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[博士论文] 特发叶·沃酷
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文试验研究由三部分组成。第一部分分析肝配蛋白A5(EphrinA5)在小鼠颗粒细胞中的生理作用和信号转导途径;第二部分探讨肝配蛋白A5的全基因组效应;第三部分分析鼠源肝配蛋白A5及其受体蛋白结构。
  实验Ⅰ:肝配蛋白A5对小鼠原代颗粒细胞凋亡和增殖的调控作用及新的信号通路
  最新研究结果表明,肝配蛋白A5除了作为神经发生因子发挥生理作用外,还在雌性小鼠繁殖过程中具有重要生物学作用,但在颗粒细胞(GC)中的生物学作用尚不清楚。GC是研究卵泡发育基因功能和调控网络的理想模型。本研究结果表明,肝配蛋白A5的表达在各年龄组小鼠GC中有差异。干扰肝配蛋白A5基因引起mRNA水平和蛋白质水平表达下调,同时抑制E游受体EphA5、Epha3、Epha8和Ephb2的mRNA表达。在体外水平,肝配蛋白A5的下调表达抑制小鼠GC细胞凋亡过程。为了揭示肝配蛋白A5在调控GC凋亡中的作用,本研究进一步分析凋亡因子mRNA和蛋白水平的表达情况,发现Bax、Tnfα、Caspase-8和Caspase-3表达下调,而Bcl-2表达上调。这些结果表明,肝配蛋白A5通过Caspase-8介导的内源性途径参与细胞凋亡。进一步敲低肝配蛋白A5的表达水平,引起Pcna表达上调,随后激活p-Akt和p-ERK途径来,促进GC增殖。此外,抑制肝配蛋白A5可增强BMH15、VEGFA和雌二醇mRNA表达水平,并且在不影响孕酮表达水平的情况下抑制GDF9表达,说明其参与卵泡血管生成和卵母细胞发育调控。综上所述,肝配蛋白A5调节雌性小鼠卵泡颗粒细胞凋亡、增殖和类固醇生成过程,因此是雌性生育障碍的潜在治疗靶标。
  实验Ⅱ:小鼠颗粒细胞肝配蛋白A5干扰后的转录组分析
  肝配蛋白A5是一种肝配蛋白-乙二醇苯醚(ephrin-Eph)信号分子,主要是神经元因子。但最近的研究表明其生理作用超过了神经发生,其在雌性生殖功能中尤其在卵泡发育中的作用日益受到关注。肝配蛋白A5与繁殖相关的研究处于初始阶段,目前尚未从转录组水平报道肝配蛋白A5在卵巢颗粒细胞中的作用。本研究研究利用肝配蛋白A5的siRNA处理小鼠颗粒细胞,然后进行转录组测序(RNA-Seq),以探索肝配蛋白A5干扰后颗粒细胞的全基因组图谱。RNA-Seq分析结果表明,在小鼠颗粒细胞中检测到16389个基因,与阴性对照相比,siRNA处理的细胞中有208个基因失调。其中,149个基因下调,59个基因上调。失调的基因主要富集在细胞外过程、钙结合和细胞粘附。此外,它们主要参与了PI3K-Akt信号转导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局灶性粘附和Rap1信号转导途径等过程。总体而言,干扰肝配蛋白A5改变了调节卵泡发生的十多种基因的转录水平、调控网络和生物学过程。本研究为肝配蛋白A5在神经生物学外的雌性生殖中的作用研究提供了新的线索和研究思路。
  实验Ⅲ小鼠肝配蛋白A5及其受体的结构分析
  蛋白质结构对于细胞功能至关重要,因此结构的缺陷可能导致细胞功能紊乱。肝配蛋白A5受体属于介导细胞通讯过程中最大的一类酪氨酸激酶家族。通过NCBI和蛋白质资源数据库中检索肝配蛋白A5(Efna5)、肝配蛋白A5受体3(Epha3)、肝配蛋白A5受体5(Epha5)和肝配蛋白A5受体B2(Ephb2)的氨基酸序列,评价和鉴定其蛋白质结构并预测候选蛋白的三维(3D)结构。候选蛋白预测结构存在轻微的构象变化,采用ProSA软件3D分数进一步分析预测模型的精度。Efna5、Epha3、Epha5和Ephb2的Verify3D分数分别为92.75%、94.77%、89.87%和85.96%,说明预测模型结构在可接受质量范围内。蛋白质结果无序性分析表明Efna5、Ephb3和Ephb2分别存在32.89%、25.4%和27.07%的残基紊乱。配体结合位点分析结果表明,Efna5、Epha5、Epha3和Ephb2分别存在3、5、4和2个不同的氨基酸残疾数目的配体分子。此外,预测到候选蛋白非结合区的3个结合位点。距离波动分析发现一些氨基酸残基在下降和上升的波动中均存在。应用互相关函数进一步分析发现这些候选蛋白均存在突变结构。相互作用和通路分析发现鉴定的40个蛋白中有15个蛋白不属于肝配蛋白A5受体家族。CpG岛分析结果表明,候选靶蛋白存在甲基化位点,其中Ephb2预测分数最高。计算机模拟分析靶蛋白的3D结构,为进一步结构分析提供直观信息。此外,候选蛋白一些已经证实结合位点区域为分子嵌合和新药物分子设计提供有力的证据。
[硕士论文] 张杨
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:细丝蛋白B(Filamin B,FLNB)由第3号常染色体上的基因编码,是细胞骨架蛋白,它与肌动蛋白交联形成三维细胞骨架网络并维持细胞形态,在细胞中参与多种生理生化活动,包括转录调控和细胞增殖等。近年来的研究表明,细丝蛋白A和细丝蛋白B在肿瘤发生、骨骼疾病、细胞迁移以及粘附过程中起关键作用;本实验室以前的研究表明,细丝蛋白A(FLNA)能够抑制RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)指导的基因转录,并且通过细胞特异性的调节方式抑制RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)指导的基因转录,进而抑制细胞增殖。由于FLNB和FLNA都属于细丝蛋白家族,初级结构上具有80%的同源性,且在细胞内共定位,因此,在本课题中,我们试图了解FLNB是否也参与PolⅠ和PolⅢ基因转录过程并影响细胞的增殖和迁移功能。
  为了完成以上研究目标,首先,我们制备了FLNB shRNA慢病毒表达系统,利用制备的慢病毒表达颗粒侵染293T和HeLa细胞并筛选出FLNB shRNA稳定表达细胞系。利用RT-qPCR分析这些细胞系中PolⅠ和PolⅢ指导的基因转录,结果表明,FLNB敲低能够显著降低所检测的一部分基因的RNA表达水平;提示FLNB是PolⅠ和PolⅢ指导的基因转录所需要的。为了确定这一发现,利用293T和HeLa细胞过表达FLNB,结果表明,FLNB过表达显著增加核糖体RNA,U6snRNA以及7SL RNA表达水平。这些结果证明FLNB是维持PolⅠ和PolⅢ正常基因转录所必需的。由于FLNA敲低能促进细胞中PolⅠ和PolⅢ基因转录,因此,在FLNB敲低的基础上再次敲降FLNA是否挽救因FLNB敲低导致的基因表达抑制,利用FLNB-FLNA双敲低细胞系以及qPCR方法,数据表明,一部分受FLNB敲低抑制的基因的表达水平有不同程度的上调。这一结果提示FLNB与FLNA在调控PolⅠ和PolⅢ基因转录功能上起着相反的作用。
  由于PolⅠ和PolⅢ基因转录和细胞增殖密切相关,因此,我们试图确定FLNB表达水平的改变是否影响细胞增殖。通过对上述细胞株在不同时间进行细胞计数和MTT实验发现,FLNB敲低抑制细胞增殖,而FLNB过表达则促进细胞的增殖。FLNB是否调节细胞的迁移还不清楚,因此我们通过细胞划痕和Transwell实验分析FLNB表达水平的改变对上述细胞迁移能力的影响。结果表明,FLNB敲低抑制细胞迁移,而FLNB过表达促进细胞迁移。进一步对FLNA敲低细胞系及FLNB-FLNA双敲低细胞系的增殖和迁移功能的分析表明,在293T、HeLa细胞中,FLNA与FLNB在调控细胞增殖和迁移功能上起相反的作用;FLNA抑制细胞增殖和迁移,而FLNB促进细胞增殖和迁移。与FLNB敲低细胞系相比,虽然FLNB-FLNA双敲低细胞系的增殖水平表现出一定程度升高,但双敲低细胞系的迁移能力则表现出的下降趋势。这一结果显示,当同时敲低293T、HeLa细胞中的FLNB后再敲低FLNA,FLNA在细胞迁移方面起正调控作用,提示FLNA对细胞迁移的调节作用依赖于FLNB的表达。综合以上数据,本课题发现,FLNB是维持细胞PolⅠ和PolⅢ正常基因转录、细胞增殖和细胞迁移所必需的,而FLNA对细胞迁移的调节取决于FLNB是否表达。这些发现对我们进一步探索FLNB对基因转录和细胞迁移的调节机制奠定了基础。
[博士论文] 张浩
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:等离子体广泛存在于宇宙中。地球环境中也存在丰富的等离子体及现象,如雷电产生的等离子体、电离层、等离子体发射的极光等,这些环境等离子体对地球生态产生重要的影响。近年来人类的生产活动产生的等离子体日渐增多,不仅广泛用于工业(电子加工、材料、光源等)和在生产中产生(如高压长距离输电线路等),而且发展到用于农业、环境治理,且在生态环境和生物医学领域具有潜在的重要应用前景。
  大气压放电冷等离子体在室温状态下具有极高的化学活性、可在开放环境中工作,逐渐被应用于生物领域,如公共场所灭菌、空气净化、污水处理、生物育种、生物医学等领域,并成为目前等离子体在和生物、医学交叉学科的一个研究热点。在等离子体应用于生物、医学的初期研究首先从物理学层面研究不同类型的低温冷等离子体对多种微生物的杀灭效果以及对人体细胞的凋亡效应。一些研究者随后开始尝试从生物学角度探究等离子体的作用机理,并且普遍认为等离子体引起的活性氧(ROS)在等离子体诱导的多种生物学效应中起到关键作用。但关于等离子体与微生物和细胞之间的相互作用机制仍不清晰。现有研究中从分子水平探究等离子体作用机理的尝试很少,尤其是功能蛋白的结构变化、表达水平变化等方面的研究匮乏。基于目前的研究现状,本文从分子学角度初步探究等离子体与蛋白质、细菌和细胞之间的相互作用过程。一方面深入研究了冷等离子体对体外功能大分子的影响,给出可能的分子作用机制,另一方面探索等离子体对细胞内功能分子的影响,并初步从分子水平探究等离子体诱导的灭菌以及细胞凋亡的机制。
  第一部分,本文主要对低温等离子体诱导溶液中蛋白质的变性及相关机理进行了研究。本文选用乳酸脱氢酶(LDH)作为蛋白分子模型,利用介质阻挡放电等离子体,以氦+氧(0.5%)为工作气体,对乳酸脱氢酶溶液进行处理。通过检测等离子体引起的几种长寿命ROS的含量以及处理前后乳酸脱氢酶的活力和结构变化,分析了等离子体诱导乳酸脱氢酶变性的可能机理。实验结果表明一定剂量的等离子处理可以诱导体外生物功能蛋白发生部分变性,而且蛋白变性依赖于等离子体产生的ROS、尤其是长寿命ROS的作用。
  第二部分,本文探究了等离子体对膜蛋白和胞内可溶性蛋白的影响。该论文以膜蛋白YgaP和胞内蛋白Swc-7作为分子模型,通过基因重组和诱导表达技术,将模型蛋白在大肠杆菌内过度表达,并提纯等离子体处理前后的细菌内的模型蛋白,通过对模型蛋白的结构变化分析,证实了等离子体同样可以影响细菌体内生物分子的结构,且这种等离子体诱导的结构改变对放置时间存在依赖性,等离子体处理后,膜蛋白比胞内蛋白更早受到影响。另外通过分析等离子体对大肠杆菌的杀灭效率,我们推断出细菌膜蛋白的改变或损伤在等离子体诱导的灭菌过程中起主导作用。
  第三部分,本文探究了不同细胞周期阶段的HeLa和MCF-7细胞对低温等离子体的敏感差异性。结果表明等离子体可以诱导细胞形态变化、抑制增殖能力、促进凋亡,尤其S和M相的HeLa和MCF-7细胞比G1和G2相细胞更易受到等离子体的损伤;蛋白质表达水平分析结果等离子体诱导的S和M相的HeLa和MCF-7细胞凋亡受caspase家族蛋白的调控。另外,等离子体处理可以诱导不同周期阶段的HeLa和MCF-7细胞内ROS积累,而ROS清除剂NAC可以显著抑制等离子体诱导的ROS生成,并减弱等离子体的抗癌效应。
[硕士论文] 查双凤
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:整合素是脊椎动物细胞表面一类非常重要的细胞黏着分子,由α、β两个亚基构成。整合素通过与胞内骨架蛋白的相互作用介导细胞与胞外基质间的黏着。整合素不仅是细胞外基质与细胞内骨架之间的物理连接桥梁,同时是细胞信号转导中的重要组分。由整合素介导完成的一系列信号事件是细胞了解环境并作出反应的重要途径之一。Talin蛋白是重要的整合素激活因子,能够结合并激活整合素。同时作为连接细胞骨架与跨膜受体整合素的桥梁,在细胞粘附、迁移等过程中发挥着关键的调控作用。
  此研究是在实验室前期研究的基础上进行的延伸和拓展。实验室研究组在2012年解析了Talin-F2F3/R9复合物晶体结构。该结构显示,在自抑制状态下,Talin上的整合素结合位点F3与其尾部片段R9(1654-1822 a.a.)结合,此时整合素不能被活化。这一自抑制复合物结构为我们认识Talin的自抑制调控机制提供了新的视角,但是仍然无法揭示Talin自抑制状态下的全长结构。
  作为一个270 kD的蛋白,Talin除了F3和R9以外的部分在自身的活化过程中如何协同发挥作用,至今仍是未知的。此外,Talin蛋白可以通过C端最后一个α螺旋形成二聚体,而Talin蛋白到底是单体内自抑制还是二体内的两个分子互相抑制,目前不清楚。我们从体外重组表达和天然组织提取两个方面着手,以获得高质量的Talin蛋白样品。考虑到Talin蛋白整体难于结晶,我们尝试结合负染色技术和冷冻电镜三维重构的方法,获得Tlin蛋白处于自抑制状态下的整体结构。原核表达的Talin蛋白在负染电镜下观察蛋白状态不均一。我们通过结合生物交联剂和密度梯度离心的方法,蛋白状态的均一性得到了很大程度的提高,负染电镜图片质量较高,且图像衬度高,蛋白颗粒明显。但遗憾的是并未得到高质量的冷冻电镜图片。天然组织提取方面,我们采用硫酸铵沉淀法将大量粗制剂中的部分目的蛋白沉淀下来。再结合各种分离能力不同的阴离子交换柱、分子筛、疏水柱、阳离子交换柱,最终得到了较为纯净的Talin蛋白样品,负染电镜下能够看到蛋白颗粒。
[博士论文] 杨玲娜
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:特异性的RNA-蛋白质相互作用在基因表达调控过程中扮演着重要的角色,包括转录的调控,RNA加工和运输,mRNA降解和翻译的调控等。RNA结合蛋白通常都是通过RNA结合结构域来与他们的RNA靶标发生相互作用。主要的RNA结合结构域包括双链RNA结合结构域(dsRBD),RNA识别基序(RRM),锌指(ZnF)以及核不均一核糖核酸蛋白K同源结构域(KH)等。
  KH结构域最早是在核不均一核糖核酸蛋白K中发现的。KH结构域广泛存在生物三域系统中,也是最丰富的RNA结合结构域之一。KH结构域通常都是以多重拷贝的形式存在于同一个蛋白质中,共同识别RNA靶标。这种串联识别RNA靶标的方式不仅可以提高蛋白质-核酸的结合亲和力,还可以提高识别特异性。KH结构域大约由70个氨基酸残基组成,这些氨基酸残基折叠形成三段α螺旋和一个由三个反平行的β-strand的β-sheet,并且这个β-sheet位于三段α螺旋的相对面。根据拓扑学排列的不同,KH结构域可以分为Ⅰ型和Ⅱ型两类,分别存在于真核生物蛋白质中和原核生物蛋白质中。Ⅰ型和Ⅱ型KH结构域都会形成一个疏水的裂缝,可以容纳4个非配对的核苷酸。根据文献报道知道,包含KH结构域的蛋白质行驶多种多样的细胞功能,并且蛋白质的KH结构域与RNA靶标之间的识别是其发挥调控功能的保证。
  线虫MEX-3蛋白质包含两个KH结构域,是包含KH结构域的蛋白质家族成员之一。根据文献报道,MEX-3是线虫早期胚胎正常发育和保持生殖细胞全能性所必需的。随后,在人和鼠中也发现了线虫MEX-3的同源蛋白质(MEX-3A,-3B,-3C和-3D)。哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,都含有两个RNA结合的KH结构域,除此之外,他们的C端还包含一个具有E3泛素蛋白连接酶活性的RING结构域。这四个哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,参与许多转录后调控。其中,MEX-3C已经被证明了与许多疾病的发生相关,包括高血压,能量代谢,免疫应答和癌症等。虽然许多研究证明了MEX-3C参与许多mRNA的翻译调控,但是MEX-3C是直接地或者间接地结合其RNA靶标并不清楚。在报道的MEX-3C调控的mRNA中,HLA-A2mRNA是目前唯一被证明了的与MEX-3C直接结合的mRNA。MEX-3C结合HLA-A2mRNA的3'非编码区,抑制该mRNA的翻译,此外,当RING结构域存在时,MEX-3C的结合还会诱导HLA-A2mRNA发生降解。然而,对于MEX-3C抑制mRNA翻译和诱发mRNA降解的分子机制,以及MEX-3C识别的RNA序列特异性并不清楚,需要进一步研究。
  在本论文工作中,我们解析了人源MEX-3C KH1-GUUUAG和KH2-CAGAGU两个复合物的晶体结构。基于结构分析,我们构建了一系列蛋白质丙氨酸突变体,通过等温量热滴定实验揭示了稳定RNA-蛋白质相互作用的关键的氨基酸残基。此外,我们还鉴定了MEX-3C KH结构域识别的RNA基序(hMRE),并且证明了HLA-A2mRNA的3'非编码区中含有该RNA基序。最后,通过荧光偏振实验,我们证明了人源MEX-3C K同源结构域可以高亲和力地结合存在于HLA-A2mRNA的3'非编码区的hMRE。
[硕士论文] 万定云
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:生物体由蛋白质、DNA、RNA等生物大分子组成,这些生物大分子在生物体各种调控通路中相辅相成,共同维持生命体的正常运转。它们主要通过DNA与RNA、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质相互作用进行生物信息的传递,最终完成生物体的一系列活动。
  其中,秀丽隐杆线虫MEX-3蛋白质的KH结构域与拟南芥PUF类蛋白质APUM5都是通过与mRNA的3'不翻译区相互作用,进而激活或抑制mRNA的翻译过程,调控整个生命进程。而斑马鱼精氨酸甲基转移酶PRMT9通过修饰某些蛋白质精氨酸的甲基化,使甲基化的蛋白质某种功能被激活或被抑制,进而影响生物体一系列下游调控过程。
  MEX-3蛋白质在秀丽隐杆线虫的P granule中被发现,具有串联的KH结构域,它通过结合RNA调控生殖细胞系全能干细胞的更新及早期胚胎发生时期细胞的分化。PUF类蛋白质存在于多种生物体中,拟南芥APUM5通过其PUF结构域结合病毒基因组从而实现自我防御的功能。而精氨酸甲基转移酶PRMT9通过甲基化剪接因子参与选择性剪接的相关调控。通过研究蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质作用的结构基础,能帮助我们进一步的了解生物体中各种调控过程的分子机制。
  我们主要利用大肠杆菌体外表达了秀丽隐杆线虫MEX-3 KH结构域、拟南芥APUM5 PUF结构域,昆虫细胞体内表达了精氨酸甲基转移酶PRMT9。通过NTA亲和层析柱、Hiload 16/60 Supdex 75/200、MonoS/Q等分离纯化手段获得纯度较高、状态良好的目的蛋白质。同时,我们也使用了核磁共振技术、动态光散射实验观测蛋白质状态。并采用等温滴定量热法验证了目的蛋白质与RNA的相互作用,由pull down实验验证了精氨酸甲基转移酶与SF3B2剪辑因子的相互作用。最后,通过晶体学实验筛选到拟南芥APUM5 PUF类蛋白质与烟草黄瓜花叶病毒的3 'UTR区RNA序列的晶体,但是由于晶体较小,分辨率较低,目前正在优化中。
[博士论文] 杨帆
生理学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:G蛋白偶联受体(GPCR)可以通过G蛋白及Arrestin将细胞外的刺激转变为细胞内信号。在这个过程中,G蛋白主要是通过调节细胞内第二信使的水平来发挥作用的;而Arrestin则是通过招募不同的下游蛋白,使受体发生脱敏或启动Arrestin自身的信号转导途径。最近的一些研究发现,GPCR的C末端磷酸化短肽或者是GPCR受体与Arrestin结合后都能够引起Arrestin发生较大的构象变化。在最近解析出的V2R受体磷酸化的C末端短肽(V2Rpp)与β-arrestin-1的复合物晶体结构中发现,V2Rpp的结合能够导致β-arrestin-1的N端结构域和C端结构域发生较大的旋转。通过电镜技术和氢氘交换质谱方法发现,当β2AR与β-arrestin-1结合后同样可以促使Arrestin发生较大构象变化。这些研究暗示Arrestin结构上的可塑性可能是其发挥不同功能的基础。
  然而该研究领域仍有一些重要的问题至今没有得到解决。其中,介导GPCR下游信号途径的关键因子只有20个G蛋白和4个Arrestin分子,它们是如何实现人类基因组所编码的800多个G蛋白偶联受体所具有的显著不同的功能?
  在本文的研究中,利用基因密码子扩展技术和19F-NMR方法研究了Arrestin与GPCR的C末端磷酸化短肽的相互作用,提出了Arrestin对GPCR的磷酸化编码的识别机制。首先,应用基因密码子扩展技术,把非天然氨基酸F2Y插入到Arrestin的七个特异结构位置和潜在的磷酸基团结合区域。19F-NMR位移变化和体外体内实验证明Arrestin能够通过其特有的、包括至少10个潜在的磷酸根结合位点的磷酸根结合凹槽来识别受体的磷酸化编码。研究发现不同的磷酸化编码模式能够产生不同的构像变化,从而引起不同的生物学效应。GRK2磷酸化的β2AR的C末端短肽可以和Arrestin上的磷酸根结合位点1-4-6-7结合,导致其发生构象变化,这种构象变化可以特异的招募网格蛋白Clathin,进而介导受体发生内吞。GRK6磷酸化的β2AR的C末端短肽可以和Arrestin上的1-5磷酸根结合位点发生相互作用,导致其发生构象变化,而这种构象可以特异招募下游的SRC蛋白。Arrestin通过其磷酸化结合位点来识别受体不同的磷酸化花样,引起自身的构象变化,并且将这种构象变化转换成不同的细胞功能。
  因此,提出了受体磷酸化编码的笛子模型:受体的磷酸化编码花样可以通过与Arrestin的10个磷酸化位点特异性的结合,就像手指按在笛子的孔上,不同的磷酸化组合可以带来不同的手指组合,从而形成特异的音符,并引起Arrestin的特异性构型变化。考虑到10个磷酸化位点的组合可以带来超过1000种变化(210-1=1023),这样受体C末端不同的磷酸化花样就可以引起超过1000种Arrestin的特异性构型,从而可以行使超过1000种功能。
[硕士论文] 洪海燕
计算机技术 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质是组成生物体的一切细胞、组织的重要成分,是生命的物质基础。蛋白质参与了机体的所有重要组成部分。一般来说,将蛋白质经过基因剔除式突变并将其移除后造成了生物体的功能丧失,并使生物体致病甚至无法生存,该蛋白质即为关键蛋白质。由于生物体的存活和后代的繁衍都离不开关键蛋白质,因此生命科学中一项重要的研究内容就是识别关键蛋白质。本文在蛋白质相互作用(PPI)网络拓扑结构的基础上,将融合多源生物信息来预测关键蛋白质,主要内容包括以下三个方面:
  (1)提出了基于改进的PageRank算法EPP(Essential Proteins Predict)识别关键蛋白质。该算法将PPI网络看成是一个不确定的、顶点带有属性的网络,然后在该网络中将重要性排名在前P%的顶点作为关键蛋白质。该方法首先需要计算顶点(即蛋白质)间的相似度,对于相似度的计算,我们综合考虑了蛋白质的可信度及语义相似度信息;其次,对于PPI网络中的每一个顶点我们还考虑了顶点的邻居信息,即计算它的邻域相似度;最后利用上述提出的可信度及语义相似度来计算顶点的重要性。本文提出的算法综合考虑了PPI网络的拓扑信息和蛋白质的生物信息,因此具有复杂度低、识别准确率高的优点。我们利用标准数据集进行测试,实验结果表明,所提出的算法能更准确地识别出更多的关键蛋白质。
  (2)提出了基于改进的PSO算法EPPSO(Essential Protein PSO)识别关键蛋白质。在该算法中,我们提出了衡量top-p关键蛋白质的整体性指标,而不是评估蛋白质关键性的单个指标。EPPSO算法采用选取候选解的方法,每一个候选解含有P个蛋白质,我们整体度量这P个蛋白质的关键性即可。对于整体关键性,我们采用这些蛋白质与其他蛋白质间的联系的紧密度来衡量,即为算法中提出的适应度函数。然后根据粒子群的算法思想,通过跟踪全局最优值及个体最优值来更新该函数。为了评估算法的性能,我们在酵母数据集等标准数据集上运行该算法,实验结果表明与其他经典算法相比,本文算法识别准确率明显优于其他方法。此外,由于本文算法只需识别出P个关键蛋白质即可,而不必根据某种指标逐个计算每个蛋白质的关键性,因此具有较低的计算量。
  (3)在以上工作的基础上,本文设计了一个基于WEB的在线关键蛋白质识别系统。该系统可以把预测的结果通过图形化的方式体现在系统上,方便高效。经测试该系统运行稳定,界面美观,具有良好的经济价值和社会价值。
[硕士论文] 邱艳姿
软件工程 湘潭大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质作为全部生命的物质基础,在生命科学研究中占据着重要的位置。其中,它的结构和功能是重点关注的两个方面。蛋白质相互作用的过程与这两方面都息息相关。因此,对此过程的研究显得十分必要。在蛋白质相互作用界面上聚集着大量的残基,其中一小部分对界面的功能来说至关重要,称为热点残基。预测界面上的热点残基可以进一步揭示蛋白质之间相互作用的本质。同时,也有助于我们更透彻的理解蛋白质的结构和功能。
  在本文中,我们根据前人的相关文献,并在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,简称PDB)中获得实验所需的训练集和单独的测试集数据。预测残基的传统生物学方法主要是丙氨酸扫描突变技术,该方法比较复杂,代价较高并且比较耗时,所以不适用于大规模的使用。近年来,研究人员基于一些高效的数据挖掘处理和学习算法,提出了热点残基的多种预测方法,这些方法统称为计算方法。如何选取有效的残基特征,是使用计算方法进行残基预测的重点研究对象。本文首先基于训练集数据,选取了62种蛋白质残基的结构信息特征属性值。并在此基础上设计了一个多步特征处理方法来提取有效特征,包括ReliefF特征选择算法,去除冗余以及选择重要特征的策略,最终确定15种特征作为重要的特征集合。然后基于极限学习机ELM学习算法,结合这15种特征的不同子集构建不同的预测模型。根据实验结果分析可确定ELM学习算法的最佳参数和最佳特征子集组合,其中最佳特征子集包括4种特征。最后根据所得到的最优参数,进而构建可以准确预测热点残基的预测模型,并在分类过程中引入投票策略对模型进行优化。为了验证本文的预测模型的有效性,我们对单独的测试集数据以及其他的案例数据进行实验预测。实验结果表明本文的预测模型能够对热点残基进行有效的分类,并较其他的模型具有更好的性能。
[硕士论文] 闫静
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在真核生物蛋白质翻译终止过程中,当三个终止密码子UAA、UAG和UGA中的一个到达核糖体A位点时,被第一类肽链释放因子eRF1识别,翻译过程终止,在第二类肽链释放因子eRF3的协同下完成新生肽链释放。在翻译终止过程中,第一类肽链释放因子eRF1利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和Y×C×××F模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。
  在本实验中,首先构建了四膜虫(Tetrahymena thermophilia)eRF1的N结构域与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1(Tt/Sc eRF1,Tt/Sp eRF1)。利用双荧光素酶报告体系检测结果证实,两种杂合的eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1识别终止密码子UGA,而不识别UAA和UAG终止密码子,与四膜虫eRF1一致,表现出了密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是1.98%、3.83%、11.04%);而Tt/Sp eRF1可以识别三个终止密码子,无密码子识别特异性(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别是2.81%、2.01%、1.88%)。由此说明四膜虫eRF1的N结构域不是决定其识别特异性的唯一因子,在eRF1的M和C结构域中可能存在决定eRF1识别性质的元件或细胞中其它因子可能通过M和C结构域参与eRF1识别终止密码子的过程。为解释这一现象,我们将Sp eRF1的C端小结构域中氨基酸进行突变,选择了其中的第357、361、364和367位的氨基酸突变为酿酒酵母eRF1相应的位点,得到一系列的突变体(Tt/Sp eRF1 A364Q、Tt/Sp eRF1 D361A/A364Q、 Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q、 Tt/Sp eRF1 L357A/D361A/A364Q/E367D)。同样也将裂殖酵母eRF1的364、367和371位氨基酸引入酿酒酵母eRF1,得到突变体Tt/Sc eRF1 Q364A、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E、Tt/Sc eRF1 Q364A/D367E/E371S。结果显示,所有的突变体对UGA的识别效率没有明显的变化,但是Tt/Sp eRF1的突变体对UAG和UAA的通读效率显著提高,说明其对这两个密码子的识别效率降低。而Tt/Sc eRF1的突变体,对终止密码子识别活性的影响不显著,其对UAG的识别活性稍有提高,通读效率从5.77%降至2.98%,以上结果表明C端小结构域影响到eRF1对UAG和UAA密码子的识别活性。为了进一步分析小结构域对识别活性的影响,通过对小结构域的蛋白结构分析发现在其结构域中存在关键的、多变的Loop(357~367aa)结构,因此我们将裂殖酵母和四膜虫eRF1小结构域中的Loop结构引入到杂合的Tt/Sc eRF1中。分析结果显示,引入两种不同Loop结构到Tt/Sc eRF1嵌合体中,均可识别三个终止密码子,说明Loop结构显著的影响终止密码子的识别活性。由此表明,四膜虫eRF1的N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,也说明eRF1的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。
  从以上实验结果推测,是否酿酒酵母第二类肽链释放因子与两种酵母的嵌合体eRF1相互作用的效率不同,导致两个嵌合体识别终止密码子的效率和功能发生了改变。因此,在本实验中,将克隆得到的四膜虫eRF1嵌合体和裂殖酵母Sp eRF1以及酿酒酵母两类肽链释放因子Sc eRF1和Sc eRF3的基因,分别连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中,得到的重组质粒共转化到酵母菌株AH109。酵母双杂交结果证实四膜虫eRF1嵌合体(Tt/Sc eRF1/Tt/Sp eRF1)、功能Sp eRF1、Sc eRF1和Sc eRF3均存在相互作用关系,说明无论在何种细胞中,蛋白质翻译终止过程都需要两类肽链释放因子的协同作用来完成。排除了酿酒酵母细胞中嵌合体eRF1识别终止密码子的性质和活性的差异是由于Sc eRF3与嵌合体eRF1相互作用的效率不同而引起的。
  为了进一步验证N端结构域识别终止密码子的活性受到C端结构域的影响,我们通过双荧光分子互补实验(BiFC)证实eRF1功能的主要调控因素是其N端结构域与C端结构域在分子内发生的相互作用引起的。通过克隆得到四膜虫eRF1的N结构域,C结构域、酿酒酵母eRF1的C结构域和裂殖酵母eRF1的C结构域及其突变体(Sp-C A364Q、Sp-C D364A/A364Q、Sp-C L357A/D364A/A364Q)的基因,分别连接到表达载体pQE-30和pET-28a中。结果表明四膜虫eRF1的N结构域与不同的C结构域以及突变体在体内都可发生相互作用,说明C端结构域通过与N端结构域的分子内相互作用,影响终止密码子的识别活性;也进一步证实了C端结构域参与了密码子的识别过程。
  综合以上结果表明,四膜虫eRF1的N端结构域不是其识别终止密码子的唯一因子,C端结构域在一定程度上影响并决定了eRF1对终止密码子是别的特异性。本研究结果,旨在为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供数据支持。
[硕士论文] 张刚
计算机技术 北京交通大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质功能模块是通过相互作用或一起执行某个特定的分子功能的蛋白质组,对其探究有助于了解细胞进程,生命活动和疾病机理。识别蛋白质功能模块是蛋白质组学领域中一个非常热门的研究方向,通过计算方法进行蛋白质模块识别既可以节省大量的时间和资源,还能给出潜在的功能模块。
  目前基于计算方法的蛋白质功能模块检测方法可以分为两类:有监督的和无监督的检测方法。大多数的无监督方法认为蛋白质功能模块存在于PPI网络图中比较密集的区域。有监督的方法则通过参考数据集的信息特征训练分类模型来指导功能模块的识别,但是特征提取的不充分和PPI数据的噪声都会导致分类模型不准确。本文首先提出了一个基于逻辑回归分类模型和局部结构信息的打分函数。训练分类模型时,通过选取24个特征来提高分类模型的准确度。将分类模型和局部结构信息结合以降低PPI数据噪声所带来的负面影响。最后,基于该打分函数设计了新的功能模块检测算法。
  在四个大规模酵母数据集上与经典的无监督检测方法进行了对比实验,实验结果表明本文提出的算法在MMR值得分上高于其它算法,综合得分大多数情况下也高于其他算法。还在五个酵母数据集上与经典的有监督检测方法进行了对比实验,实验结果表明本文提出的算法得分仅次于ClusterEPs算法。最后,GO分析的结果表明本文提出的算法可以预测到潜在的蛋白质功能模块。
[硕士论文] 岳艺
药学 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:酶的级联反应往往需要多种酶以不同比例协同作用,但是目前多酶共固定的研究较少,控制多酶固定顺序及比例的研究更为少见。本文旨在开发一种体外比例可控且定序固定多酶的方法。
  本文选择核壳式纳米磁球作为固定载体,一种是Fe3O4/PVIM-Ni2+,其表面的镍离子可以和His标签特异性结合;一种是Fe3O4-Au,其表面的金粒子可以和硫醇共价结合。我们设计了两类支架蛋白:Ⅰ类支架蛋白含有His标签、硫醇基和olpB黏合域(1~7个不等),一方面可与纳米磁性微球结合,另一方面根据黏合域和相应锚定域(docCipA)之间的特异性结合作用可固定融合了锚定域的蛋白(本文选用绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白DsRed为模型来进行研究)。Ⅰ类支架蛋白的单酶多层固定表明:荧光蛋白的负载量随着支架蛋白上结合位点的增多先增加后减少,当结合位点为四个时达到最大值(0.937μmol/g)。
  Ⅱ类支架蛋白具有His标签和两种黏合域A和C,分别和锚定域docA、docC结合,设计不同数量和位置的A和C得到多个支架蛋白,对两种融合了锚定域的荧光蛋白共固定后发现,固定不同荧光蛋白的摩尔计量比和相应黏合域的数量比基本一致。支架蛋白上黏合域的个数越多,蛋白越难表达,综合考虑本文选用具有三个结合位点的支架蛋白ACA和CAC进行定序可控固定双荧光蛋白的研究,按不同比例混合以上两种支架蛋白,定序固定的双荧光蛋白摩尔计量比从1∶3渐变到7∶4,最大负载量可达0.831μmol/g。
[硕士论文] 张成晨
生物化学与分子生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:目前,临床治疗癌症的主要方式是放疗,化疗和手术切除等。在临床实践中化疗遇到了以下瓶颈,以广谱抗肿瘤药阿霉素(Doxorubicin, Dox)为例,这种小分子药物注射后在血液循环过程中可以穿透血管壁,自由扩散进入非肿瘤区域的正常组织,因而也会对正常组织产生毒性的作用。化疗的另一瓶颈是长时间使用药物而产生的多药耐药性。目前研究普遍认为细胞膜表面高表达的三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP binding cassette transporter, ABC)是细胞产生耐药性的主要原因,其中 P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的作用最为主要。当药物进入细胞后,P-糖蛋白在 ATP供能的情况下会将药物泵出细胞膜,使细胞内的药物量减少,从而不足以产生对细胞的杀伤作用,因而产生多药耐药性。基于此,在本课题的研究中,我们采用嵌段共聚物聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)为载药的骨架材料,制备了一种生物相容性好的聚合物纳米胶束,携带化疗药物阿霉素与 P-糖蛋白抑制剂依克立达(Elacridar, Ela),通过在纳米胶束表面修饰叶酸受体靶向的叶酸分子和荧光成像功能的 Cy7荧光分子,成功构筑了一种兼具协同治疗与荧光成像的多功能化靶向纳米胶束(FA/Cy7-MCs(Dox/Ela)),可用于成像引导的肿瘤治疗。
  本论文研究结果表明,共载 Dox与 Ela并修饰 FA与 Cy7的FA/Cy7-MCs(Dox/Ela)纳米胶束在体内外均有很好的抗耐药肿瘤作用,并能实现对肿瘤部位和药物分布的实时监控,有望成为一种应用于临床的多功能聚合物纳米复合药物,实现对耐药肿瘤的高效诊断和治疗。
[硕士论文] 杨洋
生物化学与分子生物学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨去泛素化酶OTUD5对PIF1蛋白的调控机制。已知OTUD5与PIF1存在有相互作用关系,OTUD5是否对PIF1发挥重要的作用尚不清楚,所以本课题将围绕OTUD5对PIF1的调控机制进行研究,进一步探索作为OUT家族重要成员OTUD5对PIF1的调控是否有重要的功能。
  方法:
  利用Western blot实验检测OTUD5过表达后内源及外源表达的PIF1蛋白的变化。采用RNA干扰技术敲低OTUD5检测外源表达的PIF1蛋白的变化。采用实时定量PCR(RT-PCR)检测OTUD5过表达或敲低对 PIF1mRNA水平的影响,探讨 OTUD5对 PIF1转录水平的调节。利用半寿期实验检测OTUD5过表达后PIF1的降解速率,探讨OTUD5对PIF1蛋白稳定性的调节。运用泛素化实验检测OTUD5过表达或敲低对PIF1蛋白的泛素化的影响,探讨OTUD5对PIF1表达的调节作用。体外泛素化实验检测OTUD5过表达对PIF1全长蛋白及PIF1C截短体的去泛素化作用,判断PINT结构域在OTUD5去泛素化中的作用。
  结果:
  ⑴过表达OTUD5增加内源PIF1及外源表达PIF1蛋白含量。⑵敲低OTUD5降低外源表达的PIF1蛋白含量。⑶过表达OTUD5增加PIF1蛋白半寿期,但过表达或敲低OTUD5对PIF1mRNA没有影响。⑷过表达OTUD5降低PIF1蛋白的泛素化水平,敲低OTUD5增加了PIF1泛素化水平。⑸PINT结构域缺失抑制了OTUD5对PIF1的去泛素化作用。
  结论:
  OTUD5通过与PIF1蛋白PINT结构域结合去泛素化PIF1增加PIF1蛋白稳定性。
[硕士论文] 刘素美
材料工程 太原理工大学 2017(学位年度)
摘要:家蚕丝素蛋白是一类有着独特的氨基酸组成和结晶结构的动物蛋白,因具有良好的生物相容性、优异的机械性能、无毒和可生物降解等特点而广泛的应用于生物医学、光学和组织工程等领域。以再生丝素蛋白或重组丝蛋白溶液作为原材料,通过仿生的绿色化学方法获取高性能、多功能的丝基材料是实现丝素蛋白应用的基础。丝素蛋白在水溶液中的自组装机理对于深入了解其结构与功能之间的关系具有十分重要的指导意义。目前对丝素蛋白在水溶液中的组装过程和机制没有统一和清晰的认识,采用的研究方法也难以方便直观地监测自组装的过程。
  金纳米粒子具有与其形状、粒径和聚集程度相关的表面等离子共振效应,金纳米粒子发生聚集时会引发颗粒间的表面等离子耦合,表现出肉眼可见的红色到紫色或蓝色的变化。这种效应的应用逐渐发展成为以金纳米粒子为探针的比色检测方法,并应用于核酸、小分子和蛋白质等物质的比色检测。
  为此,本文提出了以金纳米粒子为探针研究丝素蛋白水溶液中组装行为的新思路。在家蚕丝素蛋白的整个序列中,高度重复的六肽单元GAGAGS能够形成反平行的β-折叠结构,进而构成丝蛋白的结晶区域,而另外一种六肽单元GAGAGY则有可能构成了其非结晶区。近年来以丝素蛋白序列中某些具有代表性的多肽序列作为简化模型来研究丝素蛋白的组装机理成为一种趋势。
  本文选用十四肽(GAGSGAGAGSGAGY,GY-14)和八肽(GAGAGAGY, GY-8)分别作为丝素蛋白晶区与非晶区的简化模型,并以多肽末端的酪氨酸原位还原的金纳米粒子作为固定在多肽模型上的探针。通过溶液颜色以及紫外吸收峰的改变,研究外源性因素对多肽溶液组装行为的影响规律,建立以金纳米粒子为探针研究多肽在水溶液中组装行为的方法。
  本文开展了以下研究:
  (1)金纳米粒子原位制备条件与性能之间关系的研究:分别以多肽GY-8和GY-14作为还原剂,原位还原氯金酸合成了稳定分散的球形金纳米粒子,并研究了多肽与氯金酸的配比、溶液 pH和温度等不同制备条件对金纳米粒子形态、分布以及稳定性的影响。通过紫外-可见吸收光谱和透射电镜表征确定了最佳的制备条件:以多肽GY-8为还原剂时,多肽与氯金酸摩尔比为5:2,pH为9,温度为40℃;以多肽GY-14为还原剂时,多肽与氯金酸摩尔比为1:1,pH为7,温度为35℃。
  (2)以金纳米粒子为探针对多肽水溶液组装行为的研究。分别研究了多肽GY-14在 pH、金属离子浓度以及溶剂组成等外源性因素影响下的自组装行为,并应用紫外光谱、红外光谱、透射电镜和原子力显微镜等方法对组装规律以及组装结构进行了表征。结果表明:多肽GY-14在 pH4的酸性水溶液中构象由无规卷曲转变为β-折叠,溶液由红色变为紫色,紫外吸收峰红移。Ca2+的引入会诱导多肽构象发生转变,当离子浓度为5 mM和10 mM时,多肽自组装形成由粒子连接而成的串珠状的β-折叠结构,溶液分别由红色变为紫色和蓝色,吸收峰红移。异丙醇溶液的加入使得多肽从无规卷曲构象转变为β-折叠构象,同样形成串珠状组装体,溶液中出现紫色絮状物并在短时间内沉淀,紫外吸收峰基本消失。
  本文以金纳米粒子为探针,将多肽GY-14在水溶液中的组装行为通过溶液颜色的改变以及紫外吸收峰的移动表现出来,为研究多肽的溶液组装行为提供了一种简单直观的新途径,为进一步研究丝素蛋白构象转变机制和过程提供指导。
[硕士论文] 李睿祎
软件工程 西安电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质磷酸化是广泛存在的翻译后修饰之一,几乎涉及细胞内所有的生物过程,例如细胞代谢、细胞生长、细胞分化以及信号传导等。磷酸化修饰是指在激酶的催化作用下,将磷酸基团添加到底物蛋白上改变其结构及功能的过程。此外,磷酸化修饰位点的突变或增删等都有可能导致蛋白质功能异常,从而导致各种复杂疾病的发生,目前已经有一些激酶蛋白被当作药物靶标来治疗癌症。
  随着实验技术的发展,大量的磷酸化位点信息被挖掘出来,然而它们对应的蛋白质激酶信息却极度匮乏,而一些计算方法的出现在一定程度上促进了磷酸化位点所缺失激酶信息的查验。这些方法大部分都是基于磷酸化位点周围的序列信息,结合蛋白质的共表达、位置共现以及相互作用等特征,应用机器学习算法例如支持向量机、决策树、贝叶斯网络等实现磷酸化关系的预测。尽管已经取得了一定进展,但是这些方法的局限性在于它们在不同数据集上表现不一,预测精度和鲁棒性都有待进一步提高。因此,有必要开发新的计算方法研究磷酸化关系预测问题。
  在本文中,我们提出一个新的计算模型,命名为PhosD,进行磷酸化关系预测。研究表明,作为蛋白质上独立的结构和功能单元,蛋白质结构域往往更稳定和保守,可以表征所在蛋白质的很多属性。那么,被相同激酶磷酸化的底物蛋白是否会具有相似的蛋白质结构域特征值得探究。因此,本文提出一个生物假设:激酶是通过识别底物蛋白上的特异结构域单元来完成和底物蛋白的磷酸化反应。基于该假设,PhosD首先通过已知的磷酸化关系数据,提取并刻画激酶和蛋白质结构域之间的相互作用模式,而该模式就是PhosD进行磷酸化关系预测的基本特征;然后,对于一个特定的激酶,那些包含该激酶特异磷酸化结构域的蛋白质被当作候选底物蛋白,PhosD用一个适当的概率模型来衡量候选底物蛋白被该激酶磷酸化的可能性。最后,考虑到磷酸化过程在本质上是一种特殊的蛋白质相互作用,所以将丰富的蛋白质相互信息集成到PhosD模型中,进行一个“二次过滤”操作从而进一步优化预测结果。
  通过与现有常用的六种计算方法在四个不同的测试集上进行比较,PhosD都表现出更好的预测性能,尤其在预测精确率上显著高于其它方法。此外,进一步的结果分析得到了两个重要的结论:首先,激酶已知的磷酸化底物蛋白越多,越有助于学习模型的建立从而获得更好的预测性能;其次,我们发现相比较于只被一个激酶磷酸化的底物蛋白,被多个激酶磷酸化的底物蛋白,其所包含的磷酸化蛋白质结构域往往更保守,从而该类磷酸化关系更容易被预测出来。这两个结论的发现可以为其它磷酸化关系预测算法提供参考。最后,通过分析新预测得到的磷酸化关系在信号通路上所扮演的重要角色,我们进一步证明了PhosD的预测能力,同时也展示了磷酸化关系在信号传导过程中的生物意义。
[硕士论文] 刘锦
药学 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质广泛存在于体液中,可作为象征人体健康的标准,用作诊断的生物标记物。将被测蛋白质的对应识别分子引入检测体系,可作为响应机制的触发点。本文引入蛋白质诱导纳米粒子亲疏水性变化机制作为分子识别,疏水片段硼酸基团与ARS络合反应为信号导出,构建蛋白质检测机制。
  1.本文用点击化学反应合成末端具有生物素的大分子链转移试剂,通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合)调节投料比例,得到聚苯硼酸丙烯酰胺(PAAPBA)为疏水片段的三种不同嵌段比例的两亲性聚合物(Biotin-PEG-block-PAAPBA)。通过疏水相互作用,两亲性聚合物自组装形成100~300nm的纳米粒子,利用被识别蛋白质与纳米粒子外壳的识别分子结合,从而产生粒子整体亲疏水性平衡变化,粒子松散而使苯硼酸部分裸露,进而与ARS形成荧光生色团,作为检测信号导出方式,利用此纳米粒子检测模型蛋白链霉亲和素,检测限(LOD)可达32.50ng·mL-1。
  2.基于上述方案已实现的定量检测,本文进一步优化检测体系,建立可视化定性检测新机制。两亲性嵌段聚合物(B iotin-P EG-b lock-PAAPBA)与ARS先配位反应后,自组装可以形成黄色纳米粒子。在蛋白质影响粒子亲疏水性平衡的同时,引入环糊精分子作为外加刺激,并与疏水内核的硼酸-ARS络合物反应,竞争置换出游离的紫色ARS,促进粒子进一步瓦解,实现溶液颜色由黄到紫的转变。根据加入蛋白质的纳米粒子溶液与无蛋白质纳米粒子溶液的荧光发射信号差值作蛋白检测标准曲线,同时实现蛋白质的可视化定性和荧光定量检测,达到的检测限为5.85ng·mL-1,检测线性范围6.50ng·mL-1~1.95μg·mL-1。
[硕士论文] 王华谱
应用化学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:人体内胰岛素瘤相关蛋白1(INSM1)主要在神经内分泌系统的发育过程中表达,对神经内分泌系统的正常发育起到关键的调控作用。INSM1是一种含有锌指结构域的转录因子,这种结构域通过特定氨基酸残基与Zn2+结合而形成具有指状的空间构型。含有锌指结构域的蛋白广泛参生物体的基本生命活动,包括DNA复制、基因转录、mRNA剪切和翻译等生命过程的调控,在生物体生长发育、生理代谢以及疾病发生等过程中都具有非常重要的调控作用。INSM1蛋白含有510个氨基酸,其羧基端存在5个C2H2锌指结构域,能特异性识别含保守性序列的双链DNA。目前,INSM1中的各个锌指结构域的结构以及与序列特异性DNA的结合机理仍不清楚。
  为深入理解INSM1中的锌指结构域的结构特征,及其识别序列特异性的DNA,构建了包含不同序列的锌指结构域载体,包括ZF(1-5)、ZF(1-3)、ZF(2-3)和ZF(4-5)等,本论文聚焦在ZF(4-5)结构域的核磁共振(NMR)结构与功能研究。首先,通过表达纯化的条件优化,获得了高产、高纯和稳定的ZF(4-5)蛋白,并完成了15N/13C同位素标记蛋白的表达。对ZF(4-5)蛋白的表征分析显示,ZF(4-5)蛋白在研究条件下主要以单体形式存在。ZF(4-5)的2D1H-15N HSQC谱图信噪比高,两维化学位移分散好,谱峰强度均一,表明该蛋白具有良好的三维折叠,适合于NMR的结构解析。其次,应用NMR方法解析了ZF(4-5)蛋白在溶液中的三维结构。ZF(4-5)的每个锌指单元分别包含了一个ββα折叠结构,两个β-strand以反平行形成一个小的β-sheet。最后,应用NMR滴定研究了 ZF(4-5)与序列特异性DNA(5'-TG/TC/TC/TT/AGGGGG/TCG/A-3')的相互作用。NMR滴定实验观察到5个氨基酸残基的化学位移发生了明显扰动,表明该蛋白与这一序列特异性DNA的发生了相互作用。等温量热滴定(ITC)实验进一步证明ZF(4-5)蛋白与DNA的结合,该结合作用较弱(Kd~20μmol/L)。
  以上研究结果表明,在INSM1特异性结合DNA的过程中,ZF(4-5)尽管参与了序列特异性的DNA识别,但较弱的相互作用表明该结构域可能并不发挥主要的识别作用。INSM1中其它锌指的结构以及与DNA的相互作用还有待进一步研究。
[硕士论文] 张凯宇
生物信息学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  蛋白质-RNA相互作用(PRI)与基因表达调控等多种生物过程密切相关,是一种基本的生物大分子相互作用。例如,细菌调控sRNA(small RNA,小RNA)Csr B与其靶标蛋白Csr A等的结合可调控碳的摄入、细胞运动、生物膜形成、群落感应与细菌致病性等。在真核生物中,许多非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)可通过与蛋白质结合而发挥多种功能。因此,构建性能优异的PRI预测模型具有重要意义,将为实验研究PRI提供生物信息学支持。
  目前,PRI的生物信息学预测方法可分为四类,分别为结合RNA的蛋白质残基预测、结合蛋白质的RNA小片段预测、基于序列水平的PRI预测和基于结合位点水平的PRI预测。其中第一类模型,可以预测蛋白质序列中与RNA结合的残基,但缺点是无法找出与之结合的RNA序列或碱基。基于第二类模型,可以找出RNA序列中与蛋白质相互作用的RNA结构域信息,但不能轻易找出与之结合的蛋白。基于第三类模型,可以预测一个给定的蛋白与一个给定的RNA是否发生相互作用,但不能确定它们的结合位点。而第四类模型则可以确定蛋白-RNA相互作用的结合位点,缺点是假阳性率很高。因此,各类方法各有侧重,我们在系统分析上述四类模型的基础上,开展了第三类模型即基于序列水平的PRI研究,一方面,该项研究可以同时考虑蛋白与RNA序列,与前两类模型相比,目标更为明确。此外,该类模型的预测结果可以为第四类模型提供输入,有助于降低假阳性与提高预测效率。
  目前一般采用传统的机器学习方法构建序列水平的PRI预测模型。然而,在传统的机器学习方法中,需要深刻理解哪些特征与PRI有关,而且即使选择了正确的特征,也无法获知其权重;此外,模型在训练中容易过拟合,即特征和权重完全适用于训练集,但不能确保测试集具有相同性能。为克服以上局限,我们探索了深度学习方法中的CNN(Convolutional Neural Network,卷积神经网络)在PRI预测模型构建中的应用。我们所知,目前尚未见到基于深度学习的构建PRI预测模型的报道。
  方法:
  为构建PRI预测模型,我们首先构建分类器所需的训练集及测试集。截止到2017年2月6日,从PDB(Protein Data Bank,蛋白质数据库)中下载到分辨率不大于5.0?的蛋白质-RNA复合物数据1370例。对复合物数据进行长度(>30)、冗余(<50%)和相似性(<70%)等方面的过滤筛选,得到3761个蛋白质-RNA对,包括1432个蛋白质片断和765个RNA片段。我们将其作为阳性样本,即相互作用的蛋白质-RNA对。
  在上述复合物数据中,随机选取蛋白质和RNA片段,与阳性样本进行比对,去除相似性较高(>70%)的相互作用对,从而得到对应的阴性样本库。阴性样本数量约为阳性样本集的10倍,训练和测试时,采用随机抽取的方法,生成与阳性样本集相当的阴性样本数据集
  除此之外,我们还对三个常用数据集进行了测试。分别是数据集RPI2241、RPI369和RPI12737。其中RPI2241包括从PRIDB(Protein-RNA Interface Database,蛋白质-RNA相互作用数据库)中提取的2241个蛋白质-RNA对,RPI369数据集是RPI2241的子集去除了原数据集中的蛋白质-核糖体RNA复合物,包含369个蛋白质-RNA相互作用对,RPI12737数据集从NPInter V2.0数据库中提取,包括12737对实验证实的蛋白质-RNA对。对于每个蛋白质-RNA对,我们从序列和二级结构两个角度编码,对提取的特征进行RBM(Restricted Boltzmann Machine,受限玻尔兹曼机)变换,最终生成1024维的特征向量。
  基于训练集,我们采用深度学习中卷积神经网络的方法构建预测模型DLPRI。模型DLPRI共有7层,不包括输入。输入为32×32即1024维特征向量,滑动窗口大小为5×5。
  第一层C1为卷积层,有28×28个节点,设定有6个不同的C1层,每一个C1层内的权值是相同的。特征映射结构采用ReLU(Rectified Linear Unit)函数作为卷积网络的激活函数,使得特征映射具有位移不变性。
  第二层S2有14×14个节点,同样为6层,采取下采样的方法,C1层四个点对应着S2层一个点,作加权平均。每个特征图的大小是C1中特征图大小的1/4(行和列各1/2)。
  C3、S4同理,5-7层均为一维的全连接层。
  结果:
  首先,我们以数据集RPI3761为基础,采用十折交叉验证的方法(10-fold cross-validation),对模型进行了测试。该模型DLRPI在训练集上的平均分类精度达到96.7%,在测试集上的平均敏感性为91.2%,平均特异性为93.4%,敏感性和特异性均超过90%。
  然后,我们以整个数据集为基础构建模型DLRPI,然后以3个数据集RPI369、RPI2241和RPI12737为独立测试集来评价模型性能。由于我们构建的训练集RPI3761,同RPI369和RPI2241一样,均是来自PDB数据库,它们之间有一些重叠的样本。为客观评价模型性能,我们将数据集RPI369和 RPI2241中与RPI3761相同的样本去除;之后,利用模型DLRPI来预测余下的样本,其预测精度分别为73.2(RPI369)、86.7(RPI2241)和88.0(RPI12737)。结果表明,该模型在独立测试集上具有较高的预测精度,可以用于新样本即基于序列的蛋白-RNA相互作用预测研究,辅助实验验证。
  最后,我们以构造的数据集RPI3761以及多个公共数据集RPI369、RPI2241和RPI12737为基础,采用DLRPI与其它三种模型分别进行机器学习,通过十折交叉验证的方法,评估模型性能。分析结果表明,除了在RPI12737数据集上性能稍逊LPIHN模型,对于其他的测试集,DLRPI的预测性能均排名第一。结果表明,与其他已有模型模型相比,DLRPI提取的特征更具代表性,对于人们识别RPI的本质规律,可以起到一定的辅助与启发作用。
  结论:
  深度学习方法是近几年来最火热的机器学习方法,展现了强大的提取特征能力。目前尚没有基于深度学习算法在蛋白质-RNA相互作用上的应用研究。本文采用深度学习中的卷积神经网络方法,构建了预测模型DLRPI,在独立测试集上,与传统的机器方法相比具有更好的敏感性和特异性。这说明深度学习算法在处理蛋白质、RNA数据方面具有很好的适用性。
  下一步,我们将在更多的独立数据集上对模型进行测试。一方面,从PDB数据库得到的数据与体内真实的数据之间存在一定差别,模型需要反映体内真实生物学过程;另一方面,对于实验得到的新数据,DLRPI模型能够有怎样的预测精度还需要进一步的验证。然后,将所有已知的RPI数据作为训练集,构建模型,搭建蛋白质-RNA相互作用预测网络服务器,从而更好的为相关研究人员进行实验验证,提供技术支持。
  随着高通量技术的发展,产生了大量RPI相关的数据,但是PRI的作用机制仍然需要进一步探讨。我们讲对隐层中的特征表示进行深入的分析,希望能够揭示出RPI的作用机理。
  目前,人工智能在各行各业中得到广泛应用,但如何与军事医学相结合还有待于深入探索,为此,拟将掌握的深度学习技术与军事医学相结合,开展广泛的应用研究。
[硕士论文] 杨国栋
材料工程 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:淀粉样多肽的错误折叠与多种退行性疾病的致病机制密切相关,例如:阿兹海默氏病、帕金森病、II-型糖尿病、亨廷顿病。而其中,II-型糖尿病,也被称作非胰岛素依赖型糖尿病,是糖尿病最常见方式的一种,约占患者人数的90%以上。找到糖尿病的有效治疗或者控制方法是目前急需解决的重要问题。胰岛淀粉样多肽是一段包含有37个氨基酸残基的多肽链,研究表明,其形成的淀粉样在胰岛的沉积与 II-型糖尿病的发病有着密不可分的联系。H2N-SNNFGILSS-COOH(hIAPP20-29)是胰岛淀粉样多肽成纤维的核心片段,因此研究如何调控这段十个氨基酸的短肽序列的聚集,对于寻找有效治疗II-型糖尿病的方法具有重要的指导意义。本文利用光驱动卟啉分子成功地抑制了hIAPP20-29的自聚集以及降解了其自聚集形成的淀粉样纤维。并结合DCF荧光、PeakForce Quantitative Nanoscale Mechanical和UV光谱对其调控机理进行了合理的推测。这一发现对以后设计新的调控胰岛淀粉样多肽聚集的方法提供了一定的指导意义,同时也丰富了抑制剂的选择。
  本研究主要内容包括:⑴利用圆二色谱(circular dichroism, CD)、Thioflavin T荧光标记以及原子力显微镜(AFM)技术,对 hIAPP20-29自聚集的过程,二级结构的变化,以及聚集体形貌演变进行了表征分析。⑵系统的研究了光照、卟啉分子、光驱动卟啉分子以及其浓度变化对于调控胰岛淀粉样多肽聚集形貌及其力学性质的影响。结果表明光驱动卟啉分子可以有效地抑制hIAPP20-29的聚集,其形貌以及二级结构的变化受卟啉分子浓度的影响,发生从短纤维到膜状结构和β-折叠到无规卷曲的转变。其结构的杨氏模量随着卟啉分子浓度的提高逐渐增强,说明卟啉参与了多肽的自组装过程。Dichlorofluorescein光谱以及UV光谱测试表明了光刺激条件下的卟啉分子产生的 ROS破坏了多肽链之间氢键的相互作用,从而破坏了原有的自组装过程,而且光驱动卟啉分子抑制效果在无持续光照刺激下具有持续抑制作用。⑶利用光驱动卟啉分子进一步的降解了成熟的淀粉样多肽纤维表明光驱动卟啉分子具有降解成熟纤维的效果。
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