出来的内源短肽,外源加入纳摩尔级浓度的AtPep1通过AtPEPR2抑制拟南芥根生长,说明AtPep1可能是一种新型激素,参与植物生长和发育。
[硕士论文] 秦亚娟
林学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:植物的维管组织是从原形成层和形成层分化而来,分生组织的干细胞向外分化为韧皮部,向内分化为木质部。CLE41多肽通过受体激酶PXY的作用,促进维管干细胞增殖。TDIF-PXY途径在维管发育过程中起重要作用,本实验主要针对PXY及其同源基因的表达分析,探究多种基因的关联作用对维管发育的影响。
  拟南芥PXY和PXL3、PXL4编码与CLV1相似的LRR-RLK,他们可能存在着功能上的重叠或冗余。研究PXL3、PXL4的过表达株系发现PXL基因对维管组织中分生组织细胞的分化有一定影响,抑制形成层细胞分化为木质部细胞。PXL4在影响分生组织分化的途径中可能依赖于PXY。虽然PXY和PXL3、PXL4同属于一个亚家族,但PXL3、PXL4的过表达都不会对pxy突变体的表型有促进或弥补的功能。
  拟南芥中有许多的基因在维管组织表达,并与分生组织的细胞命运相关。除了上述的PXY和PXL基因,还有ATHB-8、WOX4、WOX14,都与分生组织的分化相关。ATHB-8调节(原)形成层促进分化,影响木质部细胞的产生;ATHB-8能响应TDIF的调节,施加TDIF能促进ATHB-8的表达。本文研究发现,ATHB-8的表达需要PXY和PXL3、PXL4的协作,而且PXY和PXL3、PXL4间还存在着共同作用。WOX4、WOX14作为TDIF-PXY途径的下游元件调节形成层细胞的分化,在pxy突变体中WOX4、WOX14表达量只有少量下降。本文研究发现WOX4的表达对PXL3、PXL4有依赖性,但WOX14没有。
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