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[硕士论文] 何爱华
养殖 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究拟以小鼠肌肉C2C12细胞系为研究材料,构建骨骼肌细胞热应激模型,通过两个试验:1)考察热应激对小鼠肌肉C2C12细胞分化的影响,并考察在此过程中硒蛋白表达的变化;2)比较两种不同硒源对小鼠肌肉C2C12热应激的缓解效应并探索其可能机制。主要内容及结果如下:
  实验一:热应激对小鼠C2C12成肌细胞分化及硒蛋白表达的影响。
  选择小鼠C2C12成肌细胞作为试验材料,构建肌肉细胞热应激模型,考察热应激对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响,同时考察硒蛋白表达的变化。采用单因子试验设计:C2C12细胞首先于37℃二氧化碳培养箱中培养2~3d至铺板率达到80%;然后分成2组进行成肌分化诱导:对照组于37.0℃培养4、6、8d;热应激组于41.5℃培养4、6、8d,采用定量PCR技术考察24个硒蛋白基因、2个分化相关基因、2个能量调控基因和2个凋亡基因表达,采用Western-blot考察了HSP70、MYOGENIN蛋白及5个硒蛋白的表达。
  研究结果表明:(1)热应激抑制了C2C12细胞分化和损伤了肌肉肌管的发育,下调了(P<0.05)C2C12细胞MYOD、MYOGENIN基因和MYOGENIN蛋白的表达,同时上调(P<0.05)HSP70、BCL-2/BAX基因和蛋白表达;(2)热应激4、6和8d后分别上调了(P<0.05)C2C12细胞中18、11和8个硒蛋白基因,热应激6和8d后仅下调(P<0.05)了DIO2基因表达;(3)热应激6d上调了(P<0.05)C2C12细胞GPX1、GPX4和SELENON蛋白的表达,下调了(P<0.05)SELENOS蛋白的表达。热应激对骨骼肌细胞成肌分化造成损伤的同时伴随着大量的硒蛋白基因和蛋白的上调表达,这预示着硒蛋白在热应激条件下可能对分化的骨骼肌细胞起着某种保护作用。
  试验二:不同硒源对小鼠C2C12成肌细胞热应激的缓解效应及机制研究
  考察不同硒源(硒代蛋氨酸SeMet和亚硒酸钠SS)的添加对分化的小鼠C2C12成肌细胞热应激缓解作用及细胞中硒蛋白表达的影响。C2C12细胞在37℃完全培养液中培养至80%融合时,换2%马血清诱导培养基进行分化诱导,细胞四个处理组:CK组在37℃培养;HS组:在41.5℃培养;HS+SS组:添加终浓度为0.50μmolSe/L的SS后,在41.5℃培养;HS+SeMet组:添加终浓度为0.50μmol Se/L的SeMet后,在41.5℃细胞。处理4、6、8天后收集样品,采用定量PCR技术考察24个硒蛋白基因、2个分化相关基因、2个能量调控基因和2个凋亡基因表达,采用Western-blot考察了HSP70、MYOGENIN蛋白及3个硒蛋白的表达。
  研究结果表明:(1)热应激抑制C2C12成肌细胞分化,并伴随着MYOD和MYOGENIN基因,以及MYOGENIN蛋白表达的降低,同时上调了HSP70基因和蛋白的表达;(2)热应激4、6和8d分别上调(P<0.05)14、10和14个硒蛋白基因的表达,分别下调(P<0.05)1、4和3个硒蛋白基因的表达;(3)与HS组相比,添加SS和SeMet后在不同的时间段均不同程度恢复上调了AMPK、MYOGENIN和MYOD基因以及MYOGENIN蛋白的表达,降低了HSP70基因和蛋白表达、总体而言SeMet组缓解效果优于SS组;(4)与HS组相比,添加SS和SeMet后不同程度恢复上述变化的硒蛋白的表达,硒蛋白基因的表达丰度更接近CK组,总体而言SeMet组与SS组相比硒蛋白基因表达模式更接近CK组;(5)添加SS和SeMet均显著上调(P<0.05)了热应激4d对蛋白SELENON表达,而添加SeMet在热应激6d时SELENON蛋白表达接近正常组。
  综上所述,热应激抑制了小鼠C2C12成肌细胞分化,降低了小鼠肌肉C2C12细胞分化相关基因和蛋白表达,上调了HSP70基因和蛋白表达,与此同时众多硒蛋白基因的表达受到影响,预示这些硒蛋白与细胞热应激的调控之间存在密切的关系;添加SS和SeMet后均可在一定程度上缓解热应激对HSP70和分化相关基因(MYOD和MYOGENIN)和蛋白的影响;SS和SeMet可能是通过调控硒蛋白基因的表达进而发挥缓解细胞热应激的作用。总体而言,在小鼠成肌细胞中有机硒(SeMet)对热应激的缓解作用优于无机硒(SS)。
[硕士论文] 刘悦石
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠上胚层干细胞(mouse epiblast stem cells,EpiSCs)是一种来源于5.5-7.5胚龄(E5.5-7.5)的着床后的胚胎上胚层(epiblast)组织的多能性干细胞。EpiSCs的自我更新能力和多能性的维持主要依赖激活素Activin A(Nodal)/Smad和促成纤维细胞生长因子(FGF/ERK)信号对细胞多能网络进行调控。相比小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,ESCs)的原始(na?ve)状态,EpiSCs被视为一种初发(prime)状态。EpiSCs无论在细胞形态、发育潜能和多能性维持分子机制上都与ESCs具有本质上的区别。
  本研究利用化学成分明确的培养条件,即只添加Activin A和bFGF两种生物活性因子(AF培养条件),在无血清无饲养层细胞的条件下培养小鼠着床后胚龄6.5天(E6.5)的原肠期的上胚层(epiblast)建立AF-EpiSCs细胞系,并对所建立的细胞系进行鉴定。此外,利用本实验室已成熟的诱导体系ABCL,即:Activin A,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP4),CHIR99021和小鼠白血病抑制因子(mouse leukaemiainhibitoryfactor,mLIF)进一步诱导AF-EpiSCs,建立更具多能性的干细胞,命名为post-ASCs(post-Advanced Stem Cells)。并从蛋白水平、分子水平和发育潜能等方面检测post-ASCs的多能性。
  1.建立AF-EpiSCs细胞系
  通过观察AF培养条件下建立的AF-EpiSCs细胞形态学变化、检测细胞生长、染色体核型、免疫荧光、实时荧光定量PCR和体内畸胎瘤分化能力等一系列实验结果,发现利用无血清无饲养层细胞的条件下建系获得的AF-EpiSCs与传统方法建立的EpiSCs的特性基本相同,既具有多能性又具备无限自我更新能力。
  2.post-ASCs多能性检测
  由AF-EpiSCs诱导获得的post-ASCs克隆形态呈圆球状;与ESCs相比,post-ASCs细胞增殖速度更快;碱性磷酸酶染色呈阳性;诱导后染色体数目未出现异常;表达Oct4,Sox2,Nanog,Klf4等多能性基因,且表达水平与ESCs相似。
  3.post-ASCs发育潜能检测
  畸胎瘤实验结果显示,post-ASCs在体内能分化形成内中外三胚层组织;通过制备嵌合体的技术,证明post-ASCs能贡献到E13.5的胎儿及生殖嵴,且能产生健康的嵌合体;更重要的是与ESCs相比,post-ASCs还能贡献到胎盘和卵黄囊组织。
  综上所述,本实验利用化学成分明确的培养条件建立了AF-EpiSCs,并进一步诱导形成post-ASCs。与ESCs相比,在基因表达水平和发育潜能等方面,post-ASCs更具有发育潜能,是一种新型多能性干细胞系。但是关于post-ASCs发育潜能及多能性维持的机理仍需进一步研究。
[硕士论文] 弓红岩
数学 大连海事大学 2018(学位年度)
摘要:抗原-抗体间的相互关系在体液免疫反应当中扮演着非常重要的角色,在特异性位点抗原与抗体结合与抗原决定因子保持一致,B细胞表位作为抗原决定因子之一在B淋巴细胞表面被受体(膜结合抗体)识别和结合。B细胞表位,又称抗原决定因子,是位于抗原表面的一些氨基酸片段。表位能够诱导免疫反应,并且能够被特异性抗体识别,一般来说,基于它的结构特性,B细胞表位可分为两类:线性B细胞表位和构象性表位。线性B细胞表位在生物化学、病毒学、免疫学以及疫苗的研究中起着很重要的作用,因此,对于线性表位预测的计算方法的研究与进展在生物信息和计算生物方面仍的一个很大的挑战。
  特征选择是从总的特征集中选择出能够满足某一种评价标准并且使评价标准达到最优的特征子集。它的目的是根据选择出的子集让分类的性能与进行特征选择之前相比能够达到近似或者更优。经过特征选择之后,一些无关或冗余特征通过机器学习方法被剔除,从而利用剔除多余特征后的特征子集建立一个更加精确的模型。然而如何使用特征选择方法剔除无用或冗余的特征已成为一种挑战。
  目前常用的线性B细胞表位预测的方法大多数是单纯的对于B细胞中提取的特征处理,没有考虑冗余特征的存在。本文主要是提出将特征选择方法与线性B细胞表位预测结合起来,进而将无关特征剔除,最终使得预测精度提高。另外本文还通过支持向量机分类器实验验证不同的特征提取方式对应最优的的特征选择方法是不同的,每一种特征提取方法对应的预测效果也是不一样的。
[硕士论文] 薛济先
生物物理学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:随着生物信息学的飞速发展,出现了大量的未知功能的蛋白质序列,其中细胞凋亡蛋白质得到研究人员越来越多的关注。在生命体中,细胞凋亡蛋白质的异常可能导致多种疾病的发生。这些蛋白质的功能与它们在细胞中的位置紧密相关,因此,准确的预测出细胞凋亡蛋白质的亚细胞位置能更好的了解其功能。
  本文构建了新的细胞凋亡蛋白质数据集,其中包含单定位数据集、多定位数据集以及以单定位为标准的含mRNA信息的mRNA-蛋白质数据集。在单定位预测中,通过特征筛选提取了氨基酸物理化学特性、氨基酸粘性特征和进化信息,并结合了两种mRNA信息:三阅读框3-mer mRNA序列频数信息、mRNA二级结构-序列模式信息,最后将各特征信息融合,利用支持向量机的算法,对四种不同亚细胞位置的细胞凋亡蛋白质进行预测。研究发现融合mRNA信息后预测效果更佳,在Jackknife检验下预测总精度达到82.18%,且独立测试集预测总精度达到78.26%。结果表明,mRNA的序列和结构特性有助于提高细胞凋亡蛋白质的亚细胞定位预测精度。
  多定位预测中,考虑到序列相似性对预测的影响,采用CD-HIT软件将单定位与多定位数据集的序列相似性降至80%以下,筛选出氨基酸二肽组分信息、蛋白质骨架信息、氨基酸物理化学特性和进化信息作为特征参数,采用离散增量的算法对多定位细胞凋亡蛋白质进行预测,融合特征的总体位置准确率能达到79.57%。
[博士论文] 王迪
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及国内外研究进展
  昆虫是世界上种类最多的生物类群,其发育大多数经历蜕皮和变态两种主要的生理过程。昆虫的生长发育主要由蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)控制。在昆虫幼虫阶段JH滴度较高,虫体维持其幼虫状态;在蜕皮变态期JH滴度逐渐降低,而此时20E滴度逐渐升高,最终起始昆虫的蜕皮变态。这两种激素协调控制昆虫的蜕皮与变态过程。研究这一过程的分子调控机制不仅可以为害虫防治提供科学依据,而且可以为研究人类疾病的分子机制提供参考。
  先前研究发现蜕皮激素主要是通过核受体ecdysone receptor(EcR)途径转导信号起始昆虫的变态。近些年,随着分子生物学技术水平的日趋提高,研究人员发现了20E激素信号通路存在非基因组途径。许多信号通路中的蛋白质会发生快速的磷酸化修饰及移位现象。20E也可动员细胞内钙离子的释放及内流。与此同时,20E非基因组途径的膜受体也成为研究的热点。目前在许多物种中都发现了G蛋白偶联受体(GPCR)参与动物类固醇激素的非基因组信号通路,但是具体的机制尚不清楚。
  钙离子是细胞内的第二信使,调控多种生理过程,包括基因转录、细胞增殖和细胞凋亡等。类固醇激素20E在昆虫变态过程中促进程序性细胞死亡,而保幼激素JH拮抗20E的功能来阻止变态的发生。20E和JH都能诱导细胞内钙离子水平的增加。然而,这两种功能相互拮抗的激素诱导钙离子水平增加的分子机制及生理结果仍不明确。在这项研究中,我们筛选到在鳞翅目昆虫棉铃虫中的ErGPCR-2作为靶标基因,研究GPCR在20E非基因组途径中的功能,以及钙离子作为第二信使在20E调控的细胞凋亡中的分子机制。丰富和完善了20E信号途径及昆虫生长发育的理论知识。同时为害虫防治及人类疾病治疗提供靶标基因和科学依据。
  研究结果
  1.G蛋白偶联受体2在细胞膜上控制蜕皮激素信号通路
  在这项研究中,我们筛选到了鳞翅目昆虫棉铃虫中的一个GPCR,命名为ErGPCR-2,在细胞膜上控制类固醇激素20-羟基蜕皮酮信号通路。ErGPCR-2在棉铃虫的蜕皮和变态时期具有较高的表达。20E通过ErGPCR-2调控棉铃虫表皮细胞系中钙离子水平快速变化、有关蛋白质的磷酸化、相关基因的转录以及虫体的变态发育过程。ErGPCR-2定位于细胞膜上,在20E的诱导条件下,ErGPCR-2会被G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)所磷酸化,磷酸化修饰后的ErGPCR-2被内吞入细胞质中。内吞入细胞质后的ErGPCR-2被蛋白酶所降解,最终脱敏20E信号通路。细胞系干扰ErGPCR-2减少了20E的类似物[3H] ponasterone A([3H]Pon A)进入细胞的量。细胞系过表达ErGPCR-2和干扰GRK2阻止ErGPCR-2的内吞,都会增加[3H]Pon A进入细胞的量。然而,我们没有检测到ErGPCR-2蛋白直接结合于[3H]Pon A。结果表明ErGPCR-2在细胞膜上传导类固醇激素20E信号并且控制20E进入细胞。
  2.蜕皮激素促进钙离子动员并引起细胞凋亡
  20E通过GPCR诱导细胞内较强的钙离子水平升高,而JH通过受体酪氨酸激酶(RTKs)诱导较小的钙离子水平增加。钙释放激活钙通道1(Orai1)和瞬时受体电位通道(TRPs Channel),对20E诱导快速钙离子内流是必需的。相对于JH,20E处理细胞会引起钙离子维持在长时间的高水平状态,并且提高了更多的钙通道相关基因的表达,包括Orai1和TRP通道等。20E会激活Caspase3/7和促凋亡基因的表达,而JH不能。JH可以抑制20E诱导的钙内流、Caspase3/7的激活和凋亡相关基因的表达。高水平的钙离子诱导细胞凋亡。这些结果表明,20E和JH通过不同的途径调节细胞内钙并且维持钙离子在不同的稳态水平,因此导致不同的基因表达和细胞生理反应。
  研究结论及科学意义
  1.ErGPCR-2在细胞膜上控制20E进入细胞
  ErGPCR-2定位于细胞膜上控制[3H]PonA进入细胞。ErGPCR-2在细胞膜上调控20E信号通路。这一研究完善了20E非基因组途径的科学知识,建立了基因组途径与非基因组途径的连接,为今后研究20E信号途径提供了全新的理论依据。
  2.蜕皮激素促进钙离子动员引起细胞凋亡
  20E通过GPCR动员细胞内较强的钙水平升高,而JH通过RTKs动员较弱的钙水平增加。20E处理细胞会引起钙离子在细胞质中维持在长时间的高水平状态,20E上调更多钙通道相关基因的表达。20E诱导Caspase3/7活化水平、促进细胞细胞死亡和上调促凋亡基因的表达,高水平的钙离子诱导细胞凋亡。钙离子作为细胞中重要的第二信使,在细胞增殖凋亡过程中发挥重要的功能。20E通过GPCR途径动员钙离子使其维持高水平的稳态,最终细胞中高水平的钙离子诱导了细胞凋亡。这一研究证实了钙离子在细胞凋亡中的功能,不仅为完善昆虫凋亡的分子机制做出贡献,也为癌症治疗中促进癌细胞凋亡提供科学依据。
[硕士论文] 葛磊
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:亚硝酸钠是一种工业化学制剂,常被作为食品添加剂用于肉制品的防腐,增加与保持色泽度。同时,许多地区地下水中亚硝酸盐与硝酸盐含量超标从而导致人们过量摄入。许多研究表明,摄入大剂量亚硝酸钠会增加癌症风险、导致高铁血红蛋白症、氧化应激甚至死亡。然而,亚硝酸盐对女性生育力或胎儿发育影响研究甚少。
  本研究以5周龄的ICR品系雌性小鼠为实验对象,探究亚硝酸钠对雌性小鼠生殖力的影响。实验分为三组连续灌胃21天,分别为:不含有亚硝酸钠的生理盐水作为对照组,低剂量亚硝酸钠组60 mg/kg/天,高剂量亚硝酸钠组120 mg/kg/天。我们检测了灌胃后小鼠卵母细胞形态、纺锤体染色体复合体动力学、线粒体分布、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平、细胞早期凋亡、DNA损伤、组蛋白H3K4me2与H3K9me3修饰、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、产仔情况。实验结果表明,亚硝酸钠导致GV期与MⅡ期卵母细胞数量减少,并抑制卵母细胞极体的排出,增加GV期卵母细胞透明带厚度。同时,亚硝酸钠引发了MⅡ期卵母细胞纺锤体紊乱、线粒体分布异常、ATP水平降低、ROS水平升高、组蛋白H3K4me2甲基化水平上升、早期细胞凋亡增加和DNA损伤,更重要的是,亚硝酸钠的灌胃使雌性小鼠产仔数明显减少。综合上述实验结果,我们认为亚硝酸钠影响雌性小鼠的生殖机能,造成生殖毒性。这些数据为日后亚硝酸盐在食品和其他工业生产中的应用所引起的人类生殖障碍提供了理论基础。
[硕士论文] 朱丽媛
生物化学与分子生物学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:病毒结合到宿主细胞表面然后进入细胞内的这一过程包含了多种因素的参与,其中病毒受体在这一过程起到关键作用,但病毒侵染细胞的过程中不止利用一种受体。探明病毒的受体对理解病毒的入侵过程、新型抗病毒药物的研发有重要作用。家蚕质型多角体病毒(BmCPV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)质型多角体病毒属(Cypovirus)的模式种,BmCPV特异性感染家蚕中肠细胞,引起家蚕中肠型脓病的发生,导致蚕茧产量歉收。目前有关BmCPV的研究大多集中在病毒的形态结构、病毒基因的功能以及家蚕对BmCP V的感染应答等方面,而有关BmCPV的受体以及进入细胞的分子机制方面研究几乎还没有涉及。
  为了探讨BmCP V的感染机制,我们曾通过免疫共沉淀(Co-IP)、病毒覆盖蛋白结合法(VOPBA)、PVDF膜上蛋白相互作用等方法获得了BmCPV的一些候选受体蛋白以及可能与BmCPV互作的宿主蛋白。为了进一步探讨这些蛋白在BmCPV入侵细胞中所扮演角色,在本研究中,通过RNAi分别抑制唐氏综合征细胞黏附分子-1(Down syndrome cell adhesion molecule-1,Dscam)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子受体-1(vascular endothelial growth factor receptor1,VEGFR)、G蛋白偶联受体-125(G-protein coupled receptor125,GPCR-125)、烟碱乙酰胆碱受体亚基β2(nAChR subunit beta2,nAChR b2)、7跨膜超家族成员3(transmembrane7 superfamily member3,TM7SF3)、CD63抗原(CD63 antigen,CD63)、分拣蛋白相关受体(sortilin-related receptor,SOR)、热激蛋白70同源蛋白(heat shock70 kD protein cognate,HSC70)、受体表达增强蛋白4(receptor expression-enhancing protein4,REEP4)和清道夫受体B型1(scavenger receptor class B member1,SCRB)、Nogo受体-1(Nogo receptor-1, NgR1)和闭锁小带蛋白同型 X1(tight junction protein Zonula occludens-1 isoform X1,BmZo-1)基因表达对细胞感染BmCPV的影响,结果显示沉默上述基因的表达均不同程度地降低细胞对BmCPV的感染性,其中沉默REEP4、SOR、VEGFR、HSC70和BmZO-1基因对细胞感染BmCPV的影响最大。将上述5个基因的编码区的部分序列分别克隆进原核表达载体在大肠杆菌中进行表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。抗体封闭试验结果显示,用以上5种蛋白的抗体封闭细胞后,细胞对BmCP V的感染性均明显下降,表明这些蛋白可能是BmCPV受体复合物的成员之一或作为BmCPV的互作蛋白在病毒感染过程中发挥重要作用。
  前人的研究发现酪氨酸蛋白激酶 Src家族64b(tyrosine-protein kinase TPK Src64B-like,Src)和整联蛋白β1(Integrinβsubunit1,Integrin)在哺乳类Reovirus侵染细胞过程中扮演着很重要的角色。Reovirus利用Integrinβ1通过网格蛋白介导的内吞途径内化进入细胞。受体激活蛋白激酶C(Receptor for activated protein kinase C,RACK1)能与Src64B和整联蛋白结合,推测Src64B-like可能通过integrin-RACK1-Src轴在BmCPV入侵过程中发挥功能。为了探讨BmCPV与Src和Integrin的互作,本研究通过免疫荧光检测了BmCPV与Src和Integrin的互作,发现在细胞中BmCPV可与Integrin共定位。BmCPV分别感染Src和Integrin转化细胞,发现上调Src和Integrin表达可增加细胞对BmCPV的感染性。抗体封闭试验结果显示,用Integrin抗体处理细胞可阻止BmCPV对细胞的感染,表明Integrin可与BmCPV直接互作,而Src与 BmCPV可能通过Integrin间接互作,并且在BmCPV入侵细胞过程中发挥作用。
  业已明确细胞表面的神经节苷酯(ga nglios ide s)为哺乳动物呼肠孤病毒(Reovirus)和轮状病毒(Rotavirus)的共受体,但至今不明细胞表面的糖酯能否作为BmCPV的共受体。本研究发现唾液酸酶处理可降低BmN细胞对BmCPV的感染性;用不同浓度Ga nglios ide GM1、ga nglio s ide GM2、Ga nglios ide GM3处理BmCPV病毒粒子,发现GM2处理的BmCPV对细胞感染性下降;进一步用Ganglioside GM2抗体封闭细胞表面的GM2,Real-time PCR和Western blotting检测结果显示,细胞对BmCPV的感染能力下降。上述结果表明GM2是BmCPV的共受体。
  我们曾利用Co-IP、VOPBA、pull-down等方法从提取的细胞膜蛋白中筛选BmCPV候选受体,但此方法的筛选效率较低、鉴定工作量大。BmCPV在感染细胞过程中首先吸附在中肠组织的刷状缘,因此,在本研究中,提取家蚕中肠组织的刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicle,BBMV)蛋白,经双向电泳分离后,通过病毒覆盖蛋白结合法(VOPBA)筛选分离与BmCPV互作的中肠组织微绒毛膜蛋白。通过质谱法共鉴定到11种蛋白,其中,类转铁蛋白(transferrin-like,BmTF)、普通嗅觉结合蛋白(general odorant-binding protein71,OBP71)和ABC转运蛋白家族G成员23样蛋白(ABC tra nspo rte r G fa mily me mber23-like,BmABCG23)具跨膜结构,丝氨酸蛋白酶抑制剂-19(serpin-19)、含CAP-Gly结构域的接头蛋白(CAP-Gly domain-containing linker protein,CLIP)、神经钙蛋白同源体(neurocalcin homolog,BmNCA)、类成虫盘生长因子(imaginal disk growth factor,BmIDGF)、固醇载体蛋白X(sterol carrier protein x,SCP-X)、筑丝蛋白B1(tektin-B1)和类突触结合蛋白C(synaptotagmin-C-like,BmSytC)为膜外蛋白。初步分析结果显示,OBP71可能为BmCPV的受体复合体的成员,BmABCG23和家蚕SCP-X通过介导胆固醇的转运参与BmCPV的细胞入侵,CLIP、tektin-B1可能参与BBMV的胞内转运,NCA和BmSytC可能参与BmCPV的内吞过程中的钙离子转运,而BmTF作为BBMV的结构成份与BmCPV的内吞关联。
[硕士论文] 及雪敏
化学 长春理工大学 2017(学位年度)
摘要:肾脏疾病严重危害人类的健康,给人们带来了生活和经济上负担。肾小球滤过率(Glomerular filtration rate,GFR)是评价肾功能的一个常用指标。胱抑素C(Cystatin C, Cys-C)是衡量GFR的有效标志物。Cys-C常用检测方法存在弊端。因此,建立一种简单、方便、特异地检测Cys-C的方法具有非常重要的意义。
  本研究通过噬菌体表面展示技术获得Cys-C的亲和配体。经过三轮淘洗获得目标序列:Q-V-N-G-L-G-E-R-S-Q-Q-M。用人工固相合成方法标记 FITC以制得荧光探针FITC-Acp-Q-V-N-G-L-G-E-R-S-Q-Q-M,通过HPLC和MS进行测定,分子量与理论值相符。当Cys-C浓度在0.039μg/mL-2.5μg/mL时,检测的荧光强度与Cys-C浓度符合线性方程:y=182.12x+33.842,R2=0.9990;当Cys-C的浓度在2.5μg/mL-160μg/mL时,检测的荧光强度与Cys-C浓度符合曲线方程:y=599.3ln(x)-119.79,R2=0.9964。探针的荧光强度值与Cys-C浓度总体呈正相关。可为肾病早期检测提供一种有效的新方法。
[硕士论文] 温美思
信息与通信工程 天津工业大学 2017(学位年度)
摘要:干细胞是具有自我更新和高度增殖能力的一类细胞,在再生医学领域具有广阔的应用前景。大量具有高活力、无损伤的干细胞是进行干细胞生物学研究和临床应用的重要前提。因此,实时准确地获取细胞的生理状态信息具有重要的研究价值。
  针对现有干细胞状态信息检测手段的局限性和不足,本文基于光学检测技术的无标记、非侵入等优势,结合生物光子辐射对细胞生理状态灵敏的指示特性,设计并搭建了适用于活体干细胞的生物光子检测系统,旨在为进一步研究生物超弱光子辐射与干细胞生理状态的关联性提供可靠的实验平台。
  本文的主要研究内容如下:
  (一)根据生物光子的辐射强度低和辐射过程非稳态等特点,基于单光子计数测量原理,结合多通道时序控制技术,提出了一种适用于活体干细胞的生物光子检测系统的设计方案。
  (二)采用高压氙灯作为照射光源,利用光纤及耦合透镜设计系统传输光路,使用食品级不锈钢设计样品暗室,提高了系统的灵活性和避光性。采用高灵敏、低噪声的光电倍增管和快速响应的多通道光子计数器,提高了系统的集成度和灵敏度,降低了系统的噪声水平。
  (三)针对活体干细胞延迟发光检测对时序控制的需求,提出了一种基于ARM+FPGA架构的多通道时序控制器的设计方案,并进行了仪器的产品化设计。以ARM芯片STM32F103ZET6和FPGA芯片EP3C16Q240C8N为核心设计了多通道时序控制器的硬件电路,并基于此硬件平台进行了FPGA逻辑电路设计,ARM软件设计,触摸屏的界面设计以及上位机软件设计,实现了8通道并行输出、时序精度为1μs,双通道触发响应和以太网远程控制等功能。
  (四)搭建了以多通道时序控制器为控制核心的活体干细胞生物光子检测系统,并进行了干细胞检测实验。实验结果显示本文所研制的活体干细胞生物光子检测系统具有检测精度高(4.6×105/s·pW,at600nm)、噪声水平低(暗计数低于20光子/秒)、测量滞后时间短(约35ms)、扩展性强、应用灵活性高等特点,满足活体细胞光诱导延迟发光的测量要求,可为进一步研究生物超弱光子辐射与干细胞生理状态信息的关联性提供稳定可靠的测量工具。
[博士论文] 李燕
应用数学 东南大学 2016(学位年度)
摘要:本文研究了几类描述细胞在自身分泌的化学物质刺激下进行趋向性运动的偏微分方程组,包含单种群趋化模型和多种群趋化模型.论文研究了这几类趋化模型解的整体存在性与有限时刻爆破.
  本文主要内容包含五部分:
  第一章概述了所研究趋化模型的生物背景,国内外的发展现状并简要介绍本文的主要工作.
  在第二章中,我们研究了两种群趋化方程组{ut=Δu-▽·(u▽w),x∈Ω,t>0,vt=Δv-▽·(v▽w),x∈Ω,t>0,wt=Δw+u-w-vw,x∈Ω,t>0的Neumann边值问题,其中Ω(C)R2为光滑有界区域,我们得到了小初值条件下方程组解的有界性与渐近性态.具体来说,我们证明了存在ε0>0,对于任何满足‖u0‖L1(Ω)<ε0和‖▽w0‖L2(Ω)<ε0的初值(u0,u0,w0),方程组的解都整体存在并且一致有界.此外,该问题的解(u,v,w)渐近趋向于(m1,m2,m1/1+m2),这里m1=1/|Ω|∫Ωu0,m2=1/|Ω|∫Ωv0.
  第三章考虑完全抛物型两种群趋化方程组{ut=Δu-x1▽·(u▽w),x∈Ω,t>0,vt=Δv-x2▽·(v▽w),x∈Ω,t>0,wt=Δw-γw+α1u+α2v,x∈Ω,t>0的Neumann边值问题.其中Ω是RN(N≥3)中的球,x1,x2,γ,α1,α2均为正实数.我们考虑了更一般的情形x1≠x2,证明了对于任何的mi>0(i=1,2),都存在径向对称的初值(u0,v0,w0)∈(C0((Ω)))2×W1,∞(Ω)满足mi=∫Ωui0,(i=1,2),使得问题对应的解发生有限时刻爆破,即limt→T‖u1‖L∞(Ω)+‖u2‖L∞(Ω)=∞,这里T∈(0,∞).
  第四章我们讨论了单种群与两种化学物质的趋化-排斥方程组{ut=Δu-x▽·(u▽v)+ξ▽·(u▽w),x∈Ω,t>0,0=Δv+αu-βv,x∈Ω,t>0,0=Δw+γu-δw,x∈Ω,t>0的Neumann边值问题,这里Ω为R2中的光滑有界区域.x,ξ为非负实数,α,β,γ,δ为正实数.我们研究了该问题的解在条件xα-ξβ>0且β≠δ时的有限时刻爆破.
  第五章研究了非线性扩散趋化-趋触模型{ut=▽·(D(u)▽u)-x▽·(u▽v)-ξ▽·(u▽w)+μu(1-u-w),x∈Ω,t>0,ut=Δv-v+u,x∈Ω,t>0,wt=-vw x∈Ω,t>0的Neumann边值问题,其中Ω为RN中的光滑有界区域.N=2,3,4,x,ξ,μ≥0.扩散系数D(u)满足D(u)≥δum-1,u>0,其中δ>0.我们得到了m>2-2/N时,如果初值具有一定的正则性,则该问题存在整体有界的解.对于非退化情形(即D(0)>0),我们得了整体有界的古典解;对于可能退化的情形(即D(0)≥0),我们得到了整体一致有界的弱解.
[硕士论文] 凌小滨
化学生物学 厦门大学 2016(学位年度)
摘要:视黄酸受体γ(Retinoic Acid Receptor gamma,RARγ),作为核受体超家族重要成员之一,在生物体生长、发育、代谢、免疫、分化、增殖、炎症、凋亡等过程中均发挥着重要作用。RARγ一般与核受体RXRα形成异源二聚体形式,在细胞核发挥调控基因转录的活性。但是近年来的研究发现,RARγ以及其他一些核受体会出核与胞质中的蛋白直接相互作用进而快速参与到胞外的信号调控,发挥核受体的“非基因型作用”。因此,RARγ一直以来都是药物干预和治疗过程中重要且极具吸引力的靶点,而寻找RARγ的新型配体对于揭示RARγ新的生物学活性和作为特定疾病治疗靶点的潜能具有重要的意义。
  本课题基于以上理念,通过报告基因筛选系统,从化合物库筛选到选择性调控RARγ的化合物XS-0005。XS-0005是一个苯基硫脲芳香类化合物,是本课题组根据之前发表的RXRα的coregulator表面结合位点的结构,利用visualscreening技术从小分子化合物库筛选并从specs公司购买获得,到目前为止还没有关于其活性的研究报道。我们在筛选的过程中发现XS-0005化合物对RARγ有特异的转录抑制作用,并通过体外实验证明XS-0005与RARγ存在直接结合。我们通过体外结合实验和Glide docking的方法推测其在RARγ上的可能结合位点和对结合起关键作用的氨基酸,结果发现XS-0005可能并不结合在核受体经典的LBP口袋,而是结合在表面coregulator的结合位置。RAW264.7小鼠巨噬细胞中,我们发现XS-0005能够抑制本底以及炎症因子LPS激活的ERK通路,其作用机制可能是通过促进RARγ与TRAF6的相互作用进而诱导TRAF6的降解。另外,我们发现在MCF-7人乳腺癌细胞中XS-0005也会诱导TRAF2的降解并抑制ATRA对AKT的激活。在生理功能上,我们发现XS-0005会使RAW264.7小鼠巨噬细胞周期阻滞在S期并诱导细胞凋亡。
  因此,本研究揭示了一个新型的RARγ的配体XS-0005,其可能通过结合在RARγ表面coregulator的结合位点,进而调节RARγ的活性。同时,本研究揭示XS-0005新的RARγ依赖的生物学活性及可能的作用机制,即XS-0005可能通过增强RARγ和TRAF6的相互作用,进而促进TRAF6的降解和抑制ERK的激活。
[硕士论文] 孙洋
遗传学 湖南师范大学 2016(学位年度)
摘要:在细胞运动中激活Rac蛋白,其表现出很强的时间性和空间性,故在细胞前端产生扁平突起—片状足。继而使细胞产生运动牵拉胞体的过程。但对于正调控Rac蛋白局部化激活的原理到目前为止尚未定论。我们已知根据在细胞两端及其后端当整合素α4处于激活状态时,则抑制Rac蛋白的活性。并根据信号分子的结构及其功能提出了整合素正调控Rac蛋白活性的信号转导通路,即当α4胞内区域磷酸化导致其不能与Paxillin结合时,Paxillin、GIT1,与PIX、PAK形成信号分子复合物。由于PIX为Rac的转换分子,PAK为Rac的效应分子,构成了Paxillin-GIT1-PIX-PAK信号转导通路,在细胞前端Rac蛋白处于激活状态时就会导致无细胞器的扇形突起—片状足的形成,从而使细胞向前移动。
  我们利用Western blotting技术,荧光双定位技术,已经验证GIT1可与Paxillin相互作用、GIT1可与PIX相互作用、GIT1可与PAK相互作用,则确认Paxillin-GIT1-PIX-PAK信号分子复合物存在于细胞前端。我们设计、克隆了Paxillin的ShRNA,以降低细胞中Paxillin的表达。免疫荧光试验表明,在转染了shRNA中,Paxillin明显受到抑制。Rac蛋白激活试验表明,fibronectin刺激5min,Rac蛋白的激活程度最强。FRET定量检测,验证了该信号转导通路在Paxillin正常或受抑制情况下Rac的激活。研究结果表明,在Paxillin表达受到抑制时,Rac蛋白激活受到明显抑制。研究结果阐明Paxillin-GIT1-PIX-PAK信号通路在细胞前端对Rac局部化激活起着正调控作用。
[硕士论文] 邢玲玲
光学工程 江苏大学 2015(学位年度)
摘要:细胞作为生命体最基本的组成单元,其形态结构和动力学信息能够直观的反映出生命体的状态。血细胞的分类分选以及识别是疾病判断和探索生命体的重要手段之一。近几十年来,细胞研究得到了广泛的发展,其中流式细胞术和细胞成像技术成为中流砥柱的方法。流式细胞术的优点在于快速的进行细胞分选分析,而成像技术则专注于细胞的形态结构以及内容物的研究。
  流式细胞术是针对细胞、细胞内遗传物质、病毒、微粒等物质的快速分选分析方法。本文以双光源光学系统为例简要介绍了血细胞分类的方法,并且基于血细胞的双层椭球核式的光散射模型,有效采集了相关散射研究理论数据,着重分析了在模型内外折射率参数变化、模型内核直径变化、模型形态因子变化下的光散射分布,在此基础上对血细胞模型的前向、侧向以及后边散射光进行了区域划分,并且对其中部分数据进行了仿真计算以及补充,建立了血细胞模型下的全域光散射谱图,通过对图散射点的离散化特征分析,建立了在该区域内的血细胞模型特征与血细胞类别的关系,进而提出了基于全域光散射下的血细胞亚类识别方法。
  近十几年以来,定量相位显微技术得到了飞速发展。定量相位显微技术可以实现细胞的相位信息采集,通过计算出形成该相位图像的全息状况,获得样品完整的相位信息,进而反演出细胞的真实形态。本文以课题组提出的改进后的相位恢复微分法为理论基础,编制了微分法的运算程序,并且以红细胞厚度灰度图作为实验图,叙述了程序的运算过程。在此基础上,采用LabVIEW虚拟实验室软件构建了人机交互的“血细胞相位显微系统”软件,该软件采用状态机结构作为主要结构,采用了MATLAB节点调用微分法运算程序,实现了MATLAB软件和LabVIEW软件混编处理图像目的,得到了良好的反馈。
  在上述内容的探索过程中,通过分析流式细胞仪和定量相位成像技术的光路设置图,提出了一种基于光散射与相位成像下的血细胞联合检测系统。该系统采用流式细胞仪中的光路检测系统,其中包括前向散射光检测系统和侧向散射光系统,和定量相位成像光路中的改进后的马赫增德尔光路系统。
  本文的研究从流式细胞仪的光散射分析方法到定量相位显微技术的相位恢复程序编制,最终通过两者的研究,得到了血细胞联合检测系统的设计方法。该方法为血细胞研究提供一定的基础。
[硕士论文] 孙恺文
动物学 扬州大学 2015(学位年度)
摘要:细胞黏附是细胞之间信息交流和传递的一种形式。钙黏附蛋白家族是一类具有钙离子依赖性的黏附分子。原钙黏附蛋白是钙黏附蛋白家族中最大的亚族,原钙黏附蛋白18(Protocadherin18,Pcdh18)是原钙黏附蛋白亚家族的成员。在斑马鱼中已发现Pcdh18的两个同源蛋白Pcdh18a和Pcdh18b,同源性达70%。虽然两者的表达模式不尽相同,但都在斑马鱼胚胎发育过程中的中枢神经系统处表达。哺乳动物与斑马鱼的的Pcdh18有一半以上的氨基酸完全相同,说明哺乳动物中的Pcdh18表达与定位可能和在斑马鱼中具有极高的相似性。
  为了研究原钙粘附蛋白在神经系统中的生物学功能,生物学家们利用基因敲除技术除去相关基因,对基因敲除小鼠的神经系统发育进行观察。这也是探究Pcdh18基因功能的主要思路。将RNA干扰技术与转基因小鼠技术相结合,以Tet系统介导RNA干扰过程,从外部精确调控靶基因表达的干扰程度,规避胚胎死亡,又能获得缺陷表型倒推Pcdh18的基因功能。
  本研究旨在筛选出高效抑制mPcdh18表达的siRNA序列,建立并鉴定诱导表达mPcdh18-siRNA的LLC稳定细胞株,为日后RNAi转基因小鼠模型的建立打下基础。本研究分以下两部分进行。
  1.Tet系统诱导mPCDH18-siRNA在293T细胞中的表达
  针对mPcdh18基因序列设计并体外合成三对siRNA,包括一对无关序列。利用本实验室已成功构建的mPcdh18与pEGFP-N1的融合表达载体pEGFP-mPcdh18,分别与三对siRNA瞬时共转染293T细胞,并设置空白对照,在荧光显微镜下观察荧光强度,并以RT-PCR手段进行mRNA水平检测,得到基因抑制效率。实验结果表明,所设计的siRNA序列都具有较强的抑制效果。
  将三对siRNA对应的反向互补DNA序列与pSingle-tTS-shRNA载体通过“酶切-连接”方式构建融合表达载体pSingle-tTS-shRNA。与pEGFP-mPcdh18瞬时共转染293T细胞,并以适当浓度DOX诱导,观测荧光强度并检测mRNA表达水平,得到基因抑制效率。实验结果表明,所设计的siRNA序列在Tet系统内仍然具有较强的抑制效果。
  2.稳定诱导表达mPCDH18-siRNA的LLC细胞株的建立及鉴定
  以RT-PCR和Western-Blotting手段筛选数种鼠源及人源细胞,证实LLC细胞内有mPcdh18基因和蛋白高表达。将pSingle-tTS-shRNA重组质粒转入LLC细胞,G418筛选得到稳定细胞株。以qRT-PCR和Western-Blotting手段,测定不同浓度DOX诱导下,稳定细胞株mPcdh18的表达水平。结果显示,LLC细胞内mPcdh18的表达水平随着DOX浓度的增加呈明显的降低趋势,在DOX浓度1000μg/ml左右达到最强抑制效率,趋近80%。观察稳定细胞株的增值活性和细胞形态变化,并测定其生长曲线和细胞迁移能力,发现细胞增值活性降低,细胞状态变差,迁移能力也有减弱。
  综上所述,本研究已筛选出高效抑制mPcdh18表达的两对siRNA片段,成功建立并鉴定了由Tet-on系统调控mPcdh18-siRNA表达的LLC稳定细胞株,为后续RNAi转基因小鼠模型的建立打下了基础。
[硕士论文] 伍开翔
光学 南京邮电大学 2015(学位年度)
摘要:本文对BDSF增强RAW264.7巨噬细胞的吞噬作用以及杀伤癌细胞的能力进行了研究。巨噬细胞来源于生物体中的单核细胞,是一种位于组织内的白细胞,具有吞噬病原体等保护机体的作用,十二烷基癸烯酸BDSF是一种来源于细菌的小分子短链脂肪酸,可以抑制白念珠菌的生长。本课题研究BDSF在体外对小鼠RAW264.7巨噬细胞吞噬白念珠菌的作用,及对RAW264.7巨噬细胞的抗癌活性和蛋白组学的影响。通过瑞氏吉姆萨染色法检测BDSF对巨噬细胞吞噬酵母态白念珠菌的吞噬能力的变化,并利用共聚焦显微镜观察巨噬细胞形态变化及吞噬白念珠菌的过程;采用iTRAQ蛋白组学定量检定技术和ELISA试剂盒检测BDSF对巨噬细胞抗癌活性及蛋白组的变化;结果显示,BDSF可显著增强RAW264.7巨噬细胞吞噬白念珠菌的吞噬能力,100μM BDSF提升其吞噬率和吞噬指数近5倍;并且BDSF可以增强巨噬细胞杀伤癌细胞的能力,促进细胞分泌更多的TNF-α,100μM BDSF作用下对癌细胞的杀伤活性和TNF-α表达量可增加4倍。iTRAQ检测结果显示BDSF能够促进RAW264.7巨噬细胞的多种蛋白表达如Siae唾液酸乙酰酯酶和Mgp基质Gla蛋白。本课题中BDSF在细胞免疫学中增强作用显著,对细胞吞噬及癌症治疗等研究具有潜在的意义值得深入研究。
[博士论文] 高超
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2015(学位年度)
摘要:胞外ATP(Adenosine Triphosphate)激动的P2X受体蛋白家族是配体门控离子通道,能非选择性地通透多种阳离子。ATP与P2X受体蛋白结合后激活P2X受体蛋白并使该通道发生由关闭状态到开放状态的构象转变。已有的晶体结构研究表明P2X受体蛋白上的ATP结合位点与其跨膜区孔道是由结构上相对保守的三个连接区连接的,而这些连接区又构成了允许离子进入离子通道孔道的侧窗区。连接区传递由ATP结合后引起的直至跨膜区孔道一系列构象变化信息的作用还不是十分清楚。
  本实验中我们利用P2X4受体作为研究对象,采用丙氨酸、丝氨酸定点突变的方法研究连接区氨基酸残基的侧链结构对离子通道门控作用的影响。实验表明Y54A/S,F198A/S,和W259A/S这些突变受体转染后均能在HEK293细胞上正常表达,但是这些突变受体在ATP刺激下几乎不能应答。其中F198A/S突变受体的功能能被P2X4离子通道特别的阳性调节剂伊维菌素(IVM)部分恢复。Y195A/S,F200A/S和F330A/S这些突变受体都显示了与P2X4野生型受体相似的正常功能,说明这三个氨基酸残基均没有影响ATP的激动能力。然而Y195A/S,F200A/S和F330A/S这些突变受体均明显地改变了对IVM调节受体失活时间效应的敏感度,说明这三个氨基酸残基可能参与了受体离子通道门控作用的调节。总之,我们的研究数据显示离子通道胞外区与跨膜区之间的连接区保守的氨基酸残基参与了P2X受体构象转变过程中的信号转导过程与离子通道门控作用。
  
[硕士论文] 申雅静
高分子化学与物理 安徽大学 2015(学位年度)
摘要:近年来,采用天然生物大分子和有机合成高分子对无机纳米粒子表面进行修饰,不仅能改善纳米粒子在水溶液中的分散性,提高纳米粒子的生物相容性,而且可以赋予这些无机纳米粒子特殊的生物功能,从而实现特定的生物医学应用。本论文采用天然生物大分子辣根过氧化物酶(HRP)和有机合成高分子羧基化聚乙二醇(PEG5000-COOH),通过N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)偶合方法,分别在磁性介孔二氧化硅纳米粒子(MMSNs)的表面进行接枝,然后再引入荧光碳量子点(CDs),分别得到了两种产物:MMSNs-HRP-CDs和MMSNs-PEG-CDs。在对这两种产物的形貌、结构和理化性质研究基础之上,还对它们在细胞生物学中的应用进行了探索研究。
  主要研究内容包括:
  一、MMSNs-HRP-CDs的制备、表征及其消除细胞内活性氧(ROS)应用研究
  (1)通过水热法合成Fe3O4纳米粒子,利用经典的St(o)ber方法经过相转移制备出介孔SiO2包覆Fe3O4的磁性复合纳米粒子MMSNs;然后将MMSNs表面进行羧基化改性,再通过NHS/EDC偶合方法接枝上HRP;再通过HRP与CDs之间的共轭,得到最终产物MMSNs-HRP-CDs。利用透射电镜(TEM)、红外光谱(FT-IR)、氮气吸附-脱附等温曲线、紫外-可见(UV-Vis)和荧光光谱(PL),以及材料物性测量系统(PPMS)等手段对产物的形貌、结构、比表面积、荧光性质和室温磁性能等进行了表征。结果表明MMSNs粒子呈球形,形貌和尺寸均匀,平均粒径为60 nm,BET比表面积高达963 m2 g-1,介孔孔径约3.0 nm,室温下呈现超顺磁性。
  (2)采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为模型,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)双波长法研究了MMSNs-HRP和MMSNs-HRP-CDs的细胞毒性,结果表明两者的细胞毒性都很低。然后,利用一定浓度的双氧水诱导CHO细胞内产生ROS,再将MMSNs-HRP与CHO细胞共培养20小时,通过荧光显微镜的定性分析和流式细胞仪的定量分析来检测细胞内的ROS水平。分析结果表明MMSNs-HRP可以有效地消除细胞内的ROS。
  (3)利用MMSNs-HRP-CDs的荧光特性研究了外加静态磁场(约0.3 T)对细胞内吞纳米粒子的影响,结果表明:当纳米粒子的浓度为200μg mL-1时,在外加磁场条件下与CHO细胞共培养2h后,细胞内吞MMSNs-HRP-CDs纳米粒子的量要明显多于没有加磁场条件下的细胞内吞纳米粒子量。由此可见外加静态磁场对细胞内吞磁性纳米粒子具有一定的影响。
  二、MMSNs-PEG-CDs的制备、表征和生物相容性及其在细胞显影中应用研究
  (1)采用与上述相同的方法合成MMSNs,然后将MMSNs表面氨基化,加入PEG5000-COOH,通过NHS/EDC偶合在MMSNs表面接枝上聚合物PEG5000-COOH,再引入荧光CDs,得到了产物MMSNs-PEG-CDs。利用TEM、FT-IR、氮气吸附-脱附等温曲线,UV-Vis和PL光谱等手段对产物的形貌、结构、比表面积和荧光性质进行了表征。结果表明MMSNs表面修饰上PEG5000-COOH后不仅使纳米粒子在水溶液中的分散性得到了提高,而且修饰之后引入CDs得到的粒子(MMSNs-PEG-CDs)具有强而稳定的荧光性质。
  (2)选取子宫颈癌细胞(HeLa)为模型,采用MTT双波长法研究了具有相同粒径的实心二氧化硅纳米粒子(SSNs)和介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)的细胞毒性,并采用流式细胞仪细胞分选法(FACS)研究了两者诱导细胞凋亡的情况。研究结果表明:虽然两者细胞毒性都很低,但是介孔硅球诱导的细胞凋亡率略高于相同尺寸的实心硅球。再通过MTT双波长法研究了MMSNs,MMSNs-PEG和MMSNs-PEG-CDs的体外细胞毒性,结果表明在介孔二氧化硅壳层表面修饰PEG5000-COOH后,增加了MMSNs粒子的生物相容性,使得MMSNs-PEG和MMSNs-PEG-CDs的细胞毒性都很小。
  (3)采用倒置荧光显微镜研究了MMSNs-PEG-CDs在细胞显影方面的应用,结果表明MMSNs-PEG-CDs不仅细胞毒性低,并且进入细胞后在较长时间内仍然具有强而稳定的荧光性质,因此适用于长时间的细胞显影。
[硕士论文] 李洋
光学工程 天津大学 2014(学位年度)
摘要:纳米生物光子学是光学、纳米技术和生物医学研究的交叉学科,借助纳米材料独特的光学性质和生物特性,用光学的手段实现对细胞和生物体微纳米量级的操控、传感和成像。近十年来,随着纳米制造技术和激光技术的进步,各种功能和材料的纳米颗粒被大量合成出来,如半导体量子点、金属纳米颗粒、Fe2O3磁性纳米颗粒等,广泛应用于细胞成像、细胞内纳米传感、光热治疗、光动力治疗、靶向载药和转基因等技术。尤其是飞秒激光技术的进步,为纳米生物光子学提供了更优质的光源和理想的光操控手段,使其成为一个具有广阔前景的领域。
  本文首先综述了纳米生物光子学领域的研究内容和前沿应用,并对研究中应用最广泛的纳米颗粒进行简介,着重介绍了纳米金颗粒和纳米金棒的光学性质和生物相容性。同时,对细胞内信号调控、凋亡和坏死机制进行了简介,这是飞秒激光和纳米颗粒对细胞发挥作用的生物学基础。
  纳米生物光子学涉及纳米金棒、飞秒激光、体外培养的活细胞三者的相互作用,本文对其机理进行了详细介绍,阐明了飞秒激光调控细胞信号和光损伤的物理和生物机制,以及纳米金棒增强飞秒激光对生物细胞作用效果的原理。
  最后对不同重复频率和不同脉宽的飞秒激光调控含纳米金棒细胞内钙水平和光损伤的效果进行了实验研究。实验结果表明,通过调整飞秒激光曝光时间可以精确调控细胞内钙水平上升和下降,其中,飞秒激光调控细胞内钙水平下降的现象为本文首次发现。飞秒激光重复频率和脉宽对光损伤效果有重要影响,反映出热效应主导的光损伤特点。
  本文的研究成果可以用于各种钙相关的细胞生命过程的调控,如转基因、免疫调控等,对光热治疗、光动力治疗等光损伤治疗同样有指导意义。
[博士论文] 刘丰
神经生物学 上海交通大学 2014(学位年度)
摘要:研究目的:电压门控钙离子通道(voltage-gated calcium channel,Cav)对于维持可兴奋细胞钙稳态及其正常结构和生理功能具有重要作用。Cav膜表达的调控正日益受到关注,其孔道结构成分α1亚单位的膜转运及在缺乏Cav辅助亚单位的条件下其膜转运的变化和机制,目前仍不清楚。本研究探讨了14-3-3蛋白在Cav2.2通道膜转运过程中的作用及其机制。
  研究内容:14-3-3蛋白是否调控及如何调控Cav2.2通道膜转运,探索14-3-3蛋白对Cav2.2通道膜转运的影响及其转运途径和相关的可能机制。
  研究方法:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测tsA-201细胞和小鼠脑中各类内源性Cav通道辅助亚单位mRNA的表达情况;免疫印迹、免疫共沉淀方法研究14-3-3蛋白与Cav2.2钙通道孔道结构成分α1B亚单位C末端片段之间的相互作用;细胞免疫荧光染色及激光共聚焦技术,观察Cav2.2α1B以及Cav2.2α1BC末端片段的质膜表达情况,探索14-3-3蛋白对Cav2.2α1B膜转运的影响及可能作用机制;单细胞膜片钳电生理技术检测tsA-201细胞上转染的Cav2.2α1B通道电流密度及原代培养的海马神经元上的Cav2.2道电流密度,从功能角度进一步观察14-3-3蛋白对Cav2.2α1B膜表达的影响以及Cavβ亚单位与14-3-3蛋白协同调控Cavα1膜表达的可能性。
  结果:在缺乏Cav辅助亚单位条件下,14-3-3τ增强Cav2.2α1B膜表达水平,而表达14-3-3蛋白抑制肽(pSCM138)阻断14-3-3蛋白与Cav2.2α1B之间的相互作用,则会抑制14-3-3蛋白增强Cav2.2α1B膜表达水平效应;Cav2.2α1B C末端存在一段内质网滞留信号,14-3-3蛋白能够影响包含此内质网滞留信号序列的Cav2.2α1B C末端片段(CT1,aa1706-1940)而改变其膜表达水平,却不影响无此信号序列的CT2(aa2102-2220);14-3-3蛋白屏蔽内质网滞留信号从而增强CT1膜表达水平这一现象在被pSCM138阻断两者之间的相互作用时消失;无论在细胞系还是在培养的海马神经元,14-3-3蛋白与Cavβ亚单位均能够协同调控Cav2.2膜表面表达水平。
  结论:14-3-3蛋白通过屏蔽Cav2.2α1B C末端近端的内质网滞留信号来促进Cav2.2通道膜转运,且其能够与Cavβ辅助亚单位协同调控Cav2.2通道膜表达。
[硕士论文] 陈岳言
生物学 哈尔滨工业大学 2014(学位年度)
摘要:已有研究表明,唾液酸是一种重要的糖物质,位于细胞表面糖缀合物的最末端,在细胞粘附、识别、炎症反应以及肿瘤细胞的转移过程中起着重要作用。血管内皮细胞表面唾液酸的改变与心血管疾病、癌症等疾病的发生及发展紧密相关。因此对细胞表面唾液酸以及其相关的唾液酸糖基转移酶的功能研究具有重要的意义。
  本论文利用LPS诱导细胞,建立血管内皮细胞损伤模型,在此基础上,使用凝集素SNA及MAA对细胞表面唾液酸进行荧光标记,并利用流式细胞术与激光共聚焦显微镜对细胞损伤后其表面唾液酸变化进行分析。结果表明,1-10μg/mL的LPS处理可引起细胞的部分损伤。SNA结合唾液酸的流式结果显示,当LPS处理4 h时,α-2,6唾液酸含量略有降低,其中10μg/mL LPS处理组的荧光强度比对照组降低了31%。当LPS处理24h时,α-2,6唾液酸含量显著增加,其中10μg/mL LPS处理组的荧光强度比对照组升高了119%。该结果与SNA染色的激光共聚焦结果相一致。MAA结合唾液酸的流式结果显示,当LPS处理4h时,α-2,3唾液酸含量也存在降低趋势,其中1μg/mL LPS处理组的荧光强度比对照组降低了42%。当LPS处理24h时,10μg/mL LPS处理组的α-2,3唾液酸的荧光强度比对照组升高了37%。该结果与MAA染色的激光共聚焦结果相一致。
  在获得细胞损伤后细胞表面唾液酸的变化情况后,我们初步研究唾液酸相关的糖基转移酶变化情况。qRT-PCR结果表明,LPS处理细胞后,细胞的ST3-1、ST3-4及ST6-1均发生表达水平的变化,推测α-2,3连接的唾液酸的表达变化可能与ST3-4有关,α-2,6连接的唾液酸的表达变化可能与ST6-1有关。
  本研究使用LPS诱导细胞损伤,发现了细胞表面唾液酸的变化规律,并对唾液酸变化的分子机制进行了初步的分析,该结果为研究唾液酸与血管内皮细胞损伤的关系奠定了基础,也为进一步理解唾液酸及唾液酸转移酶在细胞活动中的功能提供了可靠依据。
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