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[硕士论文] 陈万方
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 张莹
动物生物技术 西北农林科技大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 代伟
生物工程 成都理工大学 2018(学位年度)
摘要:6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,g6pd)是可产生还原力的磷酸戊糖途径的限速酶,半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,cys)参与生物体抗逆代谢中重要前体物质半胱氨酸的合成,这两个基因的协同作用维持生物体的还原状态,增强抗逆代谢。论文利用基因工程技术手段将沼泽红假单胞菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因重组到大肠杆菌中,研究其提升重组基因工程菌株耐受和对重金属离子的吸附。论文研究了g6pd和cys基因的扩增和分析;构建含6-磷酸葡萄糖脱氢酶和半胱氨酸合成酶的双元表达载体,获取重组基因工程大肠杆菌;通过诱导表达,筛选重组基因工程大肠杆菌。并考察其对钴离子的吸附,研究重组蛋白对其耐受能力的提升。
  论文主要取得以下结果:
  1.在NCBI数据库上查找到沼泽红假单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因序列,设计出引物,通过PCR扩增,测序,用DNAman分析基因同源性和氨基酸组成,并用SWISS-MODEL模拟了两个基因对应蛋白质的三维结构。结果表明:扩增得到沼泽红假单胞菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因;氨基酸序列和蛋白质构象分析表明6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因表达的蛋白质含有504个氨基酸,大小为55.99kDa,半胱氨酸合成酶编码蛋白质含有332个氨基酸,大小为34.55kDa。
  2.分别设计含酶切位点的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(BamHⅠ、HindⅢ)和半胱氨酸合成酶基因(NdeⅠ、KpnⅠ)扩增引物,扩增后与克隆载体pBM20-T连接得到克隆重组质粒;扩增回收的产物与双元表达载体pETDuet-1质粒连接,构建含6-磷酸葡萄糖脱氢酶和半胱氨酸合成酶的双元表达质粒载体pETD-GC;然后将该质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,获得了含6-磷酸葡萄糖脱氢酶和半胱氨酸合成酶基因的重组大肠杆菌。
  3.基因工程菌株通过IPTG诱导表达,筛选出能正确表达的BL-GC,考察其在不同pH、温度和Co2+初始浓度等条件下对Co2+的吸附,研究BL-GC的耐受性。结果表明:BL-GC菌较适宜的吸附条件为pH=6.5,温度为30℃,Co2+浓度为60mg/L,这个条件下培养15小时吸附率可达39.7%,菌株BL-GC的吸附能力较BL21(DE3)提高了3倍,而当Co2+浓度达到120mg/L时,BL-GC仍可继续生长,吸附可达31.6%。从BL21(DE3)和BL-GC两株菌的生长曲线,发现质粒的转入导致了BL-GC的生物量略低于BL21(DE3),而BL-GC的吸附比宿主菌株更高,说明重组转入的沼泽红假单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因和半胱氨酸合成酶基因在诱导表达后成功提升了宿主菌株的抗逆能力。
[博士论文] 侯文冰
应用数学 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:一直以来,人类探索生命现象的脚步从未停歇。20世纪以来,人类对生命现象的研究逐渐深入,从生物表象型的研究进入到生物小分子领域。20世纪90年代,随着科学技术,尤其是计算机技术的飞速发展,生命科学的研究进入了新的阶段。人类基因组计划的启动和实施,开辟出大量的生物数据资源,同时也对数据的存储和处理提出了更高的要求。在这样的背景下,生物信息学这一交叉学科应运而生,它的主要特点正是运用新兴的计算机科学技术和网络技术来有效的管理分析大量的生物学数据,找出其背后隐藏的生物学规律。在生物信息学中,对生物序列进行相似性分析是一项重要任务。本文主要研究工作是围绕着生物序列的相似性分析展开,分别以DNA序列和蛋白质序列作为研究对象,提出了不同的生物序列相似性分析方法。
  在第二章中,区别于常见的图形化表达方式,从信号的角度,基于不同的编码方式,本章提出了两种不同的DNA序列的编码模型。在第一种编码方式下,DNA序列被映射为信号幅度为2的方波,用四种不同的信号持续时长来分别代表AGTC四种不同的碱基,以方波幅度的交替来表示碱基的更迭。第二种编码方式则借鉴CMI编码,将实际的DNA序列转化为CMI码序列。利用转化得到的信号序列可以对DNA序列进行相似性分析。通过与已有的模型进行对比发现,以信号的思想来理解DNA序列是切实可行的,本章提出的方法是有效的DNA序列相似性比较手段。
  第三章中以蛋白质为研究对象,提出了一种基于惯性张量的蛋白质序列分析模型。首先按照氨基酸的不同性质,将20种氨基酸映射为三维空间上不同的点。通过赋予每个点“质量”,借助惯性张量的计算,可以得到蛋白质序列之间的相似程度。本章分别采用来自哺乳动物的蛋白质序列以及来自杆状病毒的蛋白质序列说明了本章提出方法的有效性。
  第四章中提出了一种基于离散傅里叶变换和动态时间规整算法的蛋白质序列分析模型。首先将蛋白质字符序列映射为数值序列,将其视为由三组信号构成的信号序列。通过对序列进行离散傅里叶变换,能够得到氨基酸序列的功率谱,随后利用动态时间规整算法判断两个氨基酸序列的相似性。从本文的计算结果中可以发现,取自相近时间段的甲流病毒的蛋白质序列的相似性更高。通过与其它软件和论文得出的计算结果进行比较,发现使用本文中同样数据的情况下,本文提出的方法能够纠正部分目前已有的软件与其他算法中的一些错误分类。
[硕士论文] 郭晶晶
化学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:酶在医药、食品、化工等领域广受关注,有关如何保持酶活性及稳定性的研究具有重要意义。本论文以酪蛋白为底物,研究了商品化菠萝蛋白酶和菠萝水果中菠萝蛋白酶的活性及稳定性,探究了阴离子表面活性剂十六烷基硫酸钠(SDS)、阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)、Gemini表面活性剂二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二胺(12-5-12)、二溴化-双(二甲基十二烷基)庚二胺(12-8-12)、二溴化-双(二甲基十二烷基)十二胺(12-12-12)、二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二胺(16-5-16)、二溴化-双(二甲基十六烷基)辛二胺(16-8-16)和非离子表面活性剂辛基苯基聚氧乙烯醚(Tx-100)对菠萝蛋白酶活性和稳定性的调控作用,通过荧光光谱和1H NMR研究了表面活性剂和菠萝蛋白酶的相互作用,并在此基础上利用表面活性剂反胶束对菠萝蛋白酶进行了提取。
  实验结果表明,阳离子和非离子表面活性剂可提高菠萝蛋白酶的活性,阴离子表面活性剂可抑制菠萝蛋白酶的活性。当DTAB浓度达到2mM、CTAB浓度达到0.3mM后,菠萝果肉中菠萝蛋白酶粗酶活性可以提高20%-30%左右,商品化菠萝蛋白酶活性可以分别提高70%和50%。当Gemini表面活性剂12-s-12(s=5、8、12)达到0.1mM,16-s-16(s=5、8)达到20μM后,菠萝蛋白酶粗酶活性可分别提高50%和20%左右,商品化菠萝蛋白酶活性可分别提高80%和60%左右。具有较短疏水链的表面活性剂使菠萝蛋白酶对温度、pH、离子强度的耐受性增强,可使菠萝蛋白酶在更宽的反应条件下表现出较高的活性。当Tx-100/16-5-16复配后,菠萝蛋白酶粗酶活性可得到进一步的提升,说明非离子/阳离子表面活性剂存在协同效应。此外,阴离子表面活性剂会降低菠萝蛋白酶的荧光强度,阳离子表面活性剂会提高菠萝蛋白酶的荧光强度,且菠萝蛋白酶荧光强度的降低对应菠萝蛋白酶活性的衰减,菠萝蛋白酶荧光强度的增高对应菠萝蛋白酶活性的增加。
  1H NMR研究表明随着表面活性剂浓度的增加,阳离子表面活性剂极性头基信号峰的化学位移向低场移动并伴随半峰宽变宽,阴离子表面活性剂头基信号峰的化学位移向高场移动并伴随半峰宽变窄,且表面活性剂疏水链上氢的化学位移均向低场移动。菠萝蛋白酶加入后,表面活性剂的化学位移均向高场移动。菠萝蛋白酶的化学位移也与表面活性剂结构相关,阳离子表面活性剂存在时菠萝蛋白酶的化学位移均向低场移动,半峰宽变宽,阴离子表面活性剂存在时菠萝蛋白酶峰化学位移向高场移动,半峰宽变窄。阳离子表面活性剂与菠萝蛋白酶的化学位移还与温度有关。随着孵育温度的升高,表面活性剂和菠萝蛋白酶的化学位移会进一步向高场移动。说明阳离子表面活性剂与菠萝蛋白酶之间的静电作用和疏水作用使得表面活性剂加入后菠萝蛋白酶的构象更舒展。
  此外,Gemim表面活性剂反胶束在菠萝蛋白酶提取中也表现出很好的效能。研究结果使用间隔基较长的Gemini表面活性剂时,不仅可以在较宽的表面活性剂浓度范围内对菠萝蛋白酶进行萃取,而且表现出较好的提取效能。12-12-12表面活性剂反胶束对菠萝蛋白酶萃取效能最佳,能使菠萝蛋白酶的活性回收率达到160%,纯化倍数达到3倍、萃取效率达到60%。
[硕士论文] 贾羽
轻工技术与工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本研究构建了一种针对人表皮生长因子受体-2(HER-2,human epidermal growth factor receptor-2)的双特异性纳米抗体(BsNb,bispecific nanobody)。
  通过噬菌体库筛选出7个针对HER-2的纳米抗体的不同序列。将这7个序列分别连入pET-28a高表达系统进行诱导表达,通过镍柱-中高压蛋白层析系统纯化蛋白。将纯化后的蛋白进行抗原-抗体和抗体-靶细胞的结合鉴定。鉴定完毕后,挑选出两个结合活性最好的纳米抗体,将相应片段分别与pFUSE-CH,CL载体构建人源化抗体表达质粒。经细胞表达产生完整IgG形式的双表位的抗体,之后进行细胞杀伤实验。筛选出特异性较强的纳米抗体片段;成功构建pET28a-BL21可溶性蛋白高效表达菌株;构建人源化抗体表达载体,获得的双特异性纳米抗体杀伤效果明显。构建的人源化的HER-2纳米双抗,对于肿瘤细胞的亲和和杀伤效果显著。相较于其他类别的人源化抗体,人源化的纳米双抗无论在成本还是亲和力方面都是不错的选择。如果能够产业化,将具有良好的应用前景。
[硕士论文] 金戈
生物工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:酵母是细胞生物学、临床医学、遗传学等研究领域的重要模式生物,还是食品、饮品、饲料生产及加工过程中的重要工业微生物,更是生物技术产品研发的热点。尤其,酵母细胞壁中富含多糖、对食品及粮食中积累的毒素具有较好的吸附作用,使酵母细胞壁亦成为重要的生物资源。但由于酵母细胞壁较厚,现有细胞壁的获取方法较粗放,常在制备过程中使细胞大量破裂而释放出细胞内容物,影响所得细胞壁纯度,降低其吸附效率。因此,急需找到一种温和且高效的细胞壁分离方法,以获得高质量的酵母细胞壁。
  藤黄节杆菌(Arthrobacter luteus)是一种可高效裂解酵母细胞的放线菌,可通过酵母诱导表达出大量胞壁降解酶类(Lyticase)。但诱导的酶类成分较为复杂,除胞壁降解酶类还包含一些DNA酶类,且纯化效率较低。因此,本研究拟全面解析藤黄节杆菌中受到酵母诱导表达的胞壁降解酶类,构建这些酶的高效表达重组菌株,为酵母原生质体及细胞壁分离提供工具酶。本研究首先对藤黄节杆菌进行了全基因组测序,并以酵母诱导其分泌胞壁降解酶,经SDS-PAGE比较诱导组与未诱导组的差异蛋白条带,再进行质谱分析,解析差异蛋白种类。通过大肠杆菌原核表达系统制备重组胞壁降解酶。主要研究结果如下:
  1、由基因组测序得到了藤黄节杆菌的基因组全长约4.582Mb,共有3600个可读编码序列,tRNA、rRNA为78个,GC比含量约74%。
  2、经质谱检测酵母诱导组胞外粗酶的差异蛋白质组,结果表明,约40个分泌蛋白质参与到了裂解酵母细胞壁的过程中,最后筛选出了8个差异表达明显的基因,分别是:β-葡萄糖苷酶(Beta-glucosidase,EC3.2.1.21,2个)、β-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase,EC3.2.1.23)、内切木聚糖酶(Endo-1,4-beta-xylanase)、α-1,2-甘露糖苷酶(Alpha-1,2-mannosidase)、α-葡萄糖苷酶(Alpha-glucosidase,EC3.2.1.20)、糖苷水解酶(COG1649predicted glycoside hydrolase)、蛋白酶(Peptidase S8and S53,subtilisin,kexin,sedolisin)。
  3、以藤黄节杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,成功克隆了8个基因,并将其与表达载体pET28a与pET32a进行了连接,通过转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株中进行诱导、表达,并将目的蛋白经Ni柱、Q柱纯化,分别得到了这8种酶的原核表达产物。
  4、将8种重组酶组合成重组胞壁降解酶对酵母细胞进行裂解细胞壁实验,裂解率达到粗酶的49倍,纯化后的β-葡萄糖苷酶中最高的酶活为49.78U/g,β-半乳糖苷酶最高酶活为116.43U/g,内切木聚糖酶最高酶活为75.29U/g。
  目前对酵母细胞壁的裂解方法主要有细胞自溶法、机械破碎法、酶解法及酸碱法等,本研究采用的酶解法相较于其他几种方法具有省时省力,对酵母细胞内蛋白损耗较小等优点。重组胞壁降解酶则又改正了粗酶制备耗时长,成本高,引入杂酶多且难去除等缺点,该酶即可实验研究使用又可用于工业化生产,且其中的单一酶组分也具有一定的研究及生产价值。
[硕士论文] 刘若男
动物遗传育种与繁殖 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎移植技术(Embryo transfer,ET)是胚胎工程的最后一个步骤,对胚胎的妊娠率起着关键性的作用。在小鼠、牛羊以及人类的胚胎移植过程中,常常会有一定量的空气伴随胚胎被移植进入子宫。这些气泡是否影响胚胎移植的结果,至今没有定论。研究表明在豚鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类动物中,体内雌、孕激素水平在一定条件下,宫腔内空气能诱导子宫内膜发生蜕膜化反应。同时小鼠胚胎移植结果显示,子宫内气泡能够导致早期胚胎死亡。蜕膜化能否正常进行是胚胎着床发育的关键因素。因此为了探究子宫内气泡对胚胎发育的影响,向假孕3.5d、正常妊娠3.5d小鼠子宫角内移植微量空气,收集7.5d蜕膜组织,通过形态观察、子宫内膜通透性检验、组织切片、蛋白质双向电泳、转录组测序及RT-PCR验证的实验方法对其机理进行研究。结果显示子宫内气泡能够诱导小鼠子宫角发生明显的增粗、增重、体积增大,且发生明显的血管重塑,双核细胞大量出现,各类细胞不规则分布,不能够区分主、次蜕膜区,子宫内胚胎大量死亡。蛋白质双向电泳结果显示在被检测范围内,子宫内气泡诱导蜕膜与正常蜕膜无蛋白差异点。而转录组测序结果显示,两组之间有64个差异表达基因,其中有59个差异表达基因在正常蜕膜中高表达。差异表达基因中表达量最高的前10位基因依次H19,Prl7a1,Prl3d1,Prl4d1,Prl2c3,Krt8,Mmp9,Prl2c2,Plet1,Cts7。对差异表达基因进行GO分析,这些差异基因主要富集在胎盘发育、滋养层巨细胞分化、细胞对白细胞介素因子1的反应、细胞对肿瘤坏死因子的反应、生长激素活性调节、细胞蛋白分解过程中蛋白质水解等生物过程,富集基因都为正常蜕膜高表达基因。使用RT-PCR对转录组测序结果进行验证,结果显示被验证的8个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。结果表明移植进入子宫内的气泡导致子宫内膜多个位点发生异常蜕膜化反应,基因表达模式发生变化,影响胚胎正常发育,最终导致胚胎死亡。这些研究结果不仅有利于提高小鼠胚胎移植成功率,更为重要的是,它为人类以及其他动物胚胎移植研究提供了新思路。
[博士论文] 金龙
动物遗传育种与繁殖 延边大学 2018(学位年度)
摘要:体细胞核移植(SCNT)是一种哺乳动物生物医学研究方面的有价值的工具。但是SCNT效率一直很低,困扰着克隆猪的应用。目前认为克隆效率低的主要原因是异常的表观遗传修饰导致的。利用组蛋白去乙酰化抑制剂(HDACi),可以修正异常的表观遗传重编程,进而提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat和CI994是HDACi,他们都具有促进组蛋白乙酰化水平的能力,但是尚未在猪SCNT研究中报道。本研究是第一次使用这五种HDACi探究其对猪核移植胚胎发育的影响。
  方法:利用不同浓度的HDACi(MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat和CI994)处理猪克隆胚胎24小时,找出最佳处理浓度,随后用最佳处理浓度处理不同时间,找出最佳的HDACi处理时间。确定好五种HDACi的最佳处理条件后,通过免疫荧光染色方法和PCR等方法确定猪SCNT胚胎中组蛋白乙酰化水平、DNA甲基化水平、凋亡水平以及多能性和凋亡相关基因表达水平。每种HDACi处理后的克隆胚胎将被移入待遇母猪体内,观察胎儿发育情况。
  结果:(1)与对照组相比,0.2μM的MGCD0103处理猪克隆胚胎24 h可以显著提高猪SCNT胚胎的囊胚形成率(25.5% vs.10.7%;P<0.05)。之后用MGCD0103处理6小时的猪SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗体进行免疫荧光染色。结果显示,MGCD0103处理的假原核期猪核移植胚胎中组蛋白H3K9的乙酰化水平(AcH3K9)和组蛋白H4K12的乙酰化水平(AcH4K12)均显著地高于对对照组。体内移植实验结果表明CI994处理的猪SCNT胚胎移入2头代孕母猪后,获得3个克隆胎儿。这些结果说明MGCD0103可以增强核重编程并提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。(2)与对照组相比,0.5 nM的PCI-24781处理猪克隆胚胎6小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(25.3% vs.10.5%;P<0.05)。之后用PCI-24781处理6小时的猪SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗体进行免疫荧光染色。结果显示,PCI-24781处理的假原核期猪核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12均显著地高于对对照组。而且TUNEL结果表明PCI-24781处理可以显著抑制SCNT胚胎的凋亡的细胞数。体内移植实验结果表明PCI-24781处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得2个猪胎儿。综上所诉,PCI-24781处理可以明显提高体细胞核重编程的能力和猪SCNT胚胎的发育能力。(3)与未处理对照组相比,5μM的M344处理猪克隆胚胎6小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(25.1% vs.10.9%;P<0.05)。而且M344处理可以显著提高假原核期猪克隆胚胎中AcH4K12平均荧光强度。但是多能性相关基因Oct4,NANOG和SOX2的mRNA表达水平在M344处理组和未处理组之间没有显著性差异。体内移植实验结果表明CI994处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得3个克隆胎儿。综上所诉,M344处理可以提升组蛋白乙酰化水平、促进核重编程的能力并且提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。(4)与未处理对照组相比,10nM的Quisinostat处理猪克隆胚胎24小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(19.0% vs.10.2%;P<0.05)。而且Quisinostat处理可以显著提高假原核期猪克隆胚胎中AcH3K9平均荧光强度。同样,免疫荧光结果证实Quisinostat处理可以明显促进猪核移植囊胚中POU5F1的表达水平。PCR结果证明Quisinostat处理明显提升了BCL2的mRNA表达水平,但是BAX的mRNA表达水平没有显著性差异。体内移植实验结果表明Quisinostat处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得6个猪克隆胎儿。综上所诉,Quisinostat处理可以调整表观遗传修饰、促进核重编程,进而提高猪SCNT胚胎的发育能力和囊胚质量。(5)与对照组相比,10μM的CI994处理猪克隆胚胎24小时可以显著提高猪SCNT胚胎的囊胚形成率(21.9%vs.11.4%; P<0.05)。虽然CI994处理可以显著提高假原核期猪核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12的平均荧光强度,但是在囊胚期中AcH3K9和AcH4K12的平均荧光强度没有显著性差异。免疫荧光结果证明CI994可以显著促进SCNT囊胚中POU5F1的表达,但不影响5mC的平均荧光强度。TUNEL结果表明CI994处理可以显著抑制SCNT胚胎的凋亡的细胞数。PCR结果表明多能性相关基因POU5F1和SOX2的mRNA表达水平在CI994处理组中显著高于未处理组。体内移植实验结果表明CI994处理(10μM for24 h)的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得3个猪胎儿。综上所诉,CI994处理可以提升组蛋白乙酰化水平、增强体细胞核重编程的能力,进而提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。
  结论:组蛋白去乙酰化抑制剂MGCD0103(0.2μM,24小时)、PCI-24781(0.5nM,6小时)、M344(5μM,6小时)Quisinostat(10nM,24小时)及CI994(10μM,24小时)处理猪核移植克隆胚胎可以显著增强组蛋白乙酰化水平、抑制细胞的凋亡、促进多能性相关基因的表达、提高体细胞核重编程能力和体外发育能力。
[硕士论文] 王印典
材料工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:酶在纺织、发酵、食品、新能源等领域有广泛的应用。由于酶易失活、难回收,成本较高,限制了其工业应用,对酶进行固定化能增强酶的稳定性,实现酶的回收和重复利用,降低成本。常见的固定化酶的方法主要包括物理吸附、共价结合、包埋和交联,其中尤以共价结合的应用最为广泛,但目前共价固定化酶的方法普遍存在固定效率低、路线复杂、易导致酶失活等缺点。针对上述问题,本文提出了以高反应性的苯乙烯马来酸酐共聚交联微球为载体高效固定酶的新方法。论文主要取得以下结果:
  1、利用苯乙烯马来酸酐共聚物微球实现了纤维素酶的固定化。通过自稳沉淀聚合法制备苯乙烯马来酸酐交联共聚纳米粒子(Styrene/maleic anhydride copolymer nanoparticles,SMN)固定化纤维素酶。首先以苯乙烯和马来酸酐通过自稳定沉淀聚合法制备得到SMN,然后利用酸酐基团的高反应性,在室温且不加其他活化试剂的条件下将纤维素酶共价结合到SMN上,固定效率为78.5%,最适的负载量为167mg/g。纤维素酶固定后从30℃到80℃温度下活性变化几乎与游离纤维素酶一致,但其pH稳定性明显改善。在pH8.0时保留最大活性的80%,远远高于游离酶(14%)。此外,固定化纤维素酶在催化过程中表现出优异的重复使用性,其中在催化羧甲基纤维素钠盐(CMC)的重复实验中,使用6批次后保持100%的活性,10批次后仅损失20%的活性。通过SMN粒子实现纤维素酶的固定化,可以提高纤维素酶的操作稳定性,有利于实际生产,为大规模生产生物乙醇解决能源危机提供了可能。
  2、利用苯乙烯马来酸酐微球实现了木瓜蛋白酶的固定化。对固定过程的反应时间,反应pH和木瓜蛋白酶的加入量进行了探究,确定了最适的反应时间为2小时,最适的反应pH为7.4,最适的酶加入量为8mg/mL,最佳的负载量为126.6mg/g,固定效率可以达到63%。固定后木瓜蛋白酶在催化酪蛋白的重复实验中,重复5批次以后仍能保持70%的活性。通过SMN实现了对木瓜蛋白酶的固定化,提高了木瓜蛋白酶的操作稳定性,降低了成本,有利于木瓜蛋白酶的工业应用。
[硕士论文] 陈鹏
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:随着工业发展的进程,煤与石油等非再生能源的不断消耗,废气中的二氧化碳造成的环境影响也越来越大,其处理方法受到各国的关注。在生物科学的迅速发展中,有研究发现某些生物具有固定二氧化碳的生化反应,探究如何在温和的条件下对二氧化碳进行生物固定则成为了研究热点。常温下,不需要添加任何辅助因子以及ATP,芳香羧酸脱羧酶(主要催化苯酚类衍生物)就能够转化芳香类羧酸成为芳香烃与二氧化碳,同时这个反应也是可逆的。
  为了推进生物法在固定二氧化碳中的应用,本文针对两种不同来源的苯甲酸脱羧酶进行了结构生物学研究。本文工作根据前人从数据库挖掘基因所获得的芳香羧酸脱羧酶基因,设计引物,成功构建克隆pET-22b-AoDHBD(Aspergillus oryzae米曲霉菌,二羟基苯甲酸脱羧酶)与pET-22b-TmSAD(Trichosporon moniliiforme毛孢子菌属,水杨酸脱羧酶),导入Rosetta(DE3)大肠杆菌中进行表达纯化,并获取大量蛋白。在结晶实验中分别获得了7个不同的结晶条件,通过重复优化池液组分,在上海光源BL17U1和BL19U1线站分别获得了衍射分辨率达到1.76(A)与2.04(A)的晶体数据,从而解析了AoDHBD与TmSAD的晶体结构。
  在获得了二者的结构后,开展了其与底物复合物的结构研究。由于AoDHBD需要通过Zn2+结合底物从而进行反应,在诱导与纯化时补加Zn2+,初步筛选得到8个可结晶条件,重复优化后获得了高质量的晶体,同时通过浸泡小分子的方法尝试解析蛋白与底物复合物的晶体结构。
  与已报道根瘤菌(Rhizobium sp.Strain MTP-10005)的RsDHBD不同,AoDHBD的活性位点处分别是W23、F27、A63、H167、F193、H222、D291、F296,其中F27作为关键氨基酸对于羧化与脱羧反应可能具有重大影响,于是设计了F27W、F27I、F27A的突变体,准备采用野生型作为对照组进行酶动力学实验。
[硕士论文] 刘天龙
化学工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:NADH主要存在于线粒体中,是细胞进行代谢核心物质。作为一种药物,NADH有清除机体自由基、预防癌症、治疗癌症、治疗神经退行性疾病等功能。它既是一种药品,也是一种保健品,有广阔市场。本实验通过固定化实验室异丙醇脱氢酶工程菌株所产酶,并对其固定化工艺、催化反应过程进行优化,为其生产应用奠定基础。
  粗酶液制备。选取最优发酵条件,摇瓶装液量40mL,诱导剂终浓度0.8mM,诱导剂加入时机在菌体OD600到0.6左右时加入,诱导表达时间12h。在300W超声条件下,悬菌液浓度0.15g/mL,破碎时间10min可使粗酶液酶活力达到最大。
  固定化载体初筛。通过吸附、包埋、交联、全细胞固定化等方法对异丙醇脱氢酶或者工程菌细胞进行固定化。在各类树脂、凝胶颗粒等20多种载体中,经过初筛得到酶活保留率为68.3%的载体ESR-3。
  固定化过程优化。初筛得到载体固定化过程进行优化,最终使ESR-3载体固定化异丙醇脱氢酶酶活保留率达到78.3%。固定化异丙醇脱氢酶最优条件为:固定化时间2h,缓冲液pH为7,摇床转速150r/min,固定化温度20℃。
  固定化异丙醇脱氢酶酶学性质初探。固定化酶最适宜反应温度为30℃,游离态酶最适宜反应温度为35℃,固定化酶的热稳定性有所下降。固定化酶和游离态酶最适宜反应pH均为9,固定化酶耐酸、耐碱能力明显提高。储存稳定性好,4℃保存28天仍有89.7%酶活性,而游离态酶已经降至67%。固定化酶重复使用8次酶活衰减至一半,且将反应等比例放大7倍至210mL后,反应10h得到产物345mg,转化率70.4%。
[硕士论文] 涂佳娟
概率论与数理统计 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:在不同的疾病状态下,基因相关性网络经常发生变化。了解这些网络如何在两种不同疾病状态间的重新布局是基因组研究中的一项重要任务。为了实现这一目标,很多差异网络分析模型被提出,但其中大部分方法都是为某种预先定义的数据类型而设计的。随着高通量技术的发展,可以从不同视角收集基因活性测量数据(例如,mRNA表达和DNA突变)。这些不同类型的数据可能享有一些共同的特征,同时也包含这些数据类型所特有的属性。因此,需要新的估计方法来探索不同数据类型所对应的差异网络之间的相似性和特异性。在这项研究中,我们提出了一种新的差异网络推断模型。这个模型通过整合基因表达数据和基因突变数据来识别基因调控网络的重新布局,同时采用Group Bridge惩罚函数来学习不同数据类型间的相似性和特异性。模拟研究表明,我们的方法始终优于对比方法。我们还将这种差异网络推断的方法应用于铂抗性卵巢癌的基因组学图谱数据,并推断与卵巢癌铂抗性相关的基因网络重新布局。这两种数据类型对应的差异网络含有一些共同的差异边,同时也含有数据类型所特有的差异边。此外,在卵巢癌铂抗性的差异网络中共有的枢纽基因在卵巢癌铂抗性中起重要作用。
[硕士论文] 郑佳
计算机应用技术 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:机器学习中很多重要方法都离不开模型选择。模型选择在数据聚类、复杂网络社团发现及数据降维等方面应用广泛。如何准确地进行模型选择,从而选择出合理的目标维度,进而引导出具有可解释性的分析方案,挖掘出隐含在数据中的潜在信息是机器学习中模型选择所面临的一个挑战。
  矩阵低秩分解是目前应用广泛的数据降维和数据表示方法,其中非负矩阵分解是最具有代表性的矩阵低秩分解方法。非负矩阵分解(Nonnegative MatrixFactorization,NMF)作为一种矩阵的低秩逼近方法,它分解的矩阵和最终得到的结果矩阵的数值都是非负的。非负矩阵分解能将高维数据降至低维,一个合理的维度能引导更为理想的分解,使得分解之后的低维矩阵能最大限度的保留原始数据的特性。围绕非负矩阵分解的维度选择即模型选择问题,本文做了以下研究工作:
  第一、提出基于同趋性的模型选择方法(Tendency Drive Nonnegative MatrixFactorization,TDNMF)。不同于其他在分解过程中进行模型选择的方法,该方法从数据分解前后的结构保持情况出发,基于数据点之间的相关性关系,提出样本同趋性概念,并采用重采样的方法解决了在样本容量不一致的情况下比较样本相关性的问题。得益于这两种数据处理技巧,基于同趋性的模型选择方法(TDNMF)具有较小的时间复杂度。
  第二、提出基于信息均衡的模型选择方法(Entropy Balanced Nonnegative MatrixFactorization,EBNMF),该方法结合了非负矩阵的可伸缩分解特性以及高效稳定的维数选择标准,在多个模拟数据上体现了良好的性能。在此基础上,本文进一步地在真实生物数据集包括果蝇基因表达数据和人类微生物组数据集上对提出的方法进行了验证,表明了EBNMF方法的稳定性和可解释性。EBNMF能在信息分解过程中进行很好的模型选择,并能有效提取具有噪声的生物数据的有效特征。
  非负矩阵分解模型符合整体是由局部组成这一客观规律而被广泛应用于多个领域,但其模型选择仍然是一个难题。本文提出了两种非负矩阵分解的模型选择方法,分别在计算复杂度和准确性上具有一定的优势,可适用于不同级别的数据集。
[硕士论文] 苏矿喜
概率论与数理统计 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:人类的疾病多为由遗传和环境因素共同作用引起的复杂性疾病。目前全基因组关联分析(Genome Wide Association Study)已经成功鉴定了上千种与人类复杂性疾病相关联的SNP位点。这些新发现极大地推动了医学和生物学的发展。随着各个国家科研人员持续深入的研究探索,GWAS也逐渐成为近几年研究的热点问题。
  近年来,在GWAS研究中,全世界各个国家的科研人员已经识别了上千种SNPs和不同的性状或者疾病之间的关联性,并提供了实质性的内容了解疾病机制的信息。尽管关于基因与疾病的关联检验取得了长足的进步,但是GWAS中可识别与疾病关联的SNPs仅仅解释了基因变异的百分之几的比例,这就引出了一个问题即这些删失的遗传可以在哪儿以及怎样被识别,可能的解释包括以下几点:一方面,目前主效应不足以解释所有的遗传效应,许多研究已经证实了关联分析中存在交互效应,基于此,最近几年大量的检验统计量被提出来检验基因与基因之间的交互效应。另一方面,被广泛使用的检验基因之间交互作用或基因与环境之间交互作用的统计量功效一般比较低。例如常规的logistic回归方法,交互效应参数估计很不精确,且其检验识别力很低,因此提出一种高效的统计量来提高检验基因与基因之间交互效应的功效很有必要。
  在病例对照实验中,对照组中基因满足连锁平衡(LE)与哈代温伯格平衡定律(HWE)条件下,本文推导出一个新的得分检验统计量来提高检验基因与基因交互效应的功效并利用δ方法计算出得分检验统计量方差的渐近估计。本文主要在二种不同的遗传编码方式下讨论基因与基因之间的交互效应是否存在,分别为1:G1,G2的主效应和交互效应均采用可加遗传编码。2:G1,G2的主效应采用共显性遗传编码而交互效应采用可加遗传编码。我们证明了在两种不同的遗传编码下,推导出来的得分检验统计量及其方差的渐近估计完全一样。最后的模拟部分显示,在两种不同的遗传编码下,我们提出的得分检验统计量相比常规的logistic方法具有明显的数值优越性。
[硕士论文] 王田莉
应用统计 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:随着高通量技术的发展,获取大量的基因表达数据已经成为现实,因此生物学的研究方向转向了基因层面。从基因表达数据重构基因调控网络,能够了解基因表达和生物体基本功能之间的联系,这对分析生物体复杂生命现象有着重要的意义。现有的大多数方法利用相关系数及控制阈值大小构建网络,但构建的网络包含了基因间的直接与间接相互作用关系,使得网络准确度低。基于高斯图模型构建网络的方法考虑了相关系数构建网络准确度低的问题,然而,高斯图模型依赖于假设数据是高斯的。当不满足该假设时,估计的网络会产生假阳性边。此外,当样本数据出现噪音时,构建的网络准确度也较低。
  为了解决数据噪音影响结果准确度的问题,本文借助集成学习思想,提出了基于两层集成学习来构建基因调控网络的方法。第一层是对数据集进行随机抽样,产生多个数据集;第二层是对于每个数据集利用不同的鲁棒估计方法,对估计结果进行集成学习。此方法的主要特点是通过多次集成实验减少噪音的影响,提高结果的稳定性。基于高斯图模型求解算法,模拟实验验证了基于两层集成学习构建的基因调控网络准确度高,同时针对噪音数据该方法稳定性较强。
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