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[博士论文] 周彪
海洋药物学 浙江大学 2019(学位年度)
[博士论文] 孔阳
化学工程与技术 陕西科技大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 李奇威
微生物与生化药学 广东药科大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 赵铖
生物化学与分子生物学 贵州师范大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 王倩倩
海洋药物学 浙江大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 徐桑尔
森林保护学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:多粘类芽孢杆菌CF05菌株是一株从天目山古柳杉分离获得的产芽孢细菌,对根腐病等多种植物病害具有显著生防效果,具有良好研究开发价值。芽孢具有抗逆特性,是微生物农药制备的首选形态。本研究在已有基础上,围绕芽孢形成及调控,研究CF05芽孢形成的形态学和生理学特征,探讨芽孢形成与萌发的调控机制,制备CF05芽孢涂膜剂,应用于山核桃干腐病防治。研究结果如下:
  1、通过扫描电镜、透射电镜等显微观察技术,发现CF05菌株形成芽孢经历了3个形态变化阶段,分别是菌体期、前芽孢期和芽孢期。菌体期,CF05菌株细胞能够以二分裂的方式进行繁殖,菌体大小约2.4×0.5μm,呈杆状,有鞭毛,能游动;前芽孢期,细菌细胞两端尖凸,中部圆起,菌体表面开始不再光滑,大小约1.5×0.8μm;而当营养缺乏后期,形成芽孢,细菌细胞短杆状,两端平齐,无鞭毛无纤毛表面有明显皱褶,大小约1.0×0.9μm。
  2、利用转录组测序技术,比较了CF05菌体期和前芽孢期转录组的差异,发现差异基因2039个,其中上调1069个,下调970个。上调基因中有34个基因只在前芽孢期表达,下调基因中2个基因只在营养菌体表达。这34个基因中,12个基因与产孢相关,10个基因与碳源代谢相关,1个是细胞分裂蛋白,4个膜蛋白,7个基因功能未知。推测这些基因在细菌进入芽孢时,被诱导表达,参与细菌芽孢形态形成、休眠诱导以及感应蛋白积累等过程。
  3、通过单因素试验法,摸索了不同碳源、氮源、钾盐等因素对CF05菌株产芽孢量以及发酵液对供试病原菌(异孢镰刀菌Fusarium letersporum,暗色节菱孢菌Ar thrinium phaeospermum,灰葡萄球菌Botrytis Cinerea)拮抗效果的影响。结果发现GBP培养基(马铃薯浸粉10g/L,葡萄糖20g/L,牛肉膏5g/L(或蛋白胨5g/L),Mg SO4·7H2O1g/L;(NH4)2SO41g/L,CaCl2·2H2O4.41g/L,KH2PO40.6g/L,pH=7.0)效果最佳,芽孢形成时间最短,芽孢形成量达到8.83×108CFU/mL,具有明显拮抗效果。
  4、利用平板菌落计数,发现了CF05菌株能以羟甲基纤维素钠(CMC)和白乳胶(PVAs)作为唯一碳源进行生长。利用CMC和PVAs制备了CF05涂膜剂,发现芽孢浓度可以在半年内维持在107CFU/mL。说明CF05芽孢可以以CMC/PVAs作为载体,制备稳定成膜剂;林间试验发现,CF05涂膜剂对山核桃干腐病具有显著的防治效果。
  综上,本研究围绕多粘类芽孢杆菌芽孢形成及制剂研究,明确了CF05菌株芽孢形成的形态学变化,优化了芽孢形成发酵培养基,发现了芽孢形成的关键调控基因,制备了CF05芽孢涂膜剂,防治山核桃干腐病效果显著。研究结果为CF05菌株微生物农药开发提供了重要参考。
[硕士论文] 朱永明
微生物与生化药学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株Tu-569是从兔肠道中筛选出的对大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)等动物致病菌有较强抑制作用的芽孢杆菌。现将Tu-569菌株作为出发菌株进行紫外-微波诱变选育,以获得抑菌能力更高且遗传稳定的突变菌株。通过观察变异菌株的菌落和菌体形态,以生理生化试验和API50CH细菌鉴定条综合评测高产菌株生理生化特性。除不产接触酶、可耐受10%和15%的NaCl、可利用D-半乳糖和D-塔格糖外,T-70-1菌株的其余生理生化特性与Tu-569菌株均相同。与原菌株Tu-569相比,T-70-1菌株抗菌肽抑菌活性增加了1.74倍;连续传代十次后,T-70-1突变株抑菌效果仅降低了5.6%。最终获得了1株抑菌能力更强、遗传稳定的变异菌株T-70-1。
  对影响T-70-1菌株产抗菌肽的碳源、氮源、无机盐进行单因素试验以选择合适的种类,利用SPSS软件设计正交试验对菌株T-70-1产胞外抗菌肽发酵条件进行优化,以确定最优发酵条件。结果表明,T-70-1菌株产抗菌肽最优发酵条件为:葡萄糖2.5%、蛋白胨2.0%、MgSO4·7H2O0.08%、KC10.1%,初始pH值为6.5,接种量为4.0%,装液量为30mL/250mL,摇床转速180r·min-1,30℃发酵培养32h。最优发酵条件下相应的抑菌圈面积增大至525.5mm2,较优化前增幅达60.7%。获得了最优的发酵条件,显著提高了T-70-1菌株产抗菌肽的能力。
  为了获得T-70-1菌株抗菌肽适宜的提取方法,以抑制大肠埃希氏菌活性为指标,比较了不同提取方法的效果;通过不同截留分子量的透析袋处理菌株发酵液盐析溶解物,推测了该抗菌肽分子量的大致范围;采用不同的蛋白酶、pH、温度、离子种类及浓度、表面活性剂、变性剂处理该抗菌肽,以考察抗菌肽的稳定性和敏感性;以大肠埃希氏菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、福氏志贺菌(S.flexneri)、肠炎沙门氏菌(S.enterica)、芸薹链格孢菌(Alternaria brassicicola)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)为病原指示菌,测定了该抗菌肽的抑菌谱。结果表明,当硫酸铵饱和度达到70%时,抑菌圈面积为361.7mm2,抑菌活性最大;采用盐酸沉淀甲醇提取时,抑菌圈面积为178.9mm2;这两种提取方法中硫酸铵盐析的效果更好。透析处理的结果表明该抗菌肽的分子量在3.5~8.0kDa之间。该抗菌肽分别采用高浓度(5000U/mL)的胰蛋白酶、胃蛋白酶处理120min后,仍分别具有62.4%、49.1%的抑菌活性。该抗菌肽在pH7.0时抑菌活性最高,在pH3.0~9.0的范围内,有较高的抑菌活性,说明该抗菌肽对于pH稳定性较好。T-70-1菌株胞外产抗菌肽耐受高温,经100℃加热60min后,抑菌圈面积仅降低了30.1%,说明该抗菌肽耐热性良好。低浓度(25mg/mL)的Zn2+、Mn2+会显著促进抗菌肽的抑菌活性,阴离子种类对抗菌肽活性无显著影响。SDS、CTAB、巯基乙醇可以使该抗菌肽变性失活,EDTA可以增强抗菌肽的抑菌活性。综上,推测该抗菌肽为抗菌蛋白类物质,具有广谱抑菌活性,抑菌活性较为稳定。
  为了获得T-70-1菌株发酵产抗菌肽小试生产的最佳条件,考察了转速、通气量、装液量和罐压对发酵液抑菌活性的影响,设计正交试验优化5L发酵罐的发酵条件;在5L发酵罐最优发酵条件的基础上,以发酵通气率不变为原则,探索发酵时间对30L发酵罐发酵效果的影响。结果表明,5L发酵罐的最优发酵条件为:通气量为2.00L/min,压强为0.05MPa,转速为180r·min-1,装液量为40%;此时发酵液上清对应的抑菌圈面积为394.3mm2。当放大至30L发酵罐时,对应的发酵条件为:装液量20L,通气量为1.2m3/h,压强0.05MPa,转速为180r·min-1,抑菌圈面积可达到465.8mm2。实现了从5L发酵罐到30L发酵罐的放大。
  为了构建T-70-1菌株抗菌肽的分离纯化方法,以抑菌活性为指标,采用硫酸铵盐析法粗提抗菌肽,利用Superdex200(16×150mm)凝胶色谱柱和Capto Q(16×150mm)强阴离子交换色谱柱对粗提物进行分离,并以Tricine-SDS-PAGE检测目的抗菌肽的大小。结果表明,20L发酵液经70%硫酸铵盐析后获得了37.4g粗蛋白;经凝胶色谱分离后,得到2个组分S-1-1和S-1-2;组分S-1-1经检测含有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶;组分S-1-2有抑菌活性。S-1-2组分经强阴离子交换色谱分离后,得到5个洗脱峰,其中组分Q-3和组分Q-4有抑菌活性。收集有较高抑菌活性的组分Q-4,除盐浓缩,经Tricine-SDS-PAGE检测,目的抗菌肽的分子量约7.6kDa。构建了该抗菌肽的分离纯化方法,为该抗菌肽结构的测定和抑菌机制的研究奠定了基础。
[硕士论文] 宁妍
食品加工与安全 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:作为一种含苯环的稠环芳烃化合物,苯并芘(Benzopyrene)广泛存在于环境中,是一种高活性的致癌物和诱变剂,具有胚胎毒性。苯并芘在人体内降解速度缓慢,仅仅靠机体自身没有办法将苯并芘含量降解到安全水平,极大影响人体健康。国内外有研究表明,乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)具有较强的黏附性,具体表现在其细胞壁具有吸附性,可以吸附多种致突变因子。但当前对于益生菌细胞壁与苯并芘结合过程的研究较为欠缺,因此本研究使用Materials Studio软件构造双歧杆菌肽聚糖结构模型,利用分子对接原理和分子动力学方法模拟并分析双歧杆菌吸附苯并芘的过程,使用高效液相色谱法和红外光谱法对吸附模型进行试验验证。主要结果如下:
  1、使用Materials Studio软件构建肽聚糖结构模型。可以看出肽聚糖的组成结构因菌种不同而有差异。本研究所用双歧杆菌的肽聚糖采用非键作用力吸附苯并芘,结合位点所作用的基团均是与氧原子和氮原子相关的基团。
  2、使用高效液相色谱法对供试菌株肽聚糖的苯并芘吸附率进行测定。结果证实4株供试双歧杆菌菌株(Bb-02,Bl-04,HN019,Bi-26)呈现了一定的的苯并芘吸附能力,且同一种间的不同菌株苯并芘吸附能力相近。其中,乳双歧杆菌菌株HN019和Bl-04的苯并芘吸附率较高,均超过70%,分别为74.37%和76.02%。
  3、使用傅里叶红外光谱法对肽聚糖吸附前后的结构进行分析。结果显示与标准肽聚糖结构对比表明,证明本研究从供试菌株提取的肽聚糖确为双歧杆菌细胞壁肽聚糖;谱图分析表明,其苯并芘吸附位点位于酰胺的C-N和醇类的C-O键附近。
  4、对供试菌株Bl-04的肽聚糖进行酸处理后,再与苯并芘进行吸附结合。结果表明,酸处理可以提高肽聚糖的苯并芘吸附率从75.96%到92.80%,证实酸处理使肽聚糖结构发生了一定变化,暴露了更多的结合位点,同时空间位阻发生变化。
  本次研究表明分子模拟结果与实验结果具有一致性,证明了肽聚糖结构是影响双歧杆菌的苯并芘结合能力和位点的关键。
  本研究旨在对双歧杆菌肽聚糖吸附苯并芘的过程进行阐释,为益生菌脱除致突变因子的应用提供依据。现已有相关益生菌产品在市面流通。
[硕士论文] 赵红晓
生态学;微生物生态学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素是地球上最丰富,潜力巨大的可再生资源,微生物降解纤维素是纤维素有效利用的一种绿色环保的方法。而绿色木霉(Trichoderma viride)可以产生纤维素酶来降解纤维素。
  本研究以绿色木霉(T.viride)AS3.3711菌株为实验材料,根据GenBank数据库上登录号为EU518927的T.viride AS3.3711的egⅦ基因序列来设计引物,通过DNA和RNA为模板进行PCR,得到的序列经过比对得出内切葡聚糖酶Ⅶ基因没有内含子,基因长度782bp,开放阅读框750bp,编码249个氨基酸,理论分子量26.8002KD,理论等电点7.62,信号肽是N端的19个氨基酸,属于糖苷水解酶家族61的一种胞外酶。
  为高效表达内切葡聚糖酶,将克隆到的egⅦ基因连接到表达载体pPIC9K上,获得重组质粒pPIC9K-α1-egⅦ,pPIC9K-α2-egⅦ和pPIC9K-α3-egⅦ。将重组质粒用电转化法转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中,测定内切葡聚糖酶酶活后,发现pPIC9K-05的酶活力最高。甲醇诱导酵母转化子表达,目的蛋白经SDS-PAGE鉴定成功表达,且大小与理论值基本相符。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)的方法检测毕赤酵母(P.pastoris)转化子经甲醇诱导后的表达量,研究表明:转化子的最大表达量出现在第三天。通过正交实验优化重组P.pastoris转化子的发酵条件,得出:甲醇含量为1%,YNB含量为1.34%,pH为6.0,培养温度为29℃时,产酶量最高,为106.91U/g。
  经酶学特性分析,结果显示:温度在40-60℃内酶活较稳定,其中60℃为最佳温度;pH在6.0-8.0范围内有较好的酶活稳定性,其中pH=6.0时最佳;金属阳离子对酶活的影响中,Ag+激活作用较强,Mn2+抑制作用较强;所选五种底物中,MCC效果最好,该内切葡聚糖酶底物饱和时反应速度Vmax=0.5635mg/(mL·min),米氏常数Km=0.2623mg/mL,速度常数Kcat=Vmax/E=0.1702S-1,相对催化效率Kcat/Km=0.6489mL/(S·mg)。
[硕士论文] 田六
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:转录调控网络(transcriptional regulation network,TRN)是由转录因子(transcription factors,TF)和其目标基因的调控关系所构成的有向网络,是原核生物接收、处理、响应内外界环境信息的中枢。目前TRN研究主要集中在网络拓扑结构以及动力学功能两方面。然而,在构建动力学模型时,由于实验数据的缺乏,基因的空间分布以及转录因子搜索目标基因所需的时间往往被忽略。随着转录因子运动机理逐渐明晰,人们发现转录因子综合了扩散、滑动、跳跃以及节间转移等多种运动方式来寻找目标基因。单个转录因子搜索目标基因的时间远远超出之前的预料。同时,现有结果表明转录因子与目标基因的相对位置会影响转录的活性和鲁棒性。因此,细菌TRN的空间结构可能在进化过程中被优化以更好地发挥生物功能。
  近些年来,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌的三维基因组相继发表,使基因组规模的TRN空间结构特征研究成为可能。本研究以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为研究对象,通过整合TRN和三维基因组数据,在转录调控方式、网络关键节点、网络层级以及网络模体等多个方面探究了TRN的空间组织形式。本研究发现TRN在不同生理条件下存在多种稳定的空间组织特征:1)具有正调控关系的基因间的交互频率显著小于具有负调控关系的基因;2)调控其他基因较多的枢纽节点(Out-Hub nodes)以及瓶颈节点(Bottleneck nodes)都远离与它们有调控关系的节点;3)网络中Middle-Bottom-Target层级间的距离具有特定的空间结构组织模式;4)网络模体内部基因间的空间距离较TRN内部基因间的空间更为接近。这些发现表明细菌TRN的空间结构在多个层面存在优化,这些优化可能与细菌的基本生命活动有着密切的关系。
[硕士论文] 杨越
应用化学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:链霉菌属于放线菌,其次级代谢能力非常强大,代谢形式更是繁复多样,其可以提供丰富的天然产物,被广泛应用于人类医学,动物健康和植物作物保护。但是对链霉菌的代谢路径、生物合成基因簇功能的了解还是相对有限,通过对微生物代谢组学的分析,可以对链霉菌的细胞功能有更深层次的了解。
  (1)目前,代谢物的识别和鉴定是代谢组学进展最重要的限制因素之一,建立代谢物二级质谱数据库可以有效地促进代谢组学的发展。利用HPLC-Q-TOF高分辨质谱对模式菌株白色链霉菌(Streptomyces albus)的代谢产物进行检测,然后通过二级质谱(Auto ms/ms)对代谢物的结构进行鉴定,从而建立基础的白色链霉菌代谢物质谱数据库。通过实验本文共获得了1188个二级质谱谱图,297种无重复的化合物二级质谱数据,鉴定了其中52种代谢产物。此数据库为后续分析白色链霉菌以及其为宿主的异源表达菌株的代谢差异和研究SF2768生物合成基因簇功能奠定了坚实的基础。
  (2)SF2768为双异腈天然活性物质,具有潜在应用价值。本章研究旨在揭示SF2768的生物合成途径,寻找可能的生物合成前体,解释其生物合成基因簇的功能。首先,本文比较了野生型白色链霉菌与异源表达菌株S.albus∷pZMY13C的代谢差异,以确认只有异源表达菌株可以产生SF2768。随后,利用代谢组学多组比较的方法分析△sfaA、△sfaB、△sfaC、Δs faD这4个基因中断菌株与异源表达菌株S.albus∷pZMY13C代谢差异(前人研究结果表明△sfaA、△sfaB、ΔsfaC、△sfaD和△sfaE这5个基因敲除后会完全阻断抗生素SF2768的生物合成),以寻找SF2768可能的合成前体。通过实验发现谷氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯基甘氨酸、氨基丁酸和烟碱酸为SF2768生物合成途径中的关键代谢物。为了进一步确证我们的结果,在异源表达菌株S.albus∷pZMY13C发酵过程中添加这6种化合物,并检测SF2768的产量变化。同时添加等量的6种可能前体物质后,苯基甘氨酸会极大程度上调SF2768产量,最有可能为SF2768的生物合成的前体物质。
  (3)在前期利用代谢组学的方法探究SF2768生物合成基因簇功能的过程中,本文建立了相对成熟的代谢组学分析方法。由此,利用该方法对系列以白色链霉菌为宿主的异源表达菌株进行代谢组学分析,寻找宿主与异源表达菌株间的代谢差异,以提高抗生素的产量,指导其生物合成或发现新天然产物。这些菌株包括S.albus、S.albus∷pZAY10A3、S.albus∷pZAY23F11,它们分别产肠菌素、全霉素等抗生素。通过LC-MS对上述菌株进行代谢产物扫描,均检测到目标代谢产物,并进行野生菌株与各异源表达菌株代谢差异分析,发现了影响异源表达的重要差异代谢物。
  本文以HPLC-HRMS进行白色链霉菌的代谢组学分析,建立了白色链霉菌代谢物的质谱数据库,开展了以白色链霉菌为宿主的异源表达菌株代谢物差异分析,这对SF2768生物合成基因簇的功能分析和新型抗生素发掘等研究均具有重要意义。
[硕士论文] 朱思琦
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:聚酮化合物种类繁多,通常具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性,因而引起人们的广泛关注。聚酮化合物的碳链骨架由聚酮合酶催化。不同类型聚酮化合物生物合成途径的揭示,将为未来发现乃至创造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以两个聚酮合酶基因簇为研究对象,利用遗传学、分子生物学、生物化学的研究方法,对基因簇的功能及调控进行了探索。
  1链霉菌SH-62基因组中聚酮合酶基因簇cluster9的研究
  来自链霉菌SH-62的聚酮合酶基因簇cluster9属于Ⅰ型PKS,与数据库中已知的天然产物合成基因簇同源性较低,可能是一个新的天然产物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster9的BAC质粒在Streptomyces albus中异源表达产生3个疑似的代谢产物。为了检测这3个化合物与cluster9的相关性,采用两种基因组编辑方法,包括λ-Red介导的PCR-targeting系统和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系统,对cluster9中的核心pks基因进行了敲除。发现核心基因的敲除没有影响3个化合物的合成,说明它们并不是cluster9的异源表达产物。
  2Aureothin生物合成基因簇中调控因子AurD的研究
  Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香类抗生素,在其生物合成基因簇中只发现了一个潜在的转录调控因子aurD。敲除aurD基因会阻断aureothin的合成过程,而aurD基因的回补实验一直无法成功。考虑到aurD基因的过量表达可能会影响细胞的生长,因此本研究采用了基因原位回补的方法,将安装有组成型强启动子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位点,成功获得了基因回补突变菌株。回补菌株的发酵产物分析证实aurD基因的回补能够恢复aureothin的产生,并且因为组成型强启动子增强了aurD基因的表达使得aureothin产量显著提升,进一步地证实了aurD对aureothin生物合成的正调控效应。
  AurD具有一个OmpR类DNA结合结构域和一个细菌转录激活结构域,属于SARP家族转录调控蛋白。为了研究AurD蛋白的调控机制,分别在大肠杆菌和链霉菌中超量表达AurD蛋白,在链霉菌中,AurD蛋白的表达量很低;在大肠杆菌中,AurD蛋白主要以包涵体形式存在。未来需要在表达系统和条件上进行进一步的优化。
[硕士论文] 熊海涛
微生物学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌,革兰氏阳性菌,是一种重要的工程菌株,广泛用于工业上脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶的生产。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种模式菌株,具有非致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,因此是异源蛋白分泌表达的理想宿主。现有的枯草芽孢杆菌启动子不足以满足工业上利用枯草芽孢杆菌大量表达外源基因的要求,因此寻找新型的可以在枯草杆菌中表达可控的强启动子是非常必要的。
  本课题目的在于探索一种新的筛选芽孢杆菌启动子的方法,通过SDS-PAGE和生物学软件分析芽孢杆菌中筛选启动子,成功获得了具有启动活性的组成型启动子BSP3和诱导型启动子BSP5B,以Saccharomonosra viridis中的麦芽糖α-淀粉酶为报告基因,构建重组质粒pHCMCO4-BSP3-sva和pHCMCO4-BSP5B-sva分别转入B.subtilis1A857中表达。结果显示BSP3和BSP5B均能在枯草芽孢杆菌中表达SVA基因,通过DNS法测的胞外发酵液最高粗酶活分别为16.248U/mL、21.758U/mL。
  本研究以现有的组成型强启动子P43为基础,与克隆得到的组成型启动子BSP3进行核心保守区域的替换杂交。分别得到杂交载体BSP3D2-sva、BSP3D3-sva、XL3-sva、XL4-sva、XL5-sva、XL6-sva,转入B.subtilis1A857中,每隔12h取样测定SVA的酶活及OD600,测得发酵液最高粗酶酶活分别为19.924U/mL、19.063U/mL、14.982U/mL、20.578U/mL、26.142U/mL、17.538U/mL,OD600值分别为4.308、3.592、3.35、3.35、6.418、4.672,单位生物量含有的粗酶酶活单位分别为4.624U/mL、5.307U/mL、4.470U/mL、5.036U/mL、4.073U/mL、3.754U/mL。BSP3D3-sva表达效果较佳是原BSP3启动子表达活性的1.11倍。XL4-sva表达效果是P43启动子表达活性的1.44倍。说明集中不同启动子的优势核心保守区域,可以优化启动子的结构提高启动子的转录效率。
  本课题在成功构建的表达载体pHCMCO4-BSP5B-sva的基础上,对诱导型启动子BSP5B的核心保守区域定点突变,得到突变载体BSP5B-35A-sva、BSP5B-10A-sva、BSP5B-10B-sva、BSP5B-35C-sva、B SP5B-10C-sva,转入B.subtilis1A857表达测得SVA发酵液最高粗酶酶活分别为21.991U/mL、23.595U/mL、31.156U/mL、43.228U/mL、35.981U/mL,OD600值分别为5.115、4.992、5.28、5.318、4.592,单位生物量含有的粗酶酶活单位分别为4.299U/mL、4.793U/mL、5.899U/mL、8.130U/mL、7.836U/mL。突变体BSP5B-35C-sva、BSP5B-10C-sva突变优势明显,表达活性是原BSP5B启动子的1.75倍、1.69倍。该实验结果显示,突变启动子核心保守区域会改变启动子的转录活性,将启动子的核心保守区域定点突变为经典启动核心保守区域会提高启动子的转录活性。
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