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[硕士论文] 李莹
自然地理学 哈尔滨师范大学 2015(学位年度)
摘要:松江湿地是属北方典型的河川湿地,也是我国沿江城市中面积最大的城市湿地。由于受到周围农业、工业和人类活动的严重影响,湿地生态系统的连续性和稳定性遭到破坏。本文以哈尔滨松花江湿地为研究对象,选取金河湾、白鱼泡、阿什河、呼兰河口、滨江、太阳岛六个典型区域,测定沉积物样品的理化性质和酶活性,运用T-RFLP分子生物学技术和多元统计分析的方法,系统研究湿地沉积物细菌群落结构和多样性特征,探讨细菌群落结构、酶活性与环境因子之间的关系。
  本研究主要内容包括:⑴松江湿地沉积物共发现7个细菌类群,分别为变形菌门(α-Proteobacteria/β-Proteobacteria/γ-Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿菌门(Chlorobi)、梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria),其中优势菌群依次为Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes。滨江湿地细菌多样性最高,呼兰河口湿地最低。⑵松江湿地沉积物细菌群落结构与环境因子的典型对应分析(CCA)结果表明,影响金河湾湿地细菌群落结构的主要环境因子为NH4+-N和pH值、白鱼泡湿地为TN和NH4+-N、阿什河湿地为pH值和NO3--N、呼兰河口为NO3--N和NH4+-N、滨江湿地为NH4+-N和TP,太阳岛湿地为TC和EC。Firmicutes与TP和TN成显著正相关;Bacteroidetes与NH4+-N显著正相关;β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria与pH值显著正相关。⑶松江湿地沉积物酶活性分布具有空间上的差异性,酶活性的变化趋势较好的反映湿地环境因子的变化特征。其中,碱性磷酸酶、脲酶和蛋白酶以呼兰河口湿地最高;过氧化氢酶和多酚氧化酶以阿什河湿地最高。
[硕士论文] 王佳
微生物学 河南师范大学 2012(学位年度)
摘要:工业废水生物处理系统在构建的过程中常常使用城市污水处理厂的活性污泥作为种污泥接种,该污泥中的微生物群落在适应新的废水环境过程中可能发生巨大变化,这种变化有时会导致新系统构建的失败。因此理解微生物群落在工业废水处理系统构建过程中以及系统之后的运行过程中的进化规律将有助于废水处理工程的构建操作和调试运行。而全规模污水处理系统,特别是印染废水处理系统中这种微生物群落进化过程的追踪研究还鲜有报道。本研究在追踪检测日处理量为1000吨的印染废水生物处理系统在构建和3个多月的调试运行效果的基础上,利用PC-DGGE和T-RFLP两种分子生物学方法研究了包括细菌、真菌和古菌在内的三大域微生物的群落进化过程。
  具体研究成果包括如下几个方面:
  (1)印染废水生物处理系统包括两级生化处理装置,分别为水解酸化+活性污泥和水解酸化+好氧接触氧化。经过3个多月调试过程中的连续监测结果表明,COD和色度的总去除率分别高达85%和84.9%。培养和定量PCR对微生物计数的结果表明,细菌是这所有的处理单元中的绝对优势菌群,真菌数量次之,古菌最少;随着系统运行,真菌数量逐渐减少,古菌的数量明显增加,特别是二级生化处理系统中,在运行3个月末,古菌的数量超过细菌成为明显的优势菌群,古菌占细菌的比率为1:0.58。
  (2)利用PCR-DGGE的方法对系统构建和调试运行中的微生物群落进行追踪研究,结果表明,系统中细菌的多样性明显高于古菌和真菌;从种污泥到系统构建成功,细菌和真菌在系统中的持留率接近(细菌为57.3%,真菌为57.6%)并且明显高于古菌(34.8%);由于废水组分和主要污染物始终处于变化中,因此驱动着各类群的微生物种群结构在整个调试运行过程中一直发生着变化,其中,细菌和古菌的多样性都在增加,而真菌的多样性则逐渐减少;二级生化处理单元接收一级生化池处理之后的废水,其组分波动相对较小,因此其中的微生物群落稳定性明显高于一级处理单元。DGGE条带切胶测序的结果表明,系统中的细菌广泛分布在α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、梭菌纲(Clostridia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、暖蝇菌纲(Caldilineaceae)、硝化螺旋菌纲(Nitrospira)、绿菌纲(Chlorobia)、酸杆菌纲(Acidobacteria)十个纲中;真菌主要分布在壶菌纲(Chytridiomycetes)和结合纲(Zygomycota);古菌主要分布在广古菌门(Euryarchaeota)其中大部分是产甲烷菌(Methanogen),和泉古菌门(Crenarchaeota)。
  (3)利用另外一种分子生物学方法T-RFLP法对该系统中的微生物群落进化过程进行追踪研究,所得结果和DGGE的结果相似,其中主要的优势细菌分布在α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteri)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、暖蝇菌纲(Caldilineaceae)、硝化螺旋菌纲(Nitrospira)、绿菌纲(Chlorobia),其中Caldilineaceae占4.46%-11.6%,Alpha-proteobacteria占7.51-9.67%,Chloroflexi bacterium占6.02%-7.15%,Rhodobacter sp.24.32%-28.81%,Thermomonas sp占17.34%-38.95%;主要的优势真菌是壶菌纲(Chytridiomycetes),其中Blastocladiales sp。占2.30%-3.12%;主要的优势古菌是广古菌门(Euryarchaeota)中的产甲烷(Methanogen)。
  (4)通过对系统构建过程以及3个多月的调试运行过程中的微生物群落结构进化过程的追踪研究发现,尽管微生物群落发生了很大变化,但系统的运行效率没有明显的变化,古菌和真菌的多样性和种群稳定性明显比细菌大,说明细菌具有巨大的功能冗余保证系统稳定运行。古菌随着系统的运行数量明显上升并且在二级好氧生化处理系统中超过细菌的数量成为优势菌群的现象值得关注,提示古菌可能在难降解物质的降解方面具有还未知的作用。
[博士论文] 李平一
微生物学 山东大学 2011(学位年度)
摘要:根据16S rRNA基因序列,Carl Woese et al.(1990)将古菌分为两个主类群,泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota)。泉古菌特指超嗜热泉古菌(byperthermophilic Crenarchaeota)。广古菌具有多样化的生理特征,如嗜盐、产甲烷和嗜热等。以氨氧化古菌类群MG-I(Marine Group I)为代表的中温泉古菌(mesophilic Crenarchaeota)的发现表明,古菌系统发育树不只由两个主类群组成。通过对MG-I古菌Cenarchaeum symbiosum、Nitrosopumilus maritimus和Nitrososphaera gargensis的16S-23S rRNA基因、核糖体蛋白和信息加工核心蛋白进行系统发育分析,发现中温泉古菌从超嗜热泉古菌中分离出来,形成独立的类群,这表明中温泉古菌是一个新的古菌门,Brochier-Armanet et al.(2008)将其命名为Thaumarchaeota。
   MCG(Miscellaneous Crenarchaeota Group)古菌是中温泉古菌类群之一,其可能也具有独特的基因组和进化特征。MCG古菌在系统发育上分为多个子类群,命名中的“Miscellaneous”意味着这个类群拥有广阔的栖息地范围,包括土壤、淡水、热液口、表层和深层海底沉积物等。到目前为止,MCG古菌还未分离到可培养的菌株,关于MCG古菌的生理信息很少。对MCG古菌的研究仅限于建立在16S rRNA基因序列基础上的系统进化分析。在16S rRNA基因的序列分析上,目前的研究多为MCG序列与其他不可培养古菌类群的系统进化分析,缺少MCG序列与可培养古菌的系统进化分析。因此,需要更多的研究去认识MCG古菌的基因组、生理和进化特征。现在,宏基因组技术被越来越多地用于研究未培养微生物的生理与进化,因此可以应用这一技术来研究MCG古菌。沉积物E505样品采自中国南海水深154 m处0-5 cm海底表层。本文中,通过宏基因组研究南海沉积物E505样品中MCG古菌的生理和进化特征。此外,通过功能宏基因组筛选,研究了E505沉积物中的β-半乳糖苷酶。
   一、南海沉积物E505样品的古菌多样性分析
   以古菌通用引物Arch21F和Arch958R,构建了南海海底表层沉积物样品E505的古菌16S rRNA基因克隆文库。对144个克隆进行测序,得到121条古菌16SrRNA基因序列。把相似性超过97%的序列归为同一个系统类型,获得了64个古菌系统类型。这些古菌序列可以归为8个类群,包括MG-I(54.5%)、MCG(24.0%)、MBGA(Marine Benthic Group A,2.5%)、MBGB(Marine Benthic GroupB,3.3%)、DHVE6(Deep-Sea Hydrothermal Vent Euryarchaeotal Group6,13.2%)、MBGE(Marine Benthic Group E,0.8%)、MBGD(Marine Benthic Group D,0.8%)和其他未能分类的广古菌(0.8%)。0-5 cm的海底表层沉积物样品具有海水和沉积物的混合物的特点,E505中古菌群落组成也反映了这一特点。该样品中的古菌群落是海水来源的MG-I和以MCG为主的深层海底沉积物古菌的混合物。对不同环境来源的代表性MCG古菌系统类型进行系统进化分析,发现E505样品中的MCG序列主要与来源于热带西太平洋的深层海底沉积物以及Mandovi和Zuari的河口沉积物中的MCG序列聚簇。
   二、通过宏基因组研究MCG古菌的生理特征
   以E505沉积物为样品,我们构建了一个含有10,652个fosmid克隆的宏基因组文库。以古菌通用引物(Arch21F和Arch958R)对fosmid克隆文库进行序列筛选,得到3个携带古菌16S rRNA基因的fosmid,E6-3G、E37-7F和E48-1C。BLAST比对结果显示,这3个fosmid的16S rRNA基因与已报道的海洋沉积物来源的MCG16S序列具有很高的相似性(identities=98%),这表明分离到的古菌基因组片段均属于MCG。3个fosmid之间16S rRNA基因序列的相似性在81%-83%,表明E6-3G、E37-7F和E48-1C属于不同的MCG亚纲。用454测序方法对fosmid序列进行了测序。用GLIMMER软件预测fosmid上的ORF,通过搜索NCBI非冗余蛋白质库(nr)和InterPro数据库,对预测的ORF进行注释。E6-3G,长度为38,277 bp,含有1个16S-5.8S-23S rRNA操纵子和30个ORF。E6-3G上的ORFs3-10可能参与细胞壁/细胞膜上N-多糖的生物合成。E37-7F,长度为42,618 bp,含有1个16S-5.8S-23S rRNA操纵子、2个tRNA和41个ORF。E37-7F上的ORFs22、23和27编码3个与甲萘醌/泛醌合成相关的甲基化酶,甲萘醌和泛醌在原核生物的电子传递链中起到电子载体的功能。3个磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶基因(ORFs29、31和32)和1个胆碱激酶基因(ORF24)的存在,表明胆碱可能存在于E37-7F古菌的细胞壁/细胞膜上。E48-1C,长度为34,738bp,含有1个独立的16S rRNA基因、1个tRNA和37个ORF。E48-1C fosmid上的ORF4是一个重金属抗性调控蛋白(ArsR)的同源基因,这表明E48-1C古菌可能对有毒的金属离子表现出抗性。
   三、MCG古菌的分子进化分析
   以E6-3G、E37-7F和E48-1C fosmid序列为基础,通过对16S rRNA基因和信息加工蛋白进行系统发育分析以及分析共线性和四核苷酸频率,对MCG古菌的进化特征进行了研究。在16S rRNA基因的系统进化树上,中温泉古菌形成单系类群,MCG古菌和MG-I plus relatives在中温泉古菌内部形成两个独立的分枝,这表明MCG古菌是中温泉古菌内的一个新类群。对MCG fosmid上保守的信息加工蛋白进行系统进化分析,也得出了与16S rRNA基因系统进化树相同的结论。通过计算基因组片段的内部四核苷酸频率关系值,对MCG fosmid与已报道的其他中温泉古菌fosmid进行了比较分析,结果表明,MCG基因组是不稳定的。进一步分析MCG fosmid的四核苷酸频率,揭示出MCG基因组片段上含有多个四核苷酸频率异常区域。对位于异常区的基因进行系统进化分析,表明MCG fosmid很可能含有非泉古菌或非古菌来源的外源基因,这可能在一定程度上促成了MCG古菌基因组的低均一性。根据稳定四核苷酸频率的关系值(z-scores),比较了中温泉古菌、超嗜热泉古菌和广古菌之间的相似性,结果表明MCG和MG-Iplus relatives具有不同的四核苷酸频率,再次表明MCG是不同于MG-I plusrelatives的中温泉古菌类群。此外,比较基因组分析表明,MCG fosmid与已报道的213个古菌基因组片段和91个全基因组之间没有共线性,这表明MCG泉古菌在基因排列方面与已测序的古菌存在显著不同。
   四、通过功能宏基因组筛选南海沉积物中的β-半乳糖苷酶
   对E505宏基因组文库中的潜在β-半乳糖苷酶进行了功能筛选。共得到11个阳性克隆,对其中的4个(E13-9A、E14-1H、E14-5B和E109-6D)进行了全序列测序。对这4个fosmid进行注释,未找到编码β-半乳糖苷酶的相关基因。但是,这些基因组片段上编码多个未知蛋白且编码区的覆盖度相对较低,以此推测其可能含有新型β-半乳糖苷酶基因。随后,根据转座子插入失活实验、fosmid序列分析以及重组蛋白β-半乳糖苷酶活性检测的结果,确定了fosmid克隆β-半乳糖苷酶活性的来源。其活性是由EPI300宿主染色体DNA lacZ△ M15和整合LacZα-肽基因(来源于不同插入片段和pCC1FOS载体)形成α-互补所产生的。尽管已有文献报道应用该方法成功筛选到新型β-半乳糖苷酶,但是,我们的实验结果表明,以该方法筛选外源β-半乳糖苷酶时存在缺陷。通过功能筛选环境中的β-半乳糖苷酶时,为了避免假阳性克隆的产生,我们对构建宏基因组文库用到的宿主和载体的类型提出了一些建议。
[硕士论文] 刘强
生物数学 中国科学技术大学 2009(学位年度)
摘要:本文研究了两种能够从活跃状态向休眠状态转化的微生物之间的竞争。已知的结果表明,在没有休眠-生长状态转化时,两物种竞争会导致具有高“break-even concentration”的物种在竞争中灭绝。本文获得的主要结果是:休眠-生长转化机制的存在可以帮助具有高“break-even concentration”的物种能够一直生存。数值模拟表明竞争时能够生存的物种的种群密度在趋于正的稳定态前会出现高频振荡,这也证实了生物在竞争中确实可以利用状态转化来自我适应。
[硕士论文] 王飞雁
微生物学 山东大学 2009(学位年度)
摘要:遗传转化系统(包括蛋白质表达系统和基因敲除系统),是研究基因或基因产物功能的一个极为重要的工具。对于细菌及真核生物,遗传转化系统已非常成熟。然而,就古菌而言,遗传转化系统发展相对滞后,主要原因是选择标记的缺乏。近二十年来,在超嗜热古菌Sulfolobus中发现了为数不少病毒、质粒等染色体外遗传元件,但以这些遗传元件构建遗传系统的进展远远滞后于产甲烷菌及嗜盐菌中相应的研究。在过去的十年中,在Sulfolobus中先后报道了数个遗传系统,但这些遗传系统往往难以被其它实验室重复。直到最近,研究者所构建的遗传系统才在不同实验室得到应用。 在Sulfolobus属中,目前有三个种已完成全基因组序列的测定并公开发表,即S.solfataricus、S.tokodaii和S.acidocaldarius。对于S.solfataricus和S.acidocaldarius,遗传转化系统已成功建立并极大地促进了基因功能的研究。然而,迄今为止,对于S.tokodaii,尚未有任何遗传转化系统的报道。因此,在S.tokodaii中开展遗传转化系统方面的探索和研究具有重要的理论意义和应用价值。 编码乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)和乳清苷酸脱羧酶(pyrF)的基因广泛用作古菌的选择标记。本研究首先以pyrEF为选择标记,构建了S.tokodaiiβ-半乳糖苷酶基因lacS的敲除载体p5EF3。在遗传学研究中,通常采用lacS作为报告基因来检测表达载体的蛋白质表达水平或分析启动子的活性,因而可以将获得的lacS敲除菌株作为新的宿主菌用于报告基因系统中,从而避免内源性lacS的表达对穿梭载体中报告基因表达的干扰。 在古菌的细胞膜磷脂生物合成过程中,3-羟-3-甲基戊二酰辅酶 A还原酶(HMG-CoA还原酶)起着关键的作用。辛伐他汀(simvastatin)是HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂,从而抑制细胞的生长;HMG-CoA还原酶的过量表达能消除辛伐他汀的竞争性抑制作用。辛伐他汀及其同系物莫维诺林(mevinolin)作为抗生素,已被成功应用于古菌的遗传学研究中,但在Sulfolobus遗传系统中迄今未见报道。基于上述分析,本研究检测了不同浓度的辛伐他汀对野生型S.tokodaii生长的影响情况,结果显示15μM辛伐他汀在168小时内能完全抑制野生型S。tokodaii细胞的生长,表明辛伐他汀可以作为抗生素用于S.tokodaii遗传转化系统的构建。接着,本研究利用重叠延伸PCR技术,将S.solfataricus来源的谷氨酸脱氢酶启动子序列与S.tokodaii来源的HMG-CoA还原酶基因融合,构建成一个HMG-CoA还原酶过表达cassette,然后以该HMG-CoA还原酶过表达cassette为筛选标记基因,构建了针对S.tokodaii pyrE的基因敲除载体 p5PH3。将载体p5PH3电转化野生型S.tokodaii,目前已获得尿嘧啶营养缺陷型菌株,分子水平上的鉴定正在进行中。此外,为检测S.tokodaii来源的HMG-CoA还原酶是否具有预期的酶活性,本研究克隆了该古菌中的HMG-CoA还原酶基因,并在大肠杆菌中表达和纯化了HMG-CoA还原酶,并测到了HMGR的酶活性。
[硕士论文] 吕杰
生物信息学 北京师范大学 2009(学位年度)
摘要:原绿球藻(Prochlorococcus)是一种蓝细菌,其不同菌株占据着海水中差异显著的生境。一些菌株适应了海水表层贫养和强光照的环境,另一些则更适于生活在氮、硫等营养物质相对丰富而低光照的深层海水中。本课题对来自相同采样地且生长在不同海水深度的Prochlorococcus菌株进行成对比较,发现菌株蛋白质组的氮、硫元素含量随环境中氮、硫元素浓度的增大而增加。另外,我们发现蛋白质组的元素构成随Prochlorococcus不同菌株间氮元素同化能力的差异的不同而表现出显著差异,推测“体内氮元素供应量”也影响蛋白质组的元素构成。以Prochlorococcus12个菌株的核心蛋白质组代替菌株的整个蛋白质组后,重复了蛋白质组元素构成的分析过程,并最终获得了相似的结果。该结果表明环境中资源的可用性能够对蛋白质组的元素构成起到“塑性”的作用。
[博士论文] 徐玲玲
微生物学 中国科学院大学;中国科学院研究生院 2009(学位年度)
摘要:捕食线虫真菌是用菌丝特化形成的捕食器官捕食线虫的一类真菌。在自然条件下对线虫种群动态起着重要的调节作用。由于捕食功能基因要比rDNA和看家基因受到的环境选择压力更大,进化速率也更快,因此,用功能基因能够更真实地反映捕食线虫真菌各捕食器官类群的系统发育关系。捕食线虫真菌化石的发现可以推测捕食线虫真菌各捕食器官类群的分化时间表和进化历程。捕食器官的形态特征是对其进化过程的记录。小分子信号分子已被证明对真菌一些特殊器官的形态发生有重要调控作用。因此,本研究利用两个捕食功能基因和两个捕食线虫真菌化石研究捕食线虫真菌的系统发育和进化历程,同时还讨论了小分子信号分子对捕食器官形态发生的作用。
   在真菌侵染线虫过程中充当毒力因子的两个捕食功能基因,丝裂原活化蛋白激酶和丝氨酸蛋白酶基因被用来研究捕食线虫真菌系统发育关系和进化。将18株捕食线虫真菌的MAPK和丝氨酸蛋白酶基因拼接,使用最小距离法,最大简约法,最大似然法和贝叶斯法来构建系统发育树,四种计算方法得到发育树拓扑结构基本一致。结合形态发生观察,得到了以下三个结论:(ⅰ).黏性分枝,无柄黏球及串球在系统发育树上聚在一个分支,将其归为一个属Gamsylella;(ⅱ).以有柄黏球(包括伴生有非收缩环的类群)为特征的Dactylellina属,在系统发育树上也聚在一个分支,应该与Gamsylella属分开。该类群有一明显的进化特征就是黏球可以随线虫的挣扎从柄上脱落,并随线虫移动到新的环境中去;(ⅲ).以黏性网为特征的Arthrobotrys属比Gamsylella属更进化,Gamsylella属具有简单不稳定的捕食器官结构且在系统发育树上比Arthrobotrys属分化出来的更早,因此更原始。
   研究了ABA,NO和H2O2对捕食线虫真菌Drechslerela stenobrochaYNWS02-9-1捕食器官形态建成的作用。结果显示,NO供体(sodium nitroprusside,SNP)100μM(0.75 cm2面积上平均产生54个捕食器官,54 traps/colony;捕食率0),可明显抑制捕食器官生成和捕食率。而NO合酶抑制剂(1-naphthylacetic acid,L-NNA)100μM(733 traps/colony;39.3%)和NO清除剂[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide,cPTIO]100μM(1180 traps/colony;34.5%)可以明显地促进捕食器官生成和提高捕食率。外源ABA能明显促进捕食器官生成(1590 traps/colony;81.7%),并且与NO合酶抑制剂(L-NNA)共同作用,能最大限度地提高捕食器官数量和捕食率(1938 traps/colony;92.4%)。外源H2O250μM(64 traps/colony)较对照(166 traps/colony)可明显抑制捕食器官生成,而具有还原性的试剂抗坏血酸100μM(1392 traps/colony)和褪黑素(melatonin)10μM(932 traps/colony)可以明显地促进捕食器官的生成。以上研究证明,ABA能够促进捕食线虫真菌D.stenobrocha捕食器官的形态建成,而外源NO and H2O2则抑制其形态建成。
   两个捕食线虫真菌化石分别作为有柄黏球的产生时间(22.5到26 MYA)和伴生有非收缩环黏球类群的产生时间(100 MYA)作用于功能基因构建的ML树来计算捕食线虫真菌各捕食器官类群的分化时间表。另外还用两个已经确定比较可靠的真菌化石分别作为粪壳菌纲产生时间(400 MYA)和球囊霉日产生时间(460 MYA)作用于以壶菌门真菌Chytriomyces poculatus为外群构建的ITS贝叶斯树,来验证捕食线虫真菌分化时间表的可靠性。用BEAST v.1.4.7选择不相关的对数变化率模型和Yule prior分布来分析各个分枝的进化速率。以捕食线虫真菌化石作为时间标定点的结果表明,收缩环(Drechslerella)分化于210.0 MYA,其它黏性捕食器官包括黏性分枝和无柄黏球串球(Gamsylella),黏性网(Arthrobotry)以及有柄黏球或伴生非收缩环类群(Dactylellina)分别分化于185.3,158.0和117.3 MYA。该结果表明中生代是捕食线虫真菌产生和分化的重要地质年代。
[博士论文] 王海英
微生物学 中国科学院大学;中国科学院研究生院 2008(学位年度)
摘要:地衣型真菌的绝大多数属于子囊菌。子囊菌是真菌界最大的门类,在迄今已经描述的近8万种真菌中一半以上属于子囊菌,其中三分之一的子囊菌为地衣型真菌。前人的研究显示,地衣型子囊菌如此丰富的物种多样性,在演化生物学上可能有两个因为:(1)地衣型子囊菌的基因组演化速率快于非地衣型子囊菌,亦即前者的物种多样化速率快于后者;(2)子囊菌的祖先为地衣型真菌,亦即地衣型子囊菌的发生和分化早于非地衣型子囊菌。
   本论文应用统计学方法分析了数百种地衣型非地衣型子囊菌的SSU nrDNA、LSUnrDNA和RPB2数据,以及子囊菌、担子菌、毛霉亚门、和壶菌门的数十种来自EST文库和基因组的蛋白质数据,结果表明地衣型菌藻共生确实对子囊菌的演化产生了影响,但是仅限于个别基因,如nrDNA演化速率加快,RPB2演化速率减慢。这可能是由于地衣/非地衣的转变致使特定功能基因所承受选择压力的变化造成的。然而,地衣化并没有导致地衣共生菌整个基因组演化速率的变化。真菌基因组的演化速率与其生活方式(地衣/非地衣;水生/陆生)不具有相关性,而更可能是由真菌本身的内部因为决定的。此外,基因组和EST文库数据显示,子囊菌演化速率>担子菌>壶菌>毛霉亚门。子囊菌的基因组演化速率显著快于其他真菌门类,可能是子囊菌门成为真菌界最大类群的重要因为之一。
   基于数十种蛋白质数据的保守推测,陆生真菌分化于10.1~11.1亿年前,子囊菌分化于7.9~8.6亿年前,盘菌亚门分化于约5亿年前,现代散囊菌和粪壳菌都分化于3亿多年前的石炭纪。陆生真菌和子囊菌的分化明显早于植物登陆,说明真菌很可能是以菌藻共生的方式登陆的,子囊菌的祖先亦可能是地农型真菌。而盘菌亚门的分化可能与植物登陆相关。基于SSU、LSU nrDNA,以及RPB1+RPB2数据,推测茶渍纲地衣同样分化于石炭纪。说明现代子囊菌类群的发生可能与石炭纪的植物界大繁荣以及气候分界相关。由于现代地衣种类多数属于茶渍纲子囊菌,即多数现代地衣型子囊菌的发生并不早于现代非地衣型子囊菌。因此,即使子囊菌的祖先可能为地衣型真菌,但是今天地衣型子囊菌丰富的物种多样性与子囊菌地衣发生时间的早晚关系不大。
   亦即,现代地衣型子囊菌丰富的物种多样性与其基因组演化速率,及其发生时间关系不大。地衣超强的生存适应能力可能是造成该现象的主要因为。
[博士论文] 高仁钧
生物化学与分子生物学 吉林大学 2003(学位年度)
摘要:该文根据遗传信息,通过生物信息学方法进行分析,确定研究古细菌Aeropyrum pernix K1中的酯酶/乙酰氨肽酶基因.我们从培养古细菌出发,通过提取基因组DNA,设计PCR引物,再经过PCR反应,克隆出APE1547基因,再将其插入表达质粒pET11a和pET15b,构建工程菌,发酵产酶,通过热变性、Hitrap Q Sepharose离子交换柱层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析获得了电泳纯的超嗜热酯酶APE.APE分子量为63KDa左右,非变性电泳及活力染色电泳确定其为单聚体蛋白.APE的酶学性质研究表明该酶的最适温度为90℃,最适pH为8.0.此酶的最适底物为对硝基苯酚辛酸酯,K<,m>值为14μM,k<,cat>为805.8s<'-1>.该酶同时具有乙酰氨肽酶活力,最适底物为乙酰亮氨酸苯胺.该酶具有极强的热稳定性,在0.2mg/ml的酶在90℃半衰期为12小时,在pH偏碱性条件下稳定.我们通过晶体学方法解析出了APE的三维结构,并对酶的结构特征和催化机制及酶的热稳定性机制进行了研究.我们发现该酶由两个主要结构域构成,N端的推进器结构和C端的α/β水解酶结构域.推进器结构域的功能是调节酶的底物特异性,限制过大的分子进入酶的催化部位,同时在酶分子的内部构建出一个催化过程所必须的特殊微环境,酶的催化中心为Ser445、Asp524和His556.酶的催化过程需要经过底物结合、形成过渡态、酰基化酶和酶还原等四个步骤.性质实验和蛋白质分子三维结构证明该酶的热稳定性是其内部的电荷和离子相互作用起了关键的作用.
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