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[硕士论文] 曾洁
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:DCE-01是一株“广谱性”、“高效性”脱胶菌,对多种草本纤维原料均能起到很好的脱胶作用,且6.0h能独立完成苎麻脱胶,不需要其他化学方法后处理补充。其脱胶功能的广谱性和高效性在国内外都属于领先地位。本文以DCE-01菌株为研究对象,从DCE-01菌株中克隆出3个关键脱胶酶基因,以2种不同的排列方式将这3个关键脱胶酶基因串联起来,分别在大肠杆菌和DCE-01菌株中表达,获得结果如下:
  1.根据全基因组测序注释结果设计特异引物,从DCE-01菌株克隆出关键脱胶酶基因片段3个:果胶酶基因(pelE)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man)。经测序及生物信息学分析:pelE核酸序列长1185bp,编码395个氨基酸,预测蛋白分子量为43.8kDa;xyn核酸序列长1251bp,编码416个氨基酸,预测蛋白分子量45.74kDa;man核酸序列长1137bp,编码378个氨基酸,预测蛋白分子量41.85kDa。
  2.通过设计特异引物和PCR扩增获得带有特定限制性酶切位点的关键脱胶酶基因(PelE基因、Xyn基因和Man基因)片段,经酶切并与表达载体pET-28a连接,构建成单基因表达重组子,同时,按照PXM、XPM的顺序串联排列在表达载体pET-28a的MCS区段上,构建成多基因共表达重组子,然后,将单基因表达重组子和多基因共表达重组子导入BL21菌株中,成功构建PelE、Man和Xyn的单基因表达重组菌株(pET-28a-P/BL21、pET-28a-M/BL21和pET-28a-X/BL21)和多基因共表达重组菌株(pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21)。
  3.将构建的重组子转入到DCE-01(关键脱胶酶基因来源菌株)中,成功获得单基因同源表达的重组菌株3个,包括pET-28a-P/DCE-01、pET-28a-X/DCE-01、pET-28a-M/DCE-01,多基因同源共表达的重组菌株2个,即pET-28a-PXM/DCE-01(或DCE01PXM)和pET-28a-XPM/DCE-01(或DCE01TM)。
  4.对BL21系列重组菌株的酶活测定结果显示:(1)pelE重组菌株所表达PelE酶活为471.97U/mL,而把pelE排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21时,对应的PelE酶活分别是532.68U/mL和121.43U/mL。(2)xyn重组菌株所表达Xyn酶活为44.32U/mL,而把xyn排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-XPM/BL21和pET-28a-PXM/BL21时,对应的Xyn酶活分别是47.43U/mL和31.42U/mL。(3)man重组菌株所表达Man达16882.86U/mL,而将man排在远离启动子位置形成的pET-28a-PXM/BL21与pET-28a-XPM/BL21时,对应的Man酶活分别为645.21U/mL和230.83U/mL。因此,可以推论:(1)用于构建多基因共表达体系的载体的启动子对pelE的表达效果有显著促进作用;(2)构建多基因共表达体系时,目的基因的表达效果与插入位点离启动子的距离呈负相关,即距离越远效果越差;(3)在多基因共表达体系中,man的表达效果受pelE插入位点的影响突出。
  5.以DCE-01和DSM18020(模式菌株)为对照,对多基因同源共表达重组菌株纯培养液的酶活测定结果显示:(1)重组菌株DCE01PXM、DCE01XPM的PelE酶活性分别是DCE-01菌株的2.77倍、1.01倍和DSM18020菌株的10.91倍、4.11倍;(2)重组菌株DCE-01PXM、DCE-01TM的Xyn酶活性分别是DCE-01菌株的1.28倍、1.82倍和DSM18020菌株的5.61倍、8.08倍;(3)重组菌株DCE-01PⅪM、DCE-01XPM的Man酶活性分别是DCE-01菌株的1.99倍、1.01倍和DSM18020菌株的6.16倍、3.16倍。由此可以得出结论:采用基因串联方法将来自DCE-01菌株的关键脱胶酶基因(pelE、xyn、man)整合到表达载体(pET-28a)中形成重组子,无论是导入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)还是导入DCE-01菌株都获得了成功表达,而且多基因同源共表达重组菌株表达PelE、Xyn、Man的酶活都高于DCE-01菌株。
  6.液相色谱分析DCE-01、DSM18020、DCE-01PXM、DCE-01XPM菌株用于苎麻脱胶发酵液的结果表明:DCE-01PXM菌株的发酵液中检测到的单糖含量要明显高于其他几个菌株,DCE-01PXM菌株发酵液中的单糖含量略高于DCE-01菌株,而DCE-01菌株脱胶发酵液的单糖含量要明显高于DSM18020菌株。这一结果与上述酶活检测结果基本一致,说明将DCE-01关键脱胶酶基因按照PXM的顺序串联排列形成重组子后导入DCE-01中进行多基因同源共表达的方法,能在一定程度上提升DCE-01的脱胶功能。
[硕士论文] 李贺丹
生物化学与分子生物学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是重要的工业微生物,已经被广泛用于各种氨基酸的工业化生产。目前,代谢工程育种已成为C.glutamicum菌种改造的主要方式。但是C.glutamicum的低转化率成为代谢工程育种的主要障碍之一。影响C.glutamicum转化率的一个重要因素是C.glutamicum菌株中存在限制修饰系统。限制修饰系统(Restriction and Modification system)是指由限制性内切酶和甲基转移酶所组成的单亚基或多亚基的复合酶系统。这两种酶通常是成对出现的,它们具有相同的DNA识别位点,但功能是相反的。限制性内切酶通常作用于DNA的特定位点,造成DNA链的断裂;而甲基转移酶通过对DNA序列的甲基化修饰使得限制性内切酶对该位点不再起作用,从而保护了菌体免受噬菌体和外源DNA的入侵。C.glutamicumATCC13032是C.glutamicum的模式菌株,由R.cglⅠ,M.cglⅠ和H.cglⅠ基因组成的cglⅠ限制修饰系统严重影响其外源DNA的转化效率。为解决C.glutamicum转化率低的问题,本文进行了通过M.cglⅠ基因的染色体整合构建E.coli中间宿主菌的研究;为了解决限制性内切酶基因表达困难的问题,本文进行了严谨控制型表达载体的构建,并对R.cglⅠ进行了表达;本文还探索了H.cglⅠ基因的可替代性。主要研究成果如下:
  构建了用于基因敲除/敲入的同源重组载体pAU4-Larm-M.cglⅠ-cat-Rarm。选择E.coli染色体gal操纵元3个结构基因gatE(差向异构酶),galT半乳糖转移酶)和galK半乳糖激酶)中的galT基因作为待替换序列。左臂Lram选自gaiT基因的下游区域,包括gaiT3'末端119bp的DNA序列和终止密码子后的0.79kb的DNA序列。右臂Rarm选自gait基因的上游区域,包括gaiT5'端147bp的DNA序列和gaiT的起始密码子前0.85kb的DNA序列。cat基因用作E.coli整合体的选择标记。通过连续克隆操作实现质粒pAU4与同源左臂Larm、同源右臂Rarm、cat基因和M.cglⅠ基凶的连接。
  构建了大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌株E.coli AU1。将来自于C.glutamicumATCC13032菌株cglⅠ限制修饰系统中编码甲基转移酶的M.cglⅠ基因通过同源重组整合到E.coli TG1基因组上进行表达。通过将不同来源的质粒电转化C.glutamicum ATCC13032来验证M.cglⅠ甲基化对转化率的影响,抽提自E.coli TG1的质粒pAU4转化效率为1.80土0.21×102cfu/μg质粒DNA,而抽提自E.coli AU1的pAU4转化效率达到5.22±0.33×106cfu/μg质粒DNA。结果表明,E.coli AU1能够赋予质粒特异性的M.cglⅠ甲基化模式,使抽提自E.coli AU1的质粒对R.cglⅠ限制性内切酶有抗性并能高效转化C.glutamicum ATCC13032菌株中。
  构建了严谨控制型E.coli表达载体pAU10。该表达载体利用高效可控制的T7-LacO启动予/操纵子和T7启动子上游的强转录终止子rrnBT2的组合来严格控制极毒基因的转录。此外,与T7启动子方向相反的trp启动子/操纵子产生的反义RNA能阻断渗漏mRNA的翻译。在未添加IPTG和L-色氨酸的情况下,T7启动子高度抑制极毒基因的转录,而trp启动子产生反义RNA,严格阻遏极毒基因的渗漏表达。在培养基中添加IPTG和L-色氨酸后,T7启动子开始有效转录极毒基因,而L-色氨酸的存在使trp启动子关闭不产生反义RNA,这保证了载体在E.coli中高效表达极毒蛋白质。在E.coli中成功表达了限制性内切酶BamHI,表明pAU10是一个优秀的用于表达极毒基因的表达载体。
  构建了重组质粒pAU10-R.cglⅠ,将重组质粒转化至E.coli JM109(DE3)表达菌株中进行表达。表达后的蛋白质经Western Blot检测大小为40KDa,表明在E.coli中成功表达了限制性内切酶R.cglⅠ。
  pAU4-R.cglⅠ重组质粒转化E.coli Top10实验,结果并无转化子生长。表明E.coli中具有H.cglⅠ类解旋酶的DEAD家族同源蛋白,其同家族蛋白亦能协助R.cglⅠ蛋白发挥对外源DNA的限制功能。另外,在E.coli中成功进行了H.cglⅠ基因的表达及纯化。
[硕士论文] 张雪
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:原油是我国主要的能源和化工原料,但超过2/3的原油残留在地下无法被有效开采。利用厌氧微生物,将残余原油转变为甲烷进行“生物气”开采,是近年国内外研究的前沿课题。石油烃作为原油的主要组分,其产甲烷降解过程是个多重互营代谢反应(包括石油烃的起始降解、中间代谢产物脂肪酸的氧化等),需要不同功能类型的细菌和产甲烷古菌的参与才能完成。互营代谢是石油烃降解产甲烷过程的限速步骤,由于互营微生物分离培养的难度极大,目前多采用未培养的微生物分子生态学手段,研究石油烃降解产甲烷过程中的功能微生物和产甲烷途径,但是互营烃降解菌等纯培养物的缺失,已经成为限制我们深入了解厌氧烃降解分子机理的“绊脚石”。
  传统互营菌分离技术的分离通量低,而且采用先富集培养,后分离的策略,难以定向分离。本文提出了先分开后培养的新思路,并据此开发出一种多孔板高通量分离技术。利用课题组多年富集的石油烃降解产甲烷菌系为接种物,分离石油烃降解产甲烷过程中的互营微生物等功能菌。取得的结果如下:
  (1)证实了不同温度条件下(25-55℃)的石油烃降解产甲烷菌系都具有互营短链脂肪酸(VFAs:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸)的降解代谢能力;不同温度和VFA富集获得的优势互营菌群不同,高温条件下获得的优势互营菌群主要有Tepidanaerobacter、Thermosyntropha、Thermotoga和Pelotomaculum,中温条件下获得的已知互营菌群为Tepidanaerobacter,低温条件下获得的优势互营菌群主要为Syntrophomonas。此外,通过VFAs富集培养,还发现了大量未培养微生物。
  (2)分离获得厌氧菌265株,其中分类地位明确的菌株共142株,分布于12个科13个属,包含具有互营乳酸代谢功能的Thermodesulfovibrio yellowstonii11株。剩余123株代表潜在新物种18个(16S rRNA基因相似度<97%)。
  (3)鉴定了一株来源于高温互营烃降解产甲烷菌系SK的厌氧发酵细菌SK-Y3T,革兰氏阳性,产芽孢的弯杆状细菌。最适生长条件为0%NaC1、50℃和pH7.0。利用木聚糖时产生木糖。主要的细胞脂肪酸为C150iso,C150anteiso和C170iso;基因组DNA G+C mol%为37.2%。根据生理生化和分子遗传学特征,提出新属新种Petroclostridium xylanilyticum gen.nov.sp.nov。依据SK-Y3T全基因组测序和分析,将clostrdial clusterⅢI划分为4个新属(Thermoclostridium gen.nov.、Hungateiclostridium gen.nov.、Ruminiclostridium gen.nov.、Pseudoclostridium gen.nov.和Petroclostridiun gen.nov.),并与Petroclostridium xylanilyticum gen.nov.一起,被归到一个新科Hungateclostridiaceae fam.nov.。
  (4)鉴定了一株来源于高温互营烃降解产甲烷菌系SK的产乙酸菌SK-G1T,革兰氏阴性,单端生鞭毛,呈不规则的短杆状,大小约0.3-0.5μm×1.5-3.0μm;最适生长条件为55℃,pH7.0-7.5;利用碳水化合物生长的主要发酵产物为乙酸;基因组DNA G+C mol%为43.9%;全基因组测序发现其具有完整的互营丁酸代谢途径。根据生理生化和分子遗传学特征,,将SK-G1T鉴定为新属新种,并命名为Biomaibacter acetigenes gen.nov.sp.nov.。进一步根据全基因组序列特征,提出了一个新科Biomabacteraceae fam.nov.。
[硕士论文] 徐明
生物学 内蒙古科技大学 2017(学位年度)
摘要:背景:餐厨垃圾厌氧消化技术作为一种环保价值很高的处理技术,近年来受到越来越多的关注。餐厨垃圾厌氧消化技术的强化手段越来越多,但大多成本高昂。本文以价格低廉的生物强化手段为基础,在小试批式发酵的基础上优化了餐厨垃圾厌氧发酵工艺,为餐厨垃圾厌氧发酵的工艺控制提供一定的理论基础。
  方法:本研究以餐厨垃圾、玉米秸秆以及奶牛粪和污水处理厂AOA池的污泥为研究对象,试着解决以下科学问题:第一,运用Modified Gompertz模型衡量玉米秸秆堆肥物能否促进餐厨垃圾厌氧消化,并进一步寻找最佳混合发酵比例;第二,通过对比CO2/CH4等发酵参数,判断EM(Effective Microorganisms)菌剂和富里酸(FA),是否是堆肥物强化厌氧消化的关键因素;第三,寻找餐厨垃圾和玉米秸秆堆肥物混合物在不同总固体(TS)有机负荷梯度下厌氧发酵的有机负荷上限。以游离氨氮比总氨氮([NH3]/TAN)作为参数,对比不同C/N和不同有机负荷下TAN向[NH3]的转化水平;第四,将奶牛粪加入餐厨垃圾和堆肥玉米秸秆混合发酵体系,初步优化多元有机固体废弃物厌氧共消化。
  结果:第一,向餐厨垃圾中添加玉米秸秆堆肥物以优化发酵体系C/N并引入EM菌剂,发现餐厨垃圾与玉米秸秆堆肥物在挥发性固体(VS)比8:2条件下,有最高的甲烷产气速率49 mL/g-VS·d-1,甲烷积累量为543 mL/g-VS;第二,EM菌液的添加可以缩餐厨垃圾单一发酵的滞留时间(0.6~0.9 d),并提升氨氮抑制下第12 d和13 d日产气量,添加FA可以缩短氨氮抑制下的滞留时间(0.4 d)。向餐厨垃圾单一厌氧消化体系中同时添加EM菌液和富里酸,能够进一步缩短滞留时间并降低CO2/CH4,在氨氮抑制条件下使最高日产气量峰值比实验对照组提前1 d,并缩短了发酵过程中的异步性;第三,通过餐厨垃圾和堆肥玉米秸秆混合物在不同有机负荷梯度下厌氧发酵,发现有机负荷越高甲烷产气速率越低,发酵时间(T90)越长,并且通过线性回归方程得出最高TS有机负荷为1.3%;第四,添加2%TS有机负荷的奶牛粪后,与对照组相比,pH、TS去除率等环境参数无显著差异,同时甲烷积累产气量提升了21%,甲烷产气速率提高了40%,甲烷积累产气量为4.41 L/Lwork(Lwork为有效工作容积),甲烷产气速率为0.361 L/Lwork·d-1。
  结论:玉米秸秆堆肥物可以加速餐厨垃圾厌氧消化;EM菌液和FA同时添加是堆肥物可以加速厌氧消化的重要因素;餐厨垃圾的有机负荷限制了容积负荷产气量,与C/N的影响相比,有机负荷是影响TAN向[NH3]转化的主要因素;通过向餐厨垃圾厌氧消化体系中添加玉米秸秆堆肥物和奶牛粪,完成了多元有机废弃物共同优化餐厨垃圾厌氧消化体系。
[硕士论文] 景艳军
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种应用性很强的工业微生物菌种,鉴于其较好的重金属抗性,可用于贵金属的浸提、环境污染的治理等领域。铁氧还蛋白作为一种广泛存在并参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌新陈代谢过程诸如铁硫簇组装等重要环节的蛋白质,研究其结构和功能对了解嗜酸氧化亚铁硫杆菌的代谢过程、电子传递及重金属抗性具有重要意义。本研究的内容和结果如下:
  (1)从甘肃省兰州市、白银市和陇南市3个典型矿区采集的样品中分离出四株嗜酸氧化亚铁硫杆菌,一株氧化亚铁钩端螺旋菌。选取生长周期短、菌体富集量大的菌株BYSW1进行后续的研究。首先选取温度、pH值、接种量、能源种类利用单因素实验对其生长条件进行优化。在pH为2,于30℃下接种10%的菌液,BYSW1生长最好,葡萄糖和蛋白胨会明显抑制其生长。
  (2)在NCBI数据库中找出铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ),在BYSW1中扩增出目的片段,连接到pET-32(a),转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)DH5α。自BYSW1扩增出的铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ)与数据库汇总的序列一致性分别为83.92%和85.59%,编码的蛋白与数据库中的序列一致性分别为89.47%和85.59%。
  (3)重组的质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。选取温度、时间、IPTG浓度进行单因素实验,优化重组蛋白的表达条件,并用蛋白质印记法进行验证。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。FdⅠ和FdⅡ分别在25℃下加入0.5mM IPTG诱导6h、25℃下加入0.3mM IPTG诱导6 h表达效果最佳。FdⅠ和FdⅡ分别可用100mM咪唑和50mM咪唑自亲和柱中洗脱下来。
  (4)挑取五种重金属(Cd2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+),对其重金属抗性进行研究;对重金属(Cu2+和Cd2+)驯化前后的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的菌体形态和基因组变化、重组蛋白表达差异、宿主菌体的生长情况进行了研究。结果表明:BYSW1具有较强的重金属抗性,分别在0.04mol/L Cd2+、0.04mol/L Cu2+、0.15mol/L Mn2+、0.08mol/L Ni2+和0.08mol/L Zn2+存在时生长良好,但是高浓度(大于0.04mol/L)的Cu2+和Cd2+会明显抑制BYSW1的生长。Cu2+和Cd2+胁迫后,BYSW1的菌体细胞明显变小,且表面粗糙,但基因组仍然能保持完整。不同浓度、不同种类的重金属胁迫前后,铁氧还蛋白的表达存在显著差异,且Cd2+对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的影响比Cu2+显著;不同浓度、不同种类的重金属对于重组蛋白的表达宿主菌体生长影响不同,0.25mM的Cu2+和Cd2+能明显抑制宿主菌体的生长。
[硕士论文] 陈璐
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种对植物生长及人体健康有着重大危害作用的真菌。误食被黄曲霉污染的食物会出现发热、倦怠和厌食症、腹痛、呕吐、肝炎等慢性肝中毒的症状,长期便会引发肝癌。中国作为粮食生产的大国,所以研究在种植、贮存及运输中,预防黄曲霉污染带来的经济损失与食品安全等问题,具有重要的意义。实验室从南海海绵中筛选出多株黄曲霉拮抗菌株,本论文对其中拮抗活性最强的菌株CL展开研究,取得以下结果:
  从CL的培养特征、形态特征、生理生化和16S rDNA序列分析等方面对该细菌进行鉴定,确定其为芽孢杆菌属,与Bacillus velezensis strain YK50亲缘关系最近,达到99%,命名为Bacillus velezensis strain CL。
  用响应面分析法优化了Bacillus velezensis strain CL产抑菌活性物质的发酵条件,以单因素实验结果为依据进行P-B设计,确定了接种量、初始pH和培养温度为影响抑菌活性物质产量的主要因素;设计最陡爬坡实验确定最佳实验中心点;通过B-B实验,最终确定最适培养条件为:初始pH5.5、接种量3%、培养温度24℃、80mL/250mL装液量,培养时间为96 h。优化的培养基为50 g/L葡萄糖、25 g/L酵母浸粉。在最优条件下,抑菌圈直径的预计值为3.23 cm,实际值达到3.2±0.13 cm,与推理值相符性达到96.23%,Bacillus velezensis strain CL产抑菌活性物质抑菌活性较原发酵培养基提高了52.38%。
  抑菌活性物质特性试验:
  温度稳定性:Bacillus velezensis strain CL所产抑菌活性物质在4℃与37℃处理时,其抑菌活性保持率可以达到90%以上,经-20℃处理其抑菌活性保持率明显降低,只有56%的抑菌活性,而经55℃处理后抑菌活性保持率降至38%,一旦超过80℃将完全丧失抑菌活性。
  pH稳定性:Bacillus velezensis strain CL的抑菌活性物质分别经pH2-8条件下都能保持稳定,其抑菌活性保持率都能达到85%以上,而在pH10的条件下处理10 h,其抑菌活性有所降低,降至56%。
  光辐射:Bacillus velezensis strain CL所产的抑菌活性物质在紫外稳定性并不强,当紫外照射剂量达到54 K,Bacillus velezensis strain CL抑菌活性保持率降低到32%;Bacillus velezensis strain CL的抑菌活性物质具有稳定的光照稳定性,在光照条件下照射10 d Bacillus velezensis strain CL的抑菌活性保持率始终保持在98%以上。
  遗传性能:Bacillus velezensis strain CL的遗传性能相当稳定,连续传8代其所产的抑黄曲霉菌的能力没有下降,其抑菌活性保持率始终在99%以上。
  Bacillus velezensis strain CL抑菌活性物质的组分分析,CL产的的抑菌活性物质为小分子蛋白类。通过透析法发现Bacillus velezensis strain CL产的的抑菌活性物质分子量大于2 KDa小于3.5 KDa,对滤膜及超滤膜有很强的吸附性。Bacillus velezensis strain CL所产的抑菌活性物质可以抑制黄曲霉孢子的萌发。而且Bacillus velezensis strain CL基因组中含有的抑菌活性物质编码基因,扩增出3个基因序列分别为bamD、bacD与bacAB。其中bacD与 bacAB基因编码的抑菌活性物质为 bacilysin, bamD基因编码的抑菌活性物质是bacillomycin。
[硕士论文] 李娟
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:抗生素的过量使用和滥用导致大量耐药菌的出现,特别是超级耐药菌的出现,对人类健康造成严重的威胁。寻找新的更为安全高效的抗生素,以及不易产生细菌耐药性的抗生素替代物,对于保障人类健康,以及健康食品生产和动物养殖具有重要意义和迫切需求。抗菌肽类物质是天然抗菌物质,具有稳定性好、无毒副作用、不会出现细菌耐药性等突出优点,也具有替代某些抗生素的潜力。因此,本项研究的目的是利用基因工程的方法,构建人工合成抗菌肽和抗菌酶基因的重组表达质粒,将重组质粒导入毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中进行异源表达,获得了酵母表达的抗菌肽和抗菌酶,旨在为抗菌肽类物质的实际应用提供技术资料。本论文报道了几种抗菌肽类物质和具有抗菌作用的葡萄氧化酶的酵母异源表达的主要研究结果。
  1、构建了对革兰氏阴性菌有很好抗性的抗菌肽AP基因重组表达载体pPICAP,将其导入毕赤酵母SMD1168中,获得了抗E.coli的毕赤酵母菌株AP26,该菌株在培养的72 h时抑菌活性最高,之后抑菌活性降低,表明72 h时抗菌肽AP的表达量最高。进一步研究表明,在培养的72h后,重组菌抑菌活性降低是因为发生了质粒的丢失。LC-MS结果表明重组菌株正确表达了抗菌肽AP。对菌株AP26进行了亚硝基胍(NTG)诱变,筛选到了抗菌肽AP表达量最高的诱变菌株APmu4,其抗菌肽AP最高生物效价达到1.7×109 U/L。对影响抗菌肽AP表达量的因素进行了研究,发现pH为7.5、接种量为50g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AP的表达量。
  2、构建了具有广谱抗菌活性的抗菌肽AB基因的重组载体pPICAB,将其导入到毕赤酵母SMD1168菌株中,获得分泌表达抗菌肽AB的毕赤酵母菌株,该重组菌株对E.coti有抗性,LC-MS结果表明该菌株正确表达了抗菌肽AB。对重组菌株进行了NTG诱变,筛选到超量表达抗菌肽AB的诱变菌株ABN97。为了进一步提高诱变菌株抗菌肽AB表达量,构建了颤藻血红蛋白基因vgb的重组载体,将其导入到菌株ABN97中,筛选出了抑菌效果最好的菌株ABN97vgb,抗菌肽AB生物效价达到4.53×108 U/L。对影响抗菌肽AB表达量的因素进行了研究,发现pH为6.0、接种量为50 g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AB的表达量,最高表达量提高了14倍。
  3、构建了对革兰氏阳性菌有良好抑菌活性的抗菌肽菌丝霉素Plectasin基因重组质粒pPICPle,将其导入毕赤酵母并成功异源表达抗菌肽Plectasin。对重组菌株进行NTG诱变并筛选得到高效表达Plectasin的诱变菌株Ple100,其Plectasin的表达量提高了1.93倍。对影响菌株Ple100 Plectasin表达量的因素进行研究,结果表明盐浓度较高的YDFMY培养基和酵母提取物能提高菌株Plectasin表达量。
  4、构建了抗菌肽PSI基因的整合型载体pLACPSI和游离型载体pKDUPSI,将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,筛选到分泌表达抗菌肽PSI的重组菌株。对重组菌株发酵液中抗菌肽PSI进行硫酸铵沉淀法和阳离子交换柱纯化,SDS-PAGE检测验证了抗菌肽PSI。对重组菌株产抗菌肽PSI的发酵条件进行优化,结果表明中性或偏碱性、酵母提取物和盐度较高的YDFMY培养基更有利于抗菌肽PSI的表达。纯化的抗菌肽PSI对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、三线镰刀菌(Fusarfum tricinctum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、平头炭疽(Colletotrichumtruncatum)有抗性。水果保鲜实验表明纯化后的抗菌肽PSI也具有开发为新型果蔬保鲜剂的潜力。
  5、构建了葡萄糖氧化酶(GOX)基因的整合型载体pLACGOX和游离型载体pKDUGOX,成功将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,获得了一株能超量分泌表达GOX的乳酸克鲁维酵母菌株,其GOX最大表达量为70±7 kU/L,SDS-PAGE检测验证了GOX正确表达。研究了影响GOX酶活的因素,结果表明pH4件下GOX酶活最高,温度为37℃时GOX稳定,YPGal培养基中的高盐浓度对GOX有抑制作用。
[硕士论文] 唐灿
生物工程 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:研究表明微生物胞外多糖(EPS)具有降胆固醇益生功能,但是微生物EPS产量较低,并具有菌株特异性。此外,乳酸菌降胆固醇的途径众多且机理复杂,除了EPS对胆固醇有一定的吸附作用外,还存在其他的作用机理,例如胆盐水解酶介导的共沉淀作用等。因此,本论文从植物乳杆菌胞外多糖降胆固醇功能、胞外多糖合成关键酶活性、胞外多糖合成关键酶和胆盐水解酶在降胆固醇过程中的基因表达情况等方面的研究来阐述两株降胆固醇能力不同的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)La-10和La-11的降胆固醇机理。
  首先,本实验对两株植物乳杆菌发酵产EPS的工艺条件进行单因素优化实验,结果表明:La-10和La-11的最适接种量均为4%;培养基的最适蔗糖含量分别为30g/L和20g/L;最适发酵温度均为30℃;最适发酵时间均为30h。对生成的EPS进行降胆固醇实验,获得了最佳体外降胆固醇实验条件为:La-10和La-11的最适EPS质量浓度均为0.8g/L;最适吸附时间均为15h;最适吸附温度分别为30℃和37℃。除此之外本实验还从多个角度比较La-10和La-11的降胆固醇能力差异,结果表明:La-10热灭活的菌体和发酵菌液降胆固醇率分别是6.45%和9.99%,La-11为3.19%和5.79%。
  此外,本论文通过异源表达实验分析了 EPS合成基因簇中两个关键基因UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因(galE3)和引导糖基转移酶基因(cps4E)的表达情况。结果表明:galE3和cps4E表达的蛋白质分子量大小分别约为36k Da和25kDa,均为亲水性蛋白质。galE3编码的蛋白质为稳定蛋白质,表达产物纯化效果良好,利用高效液相色谱法(HPLC)分析表明其酶活力高,而cps4E编码的蛋白质为不稳定蛋白质,表达系统有待进一步摸索。经HPLC分析,La-10和La-11的GALE3酶促反应产物浓度分别为0.55mg/mL和0.30mg/mL。
  最后本论文通过荧光定量PCR实验分析了在降胆固醇过程中galE3、cps4E、bsh等基因在转录水平上变化。结果表明:La-10的galE3和cps4E相对表达量上调了3.06倍和3.34倍,La-11的galE3和cps4E的相对表达量上调了3.69倍和4.22倍。La-11 随着生活水平的不断提高高血脂症患病人群的数量也逐渐增加。虽然胆固醇具有细胞结构组成、促进脂肪消化、维持内分泌平衡等重要生理功能,但是体内胆固醇含量过高将会对健康造成不利。如何利用微生物在肠道中发挥降胆固醇的作用,以及掌握微生物降胆固醇的机理,将对心血管疾病的药物和保健品开发提供思路。
  研究表明微生物胞外多糖(EPS)具有降胆固醇益生功能,但是微生物EPS产量较低,并具有菌株特异性。此外,乳酸菌降胆固醇的途径众多且机理复杂,除了EPS对胆固醇有一定的吸附作用外,还存在其他的作用机理,例如胆盐水解酶介导的共沉淀作用等。因此,本论文从植物乳杆菌胞外多糖降胆固醇功能、胞外多糖合成关键酶活性、胞外多糖合成关键酶和胆盐水解酶在降胆固醇过程中的基因表达情况等方面的研究来阐述两株降胆固醇能力不同的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)La-10和La-11的降胆固醇机理。
  首先,本实验对两株植物乳杆菌发酵产EPS的工艺条件进行单因素优化实验,结果表明:La-10和La-11的最适接种量均为4%;培养基的最适蔗糖含量分别为30g/L和20g/L;最适发酵温度均为30℃;最适发酵时间均为30h。对生成的EPS进行降胆固醇实验,获得了最佳体外降胆固醇实验条件为:La-10和La-11的最适EPS质量浓度均为0.8g/L;最适吸附时间均为15h;最适吸附温度分别为30℃和37℃。除此之外本实验还从多个角度比较La-10和La-11的降胆固醇能力差异,结果表明:La-10热灭活的菌体和发酵菌液降胆固醇率分别是6.45%和9.99%,La-11为3.19%和5.79%。
  此外,本论文通过异源表达实验分析了 EPS合成基因簇中两个关键基因UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因(galE3)和引导糖基转移酶基因(cps4E)的表达情况。结果表明:galE3和cps4E表达的蛋白质分子量大小分别约为36k Da和25kDa,均为亲水性蛋白质。galE3编码的蛋白质为稳定蛋白质,表达产物纯化效果良好,利用高效液相色谱法(HPLC)分析表明其酶活力高,而cps4E编码的蛋白质为不稳定蛋白质,表达系统有待进一步摸索。经HPLC分析,La-10和La-11的GALE3酶促反应产物浓度分别为0.55mg/mL和0.30mg/mL。
  最后本论文通过荧光定量PCR实验分析了在降胆固醇过程中galE3、cps4E、bsh等基因在转录水平上变化。结果表明:La-10的galE3和cps4E相对表达量上调了3.06倍和3.34倍, La-11的galE3和cps4E的相对表达量上调了3.69倍和4.22倍。La-11 的bsh1,bsh2、bsh3相对表达量分别上调了4.58倍、8.77倍、2.25倍,bsh4变化不显著。
  本实验主要从分子生物学角度了解植物乳杆菌降低胆固醇的机理,证实了降胆固醇机理存在菌株特异性,不同植物乳杆菌菌株可能存在不同的降胆固醇机理。本论文研究将为利用基因工程技术获得高产EPS的菌株以及植物乳杆菌在医学和食品药品等领域上的应用提供实验基础和理论依据。
[博士论文] 孟琳
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:嗜盐菌由于其独特的耐盐碱代谢机制和遗传特性已受到许多微生物学、生态学和土壤学研究工作者的广泛关注,是一类极具基础研究价值和发掘新的耐盐碱机制的重要微生物资源,而对这类微生物新的耐盐机制的研究还可以为改造农作物、开发微生物肥料、促进粮食增产等提供重要的理论依据。肇东盐单胞菌(Halomonaszhaodongensis)是一株分离自黑龙江省肇东盐碱地的革兰氏阴性轻度嗜盐菌,它能在0-15%的S-G培养基上生长(最适盐浓度为3%)。本研究借助大肠杆菌(Escherichia coli盐敏感突变株KNabc(ΔnhaA,ΔnhaB,ΔchaA),利用基因文库筛选和功能互补相结合的技术方法,以发掘更多未知的耐盐碱基因,并对它们所编码的蛋白功能进行研究。
  本研究利用含有0.2MNaCl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具,用以克隆肇东盐单胞菌中潜在的与耐盐碱有关的基因。实验共获得21个能使KNabc突变株在0.2 M NaCl的培养基上恢复生长能力的重组质粒,经过酶切及测序分析,发现这21个重组质粒中,包括一对属于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族的蛋白和一个属于DUF2062家族(domain of unknown function with No.2062 family)的蛋白,它们的功能尚未被注释,实验结果表明它们均是与耐盐有关的基因,本文将它们分别被命名为umpAB(unknown membraneprotein)、duf2062。
  umpAB基因序列全长1580 bp,由两个开放阅读框(ORF)组成,其中第一个阅读框(umpA,765 bp)终止密码子的最后一个碱基与第二个阅读框(umpB,816 bp)起始密码子的“A”碱基重叠在一起。它们编码的蛋白序列分别由254个和271个氨基酸残基组成,并将其分别命名为Hz_UmpA、Hz_ UmpB(from Halomonaszhaodongensis)。跨膜预测分析也显示,它们皆具有7个跨膜区,它们和亲缘关系最近的12个同系物有47个高度保守的氨基酸残基,其中包括36个疏水性氨基酸、6个带正电的氨基酸、5个极性氨基酸。同源比对显示,Hz_UmpA和Hz_UmpB同属于一个未知功能的DUF1538(domain of unknown function with No.1538family)蛋白家族,该家族在NCBI的Pfam数据库中被定义为一类功能未知的、具有同一个保守结构域的蛋白集合,其发现顺序为1538。更重要的是,Hz_UmpA和Hz_UmpB与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的其他蛋白没有任何同源性。系统发育分析显示,它们与各自同源性在50%以上的同系物聚簇成阙值(bootstrap values)为96%和99%的两个分支,但是与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的其他蛋白的进化距离较远。除此之外,功能互补的实验揭示了umpAB基因具有一定的耐盐碱能力,在0.4 MNaCl或30mMLiCl的盐胁迫下,umpAB能使盐敏感突变株KNabc恢复生长,而单独的umpA,umpB却不能;当NaCl浓度为0-0.15 M时,与负对照相比,单独的Hz_UmpB具有一定的耐盐能力,而单独的Hz_UmpA在有盐条件下生长受到抑制;单独的Hz_UmpA和Hz_UmpB具有一定程度的耐碱能力,且后者要好于前者。考虑到Hz_UmpB比Hz_UmpA多出一个亲水的C末端,推测多出的这一亲水C末端在其耐盐碱过程中起到比较关键的作用。功能分析表明,Hz_UmpAB具有Na+(Li+,K+)/H+逆向转运蛋白活性,且这个活性具有一定的 pH依赖性,其最适活性pH为9.0,对Na+、Li+、K+三种离子的K0.5值分别是0.26±0.06 mM、0.46±0.09 mM、0.41±0.06 mM,换而言之,Hz_UmpAB对底物的偏好性是:Na+>K+>Li+。为了进一步研究Hz_UmpAB的细胞定位及二聚体鉴定,我们构建了共表达载体pETDuet-1-umpAB,运用超离蛋白分级法对菌体的膜蛋白及胞浆蛋白进行分离,Western Blot检测显示,Hz_UmpA和Hz_UmpB的蛋白条带(约25 KDa)仅在全蛋白样品和膜蛋白样品中被检测出来,而且它们的确是大小不同的两个蛋白,这就表明,Hz_UmpAB均定位于细胞质膜。Co-IP显示,在免疫沉淀Hz_UmpA蛋白时,用Western Blot分析也能检测到Hz_UmpB的蛋白条带,表明Hz_UmpAB很可能是由两个膜蛋白构成的一个异源二聚体。
  duf2062基因序列全长552 bp,可编码的蛋白由183个氨基酸残基组成,将其命名为Hz_DUF2062。功能互补实验显示,它可使盐敏感突变株KNabc在0.3 M NaCl或5 mM LiCl的培养基上恢复生长,而且在偏碱性的环境中,其生长能力要明显好于负对照。这表明了该基因具有一定的耐盐碱能力,且可能具有钠/氢逆向转运蛋白活性。跨膜预测分析显示,Hz_ DUF2062具有3个跨膜区,和它们亲缘关系最近的同系物有54个高度保守的氨基酸残基,其中主要包括28个疏水性氨基酸、10个带正电的氨基酸和13个极性氨基酸;同源比对表明,Hz_ DUF2062属于一个未知功能的DUF2062蛋白家族,而与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白没有任何同源性。系统进化发育学分析表明,Hz_DUF2062与同家族的其他蛋白聚集在一簇,阙值(bootstrap values)为91%,且此分支与已知的钠/氢逆向转运蛋白或具有钠/氢逆向转运活性的蛋白的进化距离较远。功能分析表明,Hz_DUF2062具有Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性,以上活性具有pH依赖性,其最适活性pH为8.5,对Na+、Li+、K+三种离子的K0.5值分别是0.2±0.13 mM、0.22±0.1 mM、0.43±0.08 mM,换而言之,Hz_ DUF2062对底物的偏好性是:Na+>Li+>K+。
  综上所述,本研究首先对Hz_UmpAB和Hz_DUF2062两个蛋白的功能进行了注释,首次报道了未知功能的DUF1538家族和DUF2062家族成员的确切功能,即代表DUF1538家族的蛋白对Hz_UmpAB和代表DUF2062家族的蛋白Hz_DUF2062具有Na+(Li+,K+)/H+逆向转运蛋白活性,同时还重点研究了Hz_UmpAB的细胞定位及这个异源二聚体的鉴定。基于以上结果,建议来自肇东盐单胞菌(H.zhaodongensis)中的Hz_UmpAB蛋白对和Hz_ DUF2062蛋白是两个新型的Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白。而且,也通过Co-IP首次揭示了钠/氢逆向转运蛋白的新结构,即钠/氢逆向转运蛋白的结构除了同源二聚体和异源多聚体之外,还应有像Hz_UmpAB这样的异源二聚体结构。
[硕士论文] 姚潇婷
生物工程 中南林业科技大学 2017(学位年度)
摘要:黄原胶具有良好的流变性、乳化稳定性、悬浮性、兼容性及增粘性,在原油开采中常被用作驱替剂,以提高钻井、完井、调剖堵水及三次采油等过程中的采油率。在实际应用过程中发现,使用黄原胶后加大了后续处理工艺的难度,因此,有效地降解黄原胶是石油开采的重要工序。本研究以课题组前期鉴定的一株具有降解黄原胶能力的嗜热地衣芽孢杆菌HT-1为材料,对其进行紫外微波复合诱变,测定复合诱变菌株温度耐受性、pH耐受性以及对黄原胶的降解能力,并与原始菌株进行比较。最后,对复合诱变菌株的应用进行初步探索。本研究对后续黄原胶生物降解法以及黄原胶在石油工业的应用提供一定的参考依据。主要研究结果如下:
  原始菌株HT-1菌株的最适生长条件:温度50℃,pH7.5,0.1%的黄原胶,1%的葡萄糖(碳源),1%的酵母粉(氮源);最适黄原胶降解条件:0.3%黄原胶作为唯一碳源和氮源,温度50℃,pH7.5。
  对原始菌株HT-1进行紫外诱变,选取一株较好的诱变菌株,命名为HT1UV-3,其对黄原胶的降粘率达到了35.79%,较原始菌株提高了14.42%。随后,对筛选得到的HT1UV-3突变株进行微波诱变,最终得到5株突变型菌株HT1UM3-1、HT1UM3-2、HT1UM3-3、HT1UM3-4、HT1UM3-5。温度耐受方面,5株突变菌株耐高温性能较原始菌株明显提高,其中HT1UM3-3菌株的最适生长温度趋于55℃;pH耐受方面,复合诱变菌株与原始菌株无明显差别;黄原胶降解方面,5株突变菌株的黄原胶降解能力较原始菌株均有提高,其中HT1UM3-5菌株的降粘率最高,达到42.02%,较原始菌株提高了20.70%。
  在原油环境下,对原始菌株和复合诱变菌株的存活情况与黄原胶降解能力进行探索。结果显示,不同原油浓度下,原始菌株和复合诱变菌株对原油的耐受程度都不高,半数致死率均在0.5g/L;在0.5g/L原油浓度下,原始菌株和复合诱变菌株对黄原胶降解能力均较差,原始菌株降粘率趋近于0%,复合诱变菌株降粘率约7.5%。
  探究原始菌株和复合诱变菌株对瓜尔胶、田箐胶、卡拉胶三种胶的降解能力。结果表明,对瓜尔胶的降解上,所有菌株降解能力微弱,最大降粘率不超过4%;对田箐胶的降解上,HT1UM3-1、HT1UM3-2、HT1UM3-4、HT1UM3-5的降解能力略高于原始菌株,降粘率在5%-8%之间;对卡拉胶的降解上,复合诱变菌株的降解能力显著高于原始菌株,降粘率在10%-12%之间,较原始菌株提高了约60%。
[硕士论文] 李垚
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:近年来科学家们在探寻新型抗生素的筛选途径时,发现昆虫内生菌能够产生许多种类多样的次生代谢产物,尤其那些能够帮助宿主抵御病原菌入侵的放线菌,其中一些具有新颖的结构并表现出较好的生物活性。由于这些化合物能够存在于真核宿主体内,且不危害宿主,所以它们很有可能对人类也没有毒副作用。因此这些昆虫内生放线菌具有很大产生人类药用的抗生素潜力,所以近年来昆虫内共生放线菌受到越来越多科学家的关注,昆虫内生放线菌也将是持续地发现新抗生素的重要领域之一,这对于对抗日益增多的抗药病原菌和新型疾病具有重要意义。
  本研究以实验室筛选得到的30株蚂蚁内生菌为材料,通过培养特征观察、抗菌活性测试和16S rRNA序列测序结果分析,发现两株潜在的放线菌新种3H-GS17T和2H-TWYE14T和一株具有良好抗菌活性放线菌1H-GS2,对它们分别进行了系统的分类学鉴定和活性物质的分离鉴定,结果如下:
  (1)16SrRNA分析结果显示菌株3H-GS17T是珊瑚放线菌属的一株菌,与Actinocoralliaglomerata JCM9376T(98.13%)和Actinocorallia longicatena JCM9377T(97.64%)的16S rRNA序列相似性最高。化学分类学特征也与Actinocorallia的特征一致。而DNA-DNA杂交结果和表型分析结果显示菌株3H-GS17T明显不同于与它相近的菌株,进一步的实验证明菌株3H-GS17T和珊瑚放线菌属的其他菌株都不相同。因此确定菌株3H-GS17T是珊瑚放线菌属的一个新种,命名为Actinocorallia lasicapitis,典型菌株是3H-GS17T(=DSM100595T=CGMCC4.7282T)。
  (2)16S rRNA分析结果显示2H-TWYE14T是链霉菌属的一株菌,与Streptomyces niveusNRRL2466T(98.84%)的16S rRNA序列相似性最高。gyrB基因分析结果同样显示2H-TWYE14T属于链霉菌属。化学分类学特征也与链霉菌属的其他菌株相一致。而2H-TWYE14T与S.niveusNRRL2466T之间的DNA-DNA杂交结果和表型分析结果显示2H-TWYE14T明显不同于S.niveus NRRL2466T。因此确定菌株2H-TWYE14T是链霉菌菌属的一个新种,命名为Streptomyces camponoticapitis,典型菌株是2H-TWYE14T(=DSM100523T=CGMCC4.7275T)。
  (3)活体生物活性检测显示菌株1H-GS2对部分测试真菌具有较好的生物活性,将菌株进行发酵,发酵产物同样显示良好的真菌抑制活性。对发酵产物中的化合物进行分离纯化后,利用现代光谱学进行结构分析鉴定,最终得到化合物白诺菌素(Albonoursin)。
[博士论文] 李英俊
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统广泛分布于古菌和细菌中,是一种抵御病毒和质粒等外源遗传物质的获得性免疫系统。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统已被分为两大类和六个亚型,其中主要的三个亚型(Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型)得到了广泛的研究。Ⅱ型CRISPR/Cas9系统目前已被广泛应用于不同的细菌和真核生物的基因组编辑;此外,Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR-Cas系统还被开发成抗菌剂来选择性消除特定的菌群。但是,迄今还没有利用Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统进行基因组编辑的报道。
  本研究在冰岛硫化叶菌中开发了一种基于其内源的Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法。该方法只需要构建一个新型的基因组编辑质粒(pGE),该质粒携带一个提供能靶向干涉或沉默基因的成熟CRISPR RNA的人工mini-CRISPR簇以及一个含有非靶标序列的用于同源重组的供体DNA片段。将pGE质粒转化到宿主细胞之后,细胞将会有两种命运:野生型细胞因基因组DNA被靶向降解而死亡;而那些基因组与供体DNA发生了同源重组从而携带突变基因的细胞能免于干涉而成为转化子存活下来。利用该方法,本研究实现了不同类型的基因组编辑,包括缺失、插入和定点突变。我们相信该方法可以推广到其它含有能干涉DNA的CRISPR-Cas系统的细菌和古菌。
  研究不同CRISPR-Cas系统的分子机制是应用开发的基础,且已成为当前生物学研究的热门领域之一。已有研究表明,Ⅲ型CRISPR-Cas系统与其它类型有显著不同的核酸干涉活性,其既有RNA酶活性也有RNA激活的DNA酶活性。我们的前期研究已经揭示了冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统在体内同时具有RNA干涉活性和依赖于转录的DNA干涉活性。为了更深入的解析相关机制,本研究用一个携带43nt SS1spacer(靶向lac基因上protospacer SS1)的人工mini-CRISPR质粒,从冰岛硫化叶菌中纯化出天然Cmr-α复合物,并对其进行了系统的体外研究。研究发现,Cmr-α复合物能切割与复合物中的crRNA互补配对的靶标RNA,同时该靶标RNA又能激活Cmr-α复合物的ssDNA切割活性,该活性需要靶标RNA的3'端侧翼序列与crRNA的5'端tag序列错配。此外,激活的Cmr-α复合物能够快速切割大量的ssDNA底物,这说明Cmr-α系统可以快速消灭复制中的病毒DNA。
  为了揭示Cmr2α蛋白在Cmr-α系统DNA干涉活性中的功能,本研究针对Cmr2α的HD和Palm两个结构域构建了四个突变株,分别命名为HD-M1(H14N和D15N),HD-M2(H14N, D15N,K19A和I23A), Palm-M1(G666K和D667K)和Palm-M2(662-IYlGGDDiLA-671—AAlAAAAiAS)。体内干涉质粒分析显示,其中3个多氨基酸突变株HD-M2、Palm-M1和Palm-M2都丧失了DNA干涉活性。而HD结构域的双氨基酸突变株HD-M1却只是消除了体外的DNA切割活性。这些结果表明,Cmr2α的HD和Palm两个结构域都是Cmr-α系统体内DNA干涉所必需的,而体外检测到的ssDNA切割活性可能只是HD结构域介导的。
  此外,Ⅲ型CRISPR-Cas系统的crRNA加工成熟和靶标核酸的结合机制仍然是不清楚的。本研究用携带不同长度spacer(14,20,28,40和76nt)的人工mini-CRISPR质粒分别纯化Cmr-α复合物。结果显示,无论spacer长短,Cmr-α系统都合成固定长度的crRNA(40nt和46 nt)。这说明mini-CRISPR簇下游的repeat元件可以在没有被加工情况下补充为crRNA序列。此外,一个仅含有上游repeat元件和40nt spacer的人工mini-CRISPR质粒也能合成一样固定长度的crRNA。这些结果表明,Cmr-α复合物的组装可能是从crRNA的5'端tag区域(经Cas6初加工产生)起始,而crRNA的3'端则由其它未知的RNase加工成熟,从而组装成两个固定大小的复合物。另外,对这些复合物的体外切割活性和结合靶标RNA能力的分析表明,随着复合物中crRNA的3'端区域和靶标RNA的5'端序列错配碱基数的增加,不能被复合物结合和切割的RNA底物的数量也随之增加。
  在Ⅲ-B型效应复合物的结构模型中,结合crRNA的3'端区域的是Cmr1亚基。本研究在冰岛硫化叶菌中构建了一个Cmr1α缺失突变株和两个关于Cmr1α的丙氨酸替换突变株,分别命名为△β△1α,△β1α-M1(W58A和F59A),△β1α-M2(I52A,G54A,R57A和R61A)。体内基于mini-CRISPR的报告基因法分析表明,△β1α-M1的RNA干涉活性相比野生型菌株大大降低,而△β△1α和△β1α-M2则基本丧失了RNA干涉活性。
  纯化Cmr1α三个突变株的Cmr-α复合物发现,突变株△β1α-M1 Cmr-α复合物的组分和野生型基本一样,而突变株△β1α-M2 Cmr-α复合物的组分却和△β△1α一样,都缺少Cmr1α蛋白。同时,体外RNA切割实验与体内的RNA干涉活性分析结果一致。在靶标RNA激活的DNA切割活性分析中,突变株△β△1α和△β1α-M2的复合物均基本丧失了DNA切割活性,突变株△β1α-M1的Cmr-α复合物也只检测到相比野生型复合物非常弱的DNA切割活性。此外,EMSA实验结果显示,△β△1α和△β1α-M1的Cmr-α复合物均很难与靶标RNA形成三元复合物(Cmr蛋白,crRNA和靶标RNA)。以上结果表明,Cmr1α在Cmr-α复合物与靶标RNA形成三元复合物过程中扮演关键角色。两个保守的疏水氨基酸(W58和F59)是Cmr-α复合物结合靶标RNA所必需的,另外四个氨基酸(I52,G54,R57和R61)可能主要介导Cmr1α与crRNA相互作用,从而形成完整的Cmr-α复合物。
[硕士论文] 张高群
遗传学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:天然免疫系统是抵御细菌、真菌和病毒等病原体的第一道防线,起着重要防御作用。当病原微生物入侵时,果蝇的天然免疫系统能够做出高效的免疫应答。果蝇体液免疫的主要特点是受免疫原刺激后脂肪体能合成大量的抗菌肽,然后分泌到血淋巴中直接杀死入侵的病原体。不同的微生物能激活不同的转录因子来调控抗菌肽的表达。已有的研究表明,在果蝇体内产生抗菌肽主要受两种信号转导途径调控,即Toll/Dif途径和Imd/Relish途径。除了体液免疫外,由血细胞引起的防御系统也发挥重要作用,主要包括通过血细胞的吞噬和包围作用清除入侵的病原微生物。黑色素瘤被广泛认为是由于异常免疫应答产生的。一些造血相关信号通路突变体,包括Toll,JAK/STAT,Ras和JNK等,当这些信号通路在血细胞中特异性被激活时,将产生大量的黑色素瘤。
  在本实验中,我们用UAS-Gal4系统在果蝇的免疫系统中过表达jumeaux(jumu),分析在造血系统中的功能。Jumeaux(Jumu)是WH/FKH基因家族转录因子的新成员,在果蝇的生长和形态发生上扮演着重要角色,并且参与血细胞的增殖和分化。在果蝇的脂肪体和血细胞中同时过表达jumu,幼虫和成虫都产生了大量的黑色素瘤。这些在脂肪体上的囊肿,被大量的血细胞通过类似于对外来物质的包裹的形式包围着。这种现象的产生是由于Toll信号通路的激活导致了血细胞沉积在脂肪体上。除此之外,本实验也发现,脂肪体出现裂解的现象,以及血细胞的异常增殖和分化。这些结果表明,Jumu介导了血细胞和脂肪体之间的相互作用,尤其是在Toll依赖的黑色素瘤的形成过程中起着重要的调节作用。
[硕士论文] 何天生
生物化学与分子生物学 江西师范大学 2017(学位年度)
摘要:生物体在长期进化过程中形成了非特异性的天然免疫系统,对入侵病原体的检测及随后特异性免疫的启动都是至关重要的,在机体抗感染的过程中发挥重要的防御功能。模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)特异性的识别包括病毒在内的病原体保守组分,招募特异的接头蛋白,引起下游一系列信号级联反应,诱导抗病毒防御,使宿主免受感染。
  视黄酸诱导基因I样家族受体(retinoic acid-inducible gene I(RIG-I)-like receptors,RLRs),是细胞质内模式识别受体,当病毒入侵机体,RIG-I样受体识别RNA病毒并激活,通过其N端caspase募集结构域(caspase recruitment domain,CARD)招募重要的病毒诱导信号接头蛋白 VISA(virus-induced signaling adapter,也称MAVS,IPS-1或 Cardif),VISA蛋白在线粒体膜促进形成 VISA抗病毒信号复合物,向下游传递信号,促使转录因子 IRF3/7和NF-κB激活并进入细胞核,启动干扰素和细胞因子迅速表达以抵抗病毒。VISA是线粒体中发现的第一个与先天免疫相关的蛋白质,与过氧化物酶体、内质网及自噬体都有关联,不仅在抗病毒与炎症途径发挥重要作用,也参与细胞凋亡和代谢功能。但是,VISA作为线粒体蛋白如何衔接参与调节RLR-VISA抗病毒信号通路还需要进一步阐明。
  基于上述考虑,我们以人VISA全长为诱饵,应用酵母双杂交系统从293T细胞cDNA文库中筛选出VISA的相互作用蛋白,得到50个阳性单克隆;通过测序、序列比对与表达框架分析,以及蛋白功能预测分析,确定4个候选蛋白。利用基因克隆技术成功将4个候选基因全长构建在哺乳动物表达载体(pRK5-Flag)上;通过免疫共沉淀实验验证出3个候选基因(HAUS8(#13)、#1、#46)能与VISA相互作用;选取其中的HAUS8利用免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因系统以及RNA干扰实验进行抗病毒功能及机理研究。结果发现在RLR-VISA信号通路激活时,HAUS8除与VISA相互作用外,还与关键信号通路分子RIG-I、TBK1也有相互作用。过表达的HAUS8能激活NF-кB,IRF3和IFN-β的活性,正调控由SeV介导的RLR-VISA信号通路。并且,敲减(knockdown)HAUS8抑制NF-κB、IRF3和IFN-β的活性,负调节由SeV诱导的RLR-VISA信号通路。并阐明HAUS8是通过靶定VISA复合体能,促进VISA、RIG-I和TBK1的泛素化,进而激活下游信号通路。
  HAUS8是微管相关蛋白,对维持纺锤体的完整性和染色体稳定性具有重要的作用。而通过我们的研究表明,HAUS8还可以通过激活VISA复合体正调控RLR-VISA抗病毒信号通路。HAUS8作为一个新的参与RLR-VISA抗病毒信号通路的细胞骨架相关蛋白,为细胞骨架参与RLR-VISA通路提供了一种新的的调节机制。
[硕士论文] 吴瑞薇
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:煤层气(CBM)作为一种自生自储形式存在的非常规天然气,以清洁、高效、优质、安全的特点越来越受到人们的关注。近年来,生物成因煤层气作为一种环境友好及高效的能源,被人们广泛研究。针对煤层气相关微生物多样性及产气途径的研究对煤层气的开采、废弃煤层气田的处理和煤层气的再生有重大意义。而在我国,由于煤层气的勘探研究起步较晚,在煤层气相关微生物的研究方面报道甚少。本文中,以山西沁水盆地煤层气田为研究对象,该地区为我国煤层气开采最为活跃的地区,采用高通量测序技术,对煤层气田原位产出水和异位煤生物转化成甲烷的过程中微生物的群落变化进行了研究,同时也对以高阶块煤为基质中试模拟生物产气过程中,培养基的浓度和添加块煤的量对微生物群落结构的影响进行了初步研究。
  微生物基因组总DNA的提取是进行环境分子生态学研究的首要关键步骤。煤是具有复杂和难降解结构的大分子物质,因此提取高质量的基因组总DNA是后续实验的关键,也是能较真实的评估微生物多样性的保障。通过优化在该特殊环境中基因组DNA的提取方法,即采用the Mini-Bead Beater机械破碎、化学破碎与酶消化相结合,得到了高浓度、片段完整的基因组总DNA,能满足后续相关的PCR扩增和宏基因组学测序分析。
  首先分析了该煤层气田5个不同煤层气井原位产出水中产甲烷菌群和生物成因气的生成途径。以甲基辅酶M还原酶基因(mcrA)作为目标基因,采用454焦磷酸测序方法,分析不同煤层气井产出水中的产甲烷菌群。高通量测序表明,样品共检测到4种已知菌属,即甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷微菌属(Methanomicrobium)、甲烷叶菌属(Methanolobus)和甲烷螺菌属(Methanospirillum),优势菌属均为Methanobacterium。系统发育分析表明,未明确地位的菌属主要与Methanobacterium、Methanomicrobium、产甲烷球菌属(Methanococcus)和甲烷囊菌属(Methanoculleus)有较近的亲缘关系。
  同时成功利用高阶块煤首次实现异位煤生物转化成甲烷的过程,该过程通过规模化中试发酵培养更加客观的表征了微生物的群落变化。通过高通量测序分析表明在原位产出水中氢营养型的产甲烷菌Methanocalculus占主导,而在异位产气过程中乙酸型产甲烷菌Methanosaeta和Methanosarcina占主导;在原位产出水和异位产气过程中大部分细菌均属于Proteobacteria,在产出水中细菌属Sulfuricurvum, Hydrogenophaga和Methylobacter占主导;而在异位产气过程中细菌菌属差异较大,由起初的Pseudomonas为优势菌属,到后来发酵培养90天后,主要的细菌为Proteocatella,Macellibacteroides和Clostridium。
  综上,在煤层出水样中生物成因煤层气的形成主要为氢营养型产甲烷途径,而在异位煤的生物转化过程中主要为乙酸型产甲烷途径,因此在异位生物成因的产气途径判定中不能依据原始微生物群落代谢途径而决定,而应以所研究的微生物群落中优势产甲烷菌作为参考依据。
[硕士论文] 张健
森林保护学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:锰过氧化物酶(Manganese peroxidase MnP)是一种糖基化胞外过氧化物酶,其具有降解木质素和芳香族化合物的特殊能力,对染料的脱色有着很显著的效果。为了提高构巢曲霉转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2产MnP的活性,本文对构巢曲霉转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2的MnP酶检测体系作用反应条件进行筛选,对菌株产MnP培养条件进行优化,为了使其应用到实际生产,对在优化过培养条件下培养的转化子菌株进行染料脱色的研究。
  优化及诱导实验研究表明;在MnP酶检测体系中,丙二酸钠缓冲溶液pH值对MnP活性表达有显著影响。pH值为3.5时MnP表达量最高。通过单因素试验筛选得到构巢曲霉转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2最适培养温度为37℃,最佳培养时间为72h时,通过正交试验的方法筛选出最佳培养条件为摇床的转速为220 r?min-1、Mn2+的浓度为267μmol·L-1、pH值为6.5、血红素浓度为0.05g·L-1,优化前酶活性在11U/L左右优化后在91U/L左右,优化后较优化前酶活提高了约9倍。然后对影响MnP产酶活性的6种诱导物进行筛选得到可以使构巢曲霉转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2 MnP活性变高的诱导物为木屑其次是没食子酸,苯甲酸,藜芦醇和麦麸,效果最差的为香兰素不仅没有提高MnP酶活性,反而抑制酶活。
  染料脱色结果表明转化子菌株的酶液对6种染料达旦黄、孔雀石绿、中性红、刚果红、曲利本蓝和结晶紫均有脱色效果。通过两种脱色率计算方法计算,方法一通过透光值计算得到优化后的菌株酶液在16h对达旦黄、孔雀绿和中性红都有显著的脱色效果时脱色率分别为98.36%、100%和96.47%。刚果红和曲利本蓝的脱色率分别为96.76%和89.39%。对结晶紫的脱色率为67.31%。方法二通过浓度标准曲线计算浓度的方法得到在1h酶液孔雀绿和中性红时都达到100%而对曲利本蓝和刚果红脱色率也达到74.77%和63.24%,结晶紫达到57.83%,但是达旦黄在16h也只达到38.16%。通过两种不同的计算方法得出构巢曲霉转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2的胞外酶液对孔雀绿和中性红有非常显著的脱色效果,曲利本蓝和刚果红脱色效果也比较明显,对结晶紫和达旦黄脱色降解效果一般。
[博士论文] 公维丽
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:进入二十一世纪,农作物秸秆作为现代农业的必然废弃物未得到充分利用,常常被就地焚烧,造成环境的污染和资源的浪费。利用生物技术将其细胞壁中多糖组分高效降解转化,形成生物化工产品或生物燃料,这对我国农业及工业绿色可持续发展具有重要意义。丝状真菌可以高效分泌生物质多糖降解酶,常被用于酶制剂生产,实现生物质多糖的降解转化。由于植物进化途径及生长环境迥异,使得不同植物细胞壁多糖组成及结构存在明显异质性;而微生物伴随植物进化过程中也形成了多样的降解策略,不同微生物分泌酶种类及浓度各不相同,因此系统认识植物细胞壁的异质性与微生物降解偏好性之间的关系,将会对生物质转化利用效率提升,推动其工业化规模应用具有意义。
  对丝状真菌降解天然生物质偏好性的研究,将会为寻找降解特定底物的优势降解酶系,根据底物类型复配降解酶系提供指导,从而提高秸秆等生物质的利用效率,丝状真菌降解偏好性主要由基因组中生物质多糖降解酶编码基因的种类和数目、基因的转录和表达、以及酶系中不同组分的功能特异性决定,基于这一问题,本文主要以三种子囊真菌,重点以黑曲霉为研究对象对其基因组、蛋白质组及胞外多糖降解代谢组进行了系统研究,认识相应微生物的降解偏好性,取得的主要成果如下:
  1.利用比较基因组学方法探究重要子囊真菌生物质多糖降解酶基因组成差异,确定不同真菌降解潜能
  通过JGI数据库和NCBI数据库获取已测序的曲霉属、木霉属、青霉属和脉胞菌属中代表性菌株ITS序列信息,构建系统发育进化树。从UniProt数据库中下载每一菌种中所有功能注释蛋白,按照生物质中多糖结构组成和糖苷键类型,将功能注释蛋白归类分析,结果表明在不同属之间曲霉属真菌基因组中生物质多糖降解酶编码基因种类及数量较多,而青霉属真菌基因组中降解双子叶植物中含量较高的木葡聚糖和半乳甘露聚糖的酶编码基因较少,因此推测其降解双子叶植物的能力可能不高,木霉属和脉胞菌属真菌在进化关系中位于同一分支,并且两者都具有较少半纤维素酶和果胶酶编码基因,但纤维素酶基因的比例较高,这可能由于其他生物质多糖降解酶基因特化为纤维素降解酶基因,从而使其在纤维素降解中具有明显优势,基因特化现象也是丝状真菌降解偏好性的基础。同时同工酶家族分布分析显示部分家族酶类如GH11和GH10家族木聚糖酶在不同菌株之间含量比例差异明显,因此,酶系种类及其专一性家族分布的差异可导致丝状真菌降解生物质能力明显不同。
  2.利用比较功能蛋白质组学方法分析黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉在固体培养条件下分泌组动态变化,确认三者在降解双子叶和单子叶植物多糖的偏好性
  利用玉米秸秆和小麦麸皮等农业废弃物对重要丝状真菌黑曲霉、里氏木霉及草酸青霉进行固体培养,并对其胞外酶的种类组成及浓度随时间的动态变化进行分析。结果表明在培养过程中大量的糖苷水解酶被诱导表达。利用LC-MS/MS在黑曲霉、里氏木霉和草酸青霉胞外共检测到279、161、183种蛋白,对其按照断裂生物质糖苷键类型分析发现,黑曲霉胞外蛋白质组中的酶种类可高效降解双子叶植物细胞壁多糖如(半乳)甘露聚糖、木葡聚糖和果胶主链,而草酸青霉胞外降解酶主要参与β-(1,3;1,4)-D-葡聚糖、木聚糖等单子叶植物细胞壁组分多糖的降解。里氏木霉主要分泌纤维素酶及Cip1,Cip2,Swollenin等辅助蛋白,而相对于里氏木霉和黑曲霉,草酸青霉的纤维素降解酶系组成更为合理。这从蛋白质组水平进一步确证丝状真菌胞外发挥功能的蛋白在降解不同生物质的偏好性,这为探究微生物的降解能力与其偏好性及工业合理复配酶系提高降解效率奠定了理论基础。
  3.利用荧光辅助糖电泳(FACE)和糖质谱定量表征木聚糖酶作用模式,建立胞外多糖降解代谢组学分析技术
  利用阴离子交换层析方法及大肠杆菌异源表达体系获得2个GH10家族木聚糖酶和5个GH11家族木聚糖酶,并建立FACE技术分析不同木聚糖酶降解异质木聚糖产物谱,结果表明FACE技术可以准确区分异质木聚糖酶解产物中带侧链木寡糖和不带侧链木寡糖,并可对不同种类木寡糖随时间的动态变化进行定量表征。基于对木寡糖谱随时间变化的定量分析,发现GH10家族和GH11家族木聚糖酶都可以将木聚糖迅速降解为木寡糖,而对木寡糖进一步降解速度却很慢。GH10家族和GH11家族木聚糖酶降解带侧链木聚糖主链的最小产物谱明显不同,具有家族特异性,利用LC MS-IT-TOF鉴定为2-甲基葡萄糖醛酸取代的木三糖和木四糖。对无侧链取代的木聚糖主链的降解,GH10与GH11家族木聚糖酶都可以产生单糖、木二糖、木三糖,未展现出家族专一性,而降解产物谱中寡糖种类及寡糖浓度差异应由酶活性中心亚位点的识别专一性及结合力差异导致。β-木糖苷酶的加入可以将2-甲基葡萄糖醛酸-木四糖高效降解为2-甲基葡萄糖醛酸-木三糖,但是对后者进一步高效降解需要侧链降解酶的参与。降解产物谱的动态变化反映不同家族同工酶对降解带侧链聚糖主链取代程度的偏好性不同,导致高效降解所需辅助酶种类不同,这为复杂聚糖高效降解酶系的复配指明了方向。
  4.限制碳源培养条件下分析黑曲霉An-76功能蛋白组动态变化,发现带侧链的木寡糖在黑曲霉降解、转运与代谢木聚糖系统中发挥重要激活作用
  黑曲霉An-76可以彻底高效降解利用木聚糖,利用功能蛋白质组学和qPCR方法对在木聚糖类底物生长的黑曲霉An-76胞外、胞内蛋白组及膜转运蛋白质进行系统分析,结果表明黑曲霉An-76可以有次序的分泌降解木聚糖的所有同工酶组分,木聚糖主链降解酶类优先被诱导,降解产生的木糖、木寡糖等进一步诱导侧链降解酶的高效表达,木寡糖比木糖等代谢产物更高效的激活转录激活因子XlnR的表达,从而可提高酶量表达,并提升降解效率。带侧链木寡糖可以提高侧链降解酶类、特定糖转运蛋白以及戊糖代谢途径中关键还原酶、脱氢酶的表达量,加快异质性木寡糖的降解代谢,因此有目的添加天然木聚糖的中间降解产物(带侧链木寡糖)可以诱导异质多糖降解的全酶系,并可以提高酶系表达量及缩短产酶周期。
[硕士论文] 吴姚平
微生物学 南昌大学 2017(学位年度)
摘要:肠道在消化吸收营养物质的同时,与肠道内大量微生物直接接触,给予微生物黏附和定植的空间位置,而肠道微生物在维系自身生长的同时,对肠道上皮细胞有着各种的刺激作用。大多肠道益生菌能够调节肠上皮细胞和树突状细胞的功能,从而调节机体健康,而多数食源性致病菌具有毒力,能够引起强烈的宿主反应。目前,益生菌和致病菌的种类很多,从菌体本身寻找共同的益生标记或致病标记,十分困难。通常益生菌促进了肠道结构的稳定而致病菌破坏肠道细胞,但肠道益生菌和致病菌对肠道作用涉及的信号通路较多,且具体的分子机制仍不清楚。故此,本论文选取常见的肠道微生物,探索它们对肠道屏障的影响,期望为建立评判益生菌或致病菌的方法提供依据。同时,为了更深一步挖掘每株细菌对肠上皮细胞其他基因转录水平的影响,借助转录组测序,尝试寻找益生菌与致病菌诱导肠道上皮细胞的差异表达基因。
  首先,选用两种品系的小鼠肠道,检测肠道微生物对肠道屏障影响。结果表明,肠道益生菌(动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌)对Balb/c小鼠小肠完整性均有一定的维持能力,其蓝色葡聚糖2000渗透量相较于空白组在4 h时分别降低了3.14%、20.9%和33.5%;对于昆明鼠小肠效果更明显,下降59.9%、59.1%和55.5%。对于Balb/c小鼠,肠出血性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌对肠道屏障具有明显的破坏能力,其蓝色葡聚糖2000的渗透量在4h时较对照组分别上升30.9%、61.1%和48.7%;但对昆明鼠小肠,肠出血性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌处理后,其在2h时的渗透量分别上升50.8%、183.3%和102.6%,说明不同品系老鼠对肠道微生物的应答是不一样的。
  利用细胞小室建立Caco-2肠上皮细胞间紧密连接结构模型,肠道细菌与其共孵育后,再分别通过测量跨膜电阻值和蓝色葡聚糖2000渗透量来判断菌体对紧密连接结构的影响。结果表明,动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌处理后,与对照相比,跨膜电阻值在6 h后分别提高了4.3%、4.3%和2.9%,表明其对紧密连接结构具有一定的维持能力,而肠出血大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核增生李斯特菌处理后,分别降低8.1%、8.2%和13.1%,表明其对紧密连接结构具有一定的破坏能力。实验选取的肠道细菌处理Caco-2单层膜模型后,蓝色葡聚糖渗透量都出现下降,动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌处理后6h后,蓝色葡聚糖2000相对渗透量分别下降7.9%,82.9%和46.2%;肠出血性大肠杆菌和单核增生李斯特菌处理后,蓝色葡聚糖2000的相对渗透量出现上升,达到13.7%和0.75%,而鼠伤寒沙门氏菌处理后,其渗透量下降0.51%。这样的结果也表明在肠道渗透性研究中,细胞模型并不能完全替代动物实验模型。通过荧光定量PCR技术,分析紧密连接结构主要的三种蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的基因转录水平,并没有发现规律性变化。
  为了进一步研究菌体对肠上皮细胞的影响,利用高通量测序技术,对菌体处理后的Caco-2细胞进行转录组测序,在数据过滤和处理之后,对所得到的数据进行分析。研究结果表明,益生菌组与致病菌组相比共有61差异表达基因,其中上调表达基因22个,下调表达基因39个。KEGG分析表明,这些基因主要富集于Toll样受体信号通路、蛋白内质网内加工、MAPK信号通路和肠道产IgA免疫网络等通路中。
  本研究结果探索了肠道微生物对肠道屏障功能的影响,对临床胃肠疾病的辅助治疗、微生态制剂和发酵食品的开发和应用具有一定的参考价值,同时,也为分析、鉴定和区分肠道微生物益生性提供数据支持。
[硕士论文] 张芬
微生物学 南昌大学 2017(学位年度)
摘要:血脂过高引起的心血管疾病严重威胁人类健康。一些乳酸菌能使机体肠道微生态发生有益变化,有效降低血脂水平。肠球菌作为机体内具有重要生理作用的乳酸菌,与其它乳酸菌相比,其降胆固醇的益生功能研究国内外鲜见,机制研究更是一片空白。
  本文旨在筛选具有安全性和降胆固醇功能的婴儿源肠球菌,探究其降胆固醇的作用机制。全文分成五章,详述如下。
  第一章绪论分别对益生菌的降胆固醇作用以及肠球菌的概貌进行了综述,包括益生菌降胆固醇的种类和分布,以及其机理;肠球菌的生物学特征、分类地位、益生和致病两重性,并对其降胆固醇的研究发展趋势做了展望。
  第二章的研究从34份健康婴儿粪便中分离获得108株菌株,经特异性PCR和16S rDNA测序鉴定获得38株肠球菌,其中22株为粪肠球菌(Enteroccoccus faecalis)、10株屎肠球菌(E.faecium)、3株海氏肠球菌(E.hirae)、2株坚韧肠球菌(E.durans)和1株酪黄肠球菌(E.casseliflavus)。进一步考察了38株菌的毒力基因、溶血和明胶溶解表型和生物膜形成能力以及耐药性等,发现10株肠球菌(屎肠球菌WEFA23、WEFA24、WEFA26、WEFA28、WEFA30和WEFA32、海氏肠球菌WEHI01和WEHI02、酪黄肠球菌WECA01和坚韧肠球菌WEDU01)均无毒力基因检出,且不存在溶血或明胶溶解毒力表型,可作为安全性的益生菌进一步研究。
  第三章的研究对10株肠球菌的益生性能进行了体外评估和优选,包括体外降胆固醇作用、胆盐水解酶活力、耐受胆盐和胃肠道消化能力以及黏附Caco-2细胞能力,并通过小鼠急性毒力实验进一步验证了其安全性。结果表明,屎肠球菌WEFA23具有最好的体外降胆固醇能力(1.89±0.07mg/1010cfu)、最高的甘氨酸脱氧胆酸(GDCA)胆盐水解酶活力(1.86±0.01U/mg)、最强的胆盐耐受能力(1.0%胆盐相对存活率75.06%)。该菌株在模拟胃液、肠液中孵育2h活菌数分别下降了0.103log cfu/mL和0.423log cfu/mL,对Caco-2细胞的黏附率达17.90±0.19%,因而在机体中具有良好的定植能力。饲喂高剂量的屎肠球菌WEFA23并未对小鼠健康指标和肠道正常结构造成影响,未发现细菌移位现象。因而,屎肠球菌WEFA23具有最优的体外益生性能。
  第四章的研究探究了屎肠球菌WEFA23对高脂饮食大鼠体内降胆固醇作用。结果表明:屎肠球菌WEFA23有效降低了高脂饮食大鼠的血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和低密度胆固醇(LDL-C);减轻大鼠体重和内脏脂肪堆积;调节血糖稳态,降低血糖和胰岛素分泌,改善胰岛素抵抗。屎肠球菌WEFA23下调了脂肪酸合成酶(Fas)、硬脂酰CoA脱饱和酶(SCD1)和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HOM-COAR)等基因表达,减少了胆固醇的生成,促进胆固醇的分解和排泄。一方面,屎肠球菌 WEFA23能够促进结合胆汁酸解离,增加胆汁酸和胆固醇的排泄,下调成纤维细胞生长因子15(FGF15)基因的表达,上调胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)基因的表达,从而增加胆固醇的分解;另一方面,屎肠球菌WEFA23能够下调含黄素单氧化酶3(FMO3)基因的表达,降低氧化三甲胺(TMAO)的生成,解除TMAO对CYP7A1基因的负反馈调节作用,以加速胆固醇的分解。此外,通过16S rRNA基因高通量测序分析发现,屎肠球菌 WEFA23增加了高脂饮食大鼠肠道菌群的多样性,改变其肠道菌群向正常饮食组靠拢,增加拟杆菌门与厚壁菌门比例,并增加了与肥胖相关细菌-理研菌(Rikenellaceae)的丰度,降低了韦荣球菌科(Veillonellaceae)的数量。
  第五章结论与展望对肠球菌降胆固醇研究结果和机制进行了总结,对深入研究其降胆固醇分子机制进行了展望。
  综上所述,从38株婴儿源肠球菌中获得一株具有开发应用价值的益生性肠球菌-屎肠球菌WEFA23。该菌株能通过对肠道菌群产生有益改变来降低胆固醇的合成,调节胆汁酸代谢,显著降低机体TMAO和胆固醇水平。
  本文率先从mRNA水平和肠道菌群变化的角度探究了屎肠球菌的降胆固醇机制,发现屎肠球菌具有降低大鼠血清TMAO水平的作用,从而为屎肠球菌的应用提供了新的科学实验依据。
[硕士论文] 张炎焱
微生物学 黑龙江大学 2017(学位年度)
摘要:许多研究显示,益生菌对生物体具有多种生理功能,如调节肠道菌群,提高免疫力,降脂等。本课题在实验室前期工作的基础上,制备了短双歧杆菌微胶囊和植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌三菌复合微胶囊,并对这些微胶囊的体外性能进行了评价,然后研究了不同的微胶囊对肥胖小鼠模型的降脂效果。
  短双歧杆菌及植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌三菌复合微胶囊的研制实验内容及主要结果如下:试验用低甲氧基果胶(LMP)作为微胶囊壁材,短双歧杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌为芯材,采用离子交联法制备了短双歧杆菌微胶囊和三菌复合微胶囊,两种微胶囊的包埋率都在99%以上;体外模拟胃肠道试验结果显示,短双歧杆菌裸菌、短双歧杆菌微胶囊活菌数分别下降了4.82,1.76lg(cfu/g),三菌复合裸菌、三菌复合微胶囊活菌数分别下降了4.82,1.741g(cfu/g);保藏稳定性试验结果表明,LMP胶囊对短双歧杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌具有非常好的保护作用。
  益生菌微胶囊对高脂饮食肥胖小鼠降脂作用的研究方案及主要结果如下:试验小鼠分别喂以普通饲料和高脂饲料,肥胖小鼠建模成功后,将小鼠随机分为六组,即空白组A(喂以普通饲料),高脂对照组B(喂以高脂饲料),高脂阳性对照组C(喂以高脂饲料加奥利司他),短双歧杆菌微胶囊组D(喂以高脂饲料加短双歧杆菌微胶囊),植物乳杆菌-发酵乳杆菌微胶囊组E(喂以高脂饲料加植物乳杆菌-发酵乳杆菌微胶囊)和植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌复合微胶囊组F(喂以高脂饲料加植物乳杆菌-发酵乳杆菌-短双歧杆菌三菌复合微胶囊)。试验结果显示,各组微胶囊不同程度的减少了高脂饮食肥胖小鼠血清中TC、TG含量。微胶囊的干预减少了高脂饮食小鼠血清中IL-6、IL-2β、LPS、TNF-α的水平,并且缓解了高脂饮食肥胖小鼠肝细胞变性程度,减小了脂肪细胞尺寸,肠道上皮细胞未发生病理变化。高脂饮食使得小鼠肠道菌群结构发生明显的改变,厚壁菌门的比例明显升高,而微胶囊的干预不同程度的调节了菌群结构,使双歧杆菌和乳杆菌数量明显增加,肠杆菌和肠球菌数量明显减少。
  本研究结果表明:微胶囊可以调节高脂饮食小鼠相关的代谢及免疫功能,发挥了降脂作用。本试验结果为益生菌系列产品在改善人类健康领域的应用提供了数据支持。
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