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[硕士论文] 李新新
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:糖基化修饰是生物体内最常见的一种蛋白质翻译后修饰,可以影响蛋白分泌、稳定性,以及免疫原性等生物学功能。自然界中真核微生物分泌大量糖苷水解酶用于降解植物多糖。这些糖苷水解酶经常发生N/O-糖基化修饰,从而影响酶的活性和稳定性。本论文中以来源于嗜热真菌篮状菌(Talaromyce leycettanus JCM12802)的β-葡萄糖苷酶bgl3A为研究材料,比较了该基因在三种真核表达系统(篮状菌,毕赤酵母和腐质霉)和一种原核表达系统(大肠杆菌)中不同程度糖基化修饰对酶学性质的影响。通过N/O-糖基化单点突变和毕赤酵母表达,初步分析了不同位点,不同类型糖基化修饰对酶的影响。主要研究结果如下:
  (1)四种重组Bgl3A的酶学性质比较
  β-葡萄糖苷酶Bg13A分别在四种系统中成功表达并纯化成单一蛋白。SDS-PAGE分析表明不同真核系统表达的重组Bgl3A存在不同程度的N-糖基化修饰和O-糖基化修饰,其中腐质霉表达系统中的糖基化修饰程度低于其他两种真核表达系统。酶学性质比较发现不同表达系统来源的重组Bgl3A性质差异较大,如pH稳定性(篮状菌>大肠杆菌>腐质霉>毕赤酵母)、纤维二糖催化效率(腐质霉,91s-1mM-1>毕赤酵母,89s-1mM-1>篮状菌,27s-1mM-1>大肠杆菌,12s-1mM-1)。结果表明不同系统表达酶蛋白存在不同程度的糖基化后修饰,这些糖基化后修饰对酶蛋白的性质有一定影响。
  (2)N-糖基化对β-葡萄糖苷酶Bgl3A酶学性质的影响
  通过定点突变构建N-糖基化突变体并进行酶学性质分析。突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到酶活力;突变体T44A和S299A的最适pH和温度没有改变,但二者的Tm值和70℃下的热稳定性都明显优于野生型。以纤维二糖为底物时,突变体T44A和S299A的催化效率基本不变。由此可知,N-糖基化主要影响Bgl3A的分泌和热稳定性,其中N226位点的N-糖基化在酶的折叠和分泌中起重要作用,且不同位点的N-糖基化修饰因其结构上的差异而导致了酶学性质的丰富性。
  (3)O-糖基化对β-葡萄糖苷酶Bgl3A酶学性质的影响
  同时构建O-糖基化突变体。与野生型相比,突变体的最适温度和pH均没有发生明显变化,但不同程度地拓宽了Bgl3A的pH稳定性,即T443A>T436A>T437A>WT。酶促反应动力学分析表明T443A对两种底物的催化能力明显降低,而突变体T436A和T437A对纤维二糖的催化效率具有一定的提高。结果表明T443位点的O-糖基化对维持Bgl3A的活性起到关键作用,而T436和T437位点的O-糖基化有可能影响到Bgl3A的三维结构,进而对催化效率起到一定作用。由于糖链与缓冲液相互作用,O-糖基化对Bgl3A的pH稳定性起到重要作用。
  本论文通过比较四种系统表达β-葡萄糖苷酶Bgl3A的酶学性质,初步得出不同糖基化对Bgl3A的性质影响不一。在毕赤酵母表达系统中,构建不同类型糖基化突变体并比较酶学性质,结果可知N-糖基化主要影响Bgl3A的催化效率,O-糖基化主要影响Bgl3A的pH稳定性。这一结论可为糖基化对β-葡萄糖苷酶Bgl3A影响机理的研究提供一定理论基础。
[硕士论文] 夏阳
模式识别与智能系统 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:针对基于生物电阻抗对人体腹部内脏(腹内)脂肪面积(VFA)的预测,本文采用基于半监督学习的ABC-SVR预测模型对人体腹内脂肪面积进行预测,以克服训练样本有限与标准值相关性不够高的问题。通过测试样本集进行标准差和相关性计算仿真实验,结果表明,该模型具有较强的非线性函数逼近,能有效对人体腹内脂肪面积的预测。
  论文的主要研究内容如下:
  1、构造了预测人体腹内脂肪面积的特征属性。通过将人体腹部等效为椭圆柱导体模型,给出了一种人体腹部生物电阻抗的测量方法,并定义了与人群类型有相关的特征属性,构成了以腹部总阻抗Zt、腹部皮下阻抗Zs、腰围值w、腹部宽度a、腹部厚度b,体质指数B、体脂肪率T、腰臀比Y八种特征的人体腹内脂肪面积预测模型的输入量特征。
  2、构建了一种人体腹内脂肪面积的ABC-SVR预测模型。通过改进的人工蜂群算法对人体腹内脂肪面积特征属性进行全局寻优训练,找出最优特征向量的解。对最优特征向量进行支持向量回归机拟合,获得人体腹内脂肪面积的ABC-SVR预测模型。
  3、给出了一种人体腹内脂肪面积预测模型的半监督学习算法。通过对新采集的未标记样本进行优化标记,通过半监督学习算法对添加的新标记样本与原有的标记样本对ABC-SVR预测模型进行重复训练,并通过与已建立的预测模型进行赤池信息量准则性能比较,获取新的最优预测模型,解决训练样本可不断增加和模型可重复训练的问题。
  4、选用经典的最小二乘回归模型和ABC-SVR模型作为本文的半监督学习ABC-SVR模型的对比模型,并通过测试样本集的预测与比较分析,本文方法是可行与有效性的。
  本文运用Matlab对基于半监督学习的人体腹内脂肪面积预测模型以及测试样本进行仿真实验,通过相关性和标准差的分析结果表明,本方法的改进效果明显。
[硕士论文] 马会芳
食品加工与安全 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:甘油磷脂是机体内含量最多的一类磷脂,它除了构成生物膜外,还是胆汁和膜表面活性物质等的成分之一,参与细胞膜对蛋白质的识别和信号传导,与许多代谢类疾病相关,如心血管病、高血压、糖尿病、肥胖病、神经性疾病、脂肪肝、冠心病和癌症等。甘油磷脂的基本结构是磷脂酸和与磷酸相连的取代基团,可以根据取代基团的不同又可以分为许多类别,其中较为重要的有:磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和磷脂酰甘油等。通过了解甘油磷脂在生物体内的代谢情况,以及在不同生理和病理状态下甘油磷脂组成和结构变化,进而可全面了解甘油磷脂在疾病发生和发展过程中发挥的重要作用。但甘油磷脂种类繁多,含量极低,且结构中缺少易电离的官能团,导致对甘油磷脂的鉴定和定量分析比较困难。利用化学衍生化技术对其进行结构修饰可以改善其色谱行为、显著提高质谱(MS)检测的灵敏度。MS与衍生化方法结合已被广泛用于在蛋白质,糖类及代谢物和许多其它的代谢物分析中。近年来,这一策略在脂质分析研究中引起了极大的兴趣。
  本课题以氨基磷脂为研究对象,结合化学衍生化技术、高效液相色谱和电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)技术相结合,开发了一种基于化学衍生化技术的氨基磷脂高选择性、高灵敏定性和定量分析方法研究,以突破现有技术在氨基磷脂分析检测中的技术瓶颈。本论文研究结果如下:
  1.本文建立了一种基于丙酮稳定同位素标记结合HPLC-MS技术的氨基磷脂定性和绝对定量分析方法。与未发生衍生化反应的氨基磷脂相比,还原烷基化反应后的磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)的灵敏度分别提高了8.13和15.71倍,且色谱柱的柱效也分别提高了4.41和10.18倍。此外,我们通过选择2种或3种d0-丙酮标记的标准品为内标建立校准曲线,可实现d6-丙酮标记的肝脏中的氨基磷脂的绝对定量分析,解决了氨基磷脂分析中的内标物缺乏和不同氨基磷脂的链长、不饱和度、浓度、溶剂组成以及仪器信号波动等因素造成的质谱响应的差别导致的定量难的瓶颈问题。最后,将上述建立的方法应用于高脂膳食喂养、含多酚高脂膳食喂养的大鼠肝脏中氨基磷脂的定性和定量分析,结合Lipid Maps和Lipid View数据库,在大鼠肝脏中共鉴定出48种PE和22种PS分子,应用多变量分析成功的找出了差异显著的PE和PS分子种类。相比高脂对照组,共有17种PE和PS的含量显著性增加;3种PE和PS的含量显著性降低。
  2.建立了基于直接进样技术(shotgun-ESI-MS)的甘油磷脂(PLs)和甘油三酯(TAG)的分析方法。对不同的饮食喂养(基础饲料喂养(Z;n=6)、高脂饲料喂养(C;n=6)、每千克高脂饲料添加200mg葡萄多酚喂养(S;n=6)、每千克高脂饲料添加200mg油菜多酚喂养(R;n=6)以及每千克高脂饲料添加混合的200mg葡萄多酚和200mg油菜多酚喂养(F;n=6))的大鼠肝脏样本中PLs和TAG分子种类进行了定性和定量分析。结合Lipid Maps和Lipid View数据库,在大鼠肝脏中的77种TAG、55种PC、49种PE、22种PS、13种PI和13种PG分子,应用多变量分析成功的找出了差异显著的脂质分子种类。分析了五组饲料喂养大鼠肝脏中的PLs和TAG分子种类和含量变化。结合多元统计分析方法,分析了不同食用油膳食的大鼠肝脏组织中PLs和TAG组分含量的变化和变化显著的PLs和TAG分子种类。
[硕士论文] 查双凤
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:整合素是脊椎动物细胞表面一类非常重要的细胞黏着分子,由α、β两个亚基构成。整合素通过与胞内骨架蛋白的相互作用介导细胞与胞外基质间的黏着。整合素不仅是细胞外基质与细胞内骨架之间的物理连接桥梁,同时是细胞信号转导中的重要组分。由整合素介导完成的一系列信号事件是细胞了解环境并作出反应的重要途径之一。Talin蛋白是重要的整合素激活因子,能够结合并激活整合素。同时作为连接细胞骨架与跨膜受体整合素的桥梁,在细胞粘附、迁移等过程中发挥着关键的调控作用。
  此研究是在实验室前期研究的基础上进行的延伸和拓展。实验室研究组在2012年解析了Talin-F2F3/R9复合物晶体结构。该结构显示,在自抑制状态下,Talin上的整合素结合位点F3与其尾部片段R9(1654-1822 a.a.)结合,此时整合素不能被活化。这一自抑制复合物结构为我们认识Talin的自抑制调控机制提供了新的视角,但是仍然无法揭示Talin自抑制状态下的全长结构。
  作为一个270 kD的蛋白,Talin除了F3和R9以外的部分在自身的活化过程中如何协同发挥作用,至今仍是未知的。此外,Talin蛋白可以通过C端最后一个α螺旋形成二聚体,而Talin蛋白到底是单体内自抑制还是二体内的两个分子互相抑制,目前不清楚。我们从体外重组表达和天然组织提取两个方面着手,以获得高质量的Talin蛋白样品。考虑到Talin蛋白整体难于结晶,我们尝试结合负染色技术和冷冻电镜三维重构的方法,获得Tlin蛋白处于自抑制状态下的整体结构。原核表达的Talin蛋白在负染电镜下观察蛋白状态不均一。我们通过结合生物交联剂和密度梯度离心的方法,蛋白状态的均一性得到了很大程度的提高,负染电镜图片质量较高,且图像衬度高,蛋白颗粒明显。但遗憾的是并未得到高质量的冷冻电镜图片。天然组织提取方面,我们采用硫酸铵沉淀法将大量粗制剂中的部分目的蛋白沉淀下来。再结合各种分离能力不同的阴离子交换柱、分子筛、疏水柱、阳离子交换柱,最终得到了较为纯净的Talin蛋白样品,负染电镜下能够看到蛋白颗粒。
[博士论文] 杨玲娜
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:特异性的RNA-蛋白质相互作用在基因表达调控过程中扮演着重要的角色,包括转录的调控,RNA加工和运输,mRNA降解和翻译的调控等。RNA结合蛋白通常都是通过RNA结合结构域来与他们的RNA靶标发生相互作用。主要的RNA结合结构域包括双链RNA结合结构域(dsRBD),RNA识别基序(RRM),锌指(ZnF)以及核不均一核糖核酸蛋白K同源结构域(KH)等。
  KH结构域最早是在核不均一核糖核酸蛋白K中发现的。KH结构域广泛存在生物三域系统中,也是最丰富的RNA结合结构域之一。KH结构域通常都是以多重拷贝的形式存在于同一个蛋白质中,共同识别RNA靶标。这种串联识别RNA靶标的方式不仅可以提高蛋白质-核酸的结合亲和力,还可以提高识别特异性。KH结构域大约由70个氨基酸残基组成,这些氨基酸残基折叠形成三段α螺旋和一个由三个反平行的β-strand的β-sheet,并且这个β-sheet位于三段α螺旋的相对面。根据拓扑学排列的不同,KH结构域可以分为Ⅰ型和Ⅱ型两类,分别存在于真核生物蛋白质中和原核生物蛋白质中。Ⅰ型和Ⅱ型KH结构域都会形成一个疏水的裂缝,可以容纳4个非配对的核苷酸。根据文献报道知道,包含KH结构域的蛋白质行驶多种多样的细胞功能,并且蛋白质的KH结构域与RNA靶标之间的识别是其发挥调控功能的保证。
  线虫MEX-3蛋白质包含两个KH结构域,是包含KH结构域的蛋白质家族成员之一。根据文献报道,MEX-3是线虫早期胚胎正常发育和保持生殖细胞全能性所必需的。随后,在人和鼠中也发现了线虫MEX-3的同源蛋白质(MEX-3A,-3B,-3C和-3D)。哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,都含有两个RNA结合的KH结构域,除此之外,他们的C端还包含一个具有E3泛素蛋白连接酶活性的RING结构域。这四个哺乳动物的MEX-3蛋白质与线虫MEX-3蛋白质一样,参与许多转录后调控。其中,MEX-3C已经被证明了与许多疾病的发生相关,包括高血压,能量代谢,免疫应答和癌症等。虽然许多研究证明了MEX-3C参与许多mRNA的翻译调控,但是MEX-3C是直接地或者间接地结合其RNA靶标并不清楚。在报道的MEX-3C调控的mRNA中,HLA-A2mRNA是目前唯一被证明了的与MEX-3C直接结合的mRNA。MEX-3C结合HLA-A2mRNA的3'非编码区,抑制该mRNA的翻译,此外,当RING结构域存在时,MEX-3C的结合还会诱导HLA-A2mRNA发生降解。然而,对于MEX-3C抑制mRNA翻译和诱发mRNA降解的分子机制,以及MEX-3C识别的RNA序列特异性并不清楚,需要进一步研究。
  在本论文工作中,我们解析了人源MEX-3C KH1-GUUUAG和KH2-CAGAGU两个复合物的晶体结构。基于结构分析,我们构建了一系列蛋白质丙氨酸突变体,通过等温量热滴定实验揭示了稳定RNA-蛋白质相互作用的关键的氨基酸残基。此外,我们还鉴定了MEX-3C KH结构域识别的RNA基序(hMRE),并且证明了HLA-A2mRNA的3'非编码区中含有该RNA基序。最后,通过荧光偏振实验,我们证明了人源MEX-3C K同源结构域可以高亲和力地结合存在于HLA-A2mRNA的3'非编码区的hMRE。
[硕士论文] 万定云
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:生物体由蛋白质、DNA、RNA等生物大分子组成,这些生物大分子在生物体各种调控通路中相辅相成,共同维持生命体的正常运转。它们主要通过DNA与RNA、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质相互作用进行生物信息的传递,最终完成生物体的一系列活动。
  其中,秀丽隐杆线虫MEX-3蛋白质的KH结构域与拟南芥PUF类蛋白质APUM5都是通过与mRNA的3'不翻译区相互作用,进而激活或抑制mRNA的翻译过程,调控整个生命进程。而斑马鱼精氨酸甲基转移酶PRMT9通过修饰某些蛋白质精氨酸的甲基化,使甲基化的蛋白质某种功能被激活或被抑制,进而影响生物体一系列下游调控过程。
  MEX-3蛋白质在秀丽隐杆线虫的P granule中被发现,具有串联的KH结构域,它通过结合RNA调控生殖细胞系全能干细胞的更新及早期胚胎发生时期细胞的分化。PUF类蛋白质存在于多种生物体中,拟南芥APUM5通过其PUF结构域结合病毒基因组从而实现自我防御的功能。而精氨酸甲基转移酶PRMT9通过甲基化剪接因子参与选择性剪接的相关调控。通过研究蛋白质与RNA、蛋白质与蛋白质作用的结构基础,能帮助我们进一步的了解生物体中各种调控过程的分子机制。
  我们主要利用大肠杆菌体外表达了秀丽隐杆线虫MEX-3 KH结构域、拟南芥APUM5 PUF结构域,昆虫细胞体内表达了精氨酸甲基转移酶PRMT9。通过NTA亲和层析柱、Hiload 16/60 Supdex 75/200、MonoS/Q等分离纯化手段获得纯度较高、状态良好的目的蛋白质。同时,我们也使用了核磁共振技术、动态光散射实验观测蛋白质状态。并采用等温滴定量热法验证了目的蛋白质与RNA的相互作用,由pull down实验验证了精氨酸甲基转移酶与SF3B2剪辑因子的相互作用。最后,通过晶体学实验筛选到拟南芥APUM5 PUF类蛋白质与烟草黄瓜花叶病毒的3 'UTR区RNA序列的晶体,但是由于晶体较小,分辨率较低,目前正在优化中。
[硕士论文] 黄小花
分析化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:上转换纳米材料作为一种非常重要的稀土发光材料,可以将长波长近红外光转换成短波长紫外或可见光。上转换发光纳米材料具有显著的优势,如:发射带窄,毒性低,化学稳定性和光稳定性好,较强的组织穿透深度,并且没有生物样品的自发荧光干扰(噪声),对生物样品的损伤较少,这些独特的反 Stokes发光性质,使得上转换纳米材料在太阳能电池、安全标记、生物成像、药物输送与释放、检测等方面具有很好的应用优势。以β-NaYF4为基质的稀土上转换纳米材料,是目前应用最广泛、发光效率最高的材料。目前,合成的大多数β-NaYF4上转换发光纳米材料具有疏水性的表面,在实际应用中存在着在水中分散性差和生物相容性差等问题,成为进一步发展的阻碍。用合适的方法来修饰和改善上转换纳米材料,具有很大的挑战。另一方面,以上转换发光纳米材料为核心,经过表面修饰后再与其他有机染料进行有机复合,以满足在不同领域的应用,也是当前需要解决的一个问题。本论文通过合成上转换发光纳米粒子,开发出能检测金属Cu2+的上转换发光纳米复合探针,主要包括如下内容:
  1.以β-NaYF4为基质的上转换发光纳米材料的合成及其表面修饰
  目前,β-NaYF4是发光效率最高的上转换基质材料之一。本论文中,通过水热法,以β-NaYF4为基质,掺杂Yb3+/Er3+/Gd3+、Yb3+/Ho3+/Gd3+、Yb3+/Tm3+/Gd3+,合成了发光性能优异的上转换发光纳米棒。合成的以β-NaYF4为基质的上转换发光纳米棒,平均直径为17 nm,平均长度为109 nm,六方相,大小形状较为均一。掺杂Yb3+/Er3+/Gd3+,Yb3+/Ho3+/Gd3+,Yb3+/Tm3+/Gd3+后,在980 nm连续波激光器激发下有不同的上转换发光,其发光颜色包括红光、绿光、蓝光。并对合成的β-NaYF4:Yb,Er,Gd采用油包水的反相微乳液法进行了二氧化硅表面修饰,增强了其在水中的分散性和生物相容性,便于以后更好地应用于分析检测中。(第2章)
  2.基于发光共振能量转移的有机染料TSPP修饰的上转换纳米探针对细胞裂解液中Cu2+的检测应用
  我们制备了一种 Cu2+响应的有机染料 TSPP修饰的上转换发光纳米复合探针:β-NaYF4:Yb,Er,Gd@SiO2-TSPP。这种纳米探针是基于上转换发光纳米材料与有机染料之间高效的发光共振能量转移(LERT)过程,以β-NaYF4:Yb,Er,Gd@SiO2上转换纳米材料作为能量给体,TSPP-Cu2+络合物作为能量受体。TSPP-Cu2+络合物的形成导致了该纳米探针在545 nm处的上转换发光淬灭,并且基于545 nm的发光强度相对659 nm处的变化来检测Cu2+。在Cu2+浓度为5μM-0.16 mM的范围内获得线性响应,通过计算得出检测限为2.16μM。因为制备的β-NaYF4:Yb,Er,Gd@SiO2-TSPP在水中具有良好的分散和生物相容性,能高选择性的检测细胞裂解液中的 Cu2+。通过测定在 Hela细胞裂解液中加标 Cu2+浓度,得出回收率范围为98%?102%,相对标准偏差低于5.0%。(第3章)
[硕士论文] 谭小平
化学工程与技术 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:荧光探针是荧光成像分析方法中最重要的工具,由于它们具有高灵敏度、高选择性、检测成本低和操作简便等优点,广泛的应用于生物化学,材料化学,分子生物学,分析化学和环境化学等领域。钯是一种贵金属,广泛的应用于燃料电池、珠宝、牙科材料、制药和电子电器等领域。并且,钯作为理想的催化剂在汽车尾气处理和有机合成方面有着独特的应用,但是大量含钯的化合物的过度使用危害了人类健康,健康人群每天的最大摄于量应不大于15μg。所以,设计合成一种能高效、灵敏地检测钯离子的荧光探针非常必要。半胱氨酸(Cys)是人体中重要的α-氨基酸,它在许多生理和病理过程中都具有重要的作用,设计合成高效灵敏的半胱氨酸荧光探针,检测它在生物体内的分布和水平,对疾病的预防和临床医学研究有重大意义。
  本论文主要开展了以下工作:
  1.设计合成了一种新型的荧光探针,该探针以4-氯-7-硝基苯并呋咱衍生物为荧光基团,不饱和丙烯酸酯为识别基团,并用1H NMR,13C NMR、EI-MS和HRMS对其结构进行了表征。此探针在485 nm激发光激发下,发出微弱的荧光;经与Pd2+反应后,在485 nm激发波长下,探针溶液发出绿色的荧光,最大发射波长为558 nm。该探针在生理pH条件下具有高选择性和高稳定性,探针荧光响应信号与Pd2+的浓度呈现良好的线性相关,线性响应范围为1-2μmol/L,检测限为0.17μmol/L。激光共聚焦荧光成像实验表明,该探针可用于活细胞中 Pd2+的可视化检测。
  2.设计合成了一种对 Cys荧光响应的探针,该探针以萘乙酮衍生物为荧光基团,以不饱和丙烯酸酯为识别位点,并通过1H NMR、13C NMR、EI-MS和HRMS对其结构进行了表征。在375 nm激发光激发下,该探针本身几乎没有荧光,经与Cys选择性反应后,探针溶液发出蓝色荧光,最大发射波长为455 nm,探针的荧光强度在28分钟趋于稳定,该探针在生理 pH条件下具有很高的稳定性、高选择性,其荧光响应信号与Cys的浓度之间呈现良好的线性关系,线性响应范围是1-10μmol/L,检测限为0.10μmol/L。激光共聚焦荧光成像实验表明,该探针可用于活细胞中Cys的可视化检测。
  3.总结本论文的研究成果,可以发现,钯离子和Cys荧光探针合成简单并且在生理pH条件下具有高稳定性和高选择性,为今后钯离子和Cys荧光探针的设计与研究提供了一定的思路和理论依据。
[硕士论文] 冯莉莉
分析化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:研究发现,细胞内的还原性物质会参与细胞内的一系列反应,并且和人类健康息息相关,因此对细胞内的这些还原性物质的检测和成像具有重要的意义。在现有的检测技术中,基于荧光的检测方法由于其较高的灵敏度和选择性得到了广泛应用。近年来大量的荧光探针被用来检测细胞内的小分子和活性物质,然而,这些探针的激发和发射波长大都处于紫外-可见区域,因此具有一些不可避免的缺点,如荧光背景高、受生物体内自发荧光的干扰等。近年来,双光子成像技术的发展促进了对双光子荧光探针的研究。双光子荧光成像是采用近红外波长激发,从而避免了生物体内自发荧光的干扰,减小了光散射,并且能够实现较深的组织深度成像。此外,近红外纳米材料作为一种新兴的纳米材料具有诸多显著的优势,如较深的组织穿透能力,较弱的发射光散射以及受生物自身荧光背景干扰小等使其在生物检测和成像中得到了广泛的应用。到目前为止,一系列近红外荧光材料已经被合成并用于细胞和组织生物样品的小分子检测和成像。
  在本文中,我们通过对双光子荧光探针的研究设计了一个基于荧光能量共振转移(FRET)的比率型双光子荧光探针 TPR-S,实现了对细胞内 H2Sn的检测及脂多糖引起的急性器官损伤成像。基于近红外石墨烯量子点(NGs)和羟基氧化钴(CoOOH)纳米材料,设计合成了具有近红外发射光的双光子荧光探针CoOOH-NGs,并实现了细胞中内源性抗坏血酸的检测和组织深度成像。主要内容如下:
  (1)在第2章中,我们通过引入2-氟-5-硝基苯甲酸作为H2Sn的识别基团,设计合成了一个基于 FRET的比率型双光子荧光探针 TPR-S用于检测 H2Sn。该探针对 H2Sn表现出较高的选择性和灵敏度,检测下限为0.7μM。我们所合成的这一双光子荧光探针 TPR-S同样可以用于检测细胞和组织中的 H2Sn以及脂多糖诱发的器官损伤样本中的H2Sn,在生物体的实际应用中具有广泛的前景。
  (2)在第3章中,我们首先合成了近红外石墨烯量子点 NGs,通过在 NGs上原位合成CoOOH纳米片构建了一个激活式的近红外纳米探针(CoOOH-NGs)。在该探针中,NGs作为信号报告单元,CoOOH纳米片作为猝灭剂可猝灭 NGs的荧光以及作为识别单元可以有效识别抗坏血酸。当抗坏血酸存在时 CoOOH被还原成Co2+,并从NGs上解离使得NGs的荧光恢复,从而实现对抗坏血酸的检测。实验结果表明该探针的尺寸比较均一且具有良好的分散性,受检测环境的 pH及反应介质的影响小,可以有效地用于抗坏血酸的检测。
  (3)在第4章中,基于前一章构建的纳米体系,我们进一步研究了 NGs的双光子性质,并将其用于细胞中内源性抗坏血酸的检测。实验结果表明此探针具有较大的双光子吸收截面,不受生物体内自发荧光的干扰,可以实现细胞中内源性抗坏血酸的检测,并且可实现较深的组织深度(40-320μm)成像。
[博士论文] 邵可可
临床检验诊断学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:乳液PCR是单分子PCR技术,通过油相的阻隔,把水相间隔成数目庞大的小水滴,这些小水滴构成了独立的PCR反应空间,最理想的状态下每个小水滴中只含有1个DNA模板,此时小水滴中的PCR反应不会受到竞争干扰。
  乳液PCR的优点是:(1)抗干扰能力强;(2)能消除竞争抑制;(3)高通量和高效率;(4)灵敏度高;(5)绝对定量。
  本课题利用乳液PCR的特点,建立了高效构建次级ssDNA文库的乳液不对称PCR和乳液单引物PCR方法。同时还建立了用于临床检验诊断的高灵敏度的两步乳液PCR法,并用初步应用到结直肠癌患者血清游离P16基因甲基化水平和乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒核酸的检测中。
  第一部分、建立和优化乳液不对称PCR高效构建随机ssDNA文库
  目的:建立并优化乳液不对称PCR来构建ssDNA次级文库。
  方法:乳液不对称PCR通过乳液颗粒把不同种类的模板隔开形成单分子PCR,每个模板分开扩增互不影响,不会形成非特异性杂交。以ssDNA文库为模板的乳液不对称PCR100μl体系含50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.6),2.5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.4μmol/L上游引物、0.02μmol/L下游引物、0.04μg/mL模板和0.1U/μL pfu DNA聚合酶。优化实验时,模板浓度优化范围从0.0004μg/mL到40μg/mL,上游引物浓度从0.2μmol/L到1μmol/L,下游引物浓度从0.0025μmol/L到0.02μmol/L。扩增反应条件为94℃变性30s,然后进入35个循环94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸30s,最后延伸3min。优化循环数从10到50个循环。扩增结束破乳液回收产物,并进行聚丙烯酰氨凝胶电泳和银染,对产物进行分析。对破乳液回收产物同时进行纯化回收,并用磁珠分离出ssDNA文库,检测浓度。同时对乳液不对称PCR与常规不对称PCR进行对比研究。
  结果:常规不对称PCR扩增ssDNA文库,在25个循环即有明显副产物出现,30个循环时出现明显的涂抹带,25个循环后dsDNA产物量随着循环数的增加逐渐减弱,只至消失,后期不对称PCR扩增无模板可用,只有非特异性扩增,只产生非特异性产物。因为25个循环即有明显副产物出现,用磁珠分离的ssDNA文库不纯,因此只分离检测10、15和20个循环时的浓度,分别为0.76,1.43和2.02μg/mL。乳液不对称PCR在从10到50个循环中均无副产物,只有ssDNA条带和dsDNA条带,且dsDNA条带无明显减少,磁珠分离10、15、20、25、30、35、40、45和50循环数的产物浓度分别为0.58、1.22、1.78、2.25、3.21、4.32、6.43、6.71和6.55μg/mL产物量明显多于常规不对称PCR。
  在优化乳液不对称PCR时,首先优化模板浓度。当模板浓度从0.0004μg/mL到0.04μg/mL时产物量随模板浓度增高而增多,再增加模板浓度产物量无明显变化,当模板浓度为4μg/mL时,副产物与产物呈涂抹带,无法分离。模板浓度为0.04~0.4μg/mL时,无肉眼可见副产物,ssDNA产物量也足够多,在模板浓度为0.4μg/mL时,dsDNA浓度明显下降。因此模板浓度在0.04μg/mL到0.4μg/mL范围内均可。
  在优化引物浓度时,不仅优化了上下游引物浓度比,还优化了上下游引物的量。不对称PCR的产物是ssDNA,因此当引物浓度过高时,易与已形成的ssDNA杂交进行非特异性扩增,所以我们首先优化浓度较高的上游引,上游引物浓度从0.2~1μmol/L时,产物量无明显变化,当上游引物浓度为0.6μmol/L时有少量副产物,为1μmol/L时有大量副产物生成。因此上游引物浓度在0.2~0.4μmol/L范围内均可。以0.4μmol/L为上游引物浓度,优化下游引物浓度时,下游引物浓度从0.0025~0.02μmol/L时产物量逐渐上升且无副产物,因此选择下游引物0.02μmol/L为最佳浓度。
  结论:乳液不对称PCR,不需要优化循环数,不会出现常规不对称PCR由过度扩增引起的副产物问题,只需通过简单模板浓度和引物浓度优化,就能得到高质量的ssDNA文库。该法能简单、方便、高效的构建ssDNA文库,用于适配子的筛选对筛选效率提高有一定的帮助。
  第二部分、乳液单引物PCR构建次级ssDNA文库方法的建立及优化
  目的:建立并优化乳液单引物PCR扩增法构建随机ssDNA文库。
  方法:构建90 bp的随机寡核苷酸文库,运用乳液PCR扩增出双链DNA文库,再以双链DNA文库为模板,分别用乳液单引物PCR和常规单引物PCR扩增构建ssDNA文库,并进行比较。乳液单引物PCR100μl体系含50mmol/LKCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.6),2.5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.75μmol/L上游引物、9pmol/L模板和0.1U/μL pfu DNA聚合酶。优化实验时,模板浓度从1pmol/mL到18pmol/mL,上游引物浓度从0.5到3μmol/L,DNA聚合酶浓度从0.075U/μL到0.175U/μL,dNTP浓度从0.25到1.25mmol/L。反应条件为94℃变性30s,然后进入35个循环94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸30s,最后延伸3min。优化退火温度时,温度从50℃到70℃。优化循环数从10到35个循环。
  结果:乳液PCR可以高质量的把ssDNA转化成dsDNA。常规单引物PCR扩增构建随机ssDNA文库,发现15个循环时就有明显副产物出现,在20个循环时目的产物和副产物已经融合成涂抹带,无法分离;乳液单引物PCR在10~35个循环均无副产物,且产物量明显高于单引物PCR。作为模板的dsDNA在常规单引物PCR扩增过程中随循环数的增加逐渐减少,到25个循环即消失,而乳液单引物PCR的模板量在10~35个扩增循环中无明显减少。在优化乳液单引物PCR时,首先优化模板浓度,当它从18pmol/mL到1pmol/mL时,产物量迅速下降,到1pmol/mL时产物几乎降到0,模板浓度对产物量影响最大。引物浓度对副产物的影响最大,退火温度同时影响产物与副产物的量。酶浓度大于0.1U/μL出现副产物,dNTP浓度对扩增影响相对较小。
  结论:乳液单引物PCR构建随机ssDNA文库同样不需要优化循环数,无过度扩增产生的副产物。因为乳液单引物PCR模板为ssDNA通过PCR扩增得到dsDNA,模板量足够,而乳液不对称PCR所用的模板为筛选过程中直接洗脱的ssDNA,所以乳液单引物PCR在模板量的选择上更有优势,因此该法也可高效的构建ssDNA文库。
  第三部分、两步乳液PCR的建立及在结直肠癌患者p16基因甲基化检测中的初步应用
  目的:建立检测P16基因甲基化的两步乳液PCR方法,并初步应用在结直肠癌患者血清中P16基因甲基化检测。
  方法:分别构建含甲基化和非甲基化P16基因序列的质粒,转入大肠杆菌DH5α感受态细菌;建立两步乳液PCR方法:(1)油包水乳液PCR:用0.1ml的反应体系(10mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、0.2mmol/LMgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1%TritonX-100、0.5mmol/L dNTP、0.2μmol/L引物、4ul菌液模板和0.1U/μL pfu DNA聚合酶),制备乳液后分装100μl/管,立即进行PCR扩增。反应条件为94℃变性5min,然后进入15个循环94℃变性30s、甲基化为69℃(非甲基化为65℃)退火60s、72℃延伸60s,最后延伸3min。(2)水包油乳液PCR:油包水乳液PCR扩增结束后,14,000rpm离心10min,去上层油相,加入33μl PCR反应体系(10mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、0.2mmol/L MgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1%TritonX-100、0.5mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物和0.1U/μLpfu DNA聚合酶),充分震荡混匀,制成水包油乳液颗粒,放入PCR仪按上述扩增条件扩增35个循环。分别应用甲基化特异性PCR和两步乳液PCR检测含不同浓度的甲基化和非甲基化P16基因序列的菌液,比较两种方法的特点。分别检测36例结直肠癌患者和25健康体检者血清中p16基因的甲基化情况。
  结果:灵敏度实验和干扰实验结果显示,两步法乳液PCR比MSP具有更高的灵敏度和更强的抗干扰能力。两步法乳液PCR的检测灵敏度是MSP的10倍。在非甲基化基因的干扰下,两步法乳液PCR能在甲基化与非甲基化比例为1∶100的情况下检测出甲基化,而MSP只能在甲基化与非甲基化比例为1∶10的情况下检测出甲基化。在检测结直肠癌患者血清中p16基因的甲基化时,两步法乳液PCR的检出率为55.5%,而MSP检出率只有44.4%。
  结论:两步乳液PCR在检测P16基因甲基化时,表现出较高的灵敏度和抗干扰能力,在临床检测实验中比MSP检出率更高,可应用于临床肿瘤的早期诊断。
  第四部分、两步乳液PCR检测乙型肝炎病毒核酸方法的建立及初步应用
  目的:建立两步乳液PCR检测乙型肝炎病毒核酸方法,并初步应用于临床。
  方法:选取乙型肝炎病毒核酸定量检测结果<500IU/mL的标本78例,应用荧光定量PCR法检测并选取无扩增曲线的标本。再分别用普通PCR和用两步乳液PCR检测乙肝病毒核酸,并用ELISA检测乙肝病毒血清标志物。
  结果:无扩增曲线的40例中,通过两步乳液PCR有14例(35%)为阳性,而常规PCR都为阴性。40例标本中有27例为乙型肝炎病毒表面抗原阳性同时e抗原阴性,即临床诊断为非活动性乙型肝炎病毒表面抗原阳性携带者,而这27例中有10例可通过两步乳液PCR检测出乙型肝炎病毒核酸。
  结论:两步乳液PCR体系较荧光定量PCR有较高的检测灵敏度,能进一步检测定量结果<500 IU/mL的病人血清中是否有乙肝病毒,可作为临床荧光定量PCR的补充检测手段,为临床乙肝的诊疗提供依据。
[硕士论文] 刘素美
材料工程 太原理工大学 2017(学位年度)
摘要:家蚕丝素蛋白是一类有着独特的氨基酸组成和结晶结构的动物蛋白,因具有良好的生物相容性、优异的机械性能、无毒和可生物降解等特点而广泛的应用于生物医学、光学和组织工程等领域。以再生丝素蛋白或重组丝蛋白溶液作为原材料,通过仿生的绿色化学方法获取高性能、多功能的丝基材料是实现丝素蛋白应用的基础。丝素蛋白在水溶液中的自组装机理对于深入了解其结构与功能之间的关系具有十分重要的指导意义。目前对丝素蛋白在水溶液中的组装过程和机制没有统一和清晰的认识,采用的研究方法也难以方便直观地监测自组装的过程。
  金纳米粒子具有与其形状、粒径和聚集程度相关的表面等离子共振效应,金纳米粒子发生聚集时会引发颗粒间的表面等离子耦合,表现出肉眼可见的红色到紫色或蓝色的变化。这种效应的应用逐渐发展成为以金纳米粒子为探针的比色检测方法,并应用于核酸、小分子和蛋白质等物质的比色检测。
  为此,本文提出了以金纳米粒子为探针研究丝素蛋白水溶液中组装行为的新思路。在家蚕丝素蛋白的整个序列中,高度重复的六肽单元GAGAGS能够形成反平行的β-折叠结构,进而构成丝蛋白的结晶区域,而另外一种六肽单元GAGAGY则有可能构成了其非结晶区。近年来以丝素蛋白序列中某些具有代表性的多肽序列作为简化模型来研究丝素蛋白的组装机理成为一种趋势。
  本文选用十四肽(GAGSGAGAGSGAGY,GY-14)和八肽(GAGAGAGY, GY-8)分别作为丝素蛋白晶区与非晶区的简化模型,并以多肽末端的酪氨酸原位还原的金纳米粒子作为固定在多肽模型上的探针。通过溶液颜色以及紫外吸收峰的改变,研究外源性因素对多肽溶液组装行为的影响规律,建立以金纳米粒子为探针研究多肽在水溶液中组装行为的方法。
  本文开展了以下研究:
  (1)金纳米粒子原位制备条件与性能之间关系的研究:分别以多肽GY-8和GY-14作为还原剂,原位还原氯金酸合成了稳定分散的球形金纳米粒子,并研究了多肽与氯金酸的配比、溶液 pH和温度等不同制备条件对金纳米粒子形态、分布以及稳定性的影响。通过紫外-可见吸收光谱和透射电镜表征确定了最佳的制备条件:以多肽GY-8为还原剂时,多肽与氯金酸摩尔比为5:2,pH为9,温度为40℃;以多肽GY-14为还原剂时,多肽与氯金酸摩尔比为1:1,pH为7,温度为35℃。
  (2)以金纳米粒子为探针对多肽水溶液组装行为的研究。分别研究了多肽GY-14在 pH、金属离子浓度以及溶剂组成等外源性因素影响下的自组装行为,并应用紫外光谱、红外光谱、透射电镜和原子力显微镜等方法对组装规律以及组装结构进行了表征。结果表明:多肽GY-14在 pH4的酸性水溶液中构象由无规卷曲转变为β-折叠,溶液由红色变为紫色,紫外吸收峰红移。Ca2+的引入会诱导多肽构象发生转变,当离子浓度为5 mM和10 mM时,多肽自组装形成由粒子连接而成的串珠状的β-折叠结构,溶液分别由红色变为紫色和蓝色,吸收峰红移。异丙醇溶液的加入使得多肽从无规卷曲构象转变为β-折叠构象,同样形成串珠状组装体,溶液中出现紫色絮状物并在短时间内沉淀,紫外吸收峰基本消失。
  本文以金纳米粒子为探针,将多肽GY-14在水溶液中的组装行为通过溶液颜色的改变以及紫外吸收峰的移动表现出来,为研究多肽的溶液组装行为提供了一种简单直观的新途径,为进一步研究丝素蛋白构象转变机制和过程提供指导。
[硕士论文] 张秀芳
分析化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:荧光探针是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使荧光剂产生荧光,通过检测所产生的的荧光实现对被检测物质进行定性或者定量分析的分子工具。与传统的分析方法相比,荧光探针具有灵敏度高、选择性好、使用方便、生物毒性小等优点。有机小分子荧光探针作为荧光探针家族中的一员,在离子、小分子、生物大分子的检测中扮演着重要角色,成为现代生命科学和疾病诊断不可或缺的分子工具。近年来,有机小分子荧光染料备受科研工作者的关注,众多有机小分子探针平台应运而生,如香豆素类有机小分子荧光探针平台、荧光素类有机小分子荧光探针平台、罗丹明类有机小分子荧光探针平台等等。然而,众多探针平台多采用单光子激发和单通道发射,其进行检测分析过程易引起光漂白、光损伤,具有组织穿透深度低、检测环境干扰大等缺点。随着科学技术的进步与发展,对实验结果准确度的要求越来越高。高的信噪比是有机小分子荧光探针面临的一大挑战,双光子成像技术及比率技术的发展有效的弥补了传统有机小分子荧光探针存在的不足。与单光子相比,双光子采用长波激发,有效的避免了光漂白、光损伤、组织穿透深度低等缺点;比率探针具有双通道发射特性,给出比率信号,因此检测结果受检测环境干扰较小,信号输出相对真实可靠。将双光子成像技术与比率技术引入有机小分子探针的设计中,在很大程度上提高了传统有机小分子荧光探针的性能。本文据此具体开展了以下工作:
  (1)构建基于苯并吡喃-荧光素杂交的能量转移型双光子比率荧光分子平台。选用具有双光子吸收特性的苯并吡喃与易于功能化识别单元的荧光素染料,通过分子杂交构建新的探针平台。该平台采用双子激发,有效的弥补了单光子激发的不足,苯并吡喃、荧光素分别作为能量给体和受体,通过二者之间的荧光共振能量转移(FRET)效应获得该探针的比率输出信号,有效的降低检测环境对输出结果的干扰。
  (2)苯并吡喃-荧光素杂交的 FRET型小分子双光子比率荧光探针选择性检测由一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)相互作用产生的次硝酸(HNO)。在工作一中构建的探针平台末端通过酯键与二苯基膦苯甲酸连接,功能化修饰 HNO的识别位点,通过收集外源性 HNO或者 NO与 H2S在复杂生物体内相互作用产生的内源性 HNO存在前后的探针荧光信号的变化,达到对外源性及由 NO与H2S相互作用产生的内源性HNO的检测目的。
  (3)苯并吡喃-荧光素杂交的 FRET型小分子双光子比率荧光探针选择性检测多硫化氢(H2Sn)。在探针末端通过酯键与甲基丙烯酰氯相连,功能化修饰H2Sn的识别位点,分析H2Sn存在前后探针的比率信号,对 H2Sn进行合理检测。
[硕士论文] 汤聘婷
分析化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:生物传感是基于生物分子特异性识别及其下游信号转换以达到目标物检测的一类分析方法,荧光生物传感是以荧光信号为基础的生物传感技术。核酸探针(Nucleicacid Probe)是基于核酸分子杂交原理的一种探针。核酸探针具有专一性强、灵敏度高、能快速准确得到测量结果等优点,使其在生物分子的检测成像、药物分析、临床疾病诊断和治疗等方面都拥有广阔的前景。纳米材料因其特有的量子尺寸效应、表面效应和体积效应等在生物传感领域尤其是荧光传感方面得到大力的发展。将核酸探针与纳米材料相结合在生物传感和检测方面的应用近年来已经得到了广泛的关注和发展,本论文基于核酸荧光探针和纳米材料构建了两种新型核酸荧光探针分别用于细胞外缺氧环境下 pH的检测成像和细胞内mRNAs的检测成像。
  (1)基于FRET DNA–二酰基脂质体(DNA-lipid)实现细胞缺氧环境下细胞膜外 pH的原位成像分析
  本章中,利用二酰基共轭物能够与细胞膜发生疏水的相互作用,将连有双标记的 i-motif序列的二酰基脂质体插入细胞膜表面实现缺氧和常氧条件下细胞外 pH的比率型检测。首先在 i-motif序列两端标记两种荧光基团 cy3和 cy5,在 pH较高的条件下,i-motif链两端的荧光基团处于分离状态, FRET效应很弱;在 pH较低的条件下, i-motif链在细胞膜表面形成四聚体结构,两端的荧光基团相互靠近,产生较强的 FRET效应。通过测定两种荧光基团的荧光强度比值可以实现 pH值的定量检测。缺氧时,细胞内糖酵解产生大量的乳酸,这一过程打破了 pH的动态平衡,从而促使肿瘤细胞通过上调细胞质膜的 H+转运蛋白,如钠氢交换蛋白-1(NHE-1)等将 H+排出细胞外,最终造成细胞外环境 pH降低而偏酸性。这一 pH值的变化对肿瘤的黏附、迁移以及耐药性等相关性质都有很大的影响。利用此探针对 pH的灵敏响应实现对缺氧环境中细胞外 pH进行精确测量,在生理病理学上都具有重大意义。
  (2)基于 DNA三链分子开关纳米探针用于活细胞内的 mRNAs的原位成像
  本章中,我们构建了一种新的程序性设计的金纳米颗粒介导三链纳米分子开关(triple-helix molecular switch,THMS)用于活细胞内多种mRNAs的同时成像检测。一般来说,在中性条件下,CGC碱基平行三链由于 C碱基的质子化作用而不能够稳定存在,而 TAT碱基三链中 T碱基的去质子化作用能使其保持相对稳定,因此我们通过控制序列中TAT/C G C的比例来设计三链分子使其克服以往 p H的依赖性而在中性甚至弱碱性环境中也能稳定存在,继而拓展其在细胞中的应用。另一方面,充分利用金纳米颗粒(AuNPs)-核酸构型的优势,例如独特的抗酶切能力以及高的内吞效率,以此为基础,我们构建了在 AuNPs表面连接程序性设计的 THMS实现了细胞内多种肿瘤相关的 mRNAs的同时成像检测。当存在多种 mRNAs时,只需要同时连接标记有不同荧光团的捕获探针就能实现多种分析物的检测。据我们所知,这是首次将 AuNPs介导的 THMS应用于活细胞进行多种分析物的成像检测。
[硕士论文] 刘锦
药学 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质广泛存在于体液中,可作为象征人体健康的标准,用作诊断的生物标记物。将被测蛋白质的对应识别分子引入检测体系,可作为响应机制的触发点。本文引入蛋白质诱导纳米粒子亲疏水性变化机制作为分子识别,疏水片段硼酸基团与ARS络合反应为信号导出,构建蛋白质检测机制。
  1.本文用点击化学反应合成末端具有生物素的大分子链转移试剂,通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合)调节投料比例,得到聚苯硼酸丙烯酰胺(PAAPBA)为疏水片段的三种不同嵌段比例的两亲性聚合物(Biotin-PEG-block-PAAPBA)。通过疏水相互作用,两亲性聚合物自组装形成100~300nm的纳米粒子,利用被识别蛋白质与纳米粒子外壳的识别分子结合,从而产生粒子整体亲疏水性平衡变化,粒子松散而使苯硼酸部分裸露,进而与ARS形成荧光生色团,作为检测信号导出方式,利用此纳米粒子检测模型蛋白链霉亲和素,检测限(LOD)可达32.50ng·mL-1。
  2.基于上述方案已实现的定量检测,本文进一步优化检测体系,建立可视化定性检测新机制。两亲性嵌段聚合物(B iotin-P EG-b lock-PAAPBA)与ARS先配位反应后,自组装可以形成黄色纳米粒子。在蛋白质影响粒子亲疏水性平衡的同时,引入环糊精分子作为外加刺激,并与疏水内核的硼酸-ARS络合物反应,竞争置换出游离的紫色ARS,促进粒子进一步瓦解,实现溶液颜色由黄到紫的转变。根据加入蛋白质的纳米粒子溶液与无蛋白质纳米粒子溶液的荧光发射信号差值作蛋白检测标准曲线,同时实现蛋白质的可视化定性和荧光定量检测,达到的检测限为5.85ng·mL-1,检测线性范围6.50ng·mL-1~1.95μg·mL-1。
[硕士论文] 王慧霞
化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白翻译后修饰(PTM)酶的共价修饰,对于多种生理过程,如转录激活/失活,染色体包装,和 DNA损伤/修复可控的进行等具有十分重要的作用,因此对PTM酶活性的分析检测及其抑制剂高通量的筛选,对临床诊断、药物开发和药物研究都是十分重要的。葡萄糖是生物体内主要的能量来源,以及新陈代谢过程中的重要中间产物,开发快速可靠地葡萄糖含量分析的传感器,对于疾病预防、临床医学等过程十分重要。
  功能生物分子 G-四链体和超电荷荧光蛋白(ScGFP),作为通用性分子工具广泛的应用于对多种分析物的高灵敏检测。功能纳米材料金纳米团簇(AuNCs),由于具有超小的尺寸,优良的光稳定性,强的发光效率以及良好的生物相容性,已成为开发新型传感方法的一类新的纳米探针。本论文中,我们基于功能生物分子G-四链体和ScGFP,以及功能纳米材料AuNCs,开展了系列研究,开发了不同的荧光生物传感器,用于对PTM酶以及葡萄糖的检测。具体细节描述如下:
  1.模拟 DNA与组蛋白的相互作用,我们提出了一种区分乙酰化相关肽的新方法。基于G-四链体(G-quadruplexes,G4s)与乙酰化相关肽之间的相互作用,并由此相互作用导致的G4/硫黄素T(Thioflavin T,ThT)的荧光变化来检测乙酰化相关肽。我们选用一条衍生自H4 N-末端组蛋白尾部的多肽及凝血酶结合适体(Thrombin-binding aptamer,TBA)为研究对象。通过动态光散射表征发现,TBA/乙酰化相关肽复合物的平均粒径为195±69 nm。通过肝素(Heparin)的竞争实验证明了 G4与乙酰化相关肽之间的主要相互作用力是正负电荷之间的静电相互作用。接着通过水凝胶成像,荧光检测以及圆二色性光谱对提出的方法进行了可行性验证,结果证明提出的方法简单方便,灵敏度高,并有望作为一个新的传感平台应用于对乙酰化相关酶的检测及其抑制剂的筛选。
  2.基于G-四链体与乙酰化相关多肽之间的相互作用,并由此相互作用导致的G4/ ThT复合物的荧光变化,我们开发了一种免标记的荧光方法来均相测定组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferases,HAT)和组蛋白去乙酰化转移酶(Histone deacetylases,HDACs)的活性并检测其抑制剂。用此方法来检测HAT(p300)活性,非常灵敏并且具有选择性,线性范围为0.1到120 nM,检测限为0.05 nM。此外,该方法还可应用于HDAC(Sirt1)活性的检测,线性范围为1到450 nM,检测限为1 nM。通过在细胞裂解液中检测HAT/HDAC的活性和评估分别以HAT和HDAC为靶点的抑制剂C464和EX527的抑制性能,来进一步说明我们的方法的效能。我们所提出的方法是方便的,免标记的和低花费的,并且有希望应用于以HAT和HDAC为靶点表观遗传的研究和药物发现。
  3.基于 AuNCs与 ScGFP的相互作用,我们开发了一种新型的荧光生物传感器来灵敏的和特异性的检测 H2O2及葡萄糖含量。我们首次证明了以 CoA为配体合成的AuNCs可以有效的淬灭ScGFP的荧光,并且H2O2通过Fenton反应产生的羟基自由基,可以有效的氧化刻蚀合成的 AuNCs。基于此原理,我们设计一个新型的荧光生物传感器,用于检测H2O2含量。此外,葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下,可以产生H2O2,我们进而利用这一现象实现对葡萄糖的检测。葡萄糖与 H2O2的检测限分别低至0.1 mM与0.05 mM,检测线性范围分别为0.1-5.0 mM和0.1-2.0 mM。此外,我们通过在5%的人血清样品中进行检测,验证了我们的生物传感器在实际样品应用的潜力。我们所提出的方法是方便的,免标记的和高灵敏度的,并且有希望应用于生物医学分析和临床检测中。
[硕士论文] 许燕燕
生物化学与分子生物学 安徽师范大学 2017(学位年度)
摘要:α晶状体型热休克蛋白(alpha-crystallin-type heat shock protein,α-HSP)是脊椎动物眼睛晶状体中的一个结构蛋白,但在脊椎动物除了眼睛之外的其他组织器官中也表达α-HSP,其他许多生物体包括原核生物也表达该蛋白。α-HSP最重要的角色是作为细胞内重要的分子伴侣,与靶蛋白结合保证其正确折叠或是帮助细胞内应激损伤的蛋白质再次折叠,防止与之结合的这些蛋白质变性或失活。本课题组在进行大乳头水螅(Hydra magnipapillata)转录组数据分析时发现了头区再生进程中不同时段差异表达基因中有α-HSP基因EST(expressed sequence tag),为深入研究水螅α-HSP基因在其再生进程中的作用和角色,本研究开展了如下工作:
  根据本实验室先期开展的大乳头水螅转录组实验获得的α-HSP基因的EST数据设计2条特异性引物,特异性引物分别与试剂盒接头引物配对进行5’RACE和3’RACE。再根据5’RACE和3’RACE PCR产物测序结果设计用于扩增大乳头水螅α-HSP基因编码区全长序列的上、下游特异性引物,以大乳头水螅SMART RACE cDNA文库为模板扩增了其α-HSP基因编码区全长序列。PCR产物纯化后与克隆载体pMD18-T连接,转化E. coli JM109菌株。运用菌落PCR方法鉴定阳性克隆后进行DNA测序(重组质粒命名为pMD18-T-α-HSP),测序结果表明大乳头水螅α-HSP基因编码区全长序列为765个核苷酸,编码254个氨基酸。生物信息学分析表明大乳头水螅α-HSP内含2个类似于脊椎动物α晶状体蛋白的保守结构域。大乳头水螅α-HSP基因cDNA序列的成功克隆为深入研究水螅α-HSP蛋白的功能进化奠定了基础。
  基于原核表达质粒pET-42a(+)多酶切位点的特点及大乳头水螅α-HSP基因序列特征设计引物,以已制备的pMD18-T-α-HSP重组质粒为模板经分子克隆方法把大乳头水螅α-HSP基因编码区全长序列连接到原核表达质粒pET-42a(+)上,构建重组原核表达载体pET-42a(+)-α-HSP,转化E. coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE胶检测结果表明本实验成功表达了大乳头水螅重组GST-α-HSP蛋白,并且该重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。大体积诱导表达的工程菌菌体经超声破碎获得上清液, 首先采用His-tag亲和层析柱从上清液中初步纯化重组蛋白,再经凝胶层析法(分子筛)进一步纯化后得到纯度较高的重组蛋白。以大乳头水螅重组GST-α-HSP蛋白为抗原,对BALB/C小鼠进行4次免疫,进一步采用ELISA方法测定小鼠抗血清效价约1:3280000。本实验获得的重组GST-α-HSP蛋白及其多克隆抗血清将有助于后续的关于水螅α-HSP蛋白的结构、表达动态及生理功能等科研工作的开展。
  为深入研究水螅α-HSP基因在其头区再生进程中的作用,本研究采用实时定量荧光PCR和整体免疫组化方法对α-HSP基因在大乳头水螅头区再生进程的表达模式进行了探讨。结果显示,α-HSP蛋白主要在切割手术后伤口附近区域(再生部位)表达。无论是基于基因转录水平、还是基于蛋白质表达水平,再生进程的早期α-HSP基因表达上调,而在再生进程后期其表达下调。切割手术对生物体来说是具有冲击力的环境压力,在损伤后修复和再生初期热休克蛋白基因表达的上调可能具有重要的生物学意义。再生进程的早期由于伤口要愈合,伤口附近的干细胞启动分裂,此时α-HSP基因表达上调可能是干细胞启动分裂的一个关键诱导因子;而到了再生进程的后期,伤口已愈合,由干细胞分裂产生的新细胞逐渐分化成其他功能细胞,这时α-HSP基因表达下调。
[博士论文] 刘红文
分析化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:随着荧光成像技术的不断发展,具有灵敏度高、选择性好、响应快速并可实现实时、原位检测等优点的荧光探针在食品安全、环境监测、生物成像、疾病诊断等领域的研究取得了显著成就,展现了巨大的应用潜力。利用分子荧光探针监测生命活动事件,对深入了解相关生理和病理过程、疾病诊断和治疗具有十分重要的意义。虽然传统荧光分子探针技术得到了很大地发展和改善,其在生化分析领域也得到了广泛地应用,但是传统荧光分子探针存在耐光漂白能力差、生物背景荧光较大、组织穿透深度低以及不能原位成像等缺点,这些在很大程度上限制了荧光探针在生物体内的应用。为了更好地满足生物分析实际应用的需求,设计和开发性质优良的荧光探针仍然是当前研究的热点。
  实时监控细胞、活体内生物分子的浓度变化和分布情况对于研究其生理和病理功能、鉴定疾病生物标志物以及疾病的早期诊断具有非常重要的意义。基于荧光探针的荧光成像技术因具有灵敏度高、能够实现时空分辨成像、对活细胞和组织损伤小等优点,已成为监测疾病生物标志物强有力的工具。双光子荧光共聚焦成像以低能量的近红外光作为激发光源,具有更好地三维空间定位能力,更深的组织穿透能力,可降低光漂白和光损伤等优点,近年来得到了越来越多的关注。近红外荧光探针在活体成像中具有不可替代的优势,一直是研究的热点。然而大多数的荧光探针不能够实现目标物的原位成像,且荧光分子容易扩散导致荧光信号衰减较快,固态发光类荧光探针为解决这些问题提供了新的思路。
  本论文以长波长激发技术能够消除生物背景干扰、固态发光探针能够提高细胞内自定位能力为出发点,结合双光子荧光成像技术、近红外荧光成像及固态发光荧光染料的优势,构建了一系列新型灵敏度高、选择性好的分子荧光探针,并成功将其应用于与生命活动密切相关的小分子、酶等目标物的检测和生物成像研究。基于分子荧光探针的设计策略,构建了一个诊疗分子前药,用于肿瘤的化学/光动力学联合治疗。具体内容如下:
  (1)设计并合成了增强型双光子荧光探针用于检测光动力学治疗过程中产生的单线态氧。在第二章中,我们将线粒体靶向基团三苯基膦盐修饰在一种具有D-π-A结构的萘酐衍生物双光子荧光团上,并与单线态氧的捕捉基团9-甲基蒽连接起来,得到一个能够靶向线粒体的双光子单线态氧探针 MNAH。9-甲基蒽对荧光团有着PET荧光猝灭机制,单线态氧和9-甲基蒽的特异性反应能够破坏后者的结构,成功的禁阻了PET过程,实现了对单线态氧荧光增强型检测。探针 MNAH对单线态氧响应快速,具有很好的选择性及线粒体定位能力。MNAH成功用于细胞和组织光动力学治疗过程中单线态氧的成像检测。
  (2)传统的双光子荧光染料的发射波长较短(<500 nm),这个波段的光不利于穿透组织,这限制了双光子荧光探针在深层组织中的成像研究。在第三章中,我们设计合成了红光发射的双光子荧光探针平台 NpRb。我们将 D-π-A结构的萘衍生物双光子荧光团与具有红光发射的 BODIPY衍生物通过共轭键链接起来,得到了具有大的双光子活性吸收截面、双光子近红外激发、红光发射的荧光探针平台。这种设计方法拓宽了双光子染料的种类,解决了传统双光子染料发射波长短的问题。以苯硫酚作为模型构建了荧光探针 NpRb1,该探针表现了非常高的双光子荧光能量转移效率,实现了苯硫酚化合物的高灵敏、高选择性地检测,将其用于组织成像,得到了较深的组织穿透深度(90-220μm)。
  (3)近红外荧光探针具有降低生物组织自发荧光、提高组织穿透深度等优点。在第四章中,我们设计合成了一个具有近红外激发近红外发射的荧光探针NALP,用于ALP活性检测。ALP是一种水解酶,催化水解蛋白质、非蛋白质底物的去磷酸基团过程。在很多组织器官中有表达,如肝、骨、肾。在一些疾病中ALP的活性会升高,因此在临床上,其已经被用于疾病诊断。在探针 NALP中,磷酸酯基团保护了荧光团的羟基抑制了探针的荧光,ALP特异性水解探针的磷酸酯基团,增强了探针的分子内电荷转移,实现了荧光增强。该探针对ALP具有很好的选择性和高灵敏度。在pH8.0的缓冲溶液中,荧光增强57倍,对ALP的线性响应范围为1 U/L-30 U/L,检测下限可达0.28 U/L(3σ/slope)。更重要的是,我们将NALP用于细胞、肿瘤组织及活体肿瘤内的ALP的成像研究,取得了令人满意的结果,表明了该探针在生物体系中的实际应用价值。
  (4)精准医疗是目前的研究热点。亚细胞靶向肿瘤治疗和原位监测治疗效果是非常有意义的研究。PDT被认为是一种比较安全的微创治疗。基于分子探针设计策略,我们设计合成了一个线粒体靶向的化学/光动力学联合治疗小分子前药。我们开发了一个能够被H2O2激活的近红外光敏剂NPS-H2O2,进一步将其与5'-脱氧-5-氟尿苷(5′-DFUR)结合起来,得到一个联合光敏剂和化疗药物的小分子前药PNPS。PNPS能够很好靶向线粒体,并被肿瘤细胞过表达的H2O2激活,释放近红外光敏剂和5′-DFUR,进而有效的杀死肿瘤细胞。PNPS是一个多功能线粒体靶向的分子诊疗药物,实现了肿瘤细胞成像,治疗,原位监测治疗效果等多重功能,突出了分子探针设计的重要性。
  (5)基于固态发光染料的优点,在第六章我们设计合成了一个新型的基于激发态分子内质子转移的固态发光染料 HTPQ,并且基于它设计了一个肿瘤标志物—碱性磷酸酶(ALP)的探针 HTPQA。固态发光染料,如四苯乙烯、HPQ,用于探针的设计已经被大量报道。然而,四苯乙烯或者HPQ的最大激发波长都在350 nm,这不利于这类探针在生物成像检测中的应用。因此,我们开发了一种新型固态发光染料,它的最大激发和发射波长分别在410 nm和550 nm,其荧光和疏水性质都可以通过保护其羟基来调控。HTPQA在水溶液里面没有荧光,当 ALP剪切掉磷酸酯基团后,释放了强疏水的 HTPQ,进而聚集,荧光显著的增强。细胞成像表明,HTPQA具有自定位原位成像的能力。同时,基于4-甲基-7-羟基香豆素的对比探针则在细胞内快速扩散,也无自定位原位成像能力。因此探针 HTPQA克服了传统水溶性染料易扩散信号易衰减的缺点,展现了原位成像的能力。同时,我们将HTPQA用于骨肉瘤细胞和骨肉瘤切片中ALP活性的检测,成功的证明了不同骨肉瘤中的ALP活性不同,突显了探针在骨肉瘤诊断中的应用潜力。
[硕士论文] 王晶
应用化学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在本论文中,运用酶活力的分析方法、DLS法及界面性质研究的张力及扩张流变法等研究了碱性蛋白酶溶液随放置时间的增加其界面性质的变化情况;并用多个界面吸附模型将碱性蛋白酶的平衡界面张力(空气/水、正己烷/水界面)进行了拟合,比较了碱性蛋白酶在两个不同界面上的吸附。
  本论文首先研究了不同质量分数的碱性蛋白酶溶液随放置时间的增加,其酶活力、粒径和Zeta电位、界面张力和界面扩张流变的变化。
  本实验测定了不同质量分数的碱性蛋白酶酶活力、粒径和Zeta电位、界面张力和界面扩张流变随放置时间的变化。随碱性蛋白酶溶液放置时间的增加和质量分数的增大,溶液中蛋白酶分子的粒径增大、Zeta电位下降,碱性蛋白酶溶液体系不稳定,溶液内蛋白酶分子趋向于发生聚集。在体相溶液中,碱性蛋白酶分子发生聚集首先导致了碱性蛋白酶的活力下降甚至失活,其次还改变了蛋白酶分子从体相扩散到界面的动力学。碱性蛋白酶溶液在水气界面的平衡张力值增大且随着时间的增加,界面吸附趋于平衡,由此引起了界面膜的弹性和机械强度全部下降的改变。
  本论文其次主要研究了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的吸附情况。
  本实验主要运用界面张力、界面扩张流变及用不同吸附模型对空气/水界面和正己烷/水界面的平衡界面张力拟合,研究了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的吸附情况进行了比较研究。首先,分别测定了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的动态界面张力随时间的变化关系;其次,用不同的吸附模型对不同浓度碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的平衡界面张力进行了拟合;此外,在一定的频率范围内,对不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的总模量随碱性蛋白酶浓度的变化情况进行测定,进一步研究碱性蛋白酶在空气/水界面和正己烷/水界面的的界面性能并进行比较。
[硕士论文] 王琴
化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:随着生命科学的迅速深入发展,准确地实现对与生命过程相关的生物酶和小分子物质进行快速分析对医药开发、临床诊断和环境保护领域具有重要的意义。纳米材料因具有独特的物理化学性质,如量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等,使其在光学,电学和磁学等方面展示出不同于大尺寸材料的性质,而被广泛应用于催化领域和生物分析领域。因此本论文利用合成的新型金属纳米材料(包括币族金属-巯基纳米材料和石墨烯/磷化铁复合材料)的特殊性质,开发了一系列用于与疾病相关的重要生物酶活性的检测及电催化析氢的传感平台。研究工作的具体内容包括以下方面:
  (1)基于辅酶A(CoA)小分子与硝酸银原位形成的一种核酸类似物CoA-Ag(I)配位聚合物(CoA-Ag(I) CP),我们开发了一种简单、灵敏的柠檬酸合酶(CS)活性电化学检测方法。首先,CS可以催化乙酰辅酶A(Ac-CoA)和草酰乙酸(OAA)之间发生缩聚反应,生成柠檬酸盐和CoA。由于巯基对Ag(I)有很强的配位作用,将CoA与硝酸银混合反应后可获得CoA-Ag(I) CP。生成的CoA-Ag(I) CP通过骨架侧链上配体中的腺嘌呤基团可与石墨烯(GO)作用从而修饰到玻碳电极表面(标记为CP/GO/GCE),并且我们通过电化学实验证明了CP/GO/GCE具有特殊的H2O2电催化活性。在优化条件下,CS的检测限低至1.65 mU/μL,线性范围为0.0033至0.264 U/μL,该方法具有简单、高灵敏和高特异性等优点,基于此方法还可进一步用于抑制剂的筛选,这对CS相关的生物研究,临床诊断和药物研发方面具有重要的意义。
  (2)基于上一章中合成的金属-巯基配位聚合物的特殊性质,我们在这里选择硫代胆碱(TCh)作为配体,将其与Cu(II)混合后可形成TCh-Cu(II) CP,利用此聚合物我们构建了一个新颖的、超灵敏的电化学传感平台用于乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的检测和抑制剂筛选。首先利用 AChE在一定条件下可以催化底物乙酰硫胆碱(ATCh)发生水解,生成含巯基的电活性物质硫代胆碱(TCh),将产物TCh与CuSO4混合作用后,获得类似于阳离子聚合物的TCh-Cu(II) CP。由于石墨烯表面含有大量的羧基,带正电荷的TCh-Cu(II) CP可以通过静电作用吸附到石墨烯表面。随后我们发现该聚合物具有明显的电催化特性,能够催化邻苯二胺(OPD)发生氧化,根据产生的电化学信号强度可对 AChE进行定量。通过这个方法获得的检测范围为0.05 mU/mL至100 mU/mL,检测限低至0.03mU/mL,并且进一步对AChE的抑制剂进行了筛选。
  (3)利用简单的水热法合成出三维石墨烯/普鲁士蓝(rGO/PB)前驱体。然后再经过煅烧和低温磷化过程,得到三维石墨烯/磷化铁(rGO/FeP)复合材料,并利用XRD,TEM和EDX对其进行表征。同时我们还对反应物物石墨烯(GO)与铁氰化钾(K3[Fe(CN)6]·3H2O)的质量配比进行了优化。通过线性扫描伏安法表征其在0.5 M电解质溶液H2SO4中的析氢催化性能,我们发现其塔菲尔斜率为94 mv·dec-1。
[硕士论文] 黄秀
化学 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:高通量质谱技术对于食品安全、组学研究、环境健康等许多领域都极其重要。纳米材料由于其极小的孔径、巨大的比表面积、优异的光电性能、极强的吸附能力,已经被用于电化学、光学、催化、吸附和净化、电子器件等各个领域。纳米材料作为质谱探针时,其吸附性能使得它具有富集目标分析物的能力,同时其优异的光吸收及能量传递能力使其能够促进目标分析物的解吸与离子化。尤其是碳纳米材料,它在光学吸收和能量传输方面的能力更为突出。但是当应用于实际复杂样品的分析时,传统的碳纳米材料由于具有易于发生团聚、抗基质干扰的能力较差、质谱背景噪音大等缺点限制了它们的应用。因此,开发新的碳纳米质谱探针对于高通量分析、复杂样品检测以及环境健康研究具有重要意义。基于此,本文开发了三种新型的基于碳纳米材料的质谱探针,并将其应用于复杂样品中的环境污染物的高通量筛查和鉴定。主要内容如下所示:
  1.首先,我们开发了有序介孔碳来作为一种新型的表面增强激光解吸离子化(SELDI)探针,能够快速、灵敏地富集和检测单滴人全血中的痕量有毒污染物,并且不需要复杂的样品前处理过程。有序介孔碳不仅能有效地富集小分子量有毒化合物,排除全血中大分子样品基质的干扰,而且能够作为一种高效的基质辅助激光解吸离子化(MALDI)基质促进小分子化合物的电离。使用这种新方法能够非常灵敏地检测一些典型的污染物(如PFOS, PCP, BPS, BDE-47等),检测限可达到 ppt的浓度水平,且检测重复性好,背景干扰少。用有序介孔碳作为 SELDI探针,我们从全氟化工厂工人的单滴全血中成功鉴定和筛选出了六种全氟化合物,分析结果与传统的高相液相色谱-质谱联用方法完全一致,证明该方法是一种非常准确可靠的快速筛查方法,因此具有良好的应用前景。
  2.然后,我们开发了一种新型的质谱探针——氟化石墨烯——用于复杂样品中的新型环境污染物的高通量鉴定与筛查。氟化石墨烯是通过亲和剥离氟化石墨的方法合成的。由于氟化石墨烯特殊的化学结构和自组装的特性,在用作基质辅助或表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-或 SELDI-TOF MS)中的基质或探针时,氟化石墨烯能够获得比其它石墨烯材料更高的灵敏度(检测限可达到 ppt甚至低于 ppt的浓度水平)和更好的重现性。用氟化石墨烯作为 SELDI探针,我们能够快速定量检测纸制品和高脂肪含量的罐头食品中的痕量双酚S。我们还利用氟化石墨烯探针从市政污水处理厂收集的污泥样品中成功鉴定和筛查了多达28种季铵卤化物,分析结果与传统的高相液相色谱-质谱联用方法完全一致,证明该方法是一种非常准确可靠的鉴定筛查方法。这些结果表明氟化石墨烯探针在复杂样品的高通量质谱分析方面具有很好的应用前景。
  3.作为一种新型的环境污染物,短链氯化石蜡(SCCPs)被认为是一类极具挑战性的目标分析化合物。所以我们发展了一种基于石墨烯基质和2,5,6,9-四氯癸烷内标的MALDI-TOF MS定量检测SCCPs的新方法,并将其用于快速高通量筛查复杂样品中的SCCPs。我们发现使用石墨烯作为基质能够获得很强的SCCPs质谱信号,且背景噪音很低。我们详细讨论了SCCPs的离子生成机制。在最优的条件下,SCCPs的检测限可达0.1-0.9 ng/mL,这个结果显著低于之前的报道。而且与之前的方法相比,该方法还具有其它明显的优势,比如极短的分析时间(<30 s)和不需要复杂的样品前处理过程等。该方法已经成功应用于快速筛查室内灰尘样品中的SCCPs以及高通量监测人体SCCPs的暴露水平,结果已经通过气相色谱-负化学电离四极杆飞行时间高分辨质谱的方法进行了验证。这一工作不仅提供了一种简单、快速、高通量、灵敏的筛查SCCPs的方法,也通过这一类复杂化合物的分析进一步证明了石墨烯基质在MALDI中的应用潜力。
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