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[硕士论文] 吴燃峰
计算机科学与技术;计算机应用技术 华北电力大学;华北电力大学(北京) 2018(学位年度)
摘要:随着科学技术的飞速发展,传统计算逐渐无法满足科学计算所需解决日益复杂的科学问题。因此,有望打破摩尔定律,并且突破传统基于“硅技术”计算包括量子计算、光子计算、纳米计算以及生物计算等在内的全新的革命性非传统计算应运而生,成为各国政府关注和资助的重点。
  本论文结合前沿热点领域中的DNA自组装技术,荧光探针技术,链置换技术,围绕DNA计算和荧光分子检测等多个交叉领域,同时利用高性能计算机,以及NUPACK等设计软件,对纳米计算中基于DNA核酶调控的分子计算模型展开多角度研究。
  一、基于纳米金颗粒自组装的分子计算逻辑门。在此分子计算模型中,成功设计并实现一种可编程的策略,能通过多个DNA输入信号链来控制纳米金颗粒与特定DNA结构的结合。其中输入操作通过加入对应DNA链来进行,输出信号通过琼脂糖电泳来检测确认。该策略利用链置换原理和近距离效应,通过不同DNA链的调控以及级联的特性实现了各种逻辑门功能(是门,两层级联是门,或门)。此外,为了进一步探究级联电路,建立了一种更复杂的催化偶联系统(与门)。
  二、DNA核酶调控的分子计算模型的研究。在此,设计并实现了一个由DNA核酶调控的分子逻辑计算系统。在该计算系统中,结合了两种机制:DNA核酶催化和熵驱动的链置换。在我们的设计中,DNA核酶扮演了一个输入信号和一个输出报告的多重角色。首先,DNA核酶将初始的基板激活到活性DNA基质状态。随后,DNA催化剂促进了熵驱动机制,从而触发了链置换,从而产生了一种新的DNA核酶产物。在熵驱动链置换机制的帮助下,输入DNA催化剂能够重新生成,从而触发生成另一个输出DNA核酶产物,这个生成DNA核酶产物可以作为驱动下一目标反应的输入驱动,从而实现DNA核酶调控的级联催化电路。同时也成功构建了一系列的逻辑门(是门,或门门和与门等)。此外,还建立了两层级联电路和反馈自催化逻辑电路。结果经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和实时荧光检测得到证实。
[硕士论文] 戴丹
计算机技术 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,长非编码RNA(lncRNA)因其潜在的生物学功能而备受关注。借助高通量转录组测序技术(RNA-Seq),研究者已经在包括人、小鼠等哺乳动物在内的多种生物中发现了数以十万计的lncRNA。研究表明,lncRNA普遍具有低序列保守性和低表达水平的特点,因此难以直接建立序列与功能之间的联系。鉴于功能性非编码RNA(ncRNA)在二级结构层面具有保守性,由此推断功能相近的lncRNA的二级结构也同样具有一定程度的保守性。本文主要借助生物信息学方法,围绕lncRNA二级结构预测问题展开研究和开发。主要工作如下:
  (1)研究了主流的RNA二级结构预测方法(主要包括比较序列分析法、动态规划算法和基于机器学习的分类预测方法等类别),分析并比较了这些方法的优缺点。综述了主要的ncRNA序列和结构数据库,包括miRBase、GtRNAdb、RNase P数据库、Rfam、GENCODE、lncRNAdb和NONCODE等。
  (2)在此基础上,提出RNA二级结构预测的评估系统(lncRScan-Fold-Assess),其主要功能包括:报告利用RNA二级结构预测方法预测得到的RNA二级结构信息、计算RNA二级结构预测方法的预测精度和比较不同的RNA二级结构预测方法的性能等。lncRScan-Fold-Assess提供了RNAfold、MARNA、Mfold、Pfold、Sfold、RNAstructure和CentroidFold七种主流的RNA二级结构预测方法的预测功能。
  (3)为了更好地将我们设计的RNA二级结构预测的评估系统用于科学研究。我们设计实验将lncRScan-Fold-Assess应用于miRNA、tRNA、RNase P RNA、ncRNA和lncRNA,结果表明:在预测一组同源序列时,基于比较分析法的Pfold和质心法CentroidFold的效果明显优于基于最小自由能的RNAfold、mfold、Sfold和RNAStructure。但是,预测一条单个序列的时候,基于不同原理的预测方法得到的结果没有明显的差异。
  综上,用户利用lncRScan-Fold-Assess可以同时对多种RNA二级结构预测方法的性能进行评估,进而可以选择性能较好的方法输出结果,因此lncRScan-Fold-Assess可以帮助提高当前lncRNA二级结构预测的效率。
[硕士论文] 刘云霞
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:虽然携带遗传信息的DNA序列在人类各组织细胞中几乎是不变的,但其上的表观遗传特征却表现出极大的差异性,这也被认为是导致基因表达细胞特异性的主要原因。在众多表观遗传特征中,DNA甲基化被认为是当前研究较为透彻的表观修饰现象之一。DNA甲基化水平的改变与基因的选择性表达与调控具有密不可分的关系,并且在基因印记、X染色体失活等过程中扮演关键作用。研究表明,基因的重要调控元件区域(如启动子)的非正常甲基化状态与包括癌症在内的各种疾病的发生密切相关,所以准确识别给定区域的甲基化水平,不仅有助于解析基因转录调控机制,而且还能为人类认识各种复杂疾病的形成机制提供帮助。
  早期研究者主要依赖各类实验方法测定DNA甲基化位点,但实验方法一方面耗时耗财,另一方面无法覆盖到全基因组层面。一个替代的策略是利用计算方法来推断目标位点的DNA甲基化水平。鉴于近年来机器学习的广泛应用,研究者们开始考虑利用机器学习算法对DNA甲基化位点构建预测模型。然而,基于机器学习的预测方法的成败非常依赖有效的特征提取算法。本研究提出一种称为“阿贝尔复杂度”的新颖的DNA序列特征提取算法,并基于此构建人类全基因组DNA甲基化的预测模型。
  我们首次将“词的组合”领域中一个新颖的数学概念—阿贝尔复杂度,应用于DNA序列的特征提取中。首先,考虑到以DNA甲基化位点为中心的窗口大小对预测准确性的影响,我们分染色体测试了100bp-2000bp(步长100bp,bp即base pair,碱基对)范围内的所有窗口大小,结合各条染色体上的预测结果发现窗口大小在1300bp时预测效果最佳。进一步,我们利用卡方统计量和互信息两个指标对1301维初始阿贝尔复杂度特征进行特征筛选,发现第14-50维是对模型贡献最大的阿贝尔复杂度特征。另外,DNA组分特征可以被定义为DNA序列的基础特征,而当综合阿贝尔复杂度特征和DNA组分特征时模型的预测能力得到了进一步的提升。最后,为了选择最适合的机器学习方法,本研究比较了支持向量机(support vector machine,SVM)、随机森林算法(Random Forest)、最邻近算法(K-nearest neighbors)和朴素贝叶斯算法(Na(i)ve Bayes)四种机器学习算法。在5类细胞系数据的测试中,结果发现SVM具有更高更稳定的预测效果。
  综上,本文首次应用阿贝尔复杂度方法提取DNA甲基化序列特征,并通过窗口大小选取、特征筛选过程选取第14-50维阿贝尔特征,最后结合SVM构建DNA甲基化预测模型。基于预测模型的全基因组扫描预测结果可以缩小或降低相关生物学实验的目标范围和难度,为相关实验提供了有力的参考和指导,有助于解析人类复杂疾病的转录调控机制和完善人类基因组功能元件的注释。
[硕士论文] 李一凡
计算机科学与技术;计算机应用技术 华北电力大学;华北电力大学(北京) 2018(学位年度)
摘要:电子计算机已经深刻地影响了人类的生活,但由于摩尔定律的限制,科学家开始寻求新型计算模式,其中分子计算和量子计算应运而生。而分子计算由于高存储,微小性,高并行性等强大的计算潜力而成为新型计算的热点研究内容。DNA分子是分子计算的主要工具,蛋白酶能够进行酶切反应。分子逻辑门电路和分子电路是分子计算的基础,与蛋白酶结合的分子逻辑门和分子电路既具有生物意义,同时也是分子计算的重要研究方向。
  本文研究内容是利用DNA分子和蛋白酶(限制性内切酶),通过对杂交链式反应与链置换等生化技术的结合,分别设计了DNA分子逻辑门和DNA分子电路。具体工作如下:
  1.基于杂交链式反应(HCR反应)设计了将限制性内切酶作为输入的“YES”门,“AND”门和“OR”门分子逻辑门系统。在此系统中,分别设计了单种酶和多种酶两种逻辑输入,该输入起到控制杂交链式反应的启动的功能,并以杂交链式反应生成的DNA双链结构作为逻辑输出的分子逻辑门。设计完成后,以聚丙烯酰胺凝胶电泳对结果进行分析,验证了该分子逻辑门计算的正确性和可行性。
  2.在成功构造出分子逻辑门后,进一步的对DNA计算进行更深的研究探讨。基于链置换反应和限制性内切酶设计了一种将酶催化反应和非酶催化反应结合的能够进行多次循环反应的DNA分子电路。整个分子电路由限制性内切酶结合非酶催化的DNA链共同调控。而且在单酶控一级分子电路的基础上,还设计了多酶控一级分子电路和单酶控级联分子电路的更复杂结构的分子电路。设计完成后,通过荧光探针和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析,验证了该分子电路计算模型的正确性和可行性。
  综上所示,本研究基于蛋白酶分别设计了DNA分子逻辑门和DNA分子电路,成功构建了不同的分子计算模型。这些计算模型具有一定的可行性,为相关的DNA分子计算提供了一些思路,结合蛋白酶的生物意义,为之后的研究奠定了基础。
[博士论文] 钱琨
概率论与数理统计 山东大学 2018(学位年度)
摘要:科学的飞速发展已经使人类开始探究生命的奥秘,包括人类自己。近几十年来,随着人类基因组计划的实施和完成,分子生物学发展的一个重要特点是生物数据的爆炸式增长。面对呈指数增长趋势的海量数据,如何高效管理、准确解读、从而挖掘有用的生物信息,是一项有意义的工作,同时也是生物、数学、计算机科学等多个领域专家学者面临的一大挑战。在这种背景下,一门交叉学科——生物信息学诞生了。生物信息学研究的对象包括核苷酸、蛋白质序列及各类生物数据库。生物信息学中最基础最核心的内容之一是序列比较。序列比较的研究方法一般分为两大类:序列比对方法和非比对方法。由于传统的序列比对方法存在一些局限性,所以非比对方法越来越受到学者们的青睐。本文以DNA序列为研究对象,研究了一些序列比较中非比对方法。主要工作有以下几方面:
  在第二章中,我们简单介绍了几种非参数检验:Spearman统计量,Wilcoxon符号秩检验和Friedman秩检验。我们通过模拟序列,利用Spear-man相关统计量找出了在不同序列长度下DS2和D*2的最佳字串长度k。另一方面,Wilcoxon符号秩检验和Friedman检验作为评价方法好坏的手段,我们将它们应用到实际数据中,通过实例说明如何使用非参数统计检验评价序列比较方法的表现。
  在第三章中,我们提出了一种新的加权度量——加权的D2类度量。传统的D2类度量是一类基于k字次数的方法。但是在D2类度量的定义中,所有的k字都被同等对待,并没有考虑不同k字在不同序列上的重要性。因此,我们利用离差最大化方法,赋予所有k字一个合适的权重,然后给出新的加权的D2类度量。我们把新提出的度量应用到相似性搜索和识别功能相关的调控序列上,实验结果表明,我们提出的方法取得了较好的效果。
  在第四章中,分数阶傅里叶变换已经在很多领域被广泛应用。因此我们考虑将离散的分数阶傅里叶变换应用到系统发育分析上。首先将DNA序列转化为数值序列,然后对数值序列做离散的分数阶傅里叶变换,并提取了新定义的矩特征向量,最后计算序列间的距离,构造系统发育树。由于分数阶傅里叶变换中参数阶的不同所得到的变换不同,因此找到合适的阶是一个至关重要的问题,我们利用Friedman检验确定合适的阶数。进一步,为了验证我们所提出方法的有效性,我们将新方法应用到三组实际数据中,通过系统发育分析表明我们的方法更加精准。
  在第五章中,提出了一个新的半度量距离,我们称之为加权指数欧式距离。类似离差最大化的思想,给出一个求解权重的优化模型。为了求解该优化模型,我们提出了基于模糊逻辑的引力搜索算法,并将新的距离应用到相似性搜索和识别功能相关的调控序列上,数值结果表明了我们提出的方法是合理的、有效的。
[硕士论文] 光天磊
高分子化学与物理 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:端粒是真核细胞染色体末端一些蛋白质与DNA的复合物,该种复合物的结构起到保护染色体以及调控细胞分裂周期的重要作用。在所有的脊椎动物中,端粒DNA是由~1000个TTAGGG序列跟其对应的互补序列构成双链DNA的结构组成,且在双链的末端还有~200个核苷酸序列长度的单链端粒DNA。本论文的研究对象就是单链端粒DNA,单链的富含鸟嘌呤(G)的端粒DNA序列在一定条件下可以形成连续的G-四链体结构。由于该结构在超分子化学,纳米器件的设计以及抗癌药物的研发等方面具有广泛的应用前景,所以引起了大家广泛的研究兴趣。本论文中,我们具体研究了以下内容:
  首先我们用分析型超速离心(AUC)研究不同链长的端粒DNA在钠离子、钾离子、以及无钠钾盐中的变化,然后研究了不同浓度的d[AGGG(TTAGGG)6](G6-DNA)在钾离子条件下的变化,发现其在钾离子溶液中会存在单体和二聚体的平衡,其中分子内的G-四链体结构比分子间的二聚体结构更加稳定,并得到了该平衡的平衡常数;接着我们用分析型超速离心(AUC)、圆二色(CD)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)等方法研究了短序列的单链端粒DNA-d(TTAGGG)(G01-DNA)对于G6-DNA的单体-二聚体平衡的影响。结果表明:G01-DNA会与G6-DNA未形成G-quadruplex的部分结合,进而影响G6-DNA的单体-二聚体的平衡。本项研究可以加深对于长链端粒DNA结构的理解。
[硕士论文] 陈阳光
化学 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:手性非环核苷作为核苷类似物,因其侧链可以连接不同种类、不同立体构型的手性基团,具有显著的抗病毒潜能。手性非环核苷传统的合成方法基于手性源策略,具有反应步骤长、总收率低和手性源不易获得等不足之处。目前,通过不对称催化来合成手性非环核苷的报道较少,仅包含不对称aza-Michael加成和N-烯丙基化反应,尚没有通过动态动力学的方法合成手性非环核苷的报道。因嘌呤中N9和N7的竞争亲核性,会产生N9和N7位的区域选择性问题。
  我们基于不对称酰基转移反应,通过嘌呤、醛和酸酐三组分动态动力学拆分合成含有半缩醛胺酯片段的手性非环核苷类产物。该方法具有原料简单、反应条件温和等特点。值得提出的是该反应具有极高的区域选择性,主要获得N9位取代的手性非环核苷类产物。
  首先我们选用6-氯嘌呤、乙醛和乙酸酐进行三组分动态动力学拆分反应作为构建非环核苷的模板反应。分别对催化剂结构、碱、溶剂、底物比例和温度进行筛选。最终确定了以手性4-氨基吡啶类催化剂作为手性酰基转移催化剂,无水碳酸钠作碱,甲苯作为溶剂,4(A)分子筛为添加剂,在25℃条件下,反应72小时为最优条件。然后,我们使用4-氨基吡啶类催化剂对不同取代基的醛、嘌呤和酸酐等底物进行普适性考察,以良好的收率(高达93%)和优异的对映选择性(高达95%)得到系列N9位取代的手性非环核苷类产物。
  随后,我们又进行了放大量的反应,发现产物的产率和对映选择性都能得到保持。同时,利用单晶衍射确定了手性产物的绝对构型,并做了一系列控制实验对反应的区域选择性进行了探究。
  本文运用一种新的方法以极高的区域选择性得到系列手性非环核苷类似物,并对嘌呤N9位的区域选择性机理进行了探究。根据文献调研,本文出现的未被表征过的化合物均已通过1H NMR,13C NMR,HRMS进行表征,结果正确。
[硕士论文] 何兴鑫
生物医学工程 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:微卫星序列(Microsatellite)是一类以2~6碱基为重复单元的DNA或RNA重复序列,也被称为简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)。微卫星序列在真核生物和原核生物基因组中的非编码区、编码区、基因间区都有广泛分布。微卫星序列具有高度的突变性及多样性,因此微卫星序列作为一种分子标记在身份识别、亲子鉴定以及种群或个体间基因相关性分析等应用中被广泛使用。除了作为分子标记以外,微卫星在生物体中还起着重要生理作用,40多种人类先天性疾病均由微卫星重复数量改变而引起。目前微卫星的研究主要集中在原核生物与真核生物,在病毒基因组中的研究还非常有限。非典冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome-Related Coronavirus,SARSr-CoV)在2002~2003年间引起了全球性的非典型性肺炎大爆发,在37个国家中发生了774例死亡。SARSr-CoV以蝙蝠为天然宿主,在2002年底通过果子狸为中间宿主感染到人,最终导致SARSr-CoV在人群之间的爆发传染,爆发时间之短,传染速度之快,可能与微卫星对物种快速适应环境的作用有所关联。本文利用现存数据库中感染蝙蝠、果子狸及人类的SARSr-CoV基因组数据,从微卫星的角度,结合统计学,计算机方法,进行微卫星分布综合分析。
  本文主要有以下两个方面的内容:
  SARSr-CoV全基因组序列中微卫星序列的分析(第2章)
  本研究从NCBI的Genbank数据库中下载165条SARSr-CoV,依其感染宿主不同分为三组,感染蝙蝠、果子狸以及人类的SARSr-CoV序列,经过分析得到以下结果:(1)SARSr-CoV基因组序列相似程度高,感染不同宿主的SARSr-CoV进化时间短,且微卫星长度普遍偏短,同样映射出病毒进化时间短(2)组间微卫星的数量分布具有差异性。(3)除了数量之外,不同重复单元类型的微卫星差异更大。其中主要差异体现在一型微卫星中,说明一型微卫星可能是推动进化的关键。而二型微卫星十分稳定,说明二型微卫星可能起到重要的生理作用,三型微卫星人类与果子狸高度一致,而蝙蝠与他们均有较大不同,且存在其独有的微卫星,说明非典可能是由大量不同的蝙蝠SARSr-CoV中的一小个种群进化而来,而蝙蝠体内大量进化各异的SARSr-CoV为跨宿主传播做好了充足的准备。
  SARSr-CoV中微卫星序列的宿主差异性分布分析(第3章)
  在第2章中对SARSr-CoV基因组序列中微卫星的数量与类型做了分析,但其分析是在平均和整体的水平上,无法得到基因组上微卫星分布的细节信息。在第3章中,使用本研究组开发的C++软件,对三组感染不同宿主的SARSr-CoV进行进一步的分析,得到SARSr-CoV基因组不同区域中的微卫星序列分布模式图,并从其中找出微卫星分布具有宿主特异性的区域,随后定位到相应的微卫星宿主特异性位点,这些位点可能对SARSr-CoV的短期快速跨宿主进化的工程中起着重要的推动作用。结果显示,微卫星在基因组不同位置上是非随机分布的,微卫星在病毒基因组上的分布存在位置偏好性,且在感染不同宿主的SARSr-CoV中微卫星在基因组同一区域上的分布是存在差异的。(1)一型微卫星多数分布在S基因区域,且有明显的宿主特异性,在S基因区域的微卫星位点上,蝙蝠SARSr-CoV中不存在一型微卫星,果子狸SARSr-CoV中存在一部分完美微卫星与一部分非完美微卫星,而人类SARSr-CoV在此位点全都存在完美微卫星。S基因表达的相关蛋白在病毒入侵细胞时起到受体识别以及溶细胞膜作用,与病毒的感染能力息息相关。(2)二型微卫星多数分布在ORF1ab基因区域,且三组病毒在相同区域内二型微卫星没有很大的数量差异,此区域负责生产病毒正常生理过程中所需的RNA解旋酶,RNA聚合酶以及蛋白酶等重要物质,为了保证病毒个体的存活,此区域必须保守,因此二型微卫星在此区域没有发生较大的突变。(3)三型微卫星在人类/果子狸的各个区域内的存在与数量相当,而蝙蝠病毒三型微卫星在基因组区域上的分布更为分散而平均,推测三型微卫星在进化过程中受到的选择压力较小,因此三型微卫星可以为蝙蝠SARSr-CoV群体提供丰富基因库,丰富的基因库为蝙蝠SARSr-CoV跨宿主传播提供了可能。
  
[硕士论文] 李茜
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:GlmZ是大肠杆菌中非编码的小RNA。它主要参与调控glmS mRNA的翻译表达,全长207个核苷酸,并且在调控的过程中依赖分子伴侣Hfq蛋白质。当细菌在准备分裂时,细胞中会大量合成生物膜,合成生物膜的必要条件就是需要大量的葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P),而葡萄糖胺-6-磷酸需要葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)的催化。基因glmS就会被激活,转录出glmS mRNA。大肠杆菌中glmSmRNA的转录后调控是通过小RNA GlmZ来调控。
  在本实验中,我们试图通过SHAPE的方法研究小RNA GlmZ和RapZ蛋白质的相互作用,希望得到它们之间具体的结合位点。SHAPE的全称是Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,就是对2'-OH选择性标记,然后通过引物延伸的方法得到RNA的二级结构。为了建立这种方法,我们先以tRNA作为实验对象,成功的进行了摸索实验。从SHAPE的实验结果可以得出tRNA的二级结构是经典的三叶草模型。然而在进一步使用SHAPE研究GlmZ的结构以及它和RapZ的结合位点过程中,我们遇到了若干实验问题,最终未能顺利完成这部分研究。同时我们还通过晶体学方法得到了RapZ蛋白质的晶体,并且收到了2套分辨率在3A以内的衍射数据,但是由于晶体堆积上的问题,结构并没有解出来。在其它研究中,我们还使用SHAPE技术研究了rox2 R2H1RNA的二级结构。
  另外,大肠杆菌中的CsdA蛋白质是一类DEAD-box RNA解旋酶,它是由629个氨基酸残基组成的多结构域的蛋白质。主要功能是参与细胞内的许多RNA有关的代谢过程,例如: RNA降解,前体mRNA的剪切,翻译起始,核糖体的生物合成等等。在之前的实验工作中我们已经发现了CsdA是由两个串联的RecA-like组成保守的核心结构域,一个二聚体结构域(DD)和一个RNA结合结构域(RBD)以及C端的尾巴构成,而且在二体的形态下发挥功能,并且我们已经得到各个结构域的结构和功能。CsdA的核心结构域主要发挥解旋酶和ATPase的功能,我们通过解旋实验发现CsdA要想行使解旋功能必须形成二体,但是并不需要两个核心结构域。而且通过酶活实验和荧光偏振实验发现,CsdA的RBD结构域在它结合RNA的过程中起到了重要的作用。
[硕士论文] 朱盼盼
化学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:离子液体表面活性剂不仅具备离子液体的特殊性质还具有表面活性剂特性,可以通过改变阴阳离子、碳链长度来设计具有某种特定功能的离子液体以满足人们的需求。异喹啉类衍生物具有抗肿瘤、抗癌、抗血小板聚集、镇痛等生物活性,以异喹啉为母体的化合物在药物传递等领域中具有潜在的应用价值。不仅如此,异喹啉环还具有光活性,将功能型阳离子异喹啉环和烷基长链引入到离子液体中,研究其在溶液中的聚集行为,进一步探讨了[C12iQuin]Br与DNA的相互作用,研究两者的作用机理,在此基础上探讨[C12iQuin]Br对药物与DNA作用方式的影响。本论文还比较了不同链长的[CnQuin]Br胶束化行为,探讨了疏水性烷基链在压缩DNA过程中的作用。本论文主要包括以下几个方面:
  1、利用表面张力、动态激光光散射(DLS)、核磁(NMR)、等温滴定微量热(ITC),透射电镜(TEM),荧光等技术研究了[C12iQuin]Br在缓冲液中的聚集行为。研究结果表明,[C12iQuin]Br在浓度较低时(小于CMC)就出现了较大尺寸的预聚集体结构,并且这一独特的结构呈现球形,随着浓度的[C12iQuin]Br溶液的进一步增大,预聚集体结构逐渐向胶束结构转变。根据2D NOESY谱图分析,预聚集体与胶束结构的分子排列方式一致,异喹啉环部分地进入疏水性胶核,并且相邻的异喹啉以π-π堆积方式堆积排列。此外,研究了烷基链长及盐浓度对[C12iQuin]Br聚集行为的影响,结果表明烷基链越长的[CniQuin]Br形成预聚集体时所需要的[CniQuin]Br的量越少,越有利于预聚集体结构的形成。盐浓度的增加导致紧密的胶束结构提前形成,并且预聚集体的尺寸随着盐浓度的增加而略有减小。
  2、利用紫外光谱、动态光散射(DLS)、低温冷冻透射电镜(cryo-TEM)、圆二色谱(CD)、稳态荧光光谱和荧光探针取代实验、Zeta电势、傅里叶红外吸收光谱(FT-IR)、等温滴定微量热(ITC)、1H NMR和2D-NOESY等技术揭示了离子液体表面活性剂结合DNA后并将其压缩的关键因素。通过紫外光谱中的几个等电点说明[C12iQuin]Br分子缔合到了DNA上形成了[C12iQuin]Br-DNA复合物。稳态荧光和时间分辨荧光数据表明[C12iQuin]Br的荧光被DNA猝灭,属静态猝灭。荧光探针取代实验表明[C12iQuin]Br可能是AT碱基特异性小沟槽光敏分子。DLS结果显示DNA分子在[C12iQuin]Br浓度比较低时开始被压缩,随着[C12iQuin]Br浓度的增加逐步由线圈向球形结构转变,cryo-TEM印证了这一结果。[C12iQuin]Br的加入使得DNA的碱基堆叠和双螺旋发生了改变,但仍保持B型构象。另外,烷基链越长的[CniQuin]Br与DNA的作用力越强。FI-IR谱图说明阳离子异喹啉环通过静电作用与负电荷的DNA磷酸根基团发生作用,且[C12iQuin]Br分子的疏水碳链与DNA碱基间存在疏水作用。Zeta电势和ITC结果表明疏水作用在DNA结构转变过程中占主导作用。1H NMR和2D NOESY图谱表明光活性[C12iQuin]Br发生AT特异性小沟槽缔合。[C12iQuin]Br浓度较低时,[C12iQuin]Br分子可能平躺于DNA小沟槽,异喹啉环平面插入碱基间,且异喹啉环上的H7与DNA一侧链上的磷酸根基团之间只有几个埃的距离,而环上的H4在DNA另一侧链的糖环1'H质子附近。当[C12iQuin]Br浓度大于0.24 mM,[C12iQuin]Br在DNA的小沟槽处缔合达到饱和。继续增加的[C12iQuin]Br分子可能结合在DNA表面,异喹啉环在DNA的磷酸根附近,疏水链与DNA表面有一定的角度。这种独特的缔合特性构筑了新的功能型的[C12iQuin]Br-DNA复合物,因此有望在光动力学治疗和基因传递中得到有效地应用。
  3、利用紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、时间分辨荧光等技术揭示了抗癌药物盐酸巴马汀分子与DNA之间的缔合模式。巴马汀与DNA结合后,荧光发射峰强度、吸光度、时间分辨荧光、圆二色谱图等光谱参数产生了变化。盐酸巴马汀本身荧光较弱,但随着DNA浓度的增加,荧光强度显著增强。实验证明盐酸巴马汀分子与DNA之间存在着静电作用和嵌插作用,二者之间形成的是动态复合物。利用紫外光谱、荧光光谱、时间分辨荧光、等温滴定微量热等技术研究了离子液体表面活性剂[C12iQuin]Br对DNA与盐酸巴马汀相互作用的影响。实验表明随着[C12iQuin]Br含量的增加,使得盐酸巴马汀分子逐渐从DNA的碱基对间排除,取代了巴马汀分子与DNA发生作用,实现了抗癌药物从DNA中的解离。
[硕士论文] 王龙
信号与信息处理 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度大于200核酸的非编码RNA。随着高通量测序技术的广泛应用,已在生物体内发现大量lncRNA,其中有相当一部分的lncRNA具有重要的生物学功能,如参与胚胎干细胞凋零、细胞循环控制等细胞过程。在lncRNA的调控机制研究方面,已有一些模型被提出,如lncRNA能够招募或驱赶蛋白质对DNA的绑定、作为蛋白质复合体的骨架等。然而,lncRNA的机制和功能研究尚处于起始阶段。与蛋白质编码基因不同,大部分lncRNA不能用于产生蛋白质。同时,lncRNA与蛋白质编码基因或其转录产物——信使RNA(Messenger RNA,mRNA)有许多相似之处。在基因层面,lncRNA与蛋白质编码基因具有相似的组蛋白修饰轮廓和剪接信号;在转录过程中,lncRNA往往也是聚合酶的产物。基于长非编码RNA和蛋白质编码基因的特征和功能差异,推测两者的转录机制也有可能不同,进而影响功能表现。
  本文从预测和分析lncRNA的转录因子绑定位点(Transcription Factor Binding Site,TFBS)入手,研究lncRNA的转录过程。首先全面综述了TFBS预测算法和TFBS模型数据库。在此基础上,提出了名为lncRScan-TFBS的生物信息学方法,该方法根据来自染色质免疫沉淀——高通量测序实验(ChIP-Seq)的数据,分析与lncRNA关联的TFBS。lncRScan-TFBS的功能主要包括:报告输入ChIP-Seq峰和基因的基本统计信息、转录起始位点(Transcirption Start Site,TSS)与峰之间的距离,分别针对lncRNA和蛋白质编码基因的TFBS进行基序查找和富集度分析等。
  将lncRScan-TFBS应用于小鼠干细胞(Mouse Embryonic Stem Cell,mESC)的ChIP-Seq数据,实验结果表明调控因子c-Myc、 n-Myc、Esrrb、Klf4和Tcfcp2l1与CTCF的TFBS有重叠,说明它们共同参与转录调控过程。特别是,c-Myc和n-Myc的TFBS几乎完全重叠,并且它们都与CTCF的TFBS有较大的重叠,这表明它们可能通过这些相关的TF与CTCF紧密相互作用。实验结果并没有发现lncRNA特异性的转录因子绑定位点,但发现部分转录因子在调控lncRNA转录时,比调控蛋白质编码基因转录有更长的距离,这可能是lncRNA表达量较低的潜在原因。综上,lncRScan-TFBS可用于有效分析lncRNA的TFBS,进而帮助推断lncRNA特异性的转录模式。
[硕士论文] 徐双斌
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:环状RNA在三十年前就已被报道。最近随着高通量测序技术的发展,研究人员在越来越多的物种中发现环状RNA,但在硬骨鱼中却仍鲜有报道。大黄鱼是我国一种重要的海水养殖鱼类,本研究通过利用大黄鱼基因组模拟得到的数据,对现有的两种挖掘环状RNA的生物信息学流程进行评估,从中选取合适的流程对实验室原有大黄鱼的真实转录组数据进行环状RNA的挖掘,并进行了大黄鱼雌雄鱼性腺环状RNA的测序、挖掘,比较了两者之间环状RNA的表达差异。主要的研究结果如下:
  1.利用模拟数据对目前常用的两种环状RNA挖掘流程,从不同的环性与线性转录本测序量方面进行评估,发现在环性转录本较低的条件下,其中的一款流程CIRCexplorer检测到的环状RNA的准确率较高。但在环性转录本较高的情况下,另一款流程CIRI检测到的环状RNA的准确率有所升高,挖掘到的环状RNA的数量也较多,但CIRCexplorer的准确率仍高于CIRI,挖掘到的环状RNA的数量仍低于CIRI。
  2.根据模拟数据的评估结果,利用CIRCexplorer对大黄鱼多组织混合样本的RNA seq数据进行环状RNA挖掘,检测到了975个环状RNA分子,其中65.95%来自编码基因的外显子;随机挑选3条进行验证,其中2条得到了确认。对挖掘到的外显子环状RNA来源基因进行GO以及KEGG富集分析,结果显示,这些来源基因主要富集在结合、翻译起始因子、细胞质内大分子代谢、翻译等通路中。对其进行microRNA靶点预测的结果显示,大黄鱼环状RNA中有丰富的miRNA的结合位点,其中有363个环状RNA具有超过5个潜在的microRNA结合位点,22个具有10个以上的miRNA-430与let-7家族的结合位点。
  3.进行了大黄鱼精巢和卵巢环状RNA测序,从测序数据中,共检测到环状RNA6115个,其中2693个在精巢中特异表达,1053个在卵巢中特异表达;余下2369个在精巢和卵巢都有表达的环状RNA中。表达差异分析结果显示,有1065个环状RNA的表达量在精巢相对上调,而有621个表达量在精巢中相对下调。对这些差异表达的环状RNA的编码基因进行GO富集分析,结果表明这些基因主要富集在神经系统发育(GO:0007399 nervoussystem development)、蛋白质结合(GO:0005515 protein binding)以及谷氨酸受体活动(GO:0004972 NMDA glutamate receptor activity)等GO术语上。KEGG代谢通过分析结果显示,雌雄性腺环状RNA的编码基因在脂类代谢途径(Ubiquitin meditated proteolysis)、孕激素介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)以及泛素介导的蛋白酶解(TNF signaling pathway)等代谢通路中具有明显差异。性腺中检出的环状RNA具有丰富的miRNA结合位点,网络分析结果显示大黄鱼性腺中的circRNA-miRNA-mRNA可能具有复杂的调控网络。
[硕士论文] 张梦华
海洋化学 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:核酸作为生命体重要的遗传物质,它的检测尤其重要,实现对核酸快速、简单、可视化的检测在生化分析领域具有重要的意义。无论是变温的核酸扩增反应,还是等温的核酸扩增反应,都是酶促反应,这类型的反应对实验条件的高要求限制了核酸检测的适用范围。所以无酶DNA自组装反应的提出,不仅在核酸检测领域,同样在DNA纳米结构和体内检测领域具有一定的应用价值。
  首先,本论文的第一章在无酶的指数发卡自组装反应的基础上,结合芘分子,展开指数发卡自组装反应的荧光检测,并对方法进行了验证,但方案不能满足核酸检测的要求。因此,调整实验方案,选用指数发卡自组装反应结合荧光共振能量转移对Cy3/Cy5,进行单链核酸的检测。为获得最佳的能量传递效率,对实验条件进行了优化。对方法的灵敏度进行的验证结果表明,方法的检测限为10pM;利用添加10%胎牛血清的细胞培养基对方法的抗干扰能力进行检测,结果表明方法具有很好的抗干扰能力;另外,通过对不同错配靶标的检测,证明了该方法具有良好的特异性。
  其次,本课题组的研究发现,PEG200能显著提高链置换的速率,而DNA自组装反应是DNA链之间自发的置换与杂交过程。因此我们设想PEG200也可能促进DNA自组装反应。在论文的第三章中,选取六种常用于核酸扩增的小分子物质,将它们用于杂交链式反应反应并比较了小分子物质对杂交链式反应的影响,结果表明PEG200为最佳的促进杂交链式反应的小分子物质,然后将PEG200用于指数发卡自组装反应,结果显示PEG200同样能促进指数发卡自组装反应。而且,在20%的PEG200的促进下,杂交链式反应的速率被提高100倍左右,指数发卡自组装反应的速率被提高10倍左右。
  最后,论文的第四章以纳米金比色为基础,从修饰后的纳米金的抗盐能力以及在加入靶标链后的变色时间及颜色变化情况比较了全修饰和不对称修饰两种纳米金修饰方式,根据实验结果确定全修饰的纳米金适合用于核酸扩增反应。然后将全修饰的纳米金用于聚合酶链式反应、环介导核酸等温扩增反应中。结果显示全修饰的纳米金对核酸扩增反应有抑制作用,通过添加BSA可减少纳米金对反应的抑制作用。但是实验的比色结果表明,该方法还不能完成明显的纳米金比色。我们认为,可以通过优化实验条件,找到集纳米金比色技术与核酸扩增反应于一体的一步核酸比色检测法。
[硕士论文] 王一凡
海洋化学 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:副溶血性弧菌是引起食物中毒的一种重要的致病菌,也是目前沿海地区首要的食源性致病菌,广泛存在于鱼、虾、蟹、贝等海产品中,因此高效快速的检测副溶血性弧菌对食品安全、疾病监测等领域具有非常重要的意义。
  为了更简单、快速的检测副溶血性弧菌,本文研究了三种等温核酸扩增反应。首先,研究了一种基于切刻内切酶和DNA聚合酶的等温链置换指数扩增反应,但实验结果表明切刻内切酶的存在容易导致非特异性扩增。因此,为了避免切刻内切酶造成的非特异性扩增,本论文又选取了不含切刻内切酶仅含一种DNA聚合酶的等温核酸扩增反应——环介导等温扩增反应对副溶血性弧菌进行检测,检测结果表明该反应对检测副溶血性弧菌具有良好的特异性和抗干扰能力,检测限低至10aM。本论文在利用环介导等温扩增反应检测副溶血性弧菌过程中发现甜菜碱的存在不仅无法促进反应的进行,反而会降低反应效率,而甜菜碱在环介导等温扩增反应发明时就存在于反应体系中,且目前已广泛应用于等温核酸扩增反应,是常用核酸反应添加剂。对此,本论文对甜菜碱降低等温核酸扩增反应机理进行了更深入地研究,结果表明甜菜碱阻碍了互补单链DNA的有效碰撞结合,减小了结合速率常数K1,从而降低了反应效率,其中0.8M甜菜碱约使环介导等温扩增反应速率降至1%。本文已经证明,在等温核酸扩增反应中,甜菜碱作为一种常用添加剂,可以减小反应效率,且阐明了甜菜碱影响的机理。因此,甜菜碱可以从等温核酸扩增反应中剔除出来,从而简化反应体系,降低实验成本,提高反应效率,缩短反应时间。这一发现将大大加快等温核酸扩增法的发展,更适宜于在POCT等领域的应用。此外,本文又利用实验室建立的一种仅需DNA聚合酶的新型等温核酸扩增反应——变性泡介导的链交换扩增反应对副溶血性弧菌进行了检测。实验结果表明,变性泡介导的链交换扩增反应对副溶血性弧菌的检测限可达到10pM,且特异性高、抗干扰能力强。
  由于甜菜碱能够降低结合速率常数K1,阻碍互补单链间的杂交,因此本文推测增加解离速率常数K2的物质能够促进双链的解离,从而促进相关反应的进行。因此,本文又进行了常用添加剂对链交换反应影响的实验。实验结果表明普鲁兰多糖、甜菜碱、二硫苏糖醇、海藻糖对链交换反应几乎没有促进效果;十六烷基三甲基溴化铵、二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇600、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000对链交换反应有促进作用,其中20%甲酰胺、30%聚乙二醇200、40%二甲基亚砜对链交换反应促进效果最佳。经实验验证聚乙二醇200能够解旋双链DNA,增大DNA双链解离速率常数K2,促进DNA自组装反应效率,对核酸反应如DNA折叠等的发展具有重要意义。
[硕士论文] 孙小红
动物遗传育种与繁殖 青岛农业大学 2017(学位年度)
摘要:核糖核酸定位是哺乳动物细胞中存在的一种普遍现象,通过这种方式可以将蛋白质精确定位到其功能位点。大量研究表明核糖核酸分子的定位过程,是在细胞内各种作用因子的作用下经过多种运输途径完成的,而且不同的核糖核酸分子所需的运输方式也不同。经过这一复杂而又高度协调的过程,细胞中的核糖核酸究竟定位到哪种亚细胞结构进行后续的翻译和降解过程,目前还不清楚。本研究以Hela S3细胞为实验材料,对细胞内RNA分子的分布进行整体水平的检测与分析;借助单分子活细胞成像系统,探究其定位的亚细胞结构与功能。
  本研究主要内容包括:⑴建立核糖核酸分子的活细胞成像系统。为了直接观察细胞内部核糖核酸分子的动态变化及分布情况,我们将一段重复的 MS噬菌体茎环结构连接至目的基因的3’UTR区,建立了实时观察活细胞内核糖核酸分子的成像系统。⑵核糖核酸定位于中间纤维。通过将Hela S3细胞分级分离为细胞核、中间纤维骨架和细胞质等可溶性组分,定量分析其中核糖核酸的含量,发现细胞中核糖核酸倾向于分布到细胞骨架上;借助活细胞成像系统和超高分辨率显微镜发现细胞中有定位的和没有定位的核糖核酸均定位于中间纤维。⑶利用CRISPR/Cas9技术,敲除细胞质全部的中间纤维系统,得到中间纤维完全敲除的细胞系。⑷中间纤维有利于核糖核酸的翻译。通过比较中间纤维全部敲除的细胞与正常细胞中蛋白质合成速度的快慢,发现中间纤维敲除的细胞中核糖核酸的翻译速率下降。
[硕士论文] 李道勇
生物工程 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:分子量标准(Marker)是指将特定大小的DNA片段混匀在一起,经过琼脂糖凝胶电泳,形成一条DNA分子梯度带(ladder),标识出未知DNA片段的大小。目前制作分子量标准主要有两种方法:一是通过PCR扩增出所需大小的DNA片段;二是利用限制性内切酶酶切较大片段的DNA分子或者基因组,得到一系列大小已知的DNA片段。但是,以上这些方法都只适用于制作小分子量Marker,不能满足大片段操作相关标识的需求。本研究采用两种不同的方法对大片段分子量标准的制备进行了探索,得到可应用于BAC文库构建的分子量Marker。
  第一种方法是:利用T4 DNA连接酶对分子量大小为48.5 kb的商业λ噬菌体基因组DNA进行连接,得到一系列梯度大小的大片段分子量标准,同时对T1噬菌体基因组DNA的提取条件进行了摸索;第二种方法是:利用本实验室的BAC文库资源,根据所制备分子量标准的要求,从中挑选出所需大小的BAC克隆,通过I-SceI酶切后进行低熔点琼脂糖包埋,从而制备成大片段分子量标准。
  通过对上述两种大片段分子量标准制备方法的探索,得到了如下实验结果:1、采用氯化锌的方法提取出了T1噬菌体基因组DNA。2、经过多次实验,摸索出了最佳的λDNA连接反应条件是:酶连接体系为400μL,λDNA(300ng/μL)15μg, T4DNA连接酶连接酶量为(Thermo)16U,16℃酶连4h。3、通过挑取目的片段大小的BAC克隆,制作得到了50kb,80kb,110kb,145kb,170kb分子量标准,并保存在低熔点琼脂糖中。
  
[硕士论文] 黄宇
农业昆虫与害虫防治 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:玫烟色棒束孢(Isaria fumosoroseaWize)是一种重要的昆虫病原真菌,在生物防治中有重要的应用价值。本论文利用DNA步移方法扩增获得了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的DNA和cDNA全长,通过基因敲除和回补获得敲除菌株和回补菌株。在比较亲本菌株和敲除菌株的生物学特性、代谢产物的生化特性以及致病力的基础上,研究了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的功能,明确了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因与菌株致病力间的关系。具体研究包括以下几个方面:
  (1)玫烟色棒束孢Ifcdp1基因全长的扩增及序列分析。利用DNA步移方法扩增了玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的DNA全长,在GenBank中登录号为KU519628。经与cDNA序列比对分析表明:玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的编码序列长度为1140bp,DNA序列中含有大小分别为65bp,59bp和59bp的内含子,在基因序列上游-508bp处有真核生物的基本启动子序列TATA-盒;Southern Blot结果显示Ifcdp1在菌株的基因组中为单拷贝,可编码380个氨基酸,含有肽酶S8-S53超家族的活性位点天冬氨酸(Asp)-组氨酸(His)-丝氨酸(Ser)催化三联体,预测分子量为39.3kDa,等电点为8.72。
  (2)玫烟色棒束孢Ifcdp1基因的敲除与回补。构建了Ifcdp1基因的敲除载体和互补载体,通过农杆菌介导将带敲除载体的质粒pPB-5’-flanking和p BT-3’-flanking导入野生菌株中、敲除玫烟色棒束孢Ifcdp1基因而获得敲除菌株,将带互补载体的质粒pBen-Ifcdp1导入敲除菌株中回补Ifcdp1基因而获得回补菌株,PCR鉴定进一步确认获得敲除和回补菌株。
  (3)敲除Ifcdp1基因对玫烟色棒束孢菌株生物学特性的影响。敲除Ifcdp1基因对菌株的菌丝生长没有影响,在相同温度和培养基下,敲除菌株(MT)与野生菌株(WT)、回补菌株(CT)的菌丝生长速率差异不显著。敲除Ifcdp1基因显著影响菌株的产孢量,在相同培养基上培养相同时间,MT菌株的产孢量只有WT菌株的50%。敲除Ifcdp1基因不影响菌株代谢产物中总蛋白酶的活性,但会导致Pr1蛋白酶的活性显著降低:在CZB培养液中,MT菌株的总蛋白酶活性与WT、CT菌株差异不显著;在CZB、PDB、SDBY培养液中培养24-48h时,MT菌株发酵液中的Pr1蛋白酶活性显著低于WT菌株的Pr1蛋白酶活性(P<0.05)。
  (4)敲除Ifcdp1基因对玫烟色棒束孢菌株致病力的影响。以烟粉虱和小菜蛾为生测对象,对CT、MT和WT菌株进行了生物测定。以烟粉虱若虫为生测对象,MT菌株第6d的致死中浓度LC50(2.26×106孢子/ml)明显高于WT的LC50(5.11×105孢子/ml),MT菌株(浓度为1×106孢子/mL)的致死中时间LT50(176h)明显长于WT的LT50(130h)值。而以小菜蛾为生测对象时,MT菌株第3d的致死中浓度LC50(1.59×105孢子/ml)明显低于WT的LC50(1.03×106孢子/ml),MT菌株(浓度为1×106孢子/mL)的致死中时间LT50(62h)明显短于WT的LT50(78h)值。表明Ifcdp1基因的敲除导致玫烟色棒束孢对烟粉虱的致病力减弱,对小菜蛾的致病力增加。经WT、MT菌株处理后烟粉虱成虫的产卵量显著降低,Ifcdp1基因敲除后玫烟色棒束孢对烟粉虱成虫产卵量的影响显著减弱。
[硕士论文] 黄可
预防兽医学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:PCR(Polymerase chain Reaction,聚合酶链式反应)是分子生物学中一种重要的诊断技术,灵敏度与特异性是表现其扩增效率的两个重要参考指标。影响PCR扩增效率的因素众多,而引物和探针的设计是一个PCR成功的关键。目前有关引物设计的研究多集中于引物的长度、GC含量等方面,而引物与模板的错误结合而引起的非特异性扩增或扩增效率下降的相关研究还很匮乏且不系统,并且无适用于临床应用的实例,目前还没有探针核苷酸错配对PCR检测影响的相关研究。为了提高PCR设计的效率和可信度,从引物与探针的核苷酸序列的特异性对扩增效率的影响进行研究十分必要,为引物与探针的设计提供更可靠的参考。
  在本论文的第二章中,我们以肺炎衣原体的全核酸为模板,在上下游引物的不同位点引入核苷酸错配,研究单个核苷酸错配、多个核苷酸错配在不同位点、数量以及错配类型对扩增效率的影响,并囊括了引物3'端4种碱基突变为其它任何碱基类型对扩增效率的影响;同时考虑到DNA聚合酶的影响,在经过对市场上商业化DNA聚合酶扩增效率的对比后,研究扩增效率较好的Takara和Platinum两种DNA聚合酶在引物发生核苷酸错配时对反应扩增效率的影响情况,本实验对扩增效率的界定是通过实时荧光定量PCR定量的拷贝数进行计算获得的。进一步研究,通过对FRET探针核苷酸进行错配,在FAM探针上的不同位点依次增加核苷酸错配的数量,研究其对PCR检测的核苷酸错配的容忍度。在第三章中,将错配研究所得到的结论应用于实际引物设计,对临床上18S rRNA序列同源性较高的巴贝斯虫以及泰勒虫进行分子区分,设计特异性地扩增巴贝斯虫的PCR,并且通过临床样品和其它参考方法比较,并用电泳和测序验证。
  上下游引物进行核苷酸错配时,其结果表明,单个核苷酸错配:Platinum DNA聚合酶比Takara DNA聚合酶的扩增效率更低,单个核苷酸错配对Takara DNA聚合酶的扩增效率没有太大影响(接近100%);引物3'端核苷酸由C变为A,以及由G变为C时扩增效率最差,由T变为C以及由A变为C时,扩增效率最好;距离3'端4个碱基位置发生错配时,扩增效率为82.3%;Platinum DNA聚合酶在引物3'端使用简并碱基,简并两个,三个,四个碱基的平均扩增效率分别为59.3%、43%、33.9%。多个核苷酸错配时:Platinum DNA聚合酶和Takara DNA聚合酶在引物5'端及引物中间的错配的平均扩增效率为92.6%和100%,对扩增效率影响不明显,5'端能够容忍连续8个核苷酸错配;Takara DNA聚合酶在引物3'端连续4个错配时扩增效率下降最快(15%以下);上下游引物错配位点不在3'端时,其总数加起来为10个时,扩增效率不低于40%。
  FAM探针进行核苷酸错配时,其结果表明:探针发生少数几个错配时,扩增效率没有影响,但在探针中间位置连续发生5个错配时,将直接导致没有扩增曲线;在任何位点发生错配时,其Tm值会随着错配个数的增加而逐渐下降,且错配位点发生在探针的中间时,其Tm值下降的更明显:发生4个核苷酸错配时,中间位点的Tm值下降10℃,下降幅度明显大于探针3'端与5'端错配4个时Tm下降的3℃。
  巴贝斯虫和泰勒虫是以蜱虫为传播媒介、胞内寄生的原虫,它们的18S rRNA序列高度相似,临床症状极度相近,实际检测中难以区分。本研究的文献查阅和初步试验表明,被大家最广泛认可的PCR方法不可以区分这二种病原体。本研究应用错配结论进行引物设计,建立区分巴贝斯虫与泰勒虫的PCR方法。在使用设计的巴贝斯虫特异性引物扩增人工构建的泰勒虫18S rRNA质粒时,当特异性引物与泰勒虫只差引物3'端最后一个核苷酸且模板浓度为100拷贝/反应时,若引物由G变为C,两种聚合酶都没有扩增出泰勒虫产物;由T变为G时,Takara DNA聚合酶扩增出泰勒虫产物,Platinum DNA聚合酶没有扩增出泰勒虫产物;由A变为C时,两种聚合酶都能扩增出泰勒虫产物。使用由G变为C这套特异性引物扩增40个来源不同的临床样品时,结果显示阳性率为7.5‰测序结果表明扩增序列正确,低于引用的常用的引物的50%与30%,且其测序结果中有泰勒虫序列出现。
  综上所述,本研究关于引物与探针核苷酸错配对扩增效率的影响表明,在引物3'端发生核苷酸错配时,不同DNA聚合酶的效率有差别,Platinum DNA聚合酶比Takara DNA聚合酶的特异性更强,而Takara DNA聚合酶的灵敏度更高,能够容忍较多的错配;引物3'端由G变为C和由T变为G时对PCR扩增效率影响最大;错配发生在距离3'端4个碱基或发生在5'端(能容忍连续8个错配)和中间时,对扩增效率的影响不大;上下游引物除3'端以外的其它位点错配在错配数量达到10个时仍然能有扩增反应。探针核苷酸在中间发生错配时对扩增效率的影响较大,能容忍的错配个数为5个核苷酸。本研究关于引物设计的实际应用表明:基于上述结论所建立的PCR方法可特异性地区分诊断巴贝斯虫和泰勒虫,这将为在临床情况下区分诊断类似于像巴贝斯虫与泰勒虫这种基因同源性较高的病原体提供了重要的参考依据。但关于错配延伸的相关机制目前尚不明确,对其进行更深入的研究将为引物和探针的设计提供更多的参考价值。
[硕士论文] 龚红玲
生物物理学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:主要利用变温紫外可见分光光度法及等温滴定量热法系统地研究了温度、离子浓度效应对DNA凝聚过程的影响。
  首先,为探究温度对不同高价离子-DNA凝聚体系的影响,利用自行搭建的变温紫外分光光度计,通过系统研究荧光单分子实验中采用的精胺(亚精胺)-DNA凝聚体系及去离子水中DNA在260nm处特征吸收值随温度变化情况,确定了DNA凝聚构象与其260nm处特征吸收值之间的对应关系为:DNA凝聚构象越紧致、有序,其对应的A260值越低。在此基础上,系统地研究了DNA凝聚实验中常用四种钴胺化合物-DNA凝聚体系随温度变化情况,结果表明三氯六胺合钴与精胺(亚精胺)类似,其对应的A260值,随着温度升高而逐渐降低,即DNA凝聚构象趋于更加紧致、有序。而三(乙二胺)氯化钴、反式双(乙二胺)氯化钴、五胺氯化钴的情况却不同,与其对应的DNA凝聚体系的A260值,随着温度升高,呈现先增加,再降低,然后再增加的规律。
  其次,利用等温滴定量热法定量研究DNA凝聚过程中温度效应及离子浓度效应。随温度增加,精胺与DNA相互作用的结合常数逐渐增大,说明温度的升高促进DNA凝聚;在DNA溶液中分别加入NaCl、NaF、Na2SO4、Na3PO4时,精胺与DNA的结合常数依次减小,表明阴离子对DNA有去凝聚作用,且去凝聚能力:PO43->SO42->F->Cl-;Mg2+,Mn2+等二价离子对DNA凝聚体系作用不同。随DNA凝聚体系中Mg2+浓度增加,A260值先增大再减小,而Mn2+却导致DNA凝聚体系A260值逐渐降低。
  最后,为了探讨氟能否与DNA形成氢键,用等温滴定量热法研究了NaF与寡核苷酸链相互结合的单分子实验。结果发现,NaF能与寡核苷酸链相互结合,推测氟与寡核苷酸链中的碱基形成了氢键。
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