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[硕士论文] 赵红晓
生态学;微生物生态学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素是地球上最丰富,潜力巨大的可再生资源,微生物降解纤维素是纤维素有效利用的一种绿色环保的方法。而绿色木霉(Trichoderma viride)可以产生纤维素酶来降解纤维素。
  本研究以绿色木霉(T.viride)AS3.3711菌株为实验材料,根据GenBank数据库上登录号为EU518927的T.viride AS3.3711的egⅦ基因序列来设计引物,通过DNA和RNA为模板进行PCR,得到的序列经过比对得出内切葡聚糖酶Ⅶ基因没有内含子,基因长度782bp,开放阅读框750bp,编码249个氨基酸,理论分子量26.8002KD,理论等电点7.62,信号肽是N端的19个氨基酸,属于糖苷水解酶家族61的一种胞外酶。
  为高效表达内切葡聚糖酶,将克隆到的egⅦ基因连接到表达载体pPIC9K上,获得重组质粒pPIC9K-α1-egⅦ,pPIC9K-α2-egⅦ和pPIC9K-α3-egⅦ。将重组质粒用电转化法转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中,测定内切葡聚糖酶酶活后,发现pPIC9K-05的酶活力最高。甲醇诱导酵母转化子表达,目的蛋白经SDS-PAGE鉴定成功表达,且大小与理论值基本相符。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)的方法检测毕赤酵母(P.pastoris)转化子经甲醇诱导后的表达量,研究表明:转化子的最大表达量出现在第三天。通过正交实验优化重组P.pastoris转化子的发酵条件,得出:甲醇含量为1%,YNB含量为1.34%,pH为6.0,培养温度为29℃时,产酶量最高,为106.91U/g。
  经酶学特性分析,结果显示:温度在40-60℃内酶活较稳定,其中60℃为最佳温度;pH在6.0-8.0范围内有较好的酶活稳定性,其中pH=6.0时最佳;金属阳离子对酶活的影响中,Ag+激活作用较强,Mn2+抑制作用较强;所选五种底物中,MCC效果最好,该内切葡聚糖酶底物饱和时反应速度Vmax=0.5635mg/(mL·min),米氏常数Km=0.2623mg/mL,速度常数Kcat=Vmax/E=0.1702S-1,相对催化效率Kcat/Km=0.6489mL/(S·mg)。
[硕士论文] 高震
微生物学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,PanD EC4.1.1.11)是微生物泛酸(由泛解酸和β-丙氨酸组成)生物合成途径中的关键酶,由panD基因编码,以丙酮酰基为催化活性中心,具有严格的底物特异性,可以催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸的合成途径只存在于微生物和植物细胞中,因此以L-天冬氨酸α-脱羧酶为靶点设计的抗真菌、抗细菌药物和除草剂对动物或人类无害。
  β-丙氨酸可用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品,用途非常广泛。目前国内β-丙氨酸主要采用化学合成法,存在成本高、生产条件对环境不友好等缺点,开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。但目前筛选到的产酶菌株产酶量较低、酶活性低,难以规模化生产和广泛应用。
  本研究通过传统纯培养技术,从亚热带海洋土壤沉积物样品中初步分离筛选到八十株具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的菌株,经纸层析复筛后选择其中4株酶活力较高的菌株进行菌种鉴定。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16S rRNA序列比对分析和系统发育分析,鉴定出这四株菌中有两株属于不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、一株属于普罗维登斯菌属(Providencia spp.)、一株属于发光细菌属(Photobacterium spp.)。
  以普罗维登斯菌株为研究对象,根据GenBank数据库中已有的普罗维登斯菌属天冬氨酸脱羧酶基因(panD)序列设计引物,PCR扩增获得L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(panDP)。以pET-30a(+)为载体、Escherichia coli DH5α为宿主细胞,构建了重组菌。生物信息学分析结果表明panDP基因包含一个长为381bp的ORF,编码一个由126个氨基酸组成的多肽,分子量预测为13.92kDa。panDP基因在核苷酸水平上与Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的aspartate1-decarboxylase precursor基因(GenBank登录号:FM162591.1)的一致性为81%;与Photorhabdus temperata subsp.thracensis strain DSM15199的aspartate decarboxylase基因(GenBank登录号:CP011104.1)的一致性为77%;在氨基酸水平上,PanDP与来自Providencia rettgeri的L-天冬氨酸α-脱羧酶(GenBank登录号:WP036958294.1)具有98%的一致性,但尚未发现其功能特征研究的相关报道。
  将构建好的重组质粒pET-30a-panDP转入表达宿主E.coli(DE3)plysS中,构建重组表达菌株。诱导表达的最佳条件为:以终浓度10g/L的α-乳糖为诱导剂,30℃诱导10h。镍柱纯化蛋白进行酶学性质分析,结果表明:在以L-天冬氨酸为底物时,PanDP的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,在最适反应条件下,金属离子的终浓度为5mM时,Ca2+、Al3+、Fe3+对酶具有促进作用,其中Al3+的促进作用最高,可达到140%。而Na+、Ba2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用,Na+的抑制作用比较微弱,Mn2+、Mg2+、Cu2+的抑制作用比较明显。该酶在低温条件下,比较稳定,超过55℃后,随着时间的延长,稳定性变差,但该酶在80℃下,保存1h,仍具有40%的酶活。当pH值为8.0时,该酶稳定性最好,在pH值为5.0到9.5的范围内,仍保持40%以上的酶活力,在pH值为7.5到8.5的范围内,保持60%左右的酶活力;Km为0.01602mmol/L,Vmax为1.6861μmol/min,kcat值为0.28s-1。
  对panDP基因进行定点突变,获得了四个突变体,分别为K9A,K9D,S25E,S25K;纯化这四个突变体蛋白,进行酶学性质研究,与野生重组酶PanDP相比,这四个突变体酶活性均丧失,由此可知氨基酸残基位点的第9位和第25位均与酶的活性相关。
  本研究完成了Providencia sp.GZ1和Acinetobacter sp.GZ8野生型菌株的鉴定,panDP基因的高效表达和功能分析;PanDP酶的最适反应温度较高,达到60℃,在80℃下仍保留较高的酶活,较高的酶反应温度使其在工业生产中有一定的应用价值和参考价值。
[博士论文] 李程程
生物医学工程 东南大学 2018(学位年度)
摘要:里氏木霉(Trichoderma reesei)因其蛋白分泌量大(100 g/L)、遗传性状稳定、生长繁殖迅速、培养条件简单和生物安全性等特点,已被广泛用于工业生产及各种异源蛋白的表达载体。并且,该菌在特定条件下可以产生大量的具有抗癌、抗病毒、抗菌特性的次级代谢产物黄色色素类物质,具有广泛的商业价值,次级代谢产物黄色色素的产生对纤维素酶的产生有一定的影响,二者受到相关调节因子的调控。同时,里氏木霉多个菌株的全基因组测序已经完成,这为研究里氏木霉纤维素酶、色素类物质的高产机制以及二者之间的相关性奠定了基础,也为基因改造获得具有优良特性的高产菌株提供了辅助手段。
  本论文主要以里氏木霉RUT-C30为出发菌株通过基因工程改造获得了在纤维素诱导条件下高产纤维素酶的基因工程菌TRB1、在纤维素和乳糖诱导下都能高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌SEU-7以及高产色素的基因工程菌ZC121121,并针对以上构建的基因工程菌研究了纤维素酶的高产机制、里氏木霉纤维素酶和色素产生之间的相互转化机制。之后,我们采用荧光标记的办法对里氏木霉三种主要的纤维素酶进行标记以研究纤维素酶的真实分布情况以及分泌机制。最后采用转录组测序及基因干扰等手段对纤维素酶的产生及其和色素产生的转化关系进行了深入研究。具体说来主要包含以下内容:
  1.构建了高产pNPGase/BGL(β-葡萄糖苷酶)的基因工程菌TRB1,并揭示了基因cel3d在纤维素酶高产中的作用及机理
  以里氏木霉RUT-C30为出发菌株,采用农杆菌介导的方法构建了高产β-葡萄糖苷酶的基因工程菌TRB1。qRT-PCR以及基因克隆实验显示TRB1中cel3d基因受到了干扰,是纤维素酶增加的原因之一。
  2.构建了乳糖诱导下高产纤维素酶的基因工程菌SEU-7并研究其高产机制
  首次构建了一株可以在乳糖诱导下高产纤维素酶的基因工程菌SEU-7。与出发菌株RUT-C30相比,SEU-7的纤维素酶和半纤维素酶活性无论在纤维素还是在乳糖诱导条件下都大幅度提高。以乳糖作为诱导物,在分批培养条件下,FPase(滤纸酶活)活性可以达到13 IU/mL;分批补料培养时,活性提高至47 IU/mL,此外,在分批培养过程中,SEU-7在纤维素和乳糖诱导条件下均表现出了极高的pNPGase活性,分别为81和144 IU/mL,是目前已知菌株中最高的。之后采用qRT-PCR、qPCR以及基因组重测序分析研究了其在不同碳源下的高产机理。
  3.敲除基因121121过程中引起的并行突变在里氏木霉纤维素酶和黄色色素产生中的开关作用
  通过构建基因121121干扰的基因工程菌及过表达121121的菌株,揭示了基因121121以及干扰该基因带来的并行突变在纤维素酶产生和黄色色素类物质sorbicillin分泌过程的开关作用,即,干扰121121以及带来的并行突变会降低纤维素酶产量但极大程度增加黄色色素sorbicillin的产量,并对该基因工程菌进行了RNA-seq分析。同时采用液质联用(HPLC-MS)的方法检测了敲除菌株ZC121121和过表达菌株OE121121的代谢产物。
  4.里氏木霉纤维素酶的产生、分布以及分泌机制研究
  采用红色荧光蛋白对三种主要的纤维素酶BGL、CMC/CMCase(内切葡聚糖酶)和CBH/pNPCase(外切葡聚糖酶)进行了标记,研究了三种纤维素酶产生的先后顺序、在细胞内的分布情况以及分泌情况,结果发现BGL在菌丝体内表达量最多,而后是CMC和CBH,然而,BGL的分泌却晚于CMC和CBH。共聚焦观察结果表明BGL和CBH是定位到细胞膜上的,而CMC没有定位到膜上,GC-Cholesterol-PEG-FITC共染、原生质体制备以及超高分辨结果更进一步的证明了BGL定位到了细胞膜上。通过进一步的内质网共染实验证明了三种主要的纤维素酶都会被输送到内质网进行加工修饰,并且三种酶都存在于囊泡中,高尔基体共染实验证明BGL和CMC都要经过高尔基体分泌到胞外,而CBH则可能不通过或少量通过高尔基体分泌。
[硕士论文] 钟越
微生物学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:为解决聚乙烯塑料在环境中难降解的问题,本研究筛选出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验和16SrDNA序列分析;将菌株先后接种于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw>100000)为唯一碳源的基础液体培养基中,28℃,180rpm培养;每24小时,用分光光度法测定菌体生长浓度和胞外蛋白含量;培养60天后,称取残留PE重量,用扫描电子显微镜观察膜片表观,用拉力测试机、水接触角测定仪以及红外光谱仪测定膜片性能。
  为进一步提高原始菌株对高分子量PE的降解能力,本研究对原始菌株进行了诱变处理。采用紫外辐照、微波热效应、LiCl、盐酸羟胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法对菌株进行诱变;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度筛选法,对诱变菌株进行筛选;通过诱变菌株在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中的菌体生长情况、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指标,选出降解性能最优的菌株,再将该菌株与原始菌株在相同培养条件下(以PE膜片为唯一碳源)培养60天,测定膜片力学性能。
  为找出降解PE的关键基因和代谢通路,我们将原始菌株在不同碳源培养条件下的(G组:以可溶性淀粉为唯一碳源;W组:以PE为唯一碳源)基因表达情况进行转录组测序分析,经RNA提取纯化、建库、测序、质控等过程,再进行GO、COG、KEGG数据库注释比对、聚类和富集分析;对两个处理组的基因表达量进行差异比较;最后随机选取差异基因进行RT-PCR表达量验证。
  结果表明,筛选出的菌株为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),命名为ZEL-1。该菌在分子量越低的聚乙烯培养液中,菌浓度、胞外蛋白含量、还原糖含量、聚乙烯失重率越高,菌液pH值下降得越快;电镜观察发现膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸强度降低74.15%,断裂伸长率减少84.90%,力学性能显著下降;水接触角从78.58±0.10°变小到41.25±0.16°,亲水性增大;红外光谱研究结果表明,膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。
  诱变育种结果表明,紫外辐照50s,微波诱变800Hz、120s,0.02%吖啶橙,0.7%LiCl,0.6%盐酸羟胺,为各方法的最优的诱变剂量。复合诱变采用紫外50s的突变菌株为出发菌株,再用0.02%吖啶橙诱变。PE培养基中菌体生长趋势,除盐酸羟胺组外,其他组均优于原始菌株组;紫外组胞外蛋白含量较原始组平均提高2.06倍,微波组平均提高1.24倍,吖啶组平均提高2.70倍,盐酸羟胺组平均提高1.60倍,复合诱变组平均提高3.30倍;盐酸羟胺组膜片失重率低于原始菌株组,其他组均高于原始菌株组,复合诱变组膜片失重率最大,高于原始组2.28倍;选择复合诱变组菌株UV-AO-1为优势菌株,PE降解60天后,UV-AO-1组水接触角比原始菌株组减小2.5°;拉伸强度减小3.37Mpa,断裂伸长率减少39.62%。
  转录组测序结果表明,此次共得到12372(63.24%)个非冗余Unigene,其中2095条Unigene富集于代谢过程组中;与COG数据库比对,有3328条Unigene与COG数据库中的基因具有同源性;涉及到代谢活动相关的Unigene占50.57%;发现差异表达基因423个,与G组相比,W组有293个基因表达上调,130个基因下调;AlkB基因差异表达最为显著。与KEGG Pathway数据库比对,有5776条转录本比对到KEGG数据库中,有92个代谢通路出现差异;碳代谢、氨基酸合成、丙酮酸代谢途径的差异基因表达上调数量较多,乙酰-CoA合成、脂肪酸代谢的相关基因表达差异上调显著,柠檬酸循环的差异基因下调明显。
  实时荧光定量PCR验证结果表明,荧光定量PCR得出的表达量与转录组测序结果的差异基因表达量上下调模式基本一致,证明此次转录组数据结果可信。
  综上所述,本研究菌株ZEL-1能够直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;诱变菌株UV-AO-1的降解性能优于原始菌株,具有更大的应用潜力。原始菌株在PE碳源的培养条件下,菌株代谢倾向于碳架构建,减少了糖类物质的合成和代谢;推测菌株ZEL-1对聚乙烯的降解始于Alk B基因编码的烷烃单加氧酶对聚乙烯的末端氧化断链作用,经由脂肪酸β氧化,完成PE的无机矿化。ZEL-1降解聚乙烯的基因表达差异,基本反映了不同碳源引起的代谢通路差异,为后期深入研究聚乙烯降解机理提供了理论依据。
[硕士论文] 郑福存
化学 东华理工大学 2017(学位年度)
摘要:目前,国内外对壳聚糖酶的研究主要集中在产壳聚糖酶菌株的筛选、酶的分离纯化及产酶条件优化等方面。由于大多微生物产生的壳聚糖酶活性较低,产量高,很难实现工业化的生产。随着分子生物学技术的不断发展,壳聚糖酶基因的克隆表达、重组、突变等技术在酶工程领域得到了广泛的应用。主要包括酶基因的定点突变,化学修饰改进酶的特性,提高酶活力和表达量等方面。运用基因工程技术克隆壳聚糖酶基因,分析酶的结构,构建产壳聚糖酶的重组微生物,是获得比自然酶活力更高、更稳定的工业酶的有效途径之一。
  本实验以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,成功克隆出一条壳聚糖酶基因。该基因序列大小831bp,编码277个氨基酸,理论分子量为31.3kDa,理论等电点为9.51。将该壳聚糖酶基因的DNA片段构建到热激表达载体pHsh中,得到含有壳聚糖酶基因的重组表达载体。将该表达载体转入大肠杆菌细胞中,通过菌落PCR和测序鉴定,证实了转化的成功,得到了表达壳聚糖酶的重组大肠杆菌。
  对重组壳聚糖酶的酶学性质进行了研究,得出结论:壳聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0。对壳聚糖酶的热稳定性研究结果表明,当温度为35℃时,相对酶活性为100%,当温度升高到50℃时,其相对酶活性下降了50%,表明该酶具有一定的热稳定性。对诱导后的宿主菌细胞进行有效破碎,使用镍柱对重组壳聚糖酶蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳检测结果表明,得到了分子量大小约为28kDa的蛋白质。根据米氏方程计算出Km值为2.952mg/mL,Vmax值为0.111mg/mL。
  运用PYMO对壳聚糖酶进行了同源建模分析,总体分子结构显示:该酶含有14个α螺旋和5个β链,组成了两个球状上部和下部结构域,产生用于底物结合的活性位点裂缝。该酶的分子折叠方式类似于来自链霉菌属的脱乙酰壳多糖酶。运用Biolog自动鉴定系统,对重组大肠杆菌对碳源、氮源的利用研究。结果表明;以四唑紫为还原染色剂,能够利用D-果糖等26种碳源,同时能够利用4种氮源,对8种抗生素有敏感作用。
[硕士论文] 尹畅
环境科学与工程 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是一种极为重要的n-3多不饱和脂肪酸,具有抗癌、抗炎、预防心血管疾病的作用,并能促进婴幼儿神经系统和视觉系统的发育和成熟。而裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)是属于破囊壶菌科的一类海洋真菌,体内积累了大量的DHA,是目前已知的DHA含量最高的海洋真菌,因其具有的重要经济价值而备受人们关注。因此通过对裂殖壶菌DHA合成途径的研究,利用生物工程方法来最大限度提高裂殖壶菌DHA产量,具有极为重要的生物学意义和经济价值。
  CRISPR/Cas9是一种高效准确的新兴基因编辑技术,目前已应用该技术成功在多个物种实现基因编辑。本文旨在以裂殖壶菌为研究对象,通过构建相应的CRISPR/Cas9基因编辑系统,对裂殖壶菌中与脂肪酸合成相关的基因进行敲除,并替换为Zeocin抗性基因片段,初步探索CRISPR/Cas9基因编辑系统在海洋真菌裂殖壶菌中的应用,以及相关基因敲除后对脂肪酸产量的影响。据此,本实验的主要内容及研究结果如下:
  (1)为了确定本实验的选择标记基因,从而能够成功筛选出转化菌株,本实验选取了基因工程中常用的抗生素Zeocin、氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan),分别研究其对裂殖壶菌生长的影响,结果表明,浓度为50μg/mL和100μg/mL的氨苄青霉素和卡那霉素对裂殖壶菌的生长基本没有影响,而Zeocin抗生素浓度为50μg/mL时,裂殖壶菌的生长受到一定的抑制作用,当Zeocin浓度为100μg/mL时,裂殖壶菌的生长被完全抑制,且到第十天仍没有菌落出现,所以本研究选择Zeocin作为裂殖壶菌的抗性筛选试剂,筛选浓度浓度为100μg/mL。
  (2)根据专门的设计网站https://www.dna20.com/products/crispr设计出用于敲除裂殖壶菌PKS亚基PksD基因的gRNA序列,并将该序列构建进能够高效表达CRISPR/Cas9系统的pCRISPR-Schi载体中。利用重叠延伸PCR克隆出带有PksD基因上下游区域同源序列的Zeocin抗性基因片段,通过电转化方法将该片段与CRISPR载体转入裂殖壶菌中,成功得到PksD基因敲除的裂殖壶菌菌株,且转化效率达到80%。而通过对转化菌株和野生型菌株生物量的测定可知,细胞干重并没有太大差异,说明CRISPR载体和抗性基因片段的插入对菌株的正常生长没有太大影响,也进一步说明CRISPR/Cas9基因编辑系统适用于海洋真菌裂殖壶菌,并且能够快速、高效地对裂殖壶菌进行相关基因的敲除与加入。
  (3)对敲除PksD基因的裂殖壶菌阳性菌株,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对其脂肪酸含量进行测定,结果发现,转化菌株与野生型菌株相比,各转化菌株总脂含量均有一定程度的提高,而脂肪酸的组成没有发生变化,但与野生型菌株相比,转化菌株的DHA含量降低约20%,说明PksD基因的破坏对总脂和DHA的合成产生了影响,进一步说明PksD基因在裂殖壶菌脂肪酸合成的PKS途径中起着比较重要的作用。该体系的构建为后续运用CRISPR/Cas9系统研究裂殖壶菌的基因功能奠定了基础。
[硕士论文] 王珏玉
微生物学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:以微生物来源的灵芝孢子为原材料,利用灵芝孢子自身为模板,采用高温碳化法将灵芝孢子制备成中空微球;灵芝孢子中空微球通过负载磁性纳米粒子形成磁性灵芝孢子微球。
  通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、能谱分析(EDS)与傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析灵芝孢子中空微球,实验结果表明其经过高温碳化后形态完整,内部有空腔,表面存在有机官能团和化学键。采用透射电子显微镜(TEM)、X-射线衍射(XRD)、振动样品磁强计(VSM)以及氮气吸附脱附实验(BET)等方法来表征磁性灵芝孢子微球,透射电镜的结果表明磁性灵芝孢子内部存在纳米粒子,成分是由Fe、O元素组成的Fe3O4;磁学性质方面,较低的剩磁(Mr=0.53emu/g)和较高的磁矫顽力(Hc=58.7Oe),可以通过外加磁场下迅速分离。
  磁性灵芝孢子微球在H2O2存在的条件下,可以催化氧化过氧化物酶底物TMB产生蓝色物质,在652nm处有吸收峰,证明其具有类过氧化物酶活性,最适pH为4.0,最适温度范围为30℃-35℃,以TMB为底物,反应符合米氏催化动力学,Km=0.095mM;磁性灵芝孢子微球还可以催化H2O2分解产生氧气,证明其具有类过氧化氢酶活性。
  磁性灵芝孢子微球可以作为吸附剂去除难降解染料刚果红,此吸附进程更符合准二级吸附速率方程和Freundlich吸附等温线模型;热力学分析表表明磁性灵芝孢子微球对刚果红的吸附是一个自发有序的过程。
  磁性灵芝孢子可以作为固定CotA蛋白的载体,利用CotA蛋白催化的性能降解橙黄Ⅰ;10mg的固定化CotA蛋白在60min内可以完全催化降解浓度为50mg/L橙黄Ⅰ,并且利用磁性重复回收利用多次酶活损失仅为16%,表面固定CotA蛋白对橙黄Ⅰ具有良好的脱色能力和重复再利用性。
[硕士论文] 刘小利
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans,DR)因其具有对非生物胁迫超强的抵抗能力而备受关注。基因组学注释表明,耐辐射异常球菌中含有3个基因(dr1372、dr0105及dr1172),其编码产物与植物干燥抗性相关的胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)同源。D.radiodurans基因组中dr0105基因编码的蛋白具有高度亲水性,为LEA3家族蛋白,本研究将该蛋白命名为Dlp(Deinococcus radioduransLEA3 protein)。本研究通过生物信息学分析、转录分析及基因缺失突变、蛋白外源表达与纯化、体外酶活等生理生化指标的测定,对Dlp蛋白的非生物胁迫抗性进行了初步研究,主要取得如下进展:
  生物信息学分析显示,耐辐射异常球菌Dlp蛋白含有163个氨基酸,分子量为17.83kDa,富含丰富的亲水性氨基酸,α螺旋结构高达90.18%,是一类稳定的亲水性蛋白,属于LEA3家族蛋白。qRT-PCR结果显示dlp基因在D.radiodurans突变株ΔdrRRA中表达量显著下调,表明dlp基因可能受D.radiodurans反应调控蛋白DrRRA的调节。据此推测Dlp蛋白可能同大多数LEA3家族蛋白一样具有一定的非生物胁迫抗性,在D.radiodurans中可能参与由DrRRA介导的耐盐、抗氧化、耐辐射等非生物胁迫过程。
  为了研究Dlp蛋白的抗逆功能,本研究利用融合PCR方法构建了耐辐射异常球菌dlp基因缺失突变株(Δdlp),非生物胁迫实验结果显示,dlp基因的缺失导致细胞对高盐、强氧化胁迫极为敏感,UV辐照对其无影响;构建外源表达菌株E32a-dlp并对其进行非生物胁迫实验,结果表明,Dlp蛋白能够显著增强大肠杆菌耐盐、耐高渗及抗氧化胁迫的能力;体外逆境胁迫胁迫条件下(氧化、反复冻融)测定苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)酶活性,结果显示Dlp能够有效地MDH、LDH酶活性。
  综上所述,耐辐射异常球菌亲水蛋白Dlp对耐辐射异常球菌的UV抗性无贡献,但能增强耐辐射异常球菌及大肠杆菌耐盐、抗氧化等非生物胁迫抗性,还能起着分子伴侣的功能保护酶活性免受胁迫损伤。
[硕士论文] 黄一锋
生物工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:S-腺苷蛋氨酸(SAM)参与生物体细胞内转甲基、转硫基和聚胺合成等多种重要的反应,它在治疗肝病、抑郁症和关节炎等疾病中起着重要的作用,目前市场需求量巨大。生物体能直接利用L-甲硫氨酸合成SAM,但不能直接利用D-甲硫氨酸,势必造成了D-甲硫氨酸的浪费。本文对酿酒酵母模式菌株BY4741进行改造,实现在BY4741细胞内D-甲硫氨酸的积累,并将D-甲硫氨酸转化为L-甲硫氨酸,最终提高BY4741胞内SAM的产量。
  运用标记回收的基因敲除技术在BY4741中敲除hpa3,发现敲除hpa3有利于D-甲硫氨酸在BY4741中的积累。利用多片段重组技术将ENO2启动子、D-氨基酸氧化酶、ENO2终止子、TEF2启动子、L-苯丙氨酸脱氢酶、TEF2终止子以及多拷贝质粒p426的骨架重组成一个新质粒pR426,转入迸BY4741(△hpa3)中,通过蛋白电泳及粗酶液反应证明改造菌成功表达D-氨基酸氧化酶和L-苯丙氨酸脱氢酶,并且菌体表达的两个酶均有酶活。将改造菌株进行摇瓶发酵培养考察其生产SAM的能力,结果显示相比于出发菌,改造菌株的SAM产量提高了18.3%,最大SAM胞含量提高了31.2%。
  利用CRISPR/Cas9系统对BY4741中的hpa3和erg6基因进行编辑,研究BY4741中CRISPR/Cas9系统的工作效率。为以后利用CRISPR/Cas9系统调控酿酒酵母中SAM的代谢网络提供方法依据。
[博士论文] 李英俊
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统广泛分布于古菌和细菌中,是一种抵御病毒和质粒等外源遗传物质的获得性免疫系统。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统已被分为两大类和六个亚型,其中主要的三个亚型(Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型)得到了广泛的研究。Ⅱ型CRISPR/Cas9系统目前已被广泛应用于不同的细菌和真核生物的基因组编辑;此外,Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR-Cas系统还被开发成抗菌剂来选择性消除特定的菌群。但是,迄今还没有利用Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统进行基因组编辑的报道。
  本研究在冰岛硫化叶菌中开发了一种基于其内源的Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法。该方法只需要构建一个新型的基因组编辑质粒(pGE),该质粒携带一个提供能靶向干涉或沉默基因的成熟CRISPR RNA的人工mini-CRISPR簇以及一个含有非靶标序列的用于同源重组的供体DNA片段。将pGE质粒转化到宿主细胞之后,细胞将会有两种命运:野生型细胞因基因组DNA被靶向降解而死亡;而那些基因组与供体DNA发生了同源重组从而携带突变基因的细胞能免于干涉而成为转化子存活下来。利用该方法,本研究实现了不同类型的基因组编辑,包括缺失、插入和定点突变。我们相信该方法可以推广到其它含有能干涉DNA的CRISPR-Cas系统的细菌和古菌。
  研究不同CRISPR-Cas系统的分子机制是应用开发的基础,且已成为当前生物学研究的热门领域之一。已有研究表明,Ⅲ型CRISPR-Cas系统与其它类型有显著不同的核酸干涉活性,其既有RNA酶活性也有RNA激活的DNA酶活性。我们的前期研究已经揭示了冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统在体内同时具有RNA干涉活性和依赖于转录的DNA干涉活性。为了更深入的解析相关机制,本研究用一个携带43nt SS1spacer(靶向lac基因上protospacer SS1)的人工mini-CRISPR质粒,从冰岛硫化叶菌中纯化出天然Cmr-α复合物,并对其进行了系统的体外研究。研究发现,Cmr-α复合物能切割与复合物中的crRNA互补配对的靶标RNA,同时该靶标RNA又能激活Cmr-α复合物的ssDNA切割活性,该活性需要靶标RNA的3'端侧翼序列与crRNA的5'端tag序列错配。此外,激活的Cmr-α复合物能够快速切割大量的ssDNA底物,这说明Cmr-α系统可以快速消灭复制中的病毒DNA。
  为了揭示Cmr2α蛋白在Cmr-α系统DNA干涉活性中的功能,本研究针对Cmr2α的HD和Palm两个结构域构建了四个突变株,分别命名为HD-M1(H14N和D15N),HD-M2(H14N, D15N,K19A和I23A), Palm-M1(G666K和D667K)和Palm-M2(662-IYlGGDDiLA-671—AAlAAAAiAS)。体内干涉质粒分析显示,其中3个多氨基酸突变株HD-M2、Palm-M1和Palm-M2都丧失了DNA干涉活性。而HD结构域的双氨基酸突变株HD-M1却只是消除了体外的DNA切割活性。这些结果表明,Cmr2α的HD和Palm两个结构域都是Cmr-α系统体内DNA干涉所必需的,而体外检测到的ssDNA切割活性可能只是HD结构域介导的。
  此外,Ⅲ型CRISPR-Cas系统的crRNA加工成熟和靶标核酸的结合机制仍然是不清楚的。本研究用携带不同长度spacer(14,20,28,40和76nt)的人工mini-CRISPR质粒分别纯化Cmr-α复合物。结果显示,无论spacer长短,Cmr-α系统都合成固定长度的crRNA(40nt和46 nt)。这说明mini-CRISPR簇下游的repeat元件可以在没有被加工情况下补充为crRNA序列。此外,一个仅含有上游repeat元件和40nt spacer的人工mini-CRISPR质粒也能合成一样固定长度的crRNA。这些结果表明,Cmr-α复合物的组装可能是从crRNA的5'端tag区域(经Cas6初加工产生)起始,而crRNA的3'端则由其它未知的RNase加工成熟,从而组装成两个固定大小的复合物。另外,对这些复合物的体外切割活性和结合靶标RNA能力的分析表明,随着复合物中crRNA的3'端区域和靶标RNA的5'端序列错配碱基数的增加,不能被复合物结合和切割的RNA底物的数量也随之增加。
  在Ⅲ-B型效应复合物的结构模型中,结合crRNA的3'端区域的是Cmr1亚基。本研究在冰岛硫化叶菌中构建了一个Cmr1α缺失突变株和两个关于Cmr1α的丙氨酸替换突变株,分别命名为△β△1α,△β1α-M1(W58A和F59A),△β1α-M2(I52A,G54A,R57A和R61A)。体内基于mini-CRISPR的报告基因法分析表明,△β1α-M1的RNA干涉活性相比野生型菌株大大降低,而△β△1α和△β1α-M2则基本丧失了RNA干涉活性。
  纯化Cmr1α三个突变株的Cmr-α复合物发现,突变株△β1α-M1 Cmr-α复合物的组分和野生型基本一样,而突变株△β1α-M2 Cmr-α复合物的组分却和△β△1α一样,都缺少Cmr1α蛋白。同时,体外RNA切割实验与体内的RNA干涉活性分析结果一致。在靶标RNA激活的DNA切割活性分析中,突变株△β△1α和△β1α-M2的复合物均基本丧失了DNA切割活性,突变株△β1α-M1的Cmr-α复合物也只检测到相比野生型复合物非常弱的DNA切割活性。此外,EMSA实验结果显示,△β△1α和△β1α-M1的Cmr-α复合物均很难与靶标RNA形成三元复合物(Cmr蛋白,crRNA和靶标RNA)。以上结果表明,Cmr1α在Cmr-α复合物与靶标RNA形成三元复合物过程中扮演关键角色。两个保守的疏水氨基酸(W58和F59)是Cmr-α复合物结合靶标RNA所必需的,另外四个氨基酸(I52,G54,R57和R61)可能主要介导Cmr1α与crRNA相互作用,从而形成完整的Cmr-α复合物。
[硕士论文] 顾小飞
生物工程 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:链霉菌 SH-62是一株具有良好生物活性的吸水链霉菌,对革兰氏阳性菌有很好的抗菌效果,对酵母以及多种植物病原真菌也有良好的拮抗作用。生物信息学分析发现链霉菌SH-62基因组中存在一个I型聚酮合酶(PKS)基因簇—gld基因簇,与Streptomyces autulyticus CGMCC0516中格尔德霉素生物合成基因簇(gdm)具有同源性。前期研究发现无论是在野生型链霉菌SH-62还是gld基因簇的异源表达菌株中均没有检测到格尔德霉素的产生,暗示着gld基因簇可能产生新的代谢产物。此外gld基因簇中存在4个gap,序列相似度很高,序列拼接困难。
  本研究首先通过特异性引物的PCR扩增以及构建阳性BAC质粒的亚克隆进行测序分析,成功填补了gld基因簇中剩余的4个gap区,获得了完整的gld基因簇序列信息。将完整的基因簇序列重新进行生物信息学分析,证实除了甲基转移酶的位置不同外,gld基因簇与格尔德霉素生物合成基因簇 gdm的组成和排布几乎完全相同。同时为了验证前期实验结果的正确性,还重新构建了gld基因簇的异源表达菌株,并且通过TLC和HPLC分析证实异源表达菌株确实能够产生新的代谢产物GD-上和GD-下。
  为了进一步验证两种异源表达产物与gld基因簇的相关性,尝试利用CRISPR/Cas9-CodA(sm)系统来敲除核心PKS基因gldAIII,已完成敲除质粒的构建,尚未筛选到正确的缺失突变菌株。同时利用λred介导的PCR-targeting技术构建了核心PKS基因gldAI的缺失突变菌株S.albus::pGXF001,发现该基因缺失后两种异源表达产物在TLC和HPLC检测中的相应信号消失,表明这两种物质确实由gld基因簇异源表达产生。通过LC-MS分析发现这两个物质的质荷比m/z分别为269.0797和285.0758,对应的分子式为C16H12O4和C16H12O5。
  
[硕士论文] 徐茜茜
水产品加工及储藏工程 河南科技学院 2017(学位年度)
摘要:酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的双重生理生化特征,其芽孢具有更强的耐高温高酸特性,当外部条件适宜时迅速萌发并生长繁殖,引起果汁腐败变质,对低pH食品工业的巴氏灭菌工艺提出严峻的挑战,该菌的危害控制已成为食品研究领域普遍关注的问题。芽孢萌发是细菌开启生长繁殖的关键环节,同时失去极端抗性,是其危害控制的重要阶段。本文研究了不同营养因子对酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢形成及pH值对其芽孢萌发的影响,通过芽孢萌发过程中的蛋白组学研究,揭示其芽孢在低pH条件下萌发生长的调控机制,为控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染及如何修订低pH食品的巴氏杀菌工艺提供理论依据。
  本研究主要内容包括:⑴葡萄糖、酵母浸粉、Mn2+、Mg2+对酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体密度和芽孢形成率影响显著,而Ca2+、NH4+和K+的影响不显著,其中过量的Mn2+和Mg2+会抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的生长,Ca2+与K+或者与NH4+协同作用时可以促进酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的形成。⑵通过芽孢菌悬液光密度检测和环境扫描电镜检测,发现酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢萌发的最佳pH值为4.0;在pH3.0和5.0条件下,芽孢萌发过程延长,pH为2.0时芽孢外壁受到破坏。⑶酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢在pH3.0条件下萌发2 h,有98种蛋白差异表达,分子功能主要集中在磷酸三酯活性、乳酰谷胱甘肽裂解酶活性、核糖体的结构组成、分子结构活性、转移酶活性、肽酶活性和外肽酶活性等;生物学过程主要集中在有机氮化合物生物合成和代谢、蛋白代谢、谷氨酰胺代谢、细胞蛋白代谢和有机物合成等中;涉及的通路有 beta-内酰胺抗性、核糖体、次级代谢产物合成、丙酮酸代谢、卟啉和叶绿素代谢、萜类化合物骨架合成、双组分系统和细菌分泌系统等。
[硕士论文] 李清云
海洋化学 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:海洋水体的富营养化导致赤潮频繁暴发,有害赤潮藻所产毒素在贝类体内富集形成贝类毒素,严重危害消费者的身体健康,阻碍水产品对外贸易的发展,成为影响贝类产业可持续发展的瓶颈之一。本文以新型贝类毒素氮杂螺环酸毒素为研究对象,建立多种AZAs毒素的Q-Exactive高分辨质谱检测方法,同时在实验室内对产自我国沿海的一株氮杂螺环酸产毒藻AZDY06进行单种培养并对其产毒能力进行了评估。随后,应用该产毒藻对栉孔扇贝进行暴露实验来研究氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的代谢轮廓,及其对栉孔扇贝组织结构和生理的胁迫作用等方面进行了实验研究。论文的主要内容如下:
  (1)采用Q-Exactive高分辨质谱,在液相色谱-串联质谱法基础上进一步创建了AZA毒素高分辨非定向定性筛查和低分辨目标物定量筛查检测方法,对蓄积代谢试验样品进行综合分析,根据化学分子式计算各AZAs的精确质量数,精确筛查到了AZA2在贝类蓄积代谢过程产生的四种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19和AZA23),并使用液相色谱-串联质谱对实际阳性样品进行了定量检测,达到了同时精准定性和精确定量的要求,适用于氮杂螺环酸毒素代谢物质的的筛查分析工作,为进一步完善我国水产品中贝类毒素的监控体系提供可靠的工作基础和技术支撑。
  (2)将栉孔扇贝(Chlamys farreri)暴露于三种产毒藻不同生物量模式下模拟赤潮爆发时初期、中期和后期海洋环境过程,通过比较毒素组分、各组织器官中毒素的蓄积及代谢转化特异性,研究氮杂螺环酸毒素(Azaspiracid,AZAs)在栉孔扇贝体内危害形成的过程。结果显示,分布于我国南海海域的氮杂螺环酸产毒藻(A.poporum,AZDY06株),其生长及产毒性状稳定,产毒能力较强,主要产生AZA2毒素,单细胞产度能力一般为7.05±0.52fg/cell;投喂低生物量产毒藻组扇贝体内有共有三种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19)产生,中生物量和高生物量实验组有四种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19和AZA23)产生,说明贝类摄食产毒藻生物量的大小影响代谢产物组分的转化过程;中生物量和低生物量组在暴露阶段的变化趋势相似,都是在蓄积阶段呈现迅速上升的趋势,达到最高点随后呈现总体下降趋势,而高生物量组在蓄积阶段呈现迅速上升的趋势,在蓄积前期既已达到峰值后呈急剧下降趋势,随后缓慢增加直至暴露结束后,比较而言,各实验组对AZAs毒素蓄积能力由大到小顺序为:中生物量组>高生物量组>低生物量组,其中以中生物量组蓄积能力最强。实验数据初步探究了AZA2在栉孔扇贝体内的代谢转化机制,为后续实验奠定基础。
  (3)前期实验表明,高生物量产毒藻暴露实验会增加栉孔扇贝体内代谢产物的组分种类和各组分的含量,但是随之也会加重对扇贝的毒害作用,会降低扇贝对氮杂螺环酸毒素的蓄积能力,暴露时间越长,扇贝对毒素的蓄积代谢能力越弱。所以将栉孔扇贝(Chlamys farreri)直接暴露于更高生物量产毒藻,同时缩短暴露时间。结果表明,栉孔扇贝对该产毒藻具有较强摄食能力及AZAs蓄积能力,扇贝在12h内摄食5×107cells产毒藻细胞后,体内AZAs毒素含量已超欧盟安全限量,达165.3μg AZA1 eq/kg,蓄积效率为78.2%;AZAs毒素在扇贝各组织间分布存在显著差异:内脏团>鳃>外套膜>闭壳肌,内脏团中毒素组份最多且AZAs毒素含量最高,为该毒素在栉孔扇贝体内蓄积代谢的靶器官;AZA2在扇贝中潜在转化方式不同,包括碳键位的羟基化、去羧基化和氧化等作用方式;暴露期间共生成4种代谢产物:AZA6、AZA12、AZA19和AZA23,其中AZA19为最主要代谢产物,约占总毒素40%左右,其他代谢产物含量较低,因此像AZA19这种持久性代谢产物,应成为我国AZA限量标准制定的潜在考虑对象。本研究证明我国近海分布氮杂螺环酸产毒藻毒性危害较强,建议加快制定AZAs限量标准。
  (4)暴露于三种不同生物量模式下的栉孔扇贝在暴露实验初期,内脏团和鳃组织内的抗氧化防御系统中的氧化还原酶被激活,MDA含量增多,脂质发生过氧化,相应的GSH-PX和POD酶活力均增强,粒细胞分泌的ACP、POX活力增强。综合AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织的超微结构的损害以及引起的组织中氧化还原酶的激活作用,可共同为AZAs胁迫下贝类的组织毒理学指标的确立提供理论依据。实验结果显示:暴露实验过程中,在AZAs的作用下栉孔扇贝内脏团和鳃组织的超微结构均出现了病理变化,内脏团的肠上皮细胞空泡化,细胞核萎缩变形,严重时细胞坏死裂解,且损伤程度随暴露毒素生物量的增加而加重;暴露前期,鳃的柱状上皮细胞中线粒体和溶酶体增多且聚集,后期上皮细胞肿胀破裂,粘液细胞大量释放粘液颗粒。通过暴露实验检测内脏团和鳃组织中抗氧化防御系统中氧化还原酶的变化,同时观察了AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织超微结构的毒理学作用进一步研究AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织的毒理学胁迫作用。
[硕士论文] 李宏彪
天然产物化学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:甘草次酸是五环三萜化合物的一种,由于其广谱的药物活性和特殊的中间体结构被广泛地应用于医药、化妆品和食品等领域,具有抗炎、抗病毒、降血脂、防治肿瘤和抗艾滋病等多种作用,也是一种极其重要的解毒剂。甘草次酸目前主要由甘草酸水解产生,生产工艺复杂、周期长、耗能高、污染环境、成本高、产品收率低,不符合绿色发展理念。随着代谢工程与合成生物学的不断发展,人工构建微生物在合成天然产物方面显示出了独特的优势,已成为国际工业生物技术研究的焦点。本研究利用分子生物学技术和代谢工程手段,在酿酒酵母中引入异源甘草次酸合成途径,并对甘草次酸合成途径进行优化,结合优化发酵方式和改变碳源的来源,提高酿酒酵母工程菌中甘草次酸的产量。研究结果如下:
  通过文献检索和酿酒酵母全基因组序列分析,确定并克隆了用于控制功能基因表达的启动子和终止子;依据酿酒酵母密码子的偏好性,密码子优化后化学合成了来源于光果甘草中的β-香树脂醇合酶bAS、P450单加氧酶CYP88D6和CYP72A154;克隆获得了来源于拟南芥的P450还原酶AtCPR1和AtCPR2。按照启动子—功能基因—终止子模式通过重叠延伸PCR构建了β-香树脂醇合酶、P450单加氧酶和 P450还原酶的基因表达盒,并通过同源重组方式将基因表达盒整合到单倍体酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组上,在酵母中实现了甘草次酸人工合成途径的构建,液相色谱质谱证明在工程菌中成功合成目标产物甘草次酸,产量达到25.5μg/L。
  分别以单倍体酿酒酵母CEN.PK2-1C、CEN.PK2-1D和二倍体酿酒酵母INVSc1为底盘宿主,研究了甘草次酸合成途径与底盘宿主的适配性关系,发现以单倍体酿酒酵母为底盘宿主更有利于甘草次酸的合成,比以二倍体酿酒酵母INVSc1为底盘宿主时甘草次酸产量提高了100%。
  以三萜合成途径中的直接前体物2,3-氧化鲨烯为代谢调控节点,过表达酿酒酵母内源基因鲨烯单加氧酶(ERG1)促进鲨烯转化为2,3-氧化鲨稀,过表达鲨烯合酶(ERG9)以提高鲨烯供应,使甘草次酸的产量提高到36.1μg/L。
  从发酵工程角度考虑,以补料批式发酵方式培养工程酿酒酵母,发酵结果表明,以葡萄糖为碳源补料批式发酵时,甘草次酸产量提高了71.8%,当以乙醇补料批式发酵时,甘草次酸产量达到48.6μg/L,比葡萄糖为碳源补料批式发酵提高了73%,说明乙醇作为碳源更有利于甘草次酸的合成。
[硕士论文] 雅男
食品科学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是自然界中最丰富、来源最广泛的有机物质,它是地球上重要的可再生资源。黑龙江省有着丰富的纤维素资源,但大部分纤维素被焚烧、废弃、对环境造成严重污染。要使纤维素被分解转化成小分子化合物或其它营养物质,筛选分离出能够降解纤维素的优良菌是关键。本文对纤维素降解菌的筛选、产酶条件的优化、酶学性质并对纤维素酶降解菌基因组进行了初步研究,主要研究内容和结果如下:
  1.纤维素降解菌的筛选
  利用羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基、结合碘液染色法、滤纸分解实验和纤维素酶活力测定,从熊猫粪便中筛选出一株纤维素降解菌。结合形态学观察、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析,初步鉴定为Paenibacillus cookii LZ033,它是一种产芽孢且好氧的革兰氏阳性细菌。
  对小鼠灌胃Paenibacillus cookii LZ033菌液,采用一次性灌胃,灌胃菌液浓度为3×108CFU/mL、3×107CFU/mL、3×106CFU/mL,并设置阳性对照组,灌胃剂量均为0.2mL/10g体重。观察14天,未出现中毒症状,无死亡现象,肝脏、脾脏及胸腺无异常改变。
  2.纤维素降解菌发酵产酶条件的优化
  Paenibacillus cookii LZ033菌株的液体发酵产酶培养基:葡萄糖添加量0.99%、蛋白胨添加量0.97%、硫酸镁添加量0.076%、磷酸二氢钾添加量0.31%,在此条件下纤维素酶活力为92.2U/mL。
  Paenibacillus cookii LZ033菌株的液体发酵产酶条件:培养基初始pH6.6、培养温度36℃、摇床转速121r/min,装液量120mL/250mL三角瓶,在此条件下纤维素酶活力为97.8U/mL。
  3.酶学性质的研究
  纤维素酶活力在60℃~70℃之间比较稳定;纤维素酶活力在pH3~4.6之间比较稳定;酶促反应最适温度为70℃;酶促反应最适pH为3。
  金属离子浓度为1mmol/L的条件下,Fe2+、Mn2+对纤维素酶具有明显的激活作用。Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+对纤维素酶具有明显的抑制作用。添加少量的 Fe2+、Mn2+有利于提高菌株的产酶能力。
  4.基因组初步分析
  采用 Illumina公司开发的Miseq测序平台进行测序,根据基因组序列对Paenibacillus cookii LZ033的基本遗传信息进行了初步分析。
  Paenibacillus cookii LZ033基因序列全长为3978050bp,GC含量为46.46%。通过使用Cenemark软件对基因组进行预测,使用COG、GO及 KEGG等数据库进行了注释。共预测到4049个基因,编码基因的序列占整个染色体序列的88.7%,平均长度为878bp。对COG、GO及KEGG注释结果进行检索,Paenibacillus cookii LZ033一共含有10个编码纤维素酶的基因,这些基因编码的酶包括β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶。
  Paenibacillus cookii LZ033含糖酵解途径、柠檬酸途径、磷酸戊糖途径及淀粉和蔗糖代谢途径,可以为自身提供能量,维持正常的生理活动。Paenibacillus cookii LZ033基因组测序为它的应用和研究提供了良好的理论基础。
[硕士论文] 段静
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:甲壳素在自然界中的含量极其丰富,是仅次于纤维素的第二大多聚物,壳聚糖可由甲壳素制备而得。壳聚糖降解产物在医学、农业、工业等多个行业中都有着很高的应用价值,比如,壳寡糖可以显著提高鱼类的免疫力,是优良的水产饲料添加剂。由于壳聚糖的分子量大,溶解度低,使得其直接应用往往具有较大的局限性。因此,探索对壳聚糖进行高效降解具有重要的理论和生产意义。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是广泛存在于自然界中的芽孢杆菌属的成员。利用以壳聚糖为唯一碳源的选择性培养基,我们筛选到一株可以高效降解壳聚糖的解淀粉芽孢杆菌,并开展其壳聚糖酶活性的研究,得到如下结果:
  1、根据细菌的形态、生理生化特征,并结合16S rDNA和gyrA基因,鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌,并对该菌株进行命名为HZ-1510。
  2、克隆了解淀粉芽孢杆菌HZ-1510的壳聚糖酶基因,通过生物信息学技术分析了该基因的结构,该壳聚糖酶基因开放读码框全长为837bp,可以编码279个氨基酸,分子量大小为31.45kDa。在其氨基末端具有信号肽,切割点位于第36位和37位氨基酸之间。氨基酸序列同源性分析结果显示该壳聚糖酶属于GH46家族,与解淀粉芽孢杆菌ABBD菌株和MBE1283菌株所编码的壳聚糖酶同源性最高。此外,Glu-55和Asp-71氨基酸为该壳聚糖酶的催化活性位点。
  3、构建谷胱甘肽转移酶(GST)-壳聚糖酶融合蛋白表达质粒pGEX-5X-1-Chi,在大肠杆菌BL21中表达,利用GST亲和层析柱纯化壳聚糖酶。
  4、研究了温度、pH和金属离子对重组壳聚糖酶的水解活力的影响,结果表明,该重组壳聚糖酶的最适反应温度约为55℃,最适pH为5.5。金属离子Mn2+、Ca2+和Mg2+对其活力起增强作用,但Fe3+、Ag+、Cu2+、Ba2+和K+对其水解活力都起抑制作用。低浓度的Zn2+对壳聚糖酶的活力起到了微弱的增强效果,但提高Zn2+的浓度会使壳聚糖酶的活力起抑制作用。
[硕士论文] 吴小丽
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:铁是生物体正常生长不可或缺的元素,而细胞内过量的铁离子会引起Fenton反应而产生ROS,从而导致细胞氧化损伤。已有研究表明生物体中,铁蛋白具有氧化胁迫抗性、调节细胞内铁离子浓度等作用。极端耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)抗氧化基因组序列分析,发现一个的类铁蛋白编码基因(drB0118),已有的研究表明该蛋白失活导致细胞对干燥胁迫敏感,但在调节细胞内铁离子浓度及氧化胁迫抗性的作用尚无报道。本研究通过生物信息学分析、基因突变和异源表达等方法对DrfE蛋白的抗氧化功能进行初步研究,主要取得如下研究结果:
  (1)利用生物信息学方法,对耐辐射异常球菌DrfE进行生物信息学分析,发现drfE位于耐辐射异常球菌基因组大质粒上,该蛋白由337个氨基酸组成,含有一个与铁蛋白类似保守结构域,属于铁蛋白2超家族。因此,将该蛋白命名为DrfE(Deinococcus radiodurans Ferritin,DrfE)。其氨基酸序列分析表明,该蛋白具有明显的跨膜结构和蛋白疏水区,是一类典型的跨膜蛋白。
  (2)为了研究耐辐射异常球菌 drfE的功能,本研究采用融合PCR和体内同源重组的方法成功构建了drfE基因的缺失突变株(ΔdrfE)和功能回补菌株(pdrfE::Δ)。胁迫冲击实验显示,drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌对氯化钠和过氧化氢敏感,80mM H2O2处理30min后,突变株比野生型菌株的生存力低4个数量级,5M NaCl处理6h导致突变株的生存力降低2个数量级,且回补株能够完全恢复突变株ΔdrfE的表型。
  (3)对野生型DR、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE::Δ中体内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定的结果表明,在正常培养条件下,drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌CAT和SOD活性下降(突变株的酶活分别下降28.36%和6.42%);而氧化胁迫(80mM H2O2处理30min)条件下,差异尤为显著(突变株酶活下降32.33%和41.30%)。进一步对胞内Fe2+含量进行测定,结果显示drfE基因缺失引起耐辐射异常球菌细胞中胞内Fe2+含量增加了26%,达293μmol/L。
  (4)将耐辐射异常球菌DrfE蛋白异源表达在大肠杆菌中,表型分析结果表明,DrfE蛋白明显增强了大肠杆菌对氯化钠和过氧化氢的胁迫抗性。在15mM H2O2处理10min条件下,DrfE蛋白异源表达的大肠杆菌生存力增加了2个数量级,1.5M NaCl处理6h条件下,其生存力增加1个数量级。
  总之,耐辐射异常球菌drfE基因在盐和氧化胁迫反应中发挥重要作用,能维持细胞CAT和SOD活性,有效降低胞内Fe2+含量,保护细胞免受氧化损伤,其分子作用机制有待于进一步研究。
[硕士论文] 石斌超
遗传学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:L-丝氨酸是一种在医药、食品、化妆品等领域具有广泛应用的非必需氨基酸。而微生物发酵法作为一种新兴的L-丝氨酸生产方法,具有生产成本低,生产效率高,环境污染小等优点,使其在未来具有十分广阔的应用前景。目前,L-丝氨酸生产菌株的构建手段及技术已经较为成熟,菌株构建主要通过两种方法实现:增强L-丝氨酸合成途径和弱化L-丝氨酸降解途径。随着合成途径及降解途径的改造日趋完善,人们的思路开始转向L-丝氨酸转运途径的改造上来。本文的研究方向则以转运途径中的吸收途径为主。基因 sstT、cycA、sdaC和tdcC是文献报道过的四个大肠杆菌 L-丝氨吸收基因,其中,sstT编码一种Na+耦合的丝氨酸-苏氨酸协同转运蛋白,cycA的转录产物是主要丙氨酸转运子,但是在大肠杆菌中,该转运子也参与丝氨酸和甘氨酸的吸收,sdcC和tdcC都能够编码H+耦合的协同转运蛋白,两者在整个编码区域具有很高的同源性,仅在3’端存在显著差异。其中sdaC编码一个高特异性的丝氨酸吸收蛋白,而tdcC则编码另一种丝氨酸-苏氨酸系统转运蛋白。
  实验室前期在出发菌株SWCH-05(sdaA缺失、glyA突变)的基础上构建得到4株单基因缺陷菌和6株双基因缺陷菌,并对单基因缺陷菌的L-丝氨酸生产情况进行了研究。发酵结果表明L-丝氨酸吸收基因sdaC的敲除对菌株产L-丝氨酸能力的提升最大。
  本研究则利用Red重组系统进一步构建了4株三基因缺陷菌及1株四基因缺陷菌,并综合之前的10株L-丝氨酸吸收基因缺陷菌通过测定菌株L-丝氨酸吸收活性对吸收基因不同敲除组合的影响进行了研究;针对该实验结果又进行了吸收基因过表达实验进一步证明吸收基因的功能;最后通过摇瓶发酵实验对菌株产L-丝氨酸能力进行了初步测定,主要研究及结果如下:
  1)以双基因缺陷菌SWCH-61、SWCH-62和SWCH-64为基础,利用Red重组系统敲除L-丝氨酸吸收基因sdaC和tdcC进一步构建了4株三基因缺陷菌SWCH-71(△sstT,△cycA,△sdaC)、SWCH-72(△sstT,△cycA,△tdcC)、SWCH-73(△sstT,△sdaC,△tdcC)和SWCH-74(△cycA,△sdaC,△tdcC)以及1株四基因缺陷菌SWCH-08(△sstT,△cycA,△sdaC,△tdcC)。
  2)为了解吸收基因敲除对菌株L-丝氨酸吸收能力的影响,我们对所有15株L-丝氨酸吸收基因缺陷菌的吸收活性进行了检测。结果表明,在单基因缺陷菌中,sdaC单基因缺陷菌SWCH-51的L-丝氨酸最终吸收活性是0.798 nmol(mg dry weight)?1,与出发菌SWCH-05相比下降23.34%。但是, sstT单基因缺陷菌SWCH-53、cycA单基因缺陷菌SWCH-52和tdcC单基因缺陷菌SWCH-54的最终吸收活性则分别提高了34.29%、78.29%和48.03%。而在双基因和三基因缺陷菌中,只有敲除了基因 sdaC的菌株其 L-丝氨酸吸收活性降低。但是当所有四个 L-丝氨酸吸收基因被敲除后, sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因缺陷菌SWCH-08的吸收活性接近于零。
  3)针对吸收活性实验中部分菌株出现吸收活性上升的情况,我们利用双酶切系统构建了4个L-丝氨酸吸收基因重组质粒 pSC-sstT、pSC-cycA、pSC-sdaC和 pSC-tdcC,并将其分别导入出发菌SWCH-05中构建得到 L-丝氨酸吸收基因过表达菌株 SWCH-05/pSC-sstT、SWCH-05/pSC-cycA、SWCH-05/pSC-sdaC和SWCH-05/pSC-tdcC。通过测定它们的L-丝氨酸吸收活性发现基因sstT、cycA、sdaC和tdcC确实参与菌株的L-丝氨酸吸收,它们确实是L-丝氨酸吸收基因。其中,过表达基因cycA的菌株 SWCH-05/pSC-cycA L-丝氨酸吸收活性最强,达到2.983 nmol·(mg dry weight)-1, SWCH-05/pSC-sdaC次之。
  4)11株多基因缺陷菌的摇瓶发酵结果表明, sstT·sdaC双基因敲除菌 SWCH-62/pSC-05, sstT·sdaC·tdcC、sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌SWCH-73/pSC-05和SWCH-71/pSC-05的L-丝氨酸产量与对照菌 SWCH-05/pSC-05相比有明显提升,分别达到271.11、312.58和322.57 mg/L;而sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌SWCH-08/pSC-05的L-丝氨酸产量最高,达到了450.58 mg/L,是对照菌的6倍。在菌株生长方面,双基因敲除菌和三基因敲除菌的生长量优于对照菌或者与对照菌相近,而四基因敲除菌的生长量与对照菌相比则下降了28%。
[硕士论文] 颜凯
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:抗肿瘤抗生素在临床中广泛使用,但存在药物毒副作用及肿瘤细胞多耐药性等问题,为了解决这一难题,寻找结构新颖的抗肿瘤化合物,本研究采用活性追踪的方法开展了抗肿瘤土壤放线菌筛选及对两株活性放线菌次级代谢产物的研究工作。
  以人肺癌细胞A549和人结肠癌细胞HCT-116为筛选模型,采用CCK-8方法从土壤放线菌中筛选出两株活性菌,经16S rRNA初步鉴定均为链霉菌,分别命名为Streptomyces sp.HS-NF-1006和Streptomyces sp.HS-NF-853。
  结合抗肿瘤模型筛选结果和菌株在不同培养基中的生长状况,最终选定葡萄糖1%,可溶性淀粉4%,酵母抽提物0.4%,麦芽提取物0.1%,CaCO30.2%,FeSO4·7H2O0.1%,MnCl2·4H2O0.1%为Streptomyces sp.HS-NF-1006的最适发酵培养基;选定葡萄糖1%,可溶性淀粉4%,酵母抽提物0.4%,麦芽糊精1%,0.1 ml/L(Fe SO4·7H2O0.1%,MnCl2·4H2O0.1%,ZnSO4·7H2O0.1%)为Streptomyces sp.HS-NF-853的最适发酵培养基。利用50 L发酵罐分别对两株活性菌进行放大发酵。
  所得发酵液经前处理后,利用硅胶、凝胶、HPLC等分离方法对两株活性菌的发酵产物进行分离,最终得到9个化合物,利用核磁共振和质谱等分析方法进行结构鉴定,从菌株HS-NF-1006提取到3个化合物1-3,均为蒽环类化合物,其中化合物1为新结构化合物,命名为13-oxy-13-decarbony-6"-cyano-6"-deoxy-TAN-1120;从菌株HS-NF-853提取到6个化合物4-9,其中化合物4是一个结构新颖度较高的四氢苯并呋喃酮化合物,命名为StrefuranoneA。
  对所得到化合物进行抗肿瘤活性评价,化合物1对结肠癌细胞HCT-116的IC50为0.0978μM,对人肺癌细胞A549的IC50为0.08μM,化合物2-9未表现抗肿瘤活性。
[硕士论文] 马建伟
预防兽医学 青岛农业大学 2017(学位年度)
摘要:沙门氏菌是常见的人畜共患病原菌,在畜牧业和公共卫生领域造成重大影响,目前沙门氏菌耐药性越来越严重,治疗难度越来越大。本研究从临床分离沙门氏菌及沙门氏菌噬菌体,对分离到的沙门氏菌噬菌体进行生物学特性的研究,并对其中一株进行全基因组测序和基因注释。
  本研究主要内容包括:⑴使用沙门氏菌的invA基因的PCR方法对分离到的菌株进行检测,从病鸡和病鸭中总共分离到25株沙门氏菌。对分离到25株沙门氏菌及实验室保存的7株沙门氏菌检测对26种抗生素的敏感情况,32株沙门氏菌均存在不同程度的耐药性,且大多数菌株都存在多重耐药。⑵从商品肉鸭厂采集鸭粪和垫料,采用双层平板法分离到2株沙门氏菌噬菌体,两株噬菌体在双层平板上形成的噬菌斑均匀透亮,直径约2mm,通过效价和裂解谱的测定,2株噬菌体效价均能达到109PFU/mL,除宿主菌外均能裂解多株其它沙门氏菌,均为宽裂解谱烈性噬菌体,电镜观察2株噬菌体均为长尾噬菌体,分别命名为BS3和BS4。⑶对分离到2株沙门氏菌噬菌体进行最佳MOI、一步生长曲线、温度、pH、紫外线稳定性等生物学特性的研究,噬菌体BS3和BS4的最佳MOI分别为0.001和0.01;两株噬菌体的在40℃下作用1h后基本能保持原效价;噬菌体BS3在pH4~12范围内基本能保持原效价,噬菌体BS4在pH5~11范围内基本能保持原效价;紫外线稳定性方面,噬菌体BS3和BS4在紫外灯下连续照射1h后,效价分别下降3个和4个数量级。⑷对沙门氏菌噬菌体BS3的全基因组序列进行测序,测得基因组全长为43696bp,为双链DNA,对其全基因组序列进行了注释,噬菌体BS3共注释得到64个开放阅读框,对预测到的开放阅读框进行分析,大部分为假设蛋白,有注释结果的29个蛋白中有裂解相关蛋白、结构蛋白、核酸相关蛋白等,分析了主要蛋白的一级、二级、三级结构,主要的二级结构为α螺旋、延伸链、β折叠、无规卷曲,对噬菌体BS3的全蛋白进行SDS-PAGE检测,结果显示总共跑出5条带,大小从39KD到90KD不等,蛋白质谱分析结果显示,跑出的五条带包括宿主蛋白、尾刺蛋白、门户蛋白、尾部蛋白、衣壳蛋白。
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