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[博士论文] 吴成超
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:人类基因组计划发现,人类基因组中超过98%的区域是非编码区域。ENCODE、Roadmap epigenomics等后续计划进一步发现,非编码DNA中包含如DNA甲基化位点、启动子、增强子等众多DNA调控元件。DNA调控元件通过激活或抑制转录事件,精准地调控目标基因的表达量。一方面,这些DNA调控元件正是由于其环境序列的特异性才能够参与转录调控;另一方面,DNA序列在数学上可被视为有限字母表上的有限词,研究其复杂度特征可以挖掘DNA的序列特异性。这激发我们通过序列复杂度数学工具来量化识别DNA调控元件。本研究分为以下三部分:
  第一部分,我们详细描述两种序列复杂度的数学定义,重点研究其计算算法,并通过特征选择筛选出有效特征。首先根据不同序列长度确定因子复杂度的算法获取原始特征,随后根据二阶差分工具筛选拓扑熵特征,并最终确定因子复杂度的有效特征。同时,我们研究了abelian复杂度的数学定义和计算算法,并通过对abelian复杂度特征进行特征筛选确定出其有效特征。
  第二部分,我们应用因子复杂度有效特征构建CpG甲基化水平预测模型。我们首先获取人类胚胎细胞的甲基化实验数据,并筛选其中的CpG甲基化位点。在将位点扩增至合适长度之后,我们提取序列因子复杂度特征和序列的基本组成特征,并构建了基于支持向量机算法的CpG甲基化水平预测模型,该模型在不同染色体上的平均分类准确率为94.7%。与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后我们利用已构建的预测模型预测全基因组水平不同功能元件中的CpG甲基化平均水平,通过与实验数据的对比,进一步验证了该模型的预测能力。
  第三部分,我们应用abelian复杂度特征构建增强子预测模型。我们从FANTOM5计划的数据库中获取人类基因组的增强子数据,通过提取序列abelian复杂度特征和序列基本组成特征,构建了基于随机森林算法的增强子预测模型,其中正负样本1∶1模型的分类准确率为93.1%,正负样本1∶10模型的分类准确率为96.0%。在与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后利用该模型在人类基因组22号染色体进行步长为100bp的扫描预测,成功预测到5,123条增强子区域。以不同细胞系和组织的组蛋白修饰信号为佐证,扫描预测准确率最高可达42.8%。
  综上所述,我们通过研究序列的因子复杂度特征和abelian复杂度特征,结合基本序列组成特征,成功构建了DNA甲基化、增强子等DNA调控元件的精准预测模型。基于预测模型的全基因组扫描预测结果可以缩小和降低相关生物学实验的目标范围和难度,为相关研究工作提供了有力的参考和指导,有助于解析人类复杂疾病的转录调控机制和完善人类基因组功能元件的注释。
[硕士论文] 张蕾
计算机技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:DNA测序是生物信息学的一项重要内容。从一代测序到二代测序,测序技术历经了方法和效率的巨大改变。在二代测序中,一次测序就可以获得GB级别的大规模测序数据。高通量测序产生的海量RNA-seq对数据分析技术提出了更高的要求。在分析RNA-seq数据的流程中,读段定位是分析RNA-seq数据的第一步,也是最重要的一步;读段定位直接影响着下游一系列数据分析的结果;已有大数据分析和计算技术为读段定位在运行时间和定位灵敏度上进一步提升提供了可能。以Hadoop为计算平台,本文开展了以下三个方面的研究工作:RNA-seq读段定位算法的研究;RNA-seq可变剪接识别算法的研究;RNA-seq数据分析结果的可视化。
  Hadoop作为大数据分析的主流计算平台,其计算特点可用来分析RNA-seq数据,本文设计了一个基于Hadoop的RNA-seq读段定位算法,以期提高读段定位过程运行效率,并使用种子扩展算法保证定位的灵敏度。算法主要学习了SeqMap的空位种子索引算法和mrFAST/mrsFAST的FastHASH方法,同时本文提出一个新的使种子定位到参考序列上的方法,新方法利用种子会连续定位的特点对定位规则做出了改变。实验证明:与传统读段定位工具相比,本文的基于Hadoop的读段定位算法不但可以在提升时间效率的同时,还可以保证读段定位过程的灵敏度。
  可变剪接是读段定位的下游的分析工作之一,对于以RNA-seq数据作为输入的可变剪接识别工具,往往需要依赖读段定位的结果才能进行可变剪接的识别分析,并且这些可变剪接识别工具需要依赖多个工具的支持以及注释文件才能进行识别,安装使用过程比较繁琐,能在并行环境下工作的可变剪接工具也较少,所以本文在读段定位的基础上设计了基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法,算法是根据工具SpliceMap和Tophat的思想设计而成,并提出一个新的跨越剪接位点的读段定位方法,新方法利用GT-AG剪切信号与读段种子间的规律辨别出剪接位点,进而实现跨越剪接位点的读段定位。实验证明:与ASTD可变剪接数据库相比,本文提出的基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法识别准确率可以达到50%以上,具有一定的实际应用价值。此外,基于本文算法开发的可变剪接识别工具具有使用过程简单,不依赖注释文件的优势。
  为了更加直观地展示可变剪接的识别结果,本文利用Servlet和Tomcat技术实现了可变剪接识别结果的可视化,可变剪接的识别结果可直接以网页的形式展示,参考序列上可变剪接发生的具体位置可以清晰显示,一目了然。
  读段定位的实验中,在2G以上的数据条件下,本文的读段定位算法的时间效率经过与Bowtie对比,可以提高将近40%,并且能识别出更多的读段,证明了基于Hadoop的读段定位算法可以提高时间效率并保证灵敏度。可变剪接实验中,本文算法通过与标准数据库对比,可以识别出参考序列五个可变剪接事件中的四个,准确率达到50%以上,可以证明本算法具有一定的实际应用价值。
[硕士论文] 李永飞
应用化学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:DNA是一种携带遗传信息的生物大分子,也是一种具有超强组装能力的纳米基元。二十世纪八十年代,Nadrian C Seeman教授率先提出采用DNA分子作为组装基元构筑高级有序结构,发展了DNA纳米技术这一重要新兴领域。迄今为止已经发展了多种组装策略,主要包括DNA模块自组装(tile-base assembly)、DNA折纸术(DNA Origam(1))和单链瓦片自组装(single-strand tile)。DNA纳米自组装的发展不仅大大丰富了微纳米结构的多样性与复杂性,在分析检测、生物医学等应用领域也展现出了巨大的应用潜力。本论文主要围绕DNA自组装开展了以下两方面研究:
  1.发展基于乙二胺的“无金属离子”缓冲体系,应用于DNA自组装。DNA自组装采用缓冲溶液大多为TAE/Mg2+,即需要金属阳离子(如:Mg2+)以屏蔽来自负电荷磷酸骨架的DNA链间静电斥力。但是,在某些应用中,镁离子或者其他金属阳离子的存在可能会带来不利影响,比如:增大金属离子依赖酶对DNA自组装纳米结构的影响。为了拓展DNA自组装的应用,本章节基于乙二胺分子开发出一种新的“无金属离子”缓冲体系用于DNA自组装,具体如下:(1)在乙二胺缓冲体系中,分别基于DNA双交叉模块和三臂模块成功组装得到二维纳米阵列和三维纳米笼—DNA四面体,表明这一新的缓冲体系适用于DNA自组装;(2)研究DNA自组装结构在新缓冲体系中的生物稳定性。研究表明:在新缓冲体系中,由于缺失镁离子,DNase I对DNA自组装结构的酶降解减弱;(3)基于新缓冲体系发展通用型pH调控手段。乙二胺分子具有pH响应性质,因此,基于乙二胺,可以实现DNA四面体组装与解组装的动态可逆调控。这种不依赖于DNA序列的pH响应调控,为DNA动态体系的开发提供了新的手段与思路。
  2.开发平行交叉四臂DNA模块,并组装得到DNA一维纳米管状结构。DNA自组装模块通常采用反平行交叉结形式,为了增加设计手段以及丰富DNA自组装结构多样性,本章节基于平行交叉结形式设计出一种新型四臂DNA自组装模块,并成功组装得到一维纳米管状结构。进一步探索了模块刚性、相对翻转角度等对自组装的影响。
[硕士论文] 程爱民
结构生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:基因的表达调控是一个发生在多时空、多层次的精细调控过程,包括表观遗传水平和翻译水平。组蛋白的翻译后修饰是重要的表观遗传调控方式之一,涉及写入器、阅读器、擦除器的相互作用。BAP1是一种重要的泛素擦除器,可以被ASXL1激活,对H2AK119ub1去泛素化,从而拮抗PRC1的功能。ASXL1激活BAP1的机制以及BAP1定位在染色质上的机理尚不清楚。CREBBP bromodomain是一种识别H3K56ac的组蛋白乙酰化阅读器,其识别的机理、识别的环境、识别的功能也不明确。除了组蛋白翻译后修饰,核糖体RNA的加工、成熟直接关系到蛋白质翻译机器核糖体的装配,也是重要的基因表达调控方式。U3 snoRNP核心复合物对rRNA进行2'-O-methylation修饰,促进rRNA的加工和成熟。目前对真核生物的U3 snoRNP核心复合物的装配研究较少。本文从三个方面对基因表达调控过程进行探究。
  BAP1是泛素羧基末端水解酶家族唯一定位在细胞核的成员,自身具有较低的酶活。ASXL1的DEUBAD结构域能够激活BAP1,并与BAP1形成PreDUB复合物对H2AK 119ub1去泛素化。我们在大肠杆菌中尝试多种方法成功表达和纯化了BAP1与ASXL1 DEUBAD结构域的复合物,生长的晶体最高衍射分辨率为2.6埃。我们发现BAP1单独存在时趋向于寡聚状态,而被ASXL1DEUBAD结构域激活后会形成稳定的异源二聚体,与报道的胞内研究结果一致。此外,我们用GST pull-down实验发现BAP1通过CTE结合在完整的核小体上,但不能作用于核小体酸性区、核小体DNA及游离的组蛋白,解释了BAP1/ASXL1复合物定位在染色质的机制。
  U3 snoRNA属于box C/D snoRNA,起引导核糖体RNA 2'-O-methylation的作用。U3 snoRNP由U3、snu13、fibrillarin、nop56/58组成,其中fibrillarin是RNA甲基转移酶。复合物装配起始于snu 13与U3的box B/C、boxC/D,然后依次招募nop56/68和fibrillarin。我们克隆了snu 13、fibrillarin、 nop56、nop58,并表达纯化了snu13和fibrillarin。通过体外转录U3、box B/C和box C/D,用EMSA实验证实了snu13与U3的相互作用。snu13结合在U3的box B/C,亲和力为2.2μM,暗示snu 13还需要结合boxC/D以提高亲和力。此前有研究报道boxB/C自身为环(loop)结构,与snu13结合才能形成扭结(Kink-turn,K-turn)结构。我们利用RNA imino氢特殊的化学位移,发现在溶液状态下U3 box B/C也能形成K-turn结构。结合以前的研究,我们认为snu13通过构象选择机制而不是构象变化来结合U3 box B/C。
  H3K56ac是一个位于核小体核心区的乙酰化修饰,在转录、DNA复制、DNA损伤修复等过程发挥重要作用,而根据报道,CREBBP bromodomain可能是H3K56ac的阅读器,但作用机理不清楚。与徐莉同学合作,我们解析了CREBBP bromodomain与H3K56ac复合物的晶体结构。晶体结构表明,CREBBP bromodomain识别H3K56ac的方式类似于其他bromodomain与乙酰化赖氨酸的相互作用,都是通过一个疏水口袋、水介导的氢键网络和保守的天冬酰胺结合赖氨酸乙酰化侧链。有意思的是,H3αN在核小体上形成α-helix,而在CREBBP bromodomain中为伸展状态。GST pull-down实验发现,CREBBP bromodomain不能结合H3K56乙酰化的重组核小体,但是能识别H3/H4 dimer上的H3K56ac,证明了伸展状态的H3αN的确存在,与之前报道的H3/H4 tetramer上H3αN构象不均一吻合。CREBBP bromodomain能明显促进HAT结构域乙酰化H3K56。根据上述研究结果,我们提出,CREBBP bromodomain从HAT活性中心捕获H3K56乙酰化的H3/H4 dimer,促进HAT进行下一轮H3K56乙酰化,随后H3K56乙酰化的H3/H4在CAF1的帮助下参与核小体组装。
[硕士论文] 蒋蓉
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察自噬水平改变对新生和成年小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)增殖和分化能力的影响,明确激活自噬对成体NSCs功能维持的保护作用,探讨维持干细胞活力的有效途径。
  方法:⑴分离培养新生(Postnatal day0,P0)小鼠室管膜下区(subventricularzone,SVZ) NSCs,应用自噬抑制剂Ly294002干预P0 NSCs,LC3免疫荧光染色观察细胞中自噬小体的变化,并且通过BrdU掺入实验检测抑制自噬对P0 NSCs增殖能力的影响。用分化培养基诱导P0 NSCs分化,western blot检测自噬相关蛋白LC3II和p62在NSCs分化过程中的表达变化。应用Ly294002作用于分化的P0 NSCs,Tuj1免疫荧光染色检测早期神经元标记物的表达变化。⑵分离培养成年(Postnatal days90,P90)小鼠SVZ区 NSCs,应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,采用LC3免疫荧光染色检测自噬水平。随后通过BrdU掺入实验和Tuj1免疫荧光染色分析激活自噬对P90 NSCs增殖和分化能力的影响。⑶成年小鼠腹腔注射自噬激活剂Rapamycin(4mg/kg),隔日一次,共14天,提取SVZ蛋白检测Rapamycin靶蛋白mTOR的磷酸化水平。同时制备脑片通过Ki67和DCX免疫荧光染色观察激活自噬对成年小鼠SVZ区NSCs增殖和分化能力的影响。
  结果:①应用自噬抑制剂Ly294002作用于P0 NSCs3d,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体明显减少,提示Ly294002能够抑制P0 NSCs自噬发生,但免疫荧光染色显示Ly294002组与DMSO组BrdU阳性率无显著差异。P0 NSCs分化后LC3II的蛋白含量较分化前升高1.0±0.4倍(p<0.05),p62的蛋白含量较未分化组降低了0.5±0.1倍(p<0.01),表明自噬参与调控 NSCs的分化过程。应用5μM和10μM Ly294002作用于P0 NSCs,降低细胞自噬水平后,则Ly294002组Tuj1的阳性率分别较对照组显著降低了0.6和0.7倍(p<0.01),提示降低自噬水平,抑制P0 NSCs向神经元方向分化。②应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体增加,提示Rapamycin提高P90 NSCs的自噬水平,并且免疫荧光染色显示Rapamycin组BrdU阳性率分别为25.4%±6.0%和26.2%±6.7%较对照组12.0%±0.8%明显升高(p<0.05),表明激活自噬可以促进P90 NSCs增殖。应用20nM和50nM Rapamycin作用于P90 NSCs,NSCs诱导分化3d后,则Rapamycin组Tuj1的阳性率分别较对照组升高了1.5倍和1.3倍,(p<0.01),提示提高自噬水平,促进P90 NSCs向神经元方向分化。③成年小鼠腹腔注射Rapamycin,Rapamycin组mTOR的磷酸化水平较对照组降低了34.0%±8.6%(p<0.01),表明腹腔注射Rapamycin后能够抑制mTOR激活自噬,免疫荧光染色显示,Rapamycin组Ki67阳性细胞数为98.9±8.1较DMSO组61.15±8.56明显升高(p<0.05),早期神经元标记物DCX阳性数是对照组的1.5倍(p<0.01),表明提高成年小鼠脑内SVZ区的自噬水平,可以提高NSCs增殖和分化潜能。
  结论:自噬参与小鼠NSCs功能维持,改变自噬水平能够影响NSCs的增殖和分化。应用自噬激活剂能够有效提高成年小鼠NSCs的活力,促进神经发生。
[硕士论文] 刘晓艺
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:脆性X染色体综合征(Fraigile X syndrom,FXS)是一种常见的智力发育障碍的遗传性疾病,该疾病是由X染色体FMR1基因5’非翻译区的CGG三核苷酸重复序列异常扩增(重复数大于200,在所有个体中处于30-200以上)所致,CGG重复序列的异常扩增会导致该区域以及其上游启动子区的CpG岛的胞嘧啶甲基化程度显著升高,改变了染色质的构象,导致该基因转录失活,无法翻译出该基因的表达产物FMRP(fragile X mental retardation protein)。FMRP的缺失,导致了FXS临床症状的出现。然而,某些特征如FXS患者FMR1位点高度的甲基化在动物疾病模型体内却无法模拟,因此,建立一种人类来源的疾病模型以研究该病的致病机制就显得尤为重要。
  目前建立疾病模型的方法大多是通过条件性基因敲除(如Cre/LoxP系统)或基因编辑技术(ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统),至今还没有利用表观遗传基因修饰技术建立疾病模型的报道。我们将Casilio(Cas9+Pumilio)系统与DNA甲基转移酶DNMT3A以及DNMT3L相结合,探索能否在人类胚胎干细胞(hESC)中实现FMR1基因启动子区的定点表观遗传修饰从而提高该区域DNA甲基化状态并降低FMR1表达以获得FXS的疾病模型。
  本研究大部分的工作为在293T细胞中进行的前期探索,通过构建表达Casilio和甲基化酶融合蛋白的相关质粒在293T细胞中进行一系列转染实验,收样后进行RT-PCR和甲基化检测,探究实验室现有的甲基化酶相关质粒能否工作以及确定可以发挥作用的guide RNA(gRNA),并且构建相关慢病毒质粒侵染人类胚胎干细胞流式分选和药筛相结合获得可以条件性地稳定表达Casilio和甲基化酶DNMT3A、DNMT3L融合蛋白的细胞系。
  目前我们确定了表达Casilio-DNMT3A-DNMT3L融合蛋白的质粒可以在293T细胞中发挥作用;筛选到了在FMR1基因启动子区可以工作的4条gRNA;筛选了慢病毒侵染的人类胚胎干细胞用于后续的研究工作。
[硕士论文] 欧阳杉
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究用含20%PEG6000的MS液体培养基模拟生理脱冰胁迫处理扁蓿豆幼苗,以上述胁迫处理6h的扁蓿豆幼苗叶片总RNA为模板进行反转录,运用RACE技术和RT-PCR方法,克隆得到扁蓿豆抗逆相关RNA剪切因子MrSKIP基因cDNA全长。序列分析结果显示,MrSKIP基因cDNA全长为2280bp,含有一个1833bp的完整开放阅读框,序列推测编码610个氨基酸含一条S-N-W-K-N的多肽,分子量为68.86145 KDa,等电点为8.95,生物信息学分析表明MrSKIP含有该家族的典型结构域SNW SKIP。进一步克隆得到了扁蓿豆基因组的MrSKIP基因,序列分析表明,该基因无内含子。
  利用tasiRNA技术和发根农杆菌转化法,在截形苜蓿108R根部干扰MrSKIP同源基因的表达,对转化外源基因的截型苜蓿根系进行干旱、高盐和低温胁迫处理,鉴定MrSKIP基因的功能,结果显示胁迫处理下干扰MrSKIP同源基因的的转基因根系样品,其根长和根鲜重均显著小于对照。研究结果初步表明MrSKIP基因表达量的降低影响植物对干旱、低温和高盐胁迫的耐受性,特别对干旱胁迫耐受性的降低尤为显著。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 董志梅
动物学 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰氏阳性、食源性胞内寄生菌,可穿过宿主胃肠道屏障、血脑屏障、胎盘屏障引起脑膜炎和流产等,致死率高达30%。单增李斯特菌发挥其致病机制需要一系列毒力因子的参与,从而破坏宿主的免疫防线和应激修复系统。硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一类广泛存在于细菌中的氧化还原蛋白,与细菌的抗氧化应激相关,且能够通过二硫键修饰参与蛋白质的折叠从而维持蛋白质功能。生物信息学分析显示单增李斯特菌可能编码含有一个硫氧还蛋白(TrxA,由lmo1233基因编码)。那么,李斯特菌作为重要的胞内寄生菌是否也利用TrxA抵抗体内外环境中的氧化应激并维持其氧化还原稳态?是否参与了重要功能蛋白的折叠修饰?因此,本研究重点探索了单增李斯特菌在适应体外环境及感染宿主过程中利用TrxA介导细菌抗氧化应激的生存机制;揭示了TrxA通过对重要毒力因子的氧化折叠修饰并协助细菌发挥致病力的分子机理;阐明了TrxA与细菌关键鞭毛调控蛋白MogR和GmaR的互作关系并介导细菌鞭毛形成的内在机制。
  本论文研究发现:(I)单增李斯特菌TrxA在巯基特异性氧化剂肼(diamide)的诱导下其蛋白表达水平极显著上调(P<0.001),缺失trxA后细菌在该氧化环境下的生长和存活能力极显著削弱(P<0.001),说明TrxA对于李斯特菌的抗氧化应激至关重要;(II)体外原核表达并纯化TrxA后发现该酶具有经典的硫氧还蛋白酶活性,可以高效且特异地将氧化态胰岛素(insulin)还原。在生物信息学分析基础上,通过氨基酸点突变技术将TrxA的两个可能关键氨基酸Cys28和Cys31分别突变成Ala后该酶活性均完全丧失,该结果首次证实李斯特菌TrxA亦属于经典的硫氧还蛋白酶家族,其中Cys28和Cys31为其关键氨基酸位点,决定了该酶的活性和功能;(III)细胞感染试验发现,缺失trxA后细菌在人肠道上皮细胞Caco-2上的黏附、侵袭及存活能力均显著削弱(P<0.01),值得关注的是,利用共聚焦荧光显微技术发现缺失株在感染Caco-2过程中招募宿主肌动蛋白Actin的能力明显受限,从而导致细菌无法在其两端形成粗壮的“彗星状尾巴”,造成其在细胞间的迁移能力显著降低(P<0.01),证明硫氧还蛋白TrxA对于李斯特菌在胞内感染和生存发挥了关键的作用。体内感染小鼠发现,trxA缺失或过表达均导致细菌在肝脏和脾脏中的复制及增殖水平显著降低(P<0.01),进一步研究表明TrxA在体内的表达水平受转录因子SigH严谨调控,证实TrxA介导的氧化还原平衡对于细菌发挥致病力尤为关键;(IV)利用全基因组转录谱测序发现,缺失trxA后共有270个基因的转录水平发生了显著变化(差异2倍以上),其中李斯特菌重要毒力基因plcA,mpl,actA,hly和plcB的转录水平下降尤为显著(P<0.01)。利用RT-PCR和Western blot验证进一步证实TrxA确实参与了对该些毒力因子的转录和表达调控。利用等温滴定量热(ITC)试验研究发现,TrxA与李斯特菌毒力中枢调控蛋白 PrfA(单体含有4个半胱氨酸)在体外能够发生明显的放热式互作(K=4.00E±1.13E4M-1),推测TrxA参与了PrfA单体分子内二硫键的形成,进而折叠成具有正确结构的二聚体并发挥正常功能,该结果证实 TrxA通过对 PrfA的氧化还原修饰进而调控下游毒力因子的表达,从而最终介导李斯特菌的致病力。(V)体外运动试验发现,李斯特菌缺失 trxA后导致其运动性完全消失,通过电镜观察证实缺失株无法形成鞭毛。ITC试验发现,TrxA在体外能够与鞭毛形成重要蛋白MogR(单体含有2个半胱氨酸)发生吸热式互作(K=1.28E±1.56E4M-1),表明TrxA可能也参与了单增李斯特菌鞭毛形成的相关蛋白修饰及功能维持。
  因此,本项目首次运用生物信息学、分子生物学、蛋白质组学、感染生物学和细胞生物学等手段,探索了单增李斯特菌硫氧还蛋白TrxA在细菌体内外环境中的抗氧化应激机制,以及在感染宿主过程中通过对重要毒力因子的氧化还原修饰而参与细菌致病过程的分子机理,首次揭示了该蛋白通过对鞭毛调控蛋白 MogR的修饰并介导细菌鞭毛形成及运动的分子机制。本研究对于揭示单增李斯特菌在体外氧化应激环境、宿主体内的抗氧化生存、二硫键稳态维持及氧化还原修饰机理以及维护人和动物健康具有重要意义。
[硕士论文] 胡双双
生物医学工程 安徽理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究江苏十个地区小家鼠的基因多样性和遗传进化关系,为国境口岸鼠形动物遗传进化规律和溯源的研究提供了确凿的技术支持,并为物种种内基因差异比较分析提供了重要的实验数据。通过生物信息学分析探索小家鼠种内差异与地理位置之间关系。
  方法:基于对江苏十个地区线粒体控制区基因和线粒体全基因组的研究,通过基因的扩增、测序和比对,研究小家鼠线粒体组成,结合GenBank的小家鼠线粒体基因组信息,对小家鼠进行遗传多态性分析和系统发育树研究。
  结果:获得小家鼠的线粒体控制区序列和线粒体全基因组序列,小家鼠线粒体基因组全长16,302 bp,由13种蛋白质编码基因、2种rRNA基因、22种tRNA基因、1个轻链复制起始区和1个控制区组成。经生物信息学分析发现小家鼠线粒体基因多态性丰富,其遗传进化规律域地理位置有一定的联系,不同地区小家鼠之间的分化程度大于同一地区小家鼠之间的分化程度。
  结论:小家鼠的种内差异程度与个体所处地理位置有很大的联系,我国的小家鼠大致可以长江为界限进行划分。江苏地区的小家鼠也显现出这种规律但并不明显。
[硕士论文] 张攀松
微生物应用工程 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:核酸是遗传变异的物质基础,是遗传信息的载体,在蛋白质生物合成中起十分重要的作用。生物体的遗传、变异、生长发育、细胞分化等都与核酸密切相关。核酸包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。其中 RNA在合成蛋白质的过程中起着非常重要的作用。同时,在生物分析、疾病诊断和食品安全中,RNA常作为分析标志物。因此,建立一种简单、易于操作和灵敏快速的 RNA检测方法是生化领域中的主要目标,这也是本论文的主要研究内容。本论文基于恒温核酸扩增的检测方法,构建了一种设计简单的,快速的检测 RNA的新方法。
  在第二章中,本论文建立了变性泡介导的链交换扩增方法(Bubble-mediated strand exchange amplification,SEA)对 RNA进行检测。该方法类似于 PCR,它仅仅利用一对引物和一种 DNA聚合酶去实现变性,退火,延伸这3个循环步骤。SEA方法利用链呼吸作用来打开双链,而不是通过热变性。双链 DNA依靠呼吸作用产生 DNA变性泡。在 DNA变性泡中的单链区域设计引物进行等温扩增,放大信号。同时,利用本课题组对 Bst一系列聚合酶具有反转录活性的这一新发现,在 SEA反应体系中加入 Bst2.0 WarmstartTM可以实现 RNA的一步法检测。利用此方法对大肠杆菌16sRNA进行了检测,检测限可以达到100 amol,实时荧光检测结果表明该方法对 RNA检测是可行的。通过加入10%的牛血清使反应体系复杂化,实验结果显示,该方法在较为复杂的体系中可以进行反应,验证了该方法具有较强的抗干扰能力。由此表明,SEA是一种简单,可以一步法检测 RNA的方法。在临床应用和现场快速检测方面具有重要意义。
  由于,SEA中双链的解开是依靠 DNA双链自身的变性泡结构。因此,反应所需要的时间较长。为了减少反应所需要的时间,加快反应速率。在第三章中对SEA方法不断进行改进。通过在 SEA反应中加入了一条带有限制性核酸内切酶位点的引物链来加快反应速率。将 SEA方法和指数等温扩增方法连用,利用限制性核酸内切酶将反应产生的双链切成较短的两个片段。在反应温度下,较短的双链自发打开的效率更快。但是,由于在体系中需要较高浓度的带有内切酶的引物链,从而产生了较高的非特异性导致实验失败。因此在本论文的第三章中对产生非特异性的原因进行了探讨。
  综上所述,本论文建立了一种简单的 RNA检测新方法,实现了一步法检测RNA。
[硕士论文] 陈铭
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。
  嗜热子囊菌( Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40~50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases, PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。
  本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列, PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。
  将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。
[硕士论文] 张永利
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌因其多种优越的性能而被研究者关注。本研究首先从奶制品中分离乳酸菌,并根据乳酸菌的菌落形态特征、过氧化氢酶接触试验以及革兰氏染色试验对乳酸菌进行初步鉴定。再利用16S rDNA序列分析、生理生化特性以及碳水化合物发酵试验进行进一步鉴定。然后通过人工胃液耐受力、胆盐耐受力以及粘附能力试验进行益生性乳酸菌的初步筛选。最后用筛选的6株乳酸杆菌灌胃小鼠,LPS/D-GalN诱导小鼠急性肝损伤,通过观察小鼠的体重、肝脏的病理变化及重量,检测小鼠外周血以及肝脏中AST与ALT的分泌量,肝脏与小肠中TNF-α与IL-6的表达量,研究这6株乳酸杆菌对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护效果。
  本研究主要内容包括:⑴从奶制品中共分离出107株乳酸菌,属于17个种。其中乳酸杆菌71株属于9个种,乳酸球菌36株属于8个种:Lactobacillus brevis、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillu helveticus、Lactobacillusplantarum subsp.argentoratensis、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillusdiolivorans、Pediococcus pentosaceus、 Enterococcus faecalis、Leuconostocmesenteroides、Pediococcus acidilactici、Pediococcus.sp、Enterococcus.sp、Lactococcus.sp、Leuconostoc.sp。这17种乳酸菌中有88.3%为同型发酵乳酸菌,11.7%为异型发酵乳酸菌,部分菌株可以在低pH、高盐、低温、高温的条件下生长。⑵对139株乳酸菌进行耐人工胃液(pH=3.0)、耐胆盐以及粘附Caco-2细胞的试验,共筛选出6株具有较强耐受和粘附能力的的乳酸杆菌,它们分别是: L.paracasei subsp.paracasei WXD5、L.casei SXJ30、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD55、 L.plantarum subsp.argentoratenis WXD100、 L.subsp.argentoratenis WXD106、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD101。⑶研究WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30这6株乳酸菌对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤保护作用。⑷结果显示,与模型组相比,灌胃乳酸菌WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30的小鼠肝脏病变程度得到不同程度的缓解,AST、ALT、IL-6以及TNF-α因子的表达量也显著下降,且以灌胃乳酸菌WXD5保护效果最为明显,可以为急性肝损伤的研究提供技术支持与理论依据。
[硕士论文] 乔晓亚
化学工程与技术 湘潭大学 2017(学位年度)
摘要:Pin1是一个含有163个氨基酸的肽基脯氨酰同分异构酶,它由一个N端的WW结构域和一个C端的PPIase结构域组成。Pin1的WW结构域特异性识别含pSer/Thr-Pro基序的蛋白质,而它的PPIase结构域则催化相应肽键的顺反异构化。Pin1通过对磷酸化蛋白的结合与催化异构化调控一系列细胞过程,如细胞周期和细胞成长等。Pin1能够与链状的pSmad2/3、pTau结合,从而影响神经组织中酶的形成,对于治疗神经性疾病有很重要的意义。如在老年痴呆症缠结的神经元纤维中,Pin1蛋白通过调节激酶、磷酸化酶的活性进一步调控与微管相关的Tau蛋白。Pin1蛋白能够识别并结合Smad3中的PEpTPPP结构,进而通过诱导泛素蛋白酶的降解来抑制 TGF-β信号传递。在乳腺癌组织中,Pin1与蛋白激酶JNK的协同作用增强了磷酸化c-Jun调控cyclin D1启动子的转录活性,导致癌症基因cyclin D1的过表达。
  本论文主要采用配备了超低温探头的700 MHz高场液体核磁共振谱仪来研究Pin1 WW WT(野生株型)及单点突变体Pin1 WW S16R(G20D)的结构、稳定性及与人类疾病密切相关的几个磷酸化蛋白如pTau和pSmad3的相互作用。首先通过二维的1H-15N异核单量子相关谱(HSQC)和三维的 HNCO、HN(CO)CA、HNCA、HNCACB及 CBCA(CO)NH谱确定骨架和支链的信号,然后通过5-25℃的核磁变温实验获得 Pin1 WW单点突变结构域氢键的变化信息,根据核磁共振滴定实验获得Pin1 WW结构域与磷酸化多肽的相互作用位点信息。
  首先根据自然演变挑选出带不同电荷的Pin1 WW结构域S16R和G20D突变体,采用核磁的方法与野生株型的Pin1 WW结构域比较,研究它们的结构、稳定性及与磷酸化Tau的相互作用。采用牛血清蛋白(BSA)来模拟细胞环境,研究类细胞环境对于Pin1 WW结构域蛋白质结构、稳定性及与pSmad3相互作用的影响,首次反映了类细胞环境下原子分辨率水平的其它大分子蛋白对 Pin1与磷酸化底物结合的影响。虽然BSA只是单一的大分子,不能模拟细胞内复杂的拥挤环境,但是可以初步的获得类细胞环境下的相关信息,为将来采用细胞裂解液或者真实细胞的相关实验提供参照。通过比较c-Jun中两个磷酸化位点与全长Pin1蛋白质的作用提出合理的多位点磷酸化c-Jun与Pin1的动态结合模型,阐明了Pin1特异性结合多位点磷酸化c-Jun的结构基础,为后期进一步细致研究Pin1蛋白质在乳腺癌等疾病中的作用机理打下基础。
[硕士论文] 袁亚洲
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:基因识别是对DNA序列进行分析,获取其中重要信息的第一步。目前测序技术的发展使得测序数据呈爆发式增涨,然而实验方法无法快速有效的从海量信息中获取知识,基于此运用计算机技术来识别基因的方法应运而生。在2015年,我们课题组研发了原核生物基因识别程序ZCURVE3.0,该算法是基于Z曲线理论,采用新的机器学习算法SVM,增加新的特征变量,并且对内部参数进行进一步的优化,使得该识别算法更加快速准确高效。在预测出基因后,还需要知道其相应编码的蛋白质,于是我们基于ZCURVE3.0算法,对其进行进一步的升级,添加相关的功能,使得其成为完善的可视化集成系统。
  在本基因识别可视化系统中,第一部分是对ZCUREV3.0的功能进行可视化(BAGA)实现,其保留了相应识别算法的所有功能。在通过对50个原核生物的全基因组进行测试,选取比对阈值,排除伪基因,同时使得删除的正确基因数尽可能少,那样基本保持正确的基因数不变。在与GenBank提供的总的基因数相比,BAGA的预测基因识别率为97.60%,预测结果的特异度为96.74%,与ZCURVE3.0的特异度94.21%相比有2%的提升。BAGA附加预测率为3.34%,比ZCURVE3.0(6.08%)下降接近3%。附加预测率的降低,表明其预测错误的基因数目相比ZCURVE3.0有更进一步的减少。第二部分是对于ZCURVE3.0和Prodigal两个基因预测软件联合方法(BAGA2.0)的实现,通过保留两者预测相同的基因,对不同的基因进行序列比对,调节合适的参数,保留比对得分较高的基因,将这两部分的基因作为最终联合预测的基因。BAGA2.0对应的识别率为98.73%,特异度为96.09%。这两者性能,都比ZCURVE3.0效果要好。另一方面,BAGA2.0的附加预测率为4.08%比ZCURVE3.0(6.08%)要低。综合来看,联合两者来识别细菌的基因性能要更优。此外,虽然BAGA2.0的特异度比BAGA要低,其附加预测率要大,但是其识别率和准确度却更佳。
  在本文中采用BLAST序列比对实现了对于预测的基因进行功能注释,对于系统中实现的两部分的预测结果都能够实现注释,而且能够选择快速注释和完全注释两者不同方式。同时,集成基因组岛预测程序。我们将此完善的集成软件编译成各种不同系统的版本,使用者能够访问http://cefg.cn/zcurve-visualization/下载,并免费使用。
[硕士论文] 赵柯郁
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳脂是牛奶中重要的营养成分之一,乳脂含量是衡量牛奶质量的重要指标。乳脂合成受到多种信号通路的调节,其中雷帕霉素靶蛋白(the mechanistictarget of rapamycin,mTOR)信号通路对乳脂合成发挥着重要的调控作用。mTOR是一种丝/苏氨酸激酶,属于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作为核心组分与其他不同蛋白形成两种复合物,mTOR complex1(mTORC1)和mTOR complex2(mTORC2)。mTORC1和mTORC2在胞内发挥不同的作用,mTORC1主要在调控细胞的增殖、代谢及蛋白合成等方面发挥作用;mTORC2则参与调控细胞骨架、细胞迁移及代谢等过程。目前,关于mTORC1在乳脂合成调控方面的研究报道比较多,而mTORC2尚显不足,二者在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂合成的调控作用对比也鲜有报道。本实验利用实验室分离并纯化得到的奶牛乳腺上皮细胞作为研究模型,首先应用ATP竞争性mTOR抑制剂AZD8055处理细胞,同时抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特异性抑制剂rapamycin处理细胞,抑制mTORC1信号通路活性,并利用RNA干扰技术靶向沉默mTORC1核心组分raptor基因来抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心组分rictor基因来抑制mTORC2活性。利用Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用质谱检测rapamycin处理组,rictor基因沉默组胞内各类脂肪酸的含量;最后,对比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情况下和mTORC1、mTORC2分别被抑制情况下TG、PA、DHA含量变化,对比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。
  本研究主要内容包括:⑴用AZD8055处理细胞后,MTT法检测显示100 nMAZD8055处理12h,100nMAZD8055处理24h,200nMAZD8055处理12h和200nMAZD8055处理24 h时均可抑制细胞增殖,其中200nM处理24h组效果最显著(p<0.05); Western blot结果显示,用AZD8055处理细胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p<0.05); ELISA结果显示对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和258.75±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055处理24 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml和188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055处理12 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为14.74±2.61 mmol/L、19.54±1.53 ng/ml和183.82±26.94 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑵利用rapamycin处理抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为5.42±0.08 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和403.3±11.17 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin处理8h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和297.82±20.8 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量2844.23±282.92 mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑶靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml和527.99±32.67 pg/ml,Raptor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46ng/ml和331.84±48.02 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑷靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14 ng/ml和109.47±7.46 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07mg/kg; Rictor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为2.49±0.24mmol/L、6.93±0.14 ng/ml和55.74±6.01 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3028.66±120.05mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑸三种方法对比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根据TG、PA和DHA抑制率分析,对TG、PA和DHA合成的作用mTORC2> mTORC1;另一方面综合考虑通路活性以及TG、PA和DHA抑制率,对TG和DHA作用 mTORC2>mTORC1,对PA作用 mTORC1>mTORC2。
[硕士论文] 张祥
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能。在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。胚胎合子基因组激活(zygotic geneactivation,ZGA)是早期胚胎正常发育的关键,研究认为ZGA的延迟或失败与早期胚胎发育阻滞有关。为探究ROS对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响,本研究比较了不同品种小鼠在不同培养液中发生阻滞的情况,检测了ZGA相关基因、胞质ROS浓度及ROS相关基因的表达;同时利用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵建立ROS引起阻滞的细胞模型,对线粒体机能相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态、mtDNA的拷贝数进行了检测;另外,检测了线粒体相关基因Grm2、Drd2、Polg2、TFAM的表达变化及其调节区的DNA甲基化的调节。
  本研究主要内容包括:⑴利用实时荧光定量PCR的方法检测了小鼠2-细胞胚胎中ZGA相关基因(Zscan4、MuERV-L、Eif-1a、Hsp70.1)及ROS相关基因(Nox1、Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达,并利用ROS特异性染料DCFH-DA对胚胎胞质内ROS水平进行检测。首先比较了阻滞品系小鼠KM与非阻滞品系小鼠BDF1受精卵在M16培养液中发生阻滞的情况,结果表明,在M16培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞发育率为44.2%,而BDF1小鼠受精卵的发育率为90.3%,KM小鼠2-细胞胚中ZGA相关基因MuER V-L、Eif-1a的表达量显著低于BDF1小鼠2-细胞胚(P<0.05)。KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平明显低于BDF1胚胎,ROS相关基因Gpx6和Prdx2的表达显著高于BDF1小鼠。以上研究表明,小鼠胚胎发育阻滞与ZGA相关基因表达有关,ROS水平的差异反映出不同品系小鼠胚胎对ROS的耐受性不同。⑵利用M16培养液和KSOM培养液比较了阻滞品系KM小鼠胚胎在不同培养液条件下的发育。结果显示,在KSOM培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞率为90.8%,不发生2-细胞阻滞。KSOM培养液中培养的KM小鼠2-细胞胚胎Eif-1a、Hsp70.1表达量显著高于M16培养液中培养的2-细胞胚胎。两种培养液中的KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平和ROS相关基因表达无明显差异。以上研究表明,小鼠胚胎体外培养液成分的不同影响ZGA相关基因表达的变化,对小鼠胚胎发育阻滞产生影响。⑶探究了ROS在小鼠体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响。使用AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理组和对照组中线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用实时荧光定量PCR检测ROS相关基因、线粒体相关基因(Grm2、Drd2、Polg2、TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数,利用重亚硫酸盐测序(BSP)检测了线粒体四个相关基因的甲基化变化。研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高。1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,实时荧光定量PCR结果显示,处理组与对照组的Grm2、Drd2、Polg2、TFAM基因表达量呈现显著性差异,处理组Grm2、Drd2表达显著低于对照组,处理组Polg2、TFAM表达显著高于对照组。利用亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing,BSP)方法检测DNA甲基化的结果,AAPH处理之后的胚胎中基因调节区DNA甲基化水平升高;Polg2、TFAM甲基化水平降低。以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体相关基因表达变化,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡,ROS可能通过影响线粒体相关基因启动子区DNA甲基化的变化调控线粒体相关基因的时序性表达。
[硕士论文] 付宇婷
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起哺乳动物感染的关键病原菌之一,易侵入乳腺组织诱发乳腺炎。乳腺炎对人畜造成的负面影响极大,影响乳品的质与量。乳蛋白是乳品重要的组成成分,乳腺上皮细胞中氨基酸的种类、含量直接影响其合成,氨基酸代谢是影响乳蛋白合成的重要因素。细菌侵袭乳腺上皮细胞会影响乳蛋白的合成与分泌,但对于氨基酸代谢的影响与机制目前还不清楚。
  本研究以人乳腺上皮细胞MCF-10A为模型,利用金黄色葡萄球菌(ATCC27543)侵袭细胞,检测宿主细胞六种氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白的表达情况。六种酶包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和谷氨酸脱羧酶(GAD),分别涉及转氨、脱氨、联合脱氨和脱羧等过程。首先,利用金黄色葡萄球菌侵袭细胞,qPCR检测细胞中氨基酸代谢关键酶基因及β-酪蛋白基因的表达,ELISA检测细胞内外相关基因产物的合成与分泌,westernblot检测mTORC1信号通路活性;其次,用肽聚糖刺激人乳腺上皮细胞,同样用qPCR和ELISA方法检测氨基酸代谢关键酶基因及其产物的表达与分泌,western blot检测mTORC1通路及几种转录因子活性;最后,在前两部分实验的基础上探究mTORC1信号通路对相关转录因子活性和氨基酸代谢关键酶表达的调控作用。通过特异性抑制剂Rapamycin及RNA干扰技术降低mTORC1活性,检测金黄色葡萄球菌侵袭与非侵袭条件下氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白基因及其产物的表达变化,并检测几种可能同氨基酸代谢相关的转录因子的活性变化。结果表明:⑴金黄色葡萄球菌能侵入体外培养的人乳腺上皮细胞内,随着侵袭过程的进行,细胞内氨基酸代谢关键酶含量呈先上升而后下降的趋势,细菌侵袭8h后,β-酪蛋白的合成量与分泌量显著下降(p<0.001)。同时,细菌侵袭过程中mTOR信号通路的活性也呈现先上升而后下降的趋势;⑵肽聚糖刺激MCF-10A细胞,诱导细胞内氨基酸代谢关键酶表达,含量显著上升(p<0.001),而对β-酪蛋白的合成与分泌没有显著影响(p>0.05)。同时mTOR信号通路和几种转录因子的活性增强;⑶Rapamycin能够显著抑制上述细菌侵袭和肽聚糖刺激对氨基酸代谢关键酶基因的诱导表达(p<0.01),导致氨基酸代谢关键酶在细胞内的含量显著下降(p<0.01),β-酪蛋白的合成与分泌也受到抑制(p<0.01),mTORC1信号通路和相关转录因子的活性均有不同程度的下降;⑷通过靶向siRNA沉默mTORC1关键组分Raptor编码基因,进而抑制mTORC1信号通路,所得结果与上述Rapamycin处理结果一致,印证了mTORC1信号通路对氨基酸代谢关键酶和β-酪蛋白的合成与分泌具有调控作用。
[硕士论文] 周文娟
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白酶体在细胞内代谢调控扮演着重要作用,诸多报道显示蛋白酶体功能异常和人类衰老等相关疾病的发生有关。虽然蛋白酶体结构与功能已被深入研究,但是由于人们对蛋白酶体的代谢调控的了解很少,对于蛋白酶体在疾病代谢调控的通路中的具体作用机制并不是很完整清晰的了解。糖原合成激酶是糖原代谢过程中的限速酶,在调控血糖方面起着重要作用,大量研究表明,在老年痴呆症发病初期,糖原合成激酶表达显著提高。而蛋白酶体活性和糖代谢有着密切关系,因此我们将研究糖原合成激酶在蛋白酶体代谢调控中扮演的作用。
  本文从细胞内和体外的实验验证糖原合成激酶对蛋白酶体活性起抑制作用,并寻找可以在体外逆转糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性的磷酸化蛋白。发掘更多蛋白酶体活性调控代谢因子,为蛋白酶体活性调控在老年痴呆、糖尿病及其他血管病的发生机理代谢机制提供新的视角和见解。从细胞内和体外的实验证明糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性,但是糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性并不直接作用于26S蛋白酶体。PP1A在体外可以提高核提取物和26S蛋白酶体的肽酶活性,并且可以逆转糖原合成激酶抑制核提取物蛋白酶体活性,证明PP1A是可以逆转糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性的磷酸化蛋白。因此得出结论糖原合成激酶抑制蛋白酶体的活性。
[硕士论文] 董平
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:中度嗜盐菌(Halophilic bacteria)泛指能够在3%-15%的NaCl存在时表现出最适生长的微生物类群。中度嗜盐菌与一般的非嗜盐性细菌相比较,具有特殊的代谢途径、生理生化结构、以及独特的遗传学特性。喜盐芽孢杆菌(Halobacillus sp.)NEAU-ST10-40是本实验室从安达市分离得到的一株中度嗜盐菌,并已经鉴定该菌株代表喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的一个新种,并将其命名为安达喜盐芽孢杆菌(Halobacillus andaensis)模式菌株NEAU-ST10-40T。
  本研究采用大肠杆菌(Escherichia coli)缺陷株KNabc(△nhaA,△nhaB,△chaA)基因功能互补法和基因文库筛选法,从NEAU-ST10-40T中克隆得到1个能够使大肠杆菌(E.co li)KNabc在0.3MNaCl的LBK培养基上生长的重组子。此重组子在M13F方向的序列分析显示,该重组子包含的外源基因片段长4442 bp,该片段含有4个开放阅读框(ORF1-4)以及各自的SD序列和推测的启动子序列。其中有3个完整的开放阅读框(ORF2-4),ORF3和ORF4共用一个终止子序列。不完整的ORF1有推测的启动子序列但无终止子序列。其中,被截短的ORF1(M13R,2-788 bp)长789 bp,ORF1与Halobacillus trueperi中的一个推测的甘氨酸甜菜碱转运蛋白(putative glycine betaine transporter,BCCT superfamily)同源性最高(82%),其基因被命名为甜菜碱转运体,但该序列不完整。ORF2(1985-2351 bp)长369 bp,ORF2与芽孢杆菌(Bacillaceae)中的一个推测的假定蛋白(hypothetical protein,YugN superfamily)同源性最高(73%),其基因被命名为yugN。ORF3(2457-3513 bp)长1059 bp,ORF3与Halobacillus kuroshimensis中一个推测的未知功能的UPF0118 family protein,UPF0118superfamily)同源性最高(81.5%),其基因被命名为upf0118。ORF4(3551-4096 bp,M13R)长548 bp。ORF4与Halobacillussp.BBL2006中一个推测的GNAT家族乙酰转移酶(GNATfamily acetyltransferase,NAT_SF superfamily)同源性最高(63%),其基因被命名为GNAT家族乙酰转移酶。通过基因亚克隆,发现upf0118基因能够与大肠杆菌(E.coli) KNabc发生互补,使其在0.3 M NaCl、30 mM LiCl以及碱性pH8.0条件下生长并与重组子几乎一致。同时,利用软件对UPF0118的氨基酸残基组成和拓扑学分析显示,此蛋白由352个氨基酸残基组成,具有6个跨膜区,其中有225个残基是疏水性氨基酸,从而说明UPF0118是低极性的。用DNAMAN6.0预测其分子量为39,611.01Dalton,等电点pI为9.76。这初步判断UPF0118蛋白可能具有Na+/H+逆向转运蛋白活性且为一个膜蛋白。构建系统发育树表明,UPF0118与其家族中的同源物单独成簇,而与所有已知的单基因Na+/H+逆向转运蛋白和具有Na+/H+逆向转运蛋白功能的单基因蛋白距离较远。蛋白同源性比对显示,UPF0118与来自于H.kuroshimensis中同源物的相似性最高为81.5%,其次为来自Halkaliphilus(accession.version No.SFF94744.1),H.halophilus(accession.version No.WP_014643083.1),H.dabanensis(accession.version No.WP_075036522.1),H.karajensis(accession.version No.SEH70700.1),Virgibacillus sp.SK-1(accession.version No.WP_053219791.1),Sediminibacillus albus(accession.version No.SDJ74814.1),Thalassobacillus cyri(accession.version No.SEB17075.1),Pontibacillus chungwhensis(accession.versionNo.WP_036781630.1)and P.marinus(accession.version No.WP_027448163.1)的同源物,相似性分别为79.3%,78.7%,78.7%,77.8%,69.0%,67.3%,65.1%,63.1%和58.4%。在以上的同源物的序列比对时,我们发现了五个高度保守的花边序列(motif),分别为“LVYLIALFLFMLE”,“GFLKAQFLVS”,“PIIGSI”,“LLAIRRTVEPKVMGRHIGLSPLATLIAM”和“IAFNSAKEAGII”。
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