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[硕士论文] 秦敬如
制药工程 青岛科技大学 2019(学位年度)
[博士论文] 洪小月
病理学与病理生理学 华中科技大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 毛如雪
神经病学 华中科技大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 张晓军
儿科学 河北医科大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 陈昇
机械电子工程 哈尔滨工业大学 2017(学位年度)
摘要:细胞粘附是一种对所有多细胞和单细胞生物都极其重要的基本现象,在组织生长、细胞间交流、细胞迁移、细胞新陈代谢、发炎和感染中起着重要的作用。对细胞粘附力的研究有助于揭示生命的奥秘,促使新的疾病诊断和治疗手段诞生,推动纳米生物力学的进一步发展,甚至为生物的基因改造提供信息。在众多的方法与技术中,原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)以其测力精度高、范围广且能在生理环境中检测等优势成为纳米生物力学中应用最广泛的研究手段之一。
  基于自主研发的纳米机器人,本文应用改进的AFM单细胞力谱法对哺乳动物细胞的粘附力进行定量研究。在保持AFM单细胞力谱法高精度的同时,采用中空探针吸附细胞,代替了传统探针的化学修饰,提高了细胞粘附力的测试效率,为细胞力学的研究提供了新的测试技术与方法。主要研究内容包括:
  首先,本文改进了传统的AFM单细胞力谱法,采用中空探针代替传统AFM探针。设计了中空探针气动装置,使中空探针内产生负压而吸附细胞,减少了固定细胞与标定探针所花的时间,提高了测试的效率。同时,该方法允许细胞和基底长时间的接触,扩大了粘附力的测量范围。
  接着,本文对中空探针负压提拉细胞的过程进行了模拟。基于薄膜-液体连续介质粘附模型提出并建立了贴壁细胞的力学模型,利用有限元法对不同内径的中空探针负压提拉细胞的过程进行了仿真,得到了探针内径大小对细胞形变与应力的影响。
  其次,本文分析了外力作用下粘附分子连接(Adhesion Molecular Bonds)的解离反应。基于液体中分子连接受力解离的布朗运动动理学理论,分析中空探针负压提拉细胞过程中粘附分子连接特性,得到了外力及其加载速率对粘附分子连接解离反应速率、寿命、强度的影响规律。
  最后,本文采用改进的AFM单细胞力谱法对细胞与基底的粘附力进行测量。测量结果精确、效率高、范围广。应用该方法可以得到细胞粘附力与探针上升速度关系以及细胞粘附力与时间的关系。
  基于纳米机器人系统,改进的AFM单细胞力谱法能够在液相中对细胞进行三维操作和粘附力测试,对纳米生物力学的研究具有推动效应,并为纳米科学的研究提供了新的途径。
[硕士论文] 贾龙略
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:miRNA的作用是通过同靶mRNA的3'端靶向结合降解或者是抑制其靶基因翻译,进而可以对靶基因的转录后进行调控。另miRNA可识别相应的靶基因且不是单一映射关系,同时存有多个不同miRNA调控同一靶基因,而miRNA也可以调控多个不同的靶基因。我们前期预测发现斑马鱼中nup4是miR-203的靶基因,并且在三唑磷,化学名称O,O-二乙基-O-(1-苯基-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酸酯的胁迫下nup43的表达受miR-203的调控。
  本研究利用MicrocosmTargets软件预测得出nup43为miR-203与miR-217共同调控靶基因,通过实验验证了这2个miRNAs分别与nup4之间的关系。评估了三唑磷暴露下斑马鱼中这2个miRNAs的表达,研究2种miRNAs能否调控nup43的表达,结果发现随着三唑磷处理浓度的升高,斑马鱼中miR-203基因的表达量显著上调,斑马鱼中miR-217基因的表达量显著下调。miRNA可作为环境化学物质或致癌基因得生物标记物。为了解释三唑磷处理后miRNA表达的变化,进一步验证生物信息学预测的结果。我们通过将nup433'-UTR中miR-203和miR-217结合位点分别敲除,成功构建了2个重组海肾荧光素酶载体,分别命名为pRL/S-K.O-203、pRL/S-K.O-217。通过双荧光素酶报告基因法验证了斑马鱼nup433'-UTR中存在miR-217的结合位点。通过对ZF4细胞转染miR-217 mimic后,检测细胞中nup43的表达量,发现nup43在mRNA水平及蛋白水平都显著下调,而转染miR-217 inhibitor后,nup4的mRNA水平及蛋白水平则显著上调,但对ZF4细胞转染miR-203mimic后,其nup43表达量为上调,但转染miR-203 inhibitor后,其nup43表达量为显著下调。依上述可得,nup43是miR-203和miR-217的靶基因,在三唑磷暴露下miR-203与miR-217的变化表明其可以作为暴露于三唑磷环境的生物标志物。
[博士论文] 江莹
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:癌症独特的能量代谢方式是其恶性表型的标志性特征之一,发展针对癌症能量代谢的治疗手段将是实现癌症有效治疗的新方向。有多篇报道指出细胞小窝结构的成分蛋白:小窝蛋白1(caveolin-1, Cav-1)与细胞能量代谢密切相关,同时小窝结构也是细胞与外界环境进行信息交换的桥梁,其运动性是其功能发挥的基础。本文通过研究Cav-1/小窝结构内吞及运动性信号途径,以及Cav-1和线粒体之间的相互作用,揭示Cav-1在细胞能量代谢中所扮演的角色,以及Cav-1运动性的关键作用,取得的主要研究成果如下:
  1. RalA调节Cav-1/小窝依赖的内吞过程:(a)通过考察牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin)诱导的内吞过程中RalA活化状态的变化,证明内吞过程可触发RalA活化。(b)通过检测RalA持续活化突变体和显性负突变体对内吞以及RalA,Cav-1结合水平的影响,说明内吞过程的实现以及RalA与Cav-1的结合都需要RalA活化。(c)利用siRNA的方法抑制RalA的表达,同时转染质粒恢复其表达,对比抑制前后以及恢复表达后内吞水平的变化,证明RalA是Cav-1/小窝内吞的重要调节分子。
  2. RalA通过活化下游效应分子PLD(Phospholipase D)调节Cav-1/小窝依赖的内吞:(a)通过研究PLD非特异性抑制剂对内吞的影响,证实PLD活化对内吞的促进作用。(b)采用PLD1和PLD2特异性抑制剂确定只有PLD2是内吞的调节分子。(c)PLD2抑制剂和突变体对Cav-1-RFP运动性的抑制再次证实PLD2在此过程中的重要作用。(d)通过PA感应器GFP-PASS(phosphatidic acid biosensor with superior sensitivity)观察内吞过程中PLD2下游产物PA(phosphatidic acid)在小窝生成并由此促进Cav-1/小窝依赖的内吞。
  3. Cav-1抑制引起线粒体形态学的改变:(a)采用siRNA的手段抑制Cav-1的表达,同时观察线粒体形态,发现线粒体呈现片段化和增长的双重改变。(b)利用PA-GFP(photoactive-GFP)在线粒体的扩散程度量化线粒体的基质融合程度,此结果亦可代表线粒体的动态水平。对比Cav-1抑制前后,发现抑制后细胞的线粒体有更高的动态水平。(c)通过FRAP(fluorescence recovery after photobleaching)方法测试基质蛋白的运动速率,进一步强化Cav-1抑制提升线粒体动态水平的结论。
  4. Cav-1通过抑制Mfn2和Drp1的线粒体定位改变线粒体动态:(a)线粒体组分分离发现抑制Cav-1,Mfn2和Drp1在线粒体的表达量增加。(b)通过免疫共沉淀和FRET(fluorescence resonance energy transfer)的方法证实Cav-1分别与Mfn2和Drp1二者结合。(c)免疫荧光染色同样检测到抑制Cav-1时Drp1在线粒体的定位增加。(d)引入ER和线粒体的人工链接分子OMM-ER-mRFP加强ER和线粒体交互,发现Mfn2在Cav-1抑制的情况下发生ER回流,说明Cav-1可能通过调节ER和线粒体交互来调整Mfn2在二者的表达水平。
  5. Cav-1的抑制是线粒体自噬的诱因:(a)对比Cav-1抑制前后线粒体比量的变化发现Cav-1抑制导致线粒体比量减少。(b)通过对比细胞自噬标志分子表达量,发现Cav-1抑制细胞的自噬水平升高。(c)引入mt-Keima检测线粒体自噬,证实Cav-1的低表达可诱导线粒体自噬的发生。
  6. RalA通过Cav-1影响线粒体功能和细胞能量代谢:(a)采用siRNA的手段实现RalA和Cav-1的单独和共同抑制。(b)检测MMP,ATP,H2O2和糖酵解产物L-lactate的生成,发现RalA和Cav-1抑制的细胞中出现MMP和ATP生成的降低以及H2O2和L-lactate的增加,并且RalA和Cav-1共同抑制时与单独抑制Cav-1结果无异,证明RalA的作用是借Cav-1发挥的。
  总之,本论文通过对Cav-1/小窝内吞途径的分析确立了RalA在此过程中的重要调节作用,并证实该作用是通过其下游效应分子PLD催化PA在小窝生成而实现的。通过研究Cav-1与线粒体的关系,发现Cav-1抑制Mfn2和Drp1的线粒体表达进而调节线粒体动态水平和线粒体自噬。最后将RalA和Cav-1联系起来,说明Cav-1的表达水平和运动性均能对线粒体功能和细胞能量代谢带来重大影响。
[硕士论文] 张俊有
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的恶性肿瘤,多发于成人,肝癌的发生、发展和转移是一个复杂的过程,受多个因子和基因的调节。微小核糖核酸RNA(MicroRNA,miRNA)是一类长度在19-24个核苷酸范围内的内源性非编码RNA,miRNA能够通过与靶基因mRNA3' UTR互补结合来抑制翻译或者促进mRNA降解,从而调控相关基因的表达。大量研究报道称miRNA在许多肿瘤细胞中都存在差异性表达,并且在肿瘤的发生发展中都可能发挥着重要的作用。实验室前期的研究发现一定浓度的脐带间充质干细胞(Umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)条件培养基能够抑制肝癌细胞HepG2的增殖,并且通过高通量测序技术,分析了UC-MSCs条件培养基共培养后HepG2 miRNAs的差异表达谱,找到了一些可能相关的miRNAs。其中miR-3065-5p和miR-1307-5p在UC-MSCs条件培养基处理HepG2后表达水平显著上调。
  本研究通过qRT-PCR检测了三种肝癌细胞系(HepG2、MHCC97-L、MHCC87-H)和正常肝细胞系L02中miR-3065-5p的表达是否存在差异;结果显示,相较正常肝细胞L02,miR-3065-5p在肝癌细胞系中的表达明显下调,接下来我们通过体外合成miR-3065-5p质粒转染三种肝癌细胞,结果发现过表达miR-3065-5p能够显著抑制三种肝癌细胞的增殖、侵袭、克隆形成能力。此外,我们通过生物信息学预测到SATB1可能是miR-3065-5p的相关靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验进一步检测了预测的可靠性,实验结果显示SATB1与miR-3065-5p存在互补结合位点。qRT-PCR与Western blot结果显示过表达的miR-3065-5p能够显著抑制SATB1表达水平。最后通过体外合成siRNA干扰SATB1在肝癌细胞中的表达,结果显示,干扰SATB1后也能显著抑制肝癌细胞的增殖,其效果与miR-3065-5p类似。在miR-1307-5p的研究中,我们发现过表达的miR-1307-5p也能显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等生物学特性,而在靶基因的筛选验证中,我们通过生物信息学软件预测了PIM3可能是miR-1307-5p的靶基因,但是双荧光素酶报告基因实验效果并不明显,说明PIM3并不是miR-1307-5p的相关靶基因,其靶基因有待进一步筛选验证。
[硕士论文] 赵卫明
生物学·细胞生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:作为一种胰蛋白酶抑制剂,丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅰ(serine peptidase inhibitor, Kazaltype1,SPINK1)的空间结构与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)的非常相似。研究表明,SPINK1的生物学功能也类似于EGF,能够促进正常细胞和癌细胞的增殖和分化。本实验室采用大鼠全基因组芯片Rat Genome2302.0检测2/3部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后再生肝肝细胞的基因表达谱,发现Spink1在肝切除后的6、24和72 h表达显著上调。众所周知PH后6-72 h肝细胞增殖明显,表明Spink1与大鼠再生肝肝细胞的增殖密切相关。基因组芯片检测二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DENA)诱导的大鼠肝癌细胞的基因表达谱,发现Spink1在诱导后的12和16w表达显著上调,并且诱导后12-16w肝细胞增殖明显,表明Spink1与大鼠肝癌细胞的增殖密切相关。然而,目前对SPINK1调控肝再生中肝细胞,以及肝癌细胞增殖的机理还不完全清楚。研究表明,SPINK1能够与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)相结合,调控细胞的增殖、分化和迁移等多种生理活动。本文通过免疫共沉淀(immunoprecipitation assay, IP)的方法也发现SPINK1能够与EGFR相结合。最近的研究表明EGFR被生长因子等激活后,能够通过p38MAPK、ERK、JNK、PKC、JAK-STAT和AKT等多条信号通路促进细胞的增殖。本文通过IPA(Ingenuity Pathway Analysis9.0)软件,结合相关文献分析SPINK1与EGFR信号通路的互作网络,发现SPINK1可能与EGFR结合后通过上述6条信号通路调控细胞的增殖。
  本研究通过基因添加的方法处理BRL-3A细胞,并用重组蛋白处理BRL-3A细胞和RH-35细胞,通过MTT、EdU、流式细胞术等方法检测SPINK1上调表达对上述两种细胞活力、增殖和周期等的影响,通过免疫共沉淀、qRT-PCR和western blot等方法推测SPINK1调控两种细胞增殖的机理。结果表明,通过基因添加的方法上调BRL-3A细胞内源性Spink1的表达后,细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显增加,然而,G1期的细胞数量和促凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。通过qRT-PCR和western blot等方法检测SPINK1信号通路相关基因/蛋白的变化,发现p38,ERK和JNK信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。当用外源性的重组大鼠SPINK1蛋白(rat recombinant SPINK1,rrSPINK1)处理BRL-3A细胞时,所得到的结果与上述结果相似。当用rrSPINK1处理RH-35细胞时,我们发现与处理BRL-3A细胞所得到的结果相似,RH-35细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显提高,G1期的细胞数量和凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。qRT-PCR和western blot检测结果表明,在RH-35细胞中,p38和JAK-STAT3信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。本文用pEGFR抗体处理稳定表达内源性Spink1的阳性单克隆BRL-3A细胞发现,该细胞的生长活力受到明显的抑制,并且抑制效果随着抗体剂量的增加愈加明显,进一步验证了SPINK1与EGFR结合后发挥其相应的功能。
[硕士论文] 谷鑫
光电子学 宁波大学 2017(学位年度)
摘要:近些年,在随着分子生物学不断发展的同时,人们对于癌症病理和病因的认识也在不断的加深,尤其是肿瘤标志物的发现,对癌症早期的诊断、检测和治疗评价以及对高危人群随访等都具有极大的使用价值。肿瘤标志物是指恶性肿瘤细胞分泌、脱落在体液或组织中的物质,能够反映肿瘤存在的化学类物质,它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织,或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量。由于肿瘤标志物是以数值的形式反应体内肿瘤细胞的数量,所以对肿瘤的监控可通过肿瘤标志物的检测来完成,从而为肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导提供信息支持。在二十世纪八十年代, A.Ashkin等研究员率先提出单光束激光光镊技术并通过实验验证该技术的可行性。他通过强聚焦的激光产生的高斯光束来提供足够强的梯度力,从而完成了光对微粒的操控。这一研究成果为探索微小物体的结构和性质提供了技术支持,也开启了人们对生物分子领域研究的新时代,这对于了解肿瘤标志物的生物特性和癌症治疗等方面具有重要意义。
  我们首先采用 St?ber法和种子法制备表面光滑、大小均一的微米尺度的SiO2微球作为链接抗原或抗体的载体。之后,通过脱水缩合反应在 SiO2微球表面修饰氨基,增强 SiO2微球表面的生物偶联性;再通过氨基与蛋白质(即抗原和抗体)羧基的反应,使抗原或抗体与不同尺寸的 SiO2微球链接。其次,我们利用层流原理将自制的多通道层流平台与双光束光镊系统相结合,对连接有不同抗原和抗体的微球进行相互作用力的测量,以此得到前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)与它们相对应的抗体之间的特异性结合力的力谱。实验结果表明,AFP/抗AFP抗体和PSA/抗PSA抗体之间的结合力是特异性的,大小分别为47.23±1pN和69.38±1 pN,其差别源于抗原分子的抗原决定簇和抗体分子的亲和常数的不同。最后,我们研究了生理环境对抗原和抗体特异性结合的影响。结果表明,在不同的电解质和 pH值生理环境中 AFP/抗 AFP抗体和 PSA/抗PSA抗体这两种抗原/抗体的结合力呈现相同的变化趋势,并对此进行了机理分析。这不仅有利于深入了解肿瘤标志物(抗原)的性质,也在临床医学领域具有潜在应用。
  本论文由五个章节组成。第一章主要对光镊技术产生的背景、发展历程、研究现状及其在生物学中的应用进行了概述,并且介绍了论文的选题意义和研究内容。第二章重点阐述了光镊技术的基本原理,定性分析了光的辐射压力及其梯度力和散射力的产生,光俘获颗粒的运动理论并给出了光阱的束缚条件。第三章则详细介绍了微米级 SiO2微球的制备和表面修饰氨基以链接抗原或抗体的过程,同时介绍了利用自制的多通道层流池与光镊系统的结合进行抗原/抗体特异性结合力的测量过程,并分析了AFP/抗AFP抗体和PSA/抗PSA抗体结合力的力学特性。第四章研究不同生理环境(即电解质环境和 pH环境)对抗原/抗体特异性结合力的影响。第五章对研究工作进行了总结和展望。
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